Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja blaszek beta-amyloidowych w skrawkach mózgu z modeli myszy choroby Alzheimera przed wstępnym osadzeniem barwienia immunologicznego i przetwarzania tkanek do mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuroimmunologii, takie jak interakcja komórki mikrogleju z synapsą w pobliżu wykresów beta amyloidu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wstępne badanie przesiewowe wycinków tkanki mózgowej zawierających wykresy beta amyloidu w obszarach i warstwach będących przedmiotem zainteresowania.

Chociaż metoda ta może być stosowana w chorobie Alzheimera, może być również stosowana do wszelkich innych chorób lub tkanek, w których występuje amyloidoza. Najpierw przygotuj pięć miligramów na mililitr roztworu związku metoksy X04. Za pomocą wagi mirco zważ pięć miligramów metoksy X04.

Pod wyciągiem rozpuścić metoksy X04 w 100 mikrolitrach DMSO i mieszać do uzyskania klarownego, zielonkawego roztworu. Kolejno dodawać 450 mikrolitrów glikolu propylenowego i 450 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, mieszając. Trzymaj roztwór mieszając się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia powinna być widoczna żółtawo-zielona emulsja. Po wstrzyknięciu methoxy X04 dodać dawkę 10 miligramów na kilogram masy ciała i poświęcić zwierzę w pożądanym punkcie czasowym zgodnie z zatwierdzonymi metodami, przemyć mózg utrwalony paraoraldehydem trzykrotnie schłodzonym PBS. Następnie, za pomocą ostrej żyletki, usuń opuszkę węchową i przetnij mózg koronalnie na dwie do trzech kawałków o mniej więcej równej wysokości, z których wszystkie można podzielić jednocześnie w celu przyspieszenia zabiegu.

Przyklej kawałki tkanki mózgowej do płytki próbki przymocowanej do tacy. Upewnij się, że gładka powierzchnia cięcia mocno przylega do płytki próbki. Dodaj roztwór PBS do tacy, aż cała powierzchnia mózgu zostanie całkowicie zanurzona.

Umieść tacę w wibratomie i dostosuj ustawienia wibratomu, aby uzyskać sekcje o grubości 50 mikronów. Rozpocznij cięcie, a w przypadku przesiewania natychmiast przenieś skrawki do PBS za pomocą cienkiego pędzla. Alternatywnie, skrawki można umieścić w szklanych fiolkach zawierających roztwór kriochroniony do przechowywania w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Za pomocą stereotaktycznego atlasu mózgu myszy wybierz sekcje mózgu zawierające obszar zainteresowania i umieść każdą sekcję w krioprotektancie w studzience z 24-dołkową płytką hodowlaną. Następnie za pomocą jednorazowej pipety dodaj kroplę PBS na szkiełko mikroskopowe, a następnie umieść wycinek na kropli. Zbadaj przekrój pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zidentyfikować obszary zawierające płytki a-beta znakowane metoksy X04.

Nie przesuwając stolika mikroskopu, uchwyć obrazy interesujących obszarów w jasnym polu, a także w trybie fluorescencji. Każdy obraz musi przedstawiać ten sam region w obu polach, aby skorelować płytkę nazębną z obszarem strukturalnym przekroju tkanki. Zapisz i nazwij zrobione zdjęcia zgodnie z numerem zwierzęcia.

Zapisz również numer studni na tabliczce i pole wykonanych zdjęć. Po zakończeniu obrazowania umieść sekcję z powrotem w wyznaczonej studzience. Zbadaj następną sekcję w sekwencji, stosując tę samą procedurę, aby uniknąć wysuszenia sekcji.

Aby wyrównać obrazy, otwórz obrazy jasnego pola i pola UV dla tego samego zwrotu z inwestycji w ImageJ. Następnie użyj wtyczki MosaicJ, aby wyrównać krawędzie dwóch obrazów. Zapisz wyrównany i połączony obraz zgodnie z numerem studzienki w folderze z numerem konkretnego zwierzęcia.

Połącz obrazy z różnych sekcji tego samego zwierzęcia, aby zidentyfikować i zlokalizować blaszki w obszarze zainteresowania. Po zakończeniu procesu przesiewowego badane skrawki należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza na 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej krioprotektant do czasu barwienia immunologicznego lub dalszej obróbki. Najpierw przygotuj 1% roztwór tetratlenku osmu w buforze fosforanowym w szklanej fiolce.

Ponieważ tetratlenek osmu jest światłoczuły, przykryj szklaną fiolkę folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem. Po umyciu w buforze fosforanowym należy usunąć bufor z odcinków i rozprowadzić je na płasko za pomocą drobnego pędzla. Pamiętaj, aby spłaszczyć sekcje bezpośrednio przed dodaniem tetratlenku osmu, ponieważ wszelkie fałdy w sekcjach staną się trwałe, a próba spłaszczenia tkanki po utrwaleniu osmu spowoduje tylko złamanie sekcji.

Użyj pipety transferowej, aby dodać tetratlenek osmu do sekcji po jednej kropli na raz, aż sekcja zostanie zanurzona. Przykryj studzienkę folią aluminiową, aby chronić sekcje przed światłem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas tej inkubacji przygotuj żywicę z tworzywa sztucznego w jednorazowej zlewce.

Połącz składniki w kolejności i dobrze wymieszaj za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aż do uzyskania jednolitego koloru. Przenieś przygotowaną mieszaninę do aluminiowych naczyń wagowych. Otrzymają one skrawki tkanek po ich odwodnieniu.

Po upływie czasu inkubacji odwodnić sekcje w rosnących stężeniach etanolu przez dwie minuty każda. Przenieś odwodnione skrawki z 24-dołkowej płytki hodowlanej do 20-mililitrowych szklanych fiolek. Następnie zanurz skrawki w tlenku propylenu trzy razy na dwie minuty za każdym razem, aby usunąć resztki etanolu.

Następnie za pomocą wygiętej szklanej końcówki pipety lub cienkiego pędzla przenieś skrawki z roztworu tlenku propylenu do żywicy z tworzywa sztucznego i pozostaw na noc do infiltracji w temperaturze pokojowej. Po infiltracji umieścić aluminiowe naczynia wagowe zawierające próbki w piekarniku o temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Aby osadzić sekcje na arkuszach folii polichlorotrifluoroetylenowej, najpierw użyj cienkiego pędzla, aby namalować cienką warstwę żywicy na sekcji.

Następnie przenoś po jednym fragmencie tkanki z aluminiowego naczynia wagowego na arkusz folii PCTFE. Usuń nadmiar żywicy z okolic tkanki, uważając, aby jej nie naruszyć. Po przeniesieniu wszystkich sekcji z jednego naczynia wagowego na arkusz folii PCTFE, umieść drugi arkusz PCTFE na pierwszym, tworząc warstwę tkanki i żywicy pomiędzy dwoma arkuszami.

Polimeryzuj żywicę w inkubatorze przez trzy dni w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza. Tkanka jest następnie gotowa do ultracienkiego przekroju i badania ultrastrukturalnego. Poniższe obrazy pokazują podwójne obrazowanie jednego odcinka hipokampa przy użyciu jasnego pola i trybów fluorescencji.

Obszary i warstwy zainteresowania są wizualizowane w jasnym polu. Podczas gdy blaszki a-beta są z powodzeniem lokalizowane za pomocą filtra UV w zakresie od 340 do 380 nanometrów. Ten obraz przedstawia przekrój hipokampa przed wstępnym osadzeniem barwienia immunologicznego dla IBA1.

Widoczna tablica jest obrysowana przerywaną linią. Ten obraz pokazuje ten sam fragment po wstępnym zatopieniu barwienia immunologicznego dla IBA1 i przetworzeniu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Należy zauważyć, że płytka otoczona przerywaną linią jest nadal widoczna po przetworzeniu tkanki do mikroskopii elektronowej.

Po opanowaniu tego protokołu można go ukończyć w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że każdy krok musi być wykonany rygorystycznie, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo zanieczyszczenia i innych uszkodzeń strukturalnych, które wpłyną na jakość próbek. Nie zapominaj, że praca z osmem może być bardzo niebezpieczna, dlatego zawsze powinieneś podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek podczas wykonywania tej procedury.

Pamiętaj, aby wyrzucić po użyciu po zakończeniu eksperymentu zgodnie z wytycznymi Twojej placówki.