Name: Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi w modelach mysich choroby Alzheimera. Technika umożliwia wstępną selekcję tkanek przed immunobarwieniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni dr Sachiko Sato i Julie-Christine Lévesque z Platformy Bioobrazowania Centre de recherche du CHU de Québec za ich pomoc techniczną. Granty z Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation oraz The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada dla M.E.T wsparły tę pracę.
H.E.H. jest stypendystą libańskiego Ministerstwa Edukacji i Szkolnictwa Wyższego, a K.B. z Faculté de médecine Université Laval.

Uwaga: Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Etyki Zwierząt, zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami zarządzanymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Université Laval. Użyto samców myszy APP-PS1 w wieku od 4 do 21 miesięcy. Zwierzęta te były trzymane w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym w temperaturze 22 - 25 °C ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
1. Przygotowanie roztworu Methoxy-X04
<ol>
	<li>Przygotować roztwór methoxy-X04 9 o stężeniu 5 mg/mlprzez rozpuszczenie metoksy-X04 w roztworze zawierającym 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), 45% glikolu propylenowego i 45% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu (0,9% NaCl w 100 mM buforze fosforanowym, pH 7,4).
	<ol>
		<li>Za pomocą mikrowagi odważyć 5 mg związku metoksy-X04. Pod wyciągiem rozpuścić metoksy-X04 w DMSO i mieszać aż do uzyskania klarownego zielonkawego roztworu. Kolejno dodawaj glikol propylenowy i sól fizjologiczną z buforu fosforanowego, mieszając przy każdym dodaniu.</li>
		<li>Wymieszać roztwór w temperaturze 4 °C na rotatorze O/N. Otrzymać żółtawozieloną emulsję. Roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch miesięcy bez degradacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie roztworu Methoxy-X04
<ol>
	<li>24 godziny przed perfuzją zważyć myszy i podać każdej myszy dootrzewnowe wstrzyknięcie metoksy-X04 w dawce 10 mg/kg masy ciała za pomocą igły 27 1/2 G.</li>
</ol>
3. Perfuzja przezsercowa myszy, którym wstrzyknięto
<ol>
	<li>Na dzień przed perfuzją należy przygotować odpowiednie objętości roztworów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 3,5% akroleiny i 4% roztworu paraformaldehydu (PFA)13 i przechowywać je w temperaturze 4 °C O/N. 
	Uwaga: Roztwory te będą używane zarówno do perfuzji, jak i wstępnego zatapiania immunohistochemii. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z akroleiną, ponieważ jest ona i toksyczna zarówno dla badaczy, jak i środowiska. Ponadto, ponieważ akroleina działa żrąco na tworzywa sztuczne, do przygotowania roztworów akroleiny należy zawsze używać odpowiednich naczyń szklanych.</li>
	<li>W dniu perfuzji przefiltrować PFA i akroleinę za pomocą gruboziarnistej bibuły filtracyjnej o retencji cząstek 25 μm.</li>
	<li>Podczas perfuzji należy użyć pompy perystaltycznej, aby dostarczyć kolejno 15 ml PBS, 75 ml akroleiny i 150 ml PFA do krążenia myszy, z szybkością przepływu 25 ml/min. 
	Zachowaj ostrożność. Perfuzję należy wykonywać wyłącznie w dygestorium, aby uniknąć szkodliwych oparów PFA i akroleiny.
	<ol>
		<li>Aby ustawić pompę, włóż jeden koniec do roztworu PBS, napełnij rurkę (o pojemności około 15 ml) PBS i przymocuj igłę do pobierania krwi o wadze 25 G ze skrzydełkami na drugim końcu. Przez cały czas upewnij się, że rurka jest wolna od uwięzionych pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Umieść rurkę bezpośrednio w butelce z akroleiną po ustawieniu pompy perfuzyjnej z rurką wypełnioną PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulać jedną mysz na raz dawką 90 mg/kg masy ciała pentobarbitalu sodu wstrzykiwaną dootrzewnowo za pomocą igły 27 1/2 G. Oceń reakcje na szczypanie ogona/palców u nóg. Kontynuuj tylko wtedy, gdy mysz nie reaguje na takie awersyjne, bolesne bodźce.</li>
	<li>Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach (leżąc na plecach twarzą do góry), przyklejając przednie i tylne łapy do powierzchni roboczej i ostrożnie odsłaniając serce, nie powodując uszkodzenia innych narządów. Pamiętaj, aby pracować szybko po przebiciu membrany.
	<ol>
		<li>Wykonaj nacięcie przez skórę nożyczkami chirurgicznymi wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej, zaczynając od ogona do klatki piersiowej i przejdź rostralnie do obojczyka.</li>
		<li>Wykonaj dwa dodatkowe boczne nacięcia wzdłuż podstawy brzusznej klatki piersiowej. Delikatnie przesuń i przypnij dwa płaty skóry, upewniając się, że odsłaniają całą klatkę piersiową.</li>
		<li>Przytrzymaj wyrostek mieczykowaty kleszczami, aby odsłonić jamę piersiową i ustabilizować spiczaste nożyczki. Przeciąć przeponę i klatkę piersiową, uważając, aby nie przebić płuc, i kontynuować nacięcie rostralne do obojczyków. Pamiętaj, aby pracować szybko po przebiciu membrany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie rozerwij worek osierdziowy kleszczami. Przytrzymaj serce stabilnie kleszczami, przetnij prawy przedsionek i rozpocznij infuzję PBS. Natychmiast wprowadzić igłę do pobierania krwi do lewej komory.</li>
	<li>Przeprowadzić fuzję myszy z PBS (w rurce), a następnie akroleiną przez 3 minuty (co odpowiada 75 ml), a następnie przełączyć na PFA na 6 minut (co odpowiada 150 ml). Pamiętaj, aby wstrzymać przepływ pompy przed zmianą roztworu, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków do rurki.</li>
	<li>Odciąć głowę myszy i wyekstrahować unieruchomiony mózg i umieścić go bezpośrednio w szklanej fiolce zawierającej 4% PFA na co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Aby wydobyć mózg, użyj nożyczek i pęsety, aby przeciąć skórę, aby odsłonić czaszkę. Ostrożnie rozbij czaszkę między oczami i odłup jej małe kawałki, aby odsłonić leżący pod spodem mózg.</li>
		<li>Ostrożnie usuń odsłonięty mózg i przymocuj go 4% PFA przez dodatkowe 2 godziny przed przystąpieniem do sekcji wibratomowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sekcja mózgu za pomocą wibratomu
<ol>
	<li>Umyj unieruchomiony mózg 3 razy schłodzonym PBS. Za pomocą ostrej żyletki usuń opuszkę węchową (chyba że ten obszar jest badany) i przetnij mózg poprzecznie na 2-3 kawałki o mniej więcej równej wysokości, z których wszystkie można podzielić jednocześnie w celu przyspieszenia zabiegu.</li>
	<li>Przyklej kawałki tkanki mózgowej pionowo do płytki próbki przymocowanej do tacy. Upewnij się, że gładka powierzchnia cięcia mocno przylega do płytki próbki i nie zostanie przemieszczona podczas procedury cięcia. Dodaj tyle roztworu PBS do tacy, aż cała powierzchnia mózgu zostanie całkowicie zanurzona. Ważne jest, aby fragmenty mózgu i kolejne sekcje były całkowicie zanurzone w PBS przez cały ten etap.</li>
	<li>Umieść tacę w wibratomie, dostosuj prędkość cięcia do 0,5 mm/s, częstotliwość cięcia na 90 Hz, a grubość podawania do 50 μm, aby uzyskać odcinki o grubości 50 μm. Następnie przenieś skrawki do 20 ml szklanych fiolek zawierających roztwór krioprotektantu (40% PBS, 30% glikolu etylenowego i 30% glicerolu) za pomocą cienkiego pędzla. Przechowywać fiolki w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Alternatywnie, zachowaj sekcje w PBS do natychmiastowego badania przesiewowego, zgodnie z opisem w poniższych krokach.</li>
</ol>
5. Sekcja przesiewowa na obecność blaszek barwionych metoksy-X04
<ol>
	<li>Za pomocą stereotaktycznego atlasumózgu myszy 14 wybierz sekcje mózgu zawierające obszar zainteresowania, na przykład hipokamp CA1, jak użyto w niniejszym przykładzie. Umieść każdą sekcję w studzience w 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej wystarczającą ilość roztworu krioprotektantu, aby zapobiec wysychaniu skrawków.</li>
	<li>Sprawdzaj kolejno każdą sekcję, aby uniknąć wysuszenia sekcji, stosując następującą procedurę:
	<ol>
		<li>Dodaj kroplę PBS do szkiełka mikroskopowego za pomocą jednorazowej pipety i umieść wycinek na kropli.</li>
		<li>Zbadaj przekrój pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby zidentyfikować obszary zawierające tabliczki Aβ znakowane metoksy-X04. 
		Uwaga: methoxy-X04 można łatwo uwidocznić za pomocą fluorescencyjnego filtra ultrafioletowego (UV) (wzbudzenie 340 - 380 nm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rób obrazy obszarów zainteresowania (ROI) w jasnym polu, a także w trybie fluorescencji bez przesuwania stolika mikroskopu, ponieważ każdy obraz musi pokazywać ten sam obszar w obu polach, aby skorelować obecność blaszek bezpośrednio z obszarem strukturalnym przekroju tkanki.</li>
	<li>Zapisz i nazwij zrobione zdjęcia zgodnie z numerem zwierzęcia. Zapisz również numer studzienki na tabliczce i pole wykonanych zdjęć. Na przykład np.: 9978A1B; Numer zwierzęcia: 9978; Numer studni: A1; Pole: Jasne. Po zakończeniu obrazowania umieść sekcję z powrotem w wyznaczonym dołku. 
	Uwaga: Na końcu, dla każdej badanej sekcji, uzyskuje się dwa obrazy, jedno w jasnym polu, a drugie w polu UV.</li>
	<li>Otwórz dwa obrazy o tym samym ROI (jeden w jasnym polu, a drugi w polu UV) na obrazie J i za pomocą wtyczki MosaicJ wyrównaj krawędzie dwóch obrazów i zapisz wyrównany i połączony obraz zgodnie z numerem studni, z którego pochodzi.</li>
	<li>Zapisz zdjęcie w osobnym folderze z numerem konkretnego zwierzęcia. Połącz obrazy, aby zidentyfikować i zlokalizować blaszki w sekcji tkanki i uzyskać pełny widok całej sekcji w dwóch różnych polach (jasnym i UV).</li>
	<li>Po zakończeniu procesu przesiewowego badane skrawki należy przechowywać w temperaturze -20 °C na 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej krioprotektant do czasu przeprowadzenia barwienia immunologicznego lub dalszego przetwarzania.</li>
</ol>
6. Wstępne osadzanie immunobarwienia dla IBA1
Uwaga: Przeprowadź barwienie immunologiczne dla IBA1 na wybranych swobodnie pływających sekcjach, umieszczając płytkę na wolno poruszającym się wahaczu przy RT.
<ol>
	<li>Dokładnie umyj skrawki 3 razy około 1 ml PBS, każde mycie trwa 10 minut.</li>
	<li>Ugasić endogenne peroksydazy 0,3% nadtlenkiem wodoru w roztworze PBS przez 10 min. Ten krok zapobiega niespecyficznej aktywności peroksydazy, co jest ważne, aby uniknąć barwienia tła.</li>
	<li>Umyj chusteczkę w PBS 3 razy po 10 minut każde.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 0,1% borowodorku sodu w roztworze PBS przez 30 minut. Ten krok jest ważny w celu zredukowania wszelkich pozostałych aldehydów z etapu utrwalania i jest szczególnie ważny, jeśli akroleina jest używana do utrwalania tkanek.</li>
	<li>Umyj chusteczkę w PBS 3 razy przez 10 minut za każdym razem i upewnij się, że usunąłeś wszystkie bąbelki.</li>
	<li>Zablokuj sekcje na 1 godzinę. Różne przeciwciała mogą wymagać różnych czasów blokowania i roztworów. Dla IBA1 należy przygotować bufor blokujący zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej, 3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,01% Triton X-100 w 50 mM soli fizjologicznej buforowanej Trisem (TBS; pH 7,4). 
	Uwaga: Etap blokowania ma na celu zapobieżenie nieswoistemu wiązaniu przeciwciała pierwszorzędowego. Niskie stężenie Triton X-100 pozwala na lekką przepuszczalność membran w celu lepszego barwienia i jest wystarczająco niskie, aby zachować większość cech ultrastrukturalnych tkanki pod EM.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący z tkanki i inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (króliczy anty-IBA1, rozcieńczony [1:1,000] w buforze blokującym) w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Prać w TBS 3 razy przez 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-królikowe sprzężone z biotyną) [1:200] w 0,05 M TBS przez 90 min.</li>
	<li>Prać w TBS 5 razy przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Inkubować w roztworze kompleksu Awidyna-Biotyna (Avidin [1:100], Biotyna [1:100]) w roztworze TBS przez 1 godzinę.</li>
	<li>Prać w TBS 5 razy przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Ujawnić barwienie IBA1 0,05% diaminobenzydyną (DAB) i 0,015% nadtlenkiem wodoru w TBS przez 8 min. 
	Uwaga: Czas opracowania DAB może się różnić w zależności od protokołu i powinien być określony poprzez szybkie zbadanie poplamionych skrawków pod mikroskopem świetlnym. 
	Uwaga: W przypadku IBA1 powinno być w stanie wyraźnie zobrazować ciała komórkowe i procesy mikrogleju barwionego IBA1 przy 20-krotnym wzroście (patrz rysunek 2 dla reprezentatywnego przykładu). Zachowaj ostrożność podczas korzystania z DAB, ponieważ jest to znany czynnik rakotwórczy.</li>
	<li>Unikaj nadmiernego rozwoju, uważnie monitorując sekcje (jak opisano powyżej) na tym etapie. Zatrzymać reakcję, myjąc sekcje w schłodzonym PB 5 razy przez 5 minut za każdym razem.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie dla mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Przygotować 1% roztwór tetratlenku osmu w PBS w szklanej fiolce. Tetroksynek osmu jest światłoczuły; Przykryj szklaną fiolkę folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem. 
	Zachowaj ostrożność przy używaniu tetratlenku osmu, ponieważ jest to bardzo niebezpieczna substancja chemiczna. Wykonaj te i następne kroki wewnątrz dygestorium.</li>
	<li>Usuń PBS z sekcji i rozprowadź je płasko za pomocą cienkiego pędzla. Wykonuj ten krok pojedynczo, aby sekcje nie wysychały. Pamiętaj, aby spłaszczyć sekcje bezpośrednio przed dodaniem tetratlenku osmu, ponieważ wszelkie fałdy w sekcjach staną się trwałe, a próba spłaszczenia tkanki po utrwaleniu osmu spowoduje tylko złamanie sekcji.</li>
	<li>Zanurz sekcje w tetratlenku osmu na 30 minut w temperaturze pokojowej, dodając po jednej kropli tetratlenku osmu za pomocą pipety transferowej, aby zapobiec składaniu się sekcji. Przykryj studnię folią aluminiową, aby chronić sekcje przed światłem. 
	Uwaga: Ten krok naprawia lipidy w sekcjach. Tkanka będzie wyglądać na bardzo ciemną po utrwaleniu osmu.</li>
	<li>Gdy skrawki są w tetratlenku osmu, przygotuj żywicę z tworzywa sztucznego w jednorazowej zlewce, mieszając 20 g składnika A, 20 g składnika B, 0,6 g składnika C i 0,4 g składnika D. Połącz składniki razem w powyższej kolejności i dobrze je wymieszaj za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aż do uzyskania jednolitego koloru.</li>
	<li>Przenieś przygotowaną mieszaninę do aluminiowych naczyń wagowych. Otrzymają one skrawki tkanek po ich odwodnieniu.</li>
	<li>Odwodnić sekcje w rosnących stężeniach etanolu przez 2 minuty w następującej kolejności: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%.</li>
	<li>Aby usunąć resztki etanolu, zanurz sekcje w tlenku propylenu 3 razy na 2 minuty za każdym razem. Wyjąć odwodnione skrawki z 24-dołkowej płytki hodowlanej do szklanych fiolek o pojemności 20 ml. Zawsze używaj szklanych fiolek podczas pracy z tlenkiem propylenu, ponieważ rozpuszcza on plastik i zachowaj ostrożność, ponieważ jest to niebezpieczne.</li>
	<li>Za pomocą wygiętej szklanej końcówki pipety lub cienkiego pędzla przenieś skrawki z roztworu tlenku propylenu do żywicy i pozostaw O/N do infiltracji w temperaturze pokojowej. Uważaj, aby nie rozcieńczyć żywicy tlenkiem propylenu.</li>
	<li>Osadzać przekrój z żywicą na arkuszach folii z poli-chloro-tri-fluoro-etylenu (PCTFE):
	<ol>
		<li>Umieścić aluminiowe naczynia wagowe zawierające próbki w piecu o temperaturze 50 - 60 °C na 10 - 15 minut przed zatopieniem sekcji na arkuszach folii PCTFE.</li>
		<li>Podczas osadzania sekcji pracuj z jedną aluminiową szalką wagową na raz. Za pomocą cienkiego pędzla namaluj cienką warstwę żywicy na jednym arkuszu folii PCTFE.</li>
		<li>Przenoś po jednym fragmencie tkanki z aluminiowego naczynia wagowego na arkusz folii PCTFE. Usuń nadmiar żywicy z okolic tkanki, uważając, aby jej nie naruszyć.</li>
		<li>Po przeniesieniu wszystkich sekcji z jednego naczynia wagowego na arkusz folii PCTFE, umieść drugi arkusz PCTFE na pierwszym, tworząc warstwę tkanki i żywicy pomiędzy 2 arkuszami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeryzować żywicę w inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 55 - 60 °C.</li>
	<li>Materiał jest teraz gotowy do ultracienkiego przekroju i badania ultrastrukturalnego, specjalistycznych technik, które są często wykonywane przez główne zakłady EM. Próbki należy bezpiecznie przechowywać między arkuszami folii PCTFE w temperaturze pokojowej bez degradacji ultrastrukturalnej. 
	Uwaga: Kolejne etapy badania ultracienkim przekrojem i transmisyjną mikroskopią elektronową są wyjaśnione w osobnym protokole13.</li>
</ol>

<ol><li>Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).</li>
<li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li>
<li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+attack%3A+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li>
<li>Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04%2C+a+systemically+administered+Congo+red+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li>
<li>Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peephole+into+the+brain%3A+Neuropathological+features+of+Alzheimer%27s+disease+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Front Psychiatry. 3, 26(2012).</li>
<li>Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Cx3cr1+knockout+prevents+neuron+loss+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).</li>
<li>Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+amyloid+deposition+in+the+brains+of+transgenic+mice+coexpressing+mutant+presenilin+1+and+amyloid+precursor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins.</a> Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).</li>
<li>Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+neuritic+plaques+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li>
<li>Bussière, T., Bard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+Thioflavin-S-positive+amyloid+plaques+in+transgenic+Alzheimer+mice+and+effect+of+passive+Abeta+immunotherapy+on+their+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance.</a> Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).</li>
<li>Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+staining+of+amyloid+and+pre-amyloid+peptides+and+proteins+in+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue.</a> Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).</li>
<li>Afkhami, A., Moosavi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorptive+removal+of+Congo+red%2C+a+carcinogenic+textile+dye%2C+from+aqueous+solutions+by+maghemite+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mater%22%5BJournal%5D)">Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles.</a> J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Riad, M., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+brain+tissue+for+immunoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Konsman, J. -P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKonsman%2C+J-P+%22Psychoneuroendocrinology%22">Psychoneuroendocrinology</a>. 28 (6), Academic Press. New York. (2003).</li>
<li>Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+priming+and+enhanced+reactivity+to+secondary+insult+in+aging%2C+and+traumatic+CNS+injury%2C+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease.</a> Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in the healthy brain.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li>
<li>Šišková, Z., Tremblay, M. è <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+synapse%3A+Interactions+in+health+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration.</a> Neural Plast. 2013, 425845(2013).</li>
<li>DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+correlates+of+cognition+in+dementia%3A+quantification+and+assessment+of+synapse+change%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change.</a> Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).</li>
<li>Terry, R. D., Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+cognitive+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%3A+Synapse+loss+is+the+major+correlate+of+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment.</a> Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten wyjaśnia korelacyjne podejście do celowania w gęste blaszki rdzeniowe Aβ za pomocą EM. Wstrzyknięcie Methoxy-X04 in vivo umożliwia szybką selekcję wycinków mózgu, które zawierają blaszki Aβ w określonych regionach i warstwach zainteresowania, na przykład hipokampie CA1, warstwach promieniowych i lacunosum-moleculare. W niniejszym przykładzie wstępne badania przesiewowe metoksy-X04 połączono ze wstępnym zatopieniem barwienia immunologicznego dla IBA1 w celu zbadania, w jaki sposób różne fenotypy mikr...

Tworzenie się blaszek amyloidowych Aβ jest główną cechą neuropatologiczną choroby Alzheimera (AD). Jednak coraz więcej dowodów wskazuje na ważną rolę układu odpornościowego w postępie choroby1,2. W szczególności nowe dane z badań przedklinicznych i klinicznych ustaliły, że dysfunkcja immunologiczna jest głównym czynnikiem napędzającym i przyczyniającym się do patologii choroby Alzheimera. Dzięki tym odkryciom centralne i obwodowe komórki odpornościowe stały się obiecującymi celami terapeutycznymi dla AD3. Poniższy protokół łączy mikroskopię świetlną i elektronową (EM) w celu uzyskania nowych informacji na temat związku między osadzaniem się blaszki Aβ a zmianami fenotypowymi mikrogleju w chorobie Alzheimera. Protokół ten umożliwia znakowanie blaszek Aβ w mysich modelach AD przy użyciu iniekcji in vivo barwnika fluorescencyjnego methoxy-X04. Methoxy-X04 to pochodna czerwieni kongijskiej, która może łatwo przekroczyć barierę krew-mózg, aby dostać się do miąższu mózgu i wiązać β-plisowane arkusze o wysokim powinowactwie. Ponieważ barwnik jest fluorescencyjny, może być stosowany do wykrywania in vivo osadzania się płytki Aβ za pomocą mikroskopii dwufotonowej4. Po związaniu z Aβ metoksy-X04 nie dysocjuje ani nie redystrybuuje się z dala od blaszek miażdżycowych i zachowuje swoją fluorescencję w czasie. Na ogół podaje się go obwodowo, aby umożliwić nieinwazyjne obrazowanie dynamiki mózgu5. Fluorescencja utrzymuje się również po utrwaleniu aldehydu, co pozwala na korelacyjne analizy pośmiertne, w tym badanie śmierci neuronów w pobliżu blaszek Aβ6.
Ten protokół wykorzystuje właściwości metoksy-X04 do selekcji sekcji mózgu myszy APPSWE/PS1A246E (APP-PS1; koekspresja podwójnej mutacji w genie APP Lys670Asn/Met671Leu, oraz ludzki wariant preseniliny PS1-A264E)7, które wykazują blaszki Aβ w określonych regionach zainteresowania (hipokamp CA1, warstwy promieniste i lacunosum-moleculare) przed wstępnym wprowadzeniem barwienia immunologicznego przeciwko markerowi mikrogleju zjonizowanemu wiązaniu wapnia cząsteczka adaptera 1 (IBA1) do wizualizacji ciał i procesów komórek mikrogleju za pomocą EM. Myszom podaje się dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu metoksy-X04 na 24 godziny przed ustabilizowaniem mózgu poprzez perfuzję przezsercową. Koronalne skrawki mózgu uzyskuje się za pomocą wibratomu. Skrawki zawierające hipokamp CA1 są badane pod mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem obecności blaszek Aβ w warstwach promieniowych i lacunosum-moleculare. Barwienie immunologiczne w kierunku IBA1, tetratlenek osmu po utrwaleniu i zatopienie w żywicy z tworzywa sztucznego są następnie wykonywane na wybranych odcinkach mózgu. Po zakończeniu tego protokołu skrawki mogą zostać zarchiwizowane bez dalszej degradacji ultrastrukturalnej, gotowe do ultracienkiego przekroju i badania ultrastrukturalnego. Co ważne, blaszki są nadal fluorescencyjne po barwieniu immunologicznym różnymi przeciwciałami, na przykład IBA1, jak w niniejszym protokole. Stają się ciemniejsze niż otaczający je neuropil po utrwaleniu tetratlenku osmu, niezależnie od barwienia metoksy-X04, co pomaga dokładnie zidentyfikować obszary zainteresowania, zwykle do kilku milimetrów kwadratowych, które mają być zbadane za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.
To podejście korelacyjne oferuje skuteczny sposób identyfikacji konkretnych sekcji mózgu do zbadania na poziomie ultrastrukturalnym. Jest to szczególnie pomocne podczas badania wczesnej patologii choroby Alzheimera, w określonych regionach lub warstwach mózgu, które mogą zawierać tylko kilka blaszek Aβ, obecnych tylko w niewielkiej części odcinków tkanki. Szczególnie w tych czasach nieefektywne byłoby stosowanie barwienia immunologicznego dla Aβ (i podwójnego znakowania dla innych markerów komórkowych, takich jak IBA1) na kilku odcinkach mózgu tylko po to, aby uzyskać niewielką frakcję zawierającą blaszki Aβ we właściwym miejscu. Ponadto wstrzyknięcie żywym myszom metoksy-X04 przed uśmierceniem i przetwarzaniem tkanek nie zagraża zachowaniu ultrastrukturalnemu. Alternatywne metody, takie jak barwienie pośmiertne czerwienią Kongo, tioflawiną S, tioflawiną T lub metoksy-X04 na utrwalonych skrawkach tkanek, wymagają barwienia różnicowania w etanolu,8-11, co powoduje stres osmotyczny i zaburza ultrastrukturę. Czerwień kongijska jest również znanym czynnikiem rakotwórczymdla ludzi 12.

<table><tbody><tr><td>Methoxy-X04</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4920</td><td>10 mg substrat w tabletce</td></tr><tr><td>Glikol propylenowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W294004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Uwaga: toksyczny</td></tr><tr><td>Chlorek sodu NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Jednowodny fosforan sodu jednowodny</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Tris Chlorowodorek</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP153500</td><td></td></tr><tr><td>Akroleina</td><td>Sigma</td><td>110221</td><td>Uwaga: Toksyczna</td></tr><tr><td>paraformaldehyd Granulowana</td><td>mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19210</td><td>Uwaga: Toksyczna</td></tr><tr><td>bibuła filtracyjna</td><td>Fisher</td><td>09-790-14F</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna z rurką</td><td>ColeParmer</td><td>cp.78023-00</td><td></td></tr><tr><td>Excel Zestaw do pobierania krwi Winged Igły 25&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>367341</td><td></td></tr><tr><td>Ekstradrobne kleszcze</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td>Kształt końcówki: zakrzywione</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>Kształt końcówki: prosty</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>FST</td><td>13003-10</td><td>Kształt końcówki: zakrzywione</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>FST</td><td>14004-16</td><td>Kształt końcówki: proste</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji</td><td>Sklep chirurgiczny ROBOZ</td><td>5818</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>74515-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom z ostrzem wibracyjnym Leica VT1000 S</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>14047235612</tr><tr><td>Ostrza wibratomu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71990</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP230-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td> <td>J.T.BAKER</td><td>kat.: 2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma</td><td>480886</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001H24</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Anty IBA1, Królik&nbsp;</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111066046</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (standardowy)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905-50TAB</td><td>Uwaga: toksyczny</td></tr><tr><td>tetratlenek osmu, 4% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19150</td><td>Uwaga: toksyczny</td></tr><tr><td>Durcupan&trade; Jednoskładnikowa żywica ACM A</td><td>Sigma</td><td>44611</td><td>Uwaga: Toksyczny</td></tr><tr><td>Durcupan&trade; Jednoskładnikowy utwardzacz ACM B</td><td>Sigma</td><td>44612</td><td>Uwaga: Toksyczny</td></tr><tr><td>Durcupan i handel; Jednoskładnikowy plastyfikator ACM C</td><td>Sigma</td><td>44613</td><td>Uwaga: Toksyczny</td></tr><tr><td>Durcupan i handel; Jednoskładnikowy akcelerator ACM D</td><td>Sigma</td><td>44614</td><td>Uwaga: Toksyczny</td></tr><tr><td>etanol</td><td>LesAlcoolsdeComerce</td><td>151-01-15N</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>Sigma</td><td>110205</td><td>Uwaga:</td></tr><tr><td>Aluminiowe naczynia wagowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>ACLAR&reg; &ndash; Folie fluoropolimerowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>50425</td><td></td></tr><tr><td>Piec/inkubator</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Szczegółowy protokół jest tutaj dostępny do identyfikacji blaszek amyloidowych Aβ w sekcjach mózgu z mysich modeli choroby Alzheimera przed wstępnym wprowadzeniem barwienia immunologicznego (szczególnie dla zjonizowanej cząsteczki adaptera wiążącego wapń 1 (IBA1), białka wiążącego wapń wyrażonego przez mikroglej) i przetwarzania tkanek do mikroskopii elektronowej (EM). Methoxy-X04 to barwnik fluorescencyjny, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Wstrzyknięcie zwierzętom metoksy-X04 przed uśmierceniem i utrwaleniem mózgu pozwala na wstępne badanie przesiewowe i selekcję skrawków mózgu zawierających płytkę do dalszego przetwarzania przy użyciu czasochłonnych manipulacji. Jest to szczególnie pomocne podczas badania wczesnej patologii choroby Alzheimera w określonych obszarach lub warstwach mózgu, które mogą zawierać bardzo mało blaszek, obecnych tylko w niewielkiej części odcinków. Pośmiertne przetwarzanie skrawków tkanek za pomocą czerwieni Kongo, tioflawiny S i tioflawiny T (lub nawet metoksy-X04) może oznaczać arkusze plisowane β, ale wymaga intensywnego oczyszczania etanolem w celu usunięcia nadmiaru barwnika, a procedury te są niezgodne z konserwacją ultrastrukturalną. Nieefektywne byłoby również znakowanie Aβ (i innych markerów komórkowych, takich jak IBA1) na wszystkich odcinkach mózgu z regionów będących przedmiotem zainteresowania, tylko po to, aby uzyskać niewielką frakcję zawierającą blaszki Aβ we właściwym miejscu. Co ważne, blaszki Aβ są nadal widoczne po przetworzeniu tkanki pod kątem EM, co pozwala na precyzyjną identyfikację obszarów (zwykle z dokładnością do kilku milimetrów kwadratowych) do zbadania za pomocą mikroskopu elektronowego.

W tej sekcji przedstawiono wyniki, jakie można uzyskać w różnych krytycznych etapach protokołu. W szczególności wyniki ukazują przykłady przekrojów mózgu zawierających blaszki barwione methoxy-X04 w konkretnych obszarach i warstwach zainteresowania: w polu CA1 hipokampa, stratum radiatum oraz stratum lacunosum-moleculare. Blaszki oraz organizacja regionalna i warstwowa hipokampa są następnie wizualizowane przy użyciu kombinacji filtrów UV i światła białego (Rysunek 1). Wy...

Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji blaszek amyloidowych Aβ w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą metoksy-X04, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Umożliwia wstępne badanie przesiewowe skrawków tkanek zawierających płytkę przed barwieniem immunologicznym i przetwarzaniem do mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja blaszek beta-amyloidu w przekrojach mózgu modeli mysich choroby Alzheimera przed immunostainowaniem przed zatopieniem i przetwarzaniem tkanki do mikroskopii elektronowej. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroimmunologii, takie jak oddziaływanie komórek mikrogleju z synapsami w pobliżu złogów beta-amyloidu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wstępnej selekcji przekrojów tkanki mózgowej zawierających złogi beta-amyloidu w interesujących badacza regionach i warstwach.Choć metodę tę można zastosować w badaniach nad chorobą Alzheimera, można ją również wykorzystać w przypadku innych chorób lub tkanek, w których występuje amyloidoza. Najpierw należy przygotować roztwór związku methoxy X04 o stężeniu 5 mg/mL. Za pomocą mikrowagi odważ 5 mg methoxy X04.W dygestorium rozpuścić metoksy X04 w 100 µL DMSO i mieszać do uzyskania klarownego, zielonkawego roztworu. Następnie, przy ciągłym mieszaniu, dodać kolejno 450 µL glikolu propylenowego oraz 450 µL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Roztwór mieszać w temperaturze 4 °C przez noc.Następnego dnia powinna być widoczna żółto-zielona emulsja. Po wstrzyknięciu methoxy X04 w dawce 10 mg/kg masy ciała i uśmierceniu zwierzęcia w wyznaczonym punkcie czasowym zgodnie z zatwierdzonymi metodami, utrwalony paraformaldehydem mózg należy przemyć trzykrotnie schłodzonym PBS. Następnie, używając ostrej żyletki, należy usunąć opuszki węchowe i pociąć mózg koronalnie na dwa do trzech fragmentów o w przybliżeniu jednakowej wysokości, które można sekcjonować jednocześnie w celu przyspieszenia procedury.Przyklej fragmenty tkanki mózgowej do płytki przedmiotowej zamocowanej w kuwecie. Upewnij się, że gładka powierzchnia cięcia przylega ściśle do płytki przedmiotowej. Dolewaj roztwór PBS do kuwety, aż cała powierzchnia mózgu zostanie całkowicie zanurzona.Umieść tackę w wibrotomie i dostosuj jego ustawienia tak, aby uzyskać przekroje o grubości 50 µm. Rozpocznij cięcie, a w przypadku bezpośredniego przesiewania niezwłocznie przenieś przekroje do PBS za pomocą cienkiego pędzla. Alternatywnie przekroje można umieścić w szklanych fiolkach zawierających roztwór krioprotekcyjny w celu przechowywania w temperaturze -20 °C.Przy pomocy stereotaktycznego atlasu mózgu myszy należy wybrać przekroje mózgu zawierające obszar zainteresowania, a następnie umieścić każdy przekrój w krioprotektancie w dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej. Następnie, za pomocą jednorazowej pipety, należy nanieść kroplę PBS na szkiełko przedmiotowe, a potem umieścić na niej przekrój. Przekrój należy zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu zidentyfikowania obszarów zawierających blaszki a-beta znakowane methoxy X04.Bez przesuwania stolika mikroskopu, należy wykonać zdjęcia obszarów zainteresowania w jasnym polu oraz w trybie fluorescencji. Każde zdjęcie musi przedstawiać ten sam obszar w obu trybach, aby możliwe było powiązanie blaszki z obszarem strukturalnym przekroju tkanki. Zdjęcia należy zapisać i nazwać zgodnie z numerem zwierzęcia.Należy również zapisać numer studzienki w płytce oraz pole widzenia wykonanych zdjęć. Po zakończeniu obrazowania umieść skrawek z powrotem w wyznaczonej studzience. Następnie zbadaj kolejny skrawek w sekwencji, stosując tę samą procedurę, aby zapobiec wysychaniu preparatów.Aby wyrównać obrazy, otwórz w programie ImageJ obrazy w polu jasnym i w polu UV dla tego samego ROI. Następnie użyj wtyczki MosaicJ, aby wyrównać krawędzie obu obrazów. Zapisz wyrównany i połączony obraz zgodnie z numerem studzienki w folderze o numerze konkretnego zwierzęcia.Połącz obrazy z różnych przekrojów tego samego zwierzęcia, aby zidentyfikować i zlokalizować blaszki w obszarze zainteresowania. Po zakończeniu procesu przesiewowego przechowuj badane przekroje w temperaturze 20 °C w 24-dołkowej płytce hodowlanej zawierającej krioprotektant do czasu przeprowadzenia immunostainingu lub dalszej obróbki. W pierwszej kolejności przygotuj w szklanej fiolce 1% roztwór czterotlenku osmu w buforze fosforanowym.Ponieważ czterotlenek osmu jest światłoczuły, należy owinąć szklaną fiolkę folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem. Po przemyciu w buforze fosforanowym należy usunąć bufor z przekrojów i rozprowadzić je płasko za pomocą cienkiego pędzla. Należy upewnić się, że przekroje są całkowicie płaskie bezpośrednio przed dodaniem czterotlenku osmu, ponieważ wszelkie zagięcia tkanek staną się trwałe, a próba ich wygładzenia po utrwaleniu osmem doprowadzi jedynie do przerwania ciągłości przekrojów.Za pomocą pipety transferowej dodawaj czetrotlenek osmu do przekrojów, kropla po kropli, aż zostaną one całkowicie zanurzone. Przykryj dołek folią aluminiową, aby chronić przekroje przed światłem, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W czasie inkubacji przygotuj żywicę plastyczną w jednorazowym zlewce.Połącz składniki w podanej kolejności i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety serologicznej 10 ml, aż do uzyskania jednolitego koloru. Przenieś przygotowaną mieszaninę do aluminiowych łódeczek wagowych. Do łódeczek tych zostaną przeniesione przekroje tkanek po ich odwodnieniu.Po upływie czasu inkubacji odwodnij skrawki w roztworach etanolu o zwiększającym się stężeniu, po dwie minuty w każdym z nich. Przenieś odwodnione skrawki z 24-dołkowej płytki hodowlanej do 20-mililitrowych fiolek szklanych. Następnie zanurz skrawki w tlenku propylenu trzykrotnie po dwie minuty za każdym razem, aby usunąć pozostałości etanolu.Następnie, używając zagiętej końcówki pipety szklanej lub cienkiego pędzla, przenieś skrawki z roztworu tlenku propylenu do żywicy plastycznej i pozostaw je na noc w temperaturze pokojowej w celu infiltracji. Po infiltracji umieść aluminiowe naczynia wagowe zawierające preparaty w piecu w temperaturze 50 do 60 °C na 10 do 15 minut. Aby zatopić skrawki na arkuszach folii z polichlorotryfluoroetylenu, najpierw użyj cienkiego pędzla, aby nałożyć cienką warstwę żywicy na skrawek.Następnie przenosi się po jednej sekcji tkanki z aluminiowej łódeczki wagowej na arkusz folii PCTFE. Należy usunąć nadmiar żywicy z okolic tkanki, uważając, aby jej nie przesunąć. Po przeniesieniu wszystkich sekcji z jednej łódeczki wagowej na arkusz folii PCTFE, na pierwszy arkusz nakłada się drugi arkusz PCTFE, tworząc kanapkę z tkanką i żywicą pomiędzy obiema foliami.Polimeryzować żywicę w inkubatorze przez trzy dni w temperaturze od 55 do 60 °C. Tkanka jest następnie gotowa do cięcia na ultra-cienkie skrawki i badania ultrastrukturalnego. Poniższe obrazy przedstawiają obrazowanie podwójne jednego skrawka hipokampa z wykorzystaniem trybu światła przechodzącego oraz fluorescencji.Obszary i warstwy zainteresowania są wizualizowane w świetle przechodzącym. Blaszki amyloidu beta są skutecznie lokalizowane przy użyciu filtra UV w zakresie od 340 do 380 nanometrów. Ten obraz przedstawia przekrój hipokampa przed immunobarwieniem IBA1 przed zatopieniem w żywicy.Widoczna blaszka jest obrysowana linią przerywaną. Obraz ten przedstawia ten sam przekrój po immunostainingu przed zatopieniem w celu wykrycia IBA1 oraz procesowaniu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Należy zauważyć, że blaszka otoczona linią przerywaną pozostaje widoczna po procesowaniu tkanki do mikroskopii elektronowej.Po opanowaniu techniki protokół ten można zrealizować w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każdy krok musi być przeprowadzony rygorystycznie, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo kontaminacji oraz innych degradacji strukturalnych, które wpłynęłyby na jakość próbek. Należy pamiętać, że praca z osmem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek.Należy pamiętać o utylizacji po zakończeniu eksperymentu, zgodnie z wytycznymi obowiązującymi w danej jednostce.

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jedną z patologicznych cech AD jest tworzenie się blaszek neurytowych wykazujących obecność białka amyloid β. W niniejszym protokole opisujemy dwie metody wykrywania blaszek neurytowych u myszy w transgenicznym modelu AD: detekcję immunohistochemiczną z wykorzystaniem metody ABC i DAB oraz detekcję fluorescencyjną z zastosowaniem barwienia tioflawiną S.

Wykrywanie blaszek neurytycznych w modelu mysim choroby Alzheimera

Źródło: Bisht, K., et. al. Korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa w celu zbadania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi. J. vis. exp. (2016) Ten film przedstawia wizualizację i mapowanie płytek amyloidowych znakowanych metoksy-X04 w mózgu myszy z chorobą Alzheimera sekcje wykorzystujące mikroskopię fluorescencyjną i jasne pole, umożliwiające precyzyjną korelację blaszek ze strukturami anatomicznymi w celu badania patologii choroby Alzheimera.

Wizualizacja i mapowanie blaszek amyloidowych znakowanych metoksy-X04 w sekcji mózgu myszy z chorobą Alzheimera

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Prezentujemy tutaj protokół, jak przygotować pierwotne hodowle komórek glejowych, astrocytów i mikrogleju z kory mózgowej szczurów do obrazowania poklatkowego wewnątrzkomórkowego Ca2+ do badań nad patofizjologią stwardnienia zanikowego bocznego w modelu szczurzym hSOD1G93A.

Pierwotne kultury astrocytów szczurów i mikrogleju oraz ich zastosowanie w badaniu stwardnienia zanikowego bocznego

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj metodę korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi w modelach mysich choroby Alzheimera. Technika umożliwia wstępną selekcję tkanek przed immunobarwieniem.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Przeglądaj więcej filmów