Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej techniki cytometrii spektralnej jest rozróżnienie różnych fluorochromów na podstawie całego ich widma emisyjnego. Co więcej, protokół ten umożliwia implementację autofluorescencji jako niezależnego parametru, pozwalającego na właściwą analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii i rozwoju biologii komórek macierzystych, takie jak identyfikacja rzadkich populacji komórek.

Główną zaletą tej techniki jest jej wyjątkowa zdolność do jednoczesnej analizy dużej liczby parametrów i zarządzania autofluorescencją tkanek stałych. Chociaż metoda ta służy do przygotowania zawiesiny jednokomórkowej pochodzącej z jelita i serca, może być również stosowana do innych narządów, takich jak płuca, szkielet, mięśnie, wątroba, tłuszcz i nerki. Na początek odizoluj i umyj jelito cienkie od dorosłej myszy.

Następnie połóż chusteczkę na ręczniku papierowym i za pomocą ostrych nożyczek ostrożnie usuń plastry Peyera. Otwórz jelito, przecinając je wzdłuż i dzieląc na jednocentymetrowe kawałki. Następnie przenieś tkankę do zlewki wypełnionej 30 mililitrami HBSS uzupełnionym dziesięcioprocentowym FCS i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle mieszając przez 30 minut.

Po zakończeniu inkubacji przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej plastikowej rurki i energicznie wiruj przez pięć minut. Następnie inkubuj zawiesinę na lodzie przez dziesięć minut, aby duże, niezdysocjowane fragmenty mogły się osadzać. Następnie przenieś supernatant do nowej probówki i obracaj komórki z prędkością 120 razy G przez siedem minut.

Po granulowaniu zawieszamy komórki w dziesięciu mililitrach jednego procenta FCS w HBSS i liczymy je za pomocą komory Neubauera. Przed barwieniem komórek przenieś od jednej dziesiątki do szóstej komórki jelitowej do pięciomililitrowej probówki, aby przygotować kontrolę ujemną. Aby przygotować próbkę, dodaj raz dziesięć do jednej szóstej komórek jelitowych, a następnie dwa mililitry HBSS z jednym procentem FCS do nowej pięciomililitrowej probówki i odwiruj zawiesinę w temperaturze 120 razy G, w czterech stopniach Celsjusza, przez pięć minut.

Po odrzuceniu supernatantu zawieszamy komórki w 50 mikrolitrach roztworu przeciwciał. Owiń probówkę folią aluminiową i inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji dodać do próbki dwa mililitry jednego procenta FCS w HBSS i odwirować ją w temperaturze 120 razy G, cztery stopnie Celsjusza, przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach po 0,5 mikrograma na mililitr roztworu jodku propidyny. Po odcięciu głowy embrionowi myszy namocz jego ciało na szalce Petriego, wyłoż wcześniej zwilżonym ręcznikiem papierowym i wypełnij 50 mililitrami jednego procenta FCS w HBSS. Pod mikroskopem stereoskopowym wykonaj nacięcie po prawej stronie klatki piersiowej zarodka i ostrożnie otwórz klatkę piersiową, unikając uszkodzenia serca.

Chwyć wielkie naczynia krwionośne i wyciągnij serce połączone z płucami i grasicą. Przenieś narządy na 35-mililitrową szalkę Petriego wypełnioną dwoma mililitrami jednego procenta FCS w HBSS. Następnie odizoluj serce od otaczających narządów i tkanki łącznej.

Po umyciu serca namocz je w jednym mililitrze podgrzanego roztworu enzymatycznego, a następnie za pomocą cienkich kleszczy i skalpela zmielić narząd na jednomilimetrowe kawałki pod mikroskopem stereoskopowym. Dodaj dodatkowy mililitr wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego i przenieś rozdrobnioną tkankę do zakrytej pięciomililitrowej probówki. Inkubować próbkę w pozycji poziomej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po zakończeniu inkubacji należy zhomogenizować tkankę poprzez wielokrotne pipetowanie zawiesiny za pomocą pipety P1000. Następnie należy odłożyć próbki, ustawione pionowo, na bok, aż fragmenty niestrawionych tkanek osiądą. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj dwa mililitry dziesięcioprocentowego FCS do HBSS i utrzymuj izolowane komórki na lodzie. Następnie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego do pięciomililitrowej probówki zawierającej niestrawiony osad tkankowy i kontynuuj trawienie tkanki, jak pokazano wcześniej, aż nie zaobserwuje się żadnej pozostałej tkanki. Otrzymaną zawiesinę komórkową odwirować w temperaturze 120 razy G przez dziesięć minut.

Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze jednego procenta FCS w HBSS, wolnym od kationów wapnia i magnezu. Aby zabarwić komórki serca, przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do studzienek z okrągłym dnem 96-dołkowej. Odwirować płytkę o temperaturze 480 razy G przez jedną minutę i odrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawieś komórki serca w 100 mikrolitrach roztworu przeciwciała. Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji przemyć komórki serca 200 mikrolitrami jednego procenta FCS w HBSS bez wapnia i magnezu i odwirować zawiesinę w temperaturze 480 razy G przez jedną minutę.

Następnie ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach jednego procenta FCS w HBSS bez jonów wapnia i magnezu i przenieś zawiesinę do pięciomililitrowej rurki wstępnie wypełnionej 200 mikrolitrami jednego procenta FCS w HBSS bez wapnia i magnezu. Na koniec dodaj 400 mikrolitrów jednego procenta FCS w HBSS bez kationów wapnia i magnezu, zawierających 0,5 mikrograma na mililitr jodku propidyny i przefiltruj zawiesinę komórkową przez 70-mikronylonową siatkę. Aby zobrazować komórki, załaduj barwioną próbkę do cytometrii przepływowej i kliknij przycisk podglądu, a następnie zarejestruj do dwóch razy od dziesięciu do szóstych zdarzeń w próbce, klikając przycisk pobierz.

W zakładce analizy otwórz okno palety kolorów i zarejestruj wszystkie badane parametry, dodając fluorochrom wraz z odpowiadającym mu markerem. Upewnij się, że uwzględniłeś parametry autofluorescencji i żywotności. W oknie kontrolnym, na liście probówek, przeanalizuj pierwszą pojedynczą barwioną próbkę zawierającą kulki kompensacyjne.

Następnie w arkuszu roboczym kliknij narzędzie do projektowania wielokątów i zbierz populację ściegów na wykresie FSC SSC. Kliknij dwukrotnie bramę, aby utworzyć działkę potomną bramkowanych koralików. A następnie bramka dodatnie i ujemne koraliki osobno.

Zweryfikuj wybraną populację potomną poprzez kolejne bramkowanie i eliminację wartości odstających w każdej frakcji dodatniej i ujemnej. Następnie prześlij bramki ujemne i dodatnie w oknie odłączania. Następnie wybierz niebarwioną próbkę komórek z listy probówek i zaprojektuj oddzielne bramki dla komórek autofluorescencyjnych i nieautofluorescencyjnych.

Po zdefiniowaniu bramek ujemnych i dodatnich dla wszystkich parametrów, w tym autofluorescencji i żywotności, kliknij przycisk Oblicz. Następnie do analizowanych próbek należy zastosować odmieszanie. Aby przeanalizować dane, należy zabramkować komórki na wykresie SSC w porównaniu z FSC i wykluczyć martwe komórki barwione jodkiem propidyny.

Na koniec określ bramki dla wszystkich interesujących populacji. Przedstawiono wyniki analiz cytometrii przepływowej i cytometrii spektralnej komórek wyizolowanych z serca płodu i wybarwionych przeciwciałami anty-TER119, anty-CD45 i anty-Sca-1. Podzbiór komórek autofluorescencyjnych wykryto za pomocą dwóch konwencjonalnych cytometrów, podczas gdy w cytometrii spektralnej komórki te nie zostały zdefiniowane jako autofluorescencyjne i należały do populacji CD45 TER119 ujemnej.

Komórki zidentyfikowane za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej jako autofluorescencyjne, ale nie komórki CD31-dodatnie, zostały następnie przeanalizowane pod kątem ekspresji transkryptów specyficznych dla kardiomiocytów. Wysokie poziomy troponiny sercowej i miocytów przedsionkowych, takich jak transkrypty pociągów, stwierdzono w populacji komórek autofluorescencyjnych, co potwierdza, że duży podzbiór miocytów sercowych jest pomijany w konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około ośmiu godzin, jeśli jest odpowiednio uformowana.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wszystkie kroki powinny być wykonywane na lodzie i w odpowiednim czasie, aby zapewnić żywotność komórek. Po wykonaniu tej procedury można wstępnie przygotować białka wewnątrzkomórkowe i analizy dodatkowych markerów powierzchniowych w celu uzyskania odpowiedzi na pytania dotyczące określonych szlaków molekularnych. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią i biologią rozwojową lub biologią komórek macierzystych do badania i izolowania rzadkich populacji z różnych narządów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i barwić komórki z tkanek komórkowych oraz jak analizować ekspresję markerów powierzchniowych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej, która pokonuje ograniczenia wynikające z autofluorescencji komórek. Nie zapominaj, że praca z jodkiem propidyny może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej.