Name: Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj spektralną cytometrię przepływową do analizy zawiesin komórkowych z tkanek stałych, w tym jelita i serca myszy. Ta metoda umożliwia niezależne traktowanie autofluorescencji i identyfikację rzadkich populacji komórkowych w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy techniczny i teoretyczny wkład w cytometrię spektralną K. Futamury, który również krytycznie zrewidował manuskrypt. Mamy również dług wdzięczności wobec C. Ait-Mansoura, P.-H. Commere, A. Bandeirze i P. Pereirze za krytyczną lekturę manuskryptu oraz za niekończące się porady i wsparcie techniczne. Dziękujemy również P. Pereira za dar przeciwciał znakowanych anty Vγ7-APC i Vδ4-biotyną. Dziękujemy Centre d'Enseignements z Instytutu Pasteura za przyjęcie i wsparcie w logistyce filmowania. Prace te były wspierane przez Instytut Pasteura, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); Szwajcarska Narodowa Fundacja Nauki i Pasteur Bourse Roux (S.S.); Fundação para a Ciência e a Tecnologia - SFRH/BD/74218/2010 (M.V.); oraz Université Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR), projekt Twothyme, ANR i Program REVIVE (Inwestycja dla Przyszłości) (A.C.).

<ol><li>Futamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+full-spectral+flow+cytometry+with+multiple+spectrally-adjacent+fluorescent+proteins+and+fluorochromes+and+visualization+of+in+vivo+cellular+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement.</a> Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).</li>
<li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Cytometry+Has+Unique+Properties+Allowing+Multicolor+Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral Cytometry Has Unique Properties Allowing Multicolor Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues.</a> PLoS One. 11 (8), e0159961(2016).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+FACS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter FACS analysis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 5, Unit 5.8, (2002).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Grigoriadou, K., Boucontet, L., Pereira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-gamma+allele-specific+selection+of+V+gamma+1%2FV+delta+4+cells+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-gamma allele-specific selection of V gamma 1/V delta 4 cells in the intestinal epithelium.</a> J Immunol. 169 (7), 3736-3743 (2002).</li>
<li>Guy-Grand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+trafficking%2C+and+intraepithelial+fate+of+gut-tropic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Origin, trafficking, and intraepithelial fate of gut-tropic T cells.</a> J Exp Med. 210 (9), 1839-1854 (2013).</li>
<li>Lavoinne, A., Cauliez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCardiac+troponin+I+and+T%3A+specific+biomarkers+of+cardiomyocyte%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Interne%22%5BJournal%5D)">[Cardiac troponin I and T: specific biomarkers of cardiomyocyte].</a> Rev Med Interne. 25 (2), 115-123 (2004).</li>
<li>Staudt, D. W., Liu, J., Thorn, K. S., Stuurman, N., Liebling, M., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+imaging+of+cardiomyocyte+behavior+reveals+two+distinct+steps+in+ventricular+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">High-resolution imaging of cardiomyocyte behavior reveals two distinct steps in ventricular trabeculation.</a> Development. 141 (3), 585-593 (2014).</li>
<li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Keith, M. C., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22String+theory%22+of+c-kit%28pos%29+cardiac+cells%3A+a+new+paradigm+regarding+the+nature+of+these+cells+that+may+reconcile+apparently+discrepant+results%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">"String theory" of c-kit(pos) cardiac cells: a new paradigm regarding the nature of these cells that may reconcile apparently discrepant results.</a> Circ Res. 116 (7), 1216-1230 (2015).</li>
<li>Valente, M., Nascimento, D. S., Cumano, A., Pinto-do-Ó, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sca-1%2B+cardiac+progenitor+cells+and+heart-making%3A+a+critical+synopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Sca-1+ cardiac progenitor cells and heart-making: a critical synopsis.</a> Stem Cells Dev. 23 (19), 2263-2273 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Konwencjonalny FCM opiera się na detekcji fotonów emitowanych po wzbudzeniu sond fluorescencyjnych. Emisja fluorescencji jednego fluorochromu wykryta w detektorze przeznaczonym do pomiaru sygnału z innego fluorochromu indukuje fizyczne nakładanie się. To rozlanie się widm emisji musi zostać skorygowane za pomocą kompensacji.
Spektralny FCM i przetwarzanie danych przez algorytm dekonwolucji bez mieszania pozwala na łączenie fluorochromów o bliskich pikach emisji bez dodatkowej kompensacji, pod ...

W ciągu ostatnich kilku dekad cytometria przepływowa (FCM) stała się powszechnie dostępną metodą analityczną, niezbędną do badań fenotypowania komórek. Nastąpił znaczny wzrost dostępnych barwników fluorescencyjnych, w szczególności fluorochromów wzbudzanych laserem fioletowym (405 nm) (np. Brilliant Violet i nowe barwniki Q-dot). Jednak wzrost dostępnych barwników fluorescencyjnych zwiększa ryzyko nakładania się emisji i wymaga pracochłonnych matryc kompensacyjnych. FCM stał się szeroko stosowany do analizy zawiesin komórkowych z tkanek stałych, ale obecność komórek autofluorescencyjnych ogranicza dyskryminację specyficznie znakowanych populacji.
Podstawowe zasady spektralnego FCM są szczegółowo opisane w Futamura et al.1,2. Krótko mówiąc, zastosowany tutaj spektralny FCM (patrz tabela materiałów) jest wyposażony w lasery o długości fali 405, 488 i 638 nm. Widmowy FCM wychwytuje całą emitowaną fluorescencję jako widma w 32-kanałowym układzie liniowym PMT (32-kanałowym PMT) dla 500 nm do 800 nm i 2 niezależnych PMT dla 420 nm do 440 nm i 450 nm do 469 nm, które zastępują konwencjonalne filtry pasmowo-przepustowe. Plamki laserowe 488 i 405/638 nm są przestrzennie oddzielone, natomiast plamki laserowe 405 nm i 638 nm są współliniowe. Dla każdej pojedynczej cząstki spektralny FCM mierzy do 66 kanałów danych fluorescencyjnych wzbudzonych przez lasery 405 nm i 488 nm. Gdy komórki są wzbudzane przez laser 638 nm, spektralny FCM mierzy 58 kanałów danych fluorescencyjnych, ponieważ wkładana jest maska, aby zapobiec świeceniu lasera 638 nm do PMT. Spectral FCM analizuje uzyskane dane o pełnym spektrum za pomocą algorytmu opartego na metodzie ważonych najmniejszych kwadratów (WLSM), która umożliwia separację nakładających się widm fluorescencyjnych. Widma pochodzące z próbek barwionych pojedynczo i niebarwionych są uznawane za podstawowe widma referencyjne. Próbki barwione wielobarwnie są matematycznie dopasowane i niewymieszane, a widmo próbki z mieszanymi znacznikami fluorescencyjnymi jest rozkładane na zbiór widm składowych. Unmixing, w technologii spektralnej3,4, zastępuje kompensację, która usuwa sygnał ze wszystkich detektorów z wyjątkiem tego, który mierzy dany barwnik.
W tym badaniu połączyliśmy i przetestowaliśmy 19 fluorochromów w pojedynczej, 21-parametrowej analizie, która charakteryzowała główne podzbiory hematopoetyczne znalezione w śledzionie myszy. Dodatkowo wykazaliśmy, że cytometria spektralna może zarządzać sygnałem autofluorescencyjnym, poprawiając w ten sposób charakterystykę jelitowych limfocytów śródnabłonkowych i serca embrionalnego. Rzeczywiście, w tych tkankach zarządzanie autofluorescencją pozwoliło na przypisanie określonej fluorescencji komórkom, które zostałyby wyłączone z analizy w konwencjonalnym FCM.

<table><tbody><tr><td>Myszy</td><td>Janvier Labs</td><td>CD45.2</td><td>Źródło komórek</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterylizacja</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>14040-174</td><td>Kolekcja zarodków</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>Roztwory dysocjacyjne, mineralizujące i barwiące</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-)</td><td>GIBCO Life ThermoFisher</td><td>14175095</td><td>Roztwory dysocjacyjne, trawiące i barwiące</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>Roztwory dysocjacyjne, trawienne i barwiące</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td>Roztwór enzymatyczny</td></tr><tr><td>90 x 15 mm, plastikowa kultura tkankowa szalki Petriego.</td><td>TPP</td><td>T93100</td><td>Kolekcja zarodków i serc</td></tr><tr><td>35 x 15 mm, plastikowa hodowla tkankowa szalki Petriego.</td><td>TPP</td><td>T9340</td><td>Kolekcja serc</td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Narzędzia do preparowania</td></tr><tr><td>Kleszcze grube (kleszcze o wąskim wzorze, zakrzywione 12 cm)</td><td>Narzędzia do nauki o</td> nauce <td>11003-12</td><td>Narzędzia do preparowania</td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste (kleszcze Dumont nr 7)</td><td>Narzędzia do nauki o</td> nauce <td>11272-30</td><td>Narzędzia do preparowania</td></tr><tr><td>Skalpel&nbsp;</td><td>VWR</td><td>21909-668</td><td>Narzędzia preparacyjne</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Mikroskop preparacyjny</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Pobieranie próbek; Okkularny W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Źródło zimnej lampy</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 kompaktowe</td><td>Pobieranie próbek; Dwa włókna gęsiej szyi dostosowane</td></tr><tr><td>do rurek FACS</td><td>VWR</td><td>60819-310</td><td>Komory trawiące</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa (okrągłe dno)</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td>Komórki barwiące</td></tr><tr><td>Tkanina kotwiąca z siatki nylonowej sterylizowana, 50/50 mm sztuki.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>SEFAR NITEX</td><td>Filtracja komórkowa</td></tr><tr><td>UltrasComp eBeads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała znakowane fluorescencją</td><td>Biolegend</td><td>Numer katalogowy patrz tabela poniżej</td><td>Barwienie komórek</td></tr></tbody></table>

analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Cytometria przepływowa była używana przez ostatnie 40 lat do definiowania i analizowania fenotypu komórek limfoidalnych i innych komórek krwiotwórczych. Początkowo ograniczone do analizy kilku fluorochromów, obecnie istnieją dziesiątki różnych barwników fluorescencyjnych, a jednocześnie można łączyć do 14-18 różnych barwników. Jednak kilka ograniczeń nadal ogranicza możliwości analityczne. Ze względu na mnogość sond fluorescencyjnych, analiza danych staje się coraz bardziej złożona ze względu na zapotrzebowanie na duże, wieloparametryczne matryce kompensacyjne. Co więcej, dostępne stały się zmutowane modele myszy przenoszące białka fluorescencyjne w celu wykrywania i śledzenia określonych typów komórek w różnych tkankach, dlatego wymagana jest analiza (za pomocą cytometrii przepływowej) autofluorescencyjnych zawiesin komórkowych uzyskanych z narządów stałych. Spektralna cytometria przepływowa, która rozróżnia kształty widm emisyjnych w szerokim zakresie ciągłych długości fal, rozwiązuje niektóre z tych problemów. Dane są analizowane za pomocą algorytmu, który zastępuje matryce kompensacji i traktuje autofluorescencję jako niezależny parametr. W związku z tym spektralna cytometria przepływowa powinna być w stanie rozróżnić fluorochromy o podobnych pikach emisji i może zapewnić analizę wieloparametryczną bez wymagań dotyczących kompensacji.
Ten protokół opisuje analizę spektralnej cytometrii przepływowej, pozwalając na charakterystykę 21 parametrów (19 sond fluorescencyjnych) i zarządzanie sygnałem autofluorescencyjnym, zapewniając wysoką rozdzielczość w wykrywaniu mniejszych populacji. Przedstawione wyniki pokazują, że spektralna cytometria przepływowa ma zalety w analizie populacji komórek z tkanek trudnych do scharakteryzowania w konwencjonalnej cytometrii przepływowej, takich jak serce i jelito. Spektralna cytometria przepływowa demonstruje zatem wieloparametryczną zdolność analityczną wysokowydajnej konwencjonalnej cytometrii przepływowej bez konieczności kompensacji i umożliwia zarządzanie autofluorescencją.

21-parametrowy panel spektralnej FCM do analizy splenocytów
Rysunek 1 przedstawia wyniki uzyskane przy użyciu panelu 19 przeciwciał fluorescencyjnych zastosowanych do komórek śledziony, obejmującego różne przeciwciała rozpoznające subpopulacje komórek T, B, NK, dendrytycznych i mieloidalnych, podczas gdy CD45 znakuje wszystkie jądrowe komórki hematopoetyczne. Panel zawiera również barwnik żywotności (PI) oraz param...

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Ogólnym celem tej techniki cytometrii spektralnej jest rozróżnianie różnych fluorochromów przy użyciu ich pełnych widm emisji. Co więcej, niniejszy protokół umożliwia wykorzystanie autofluorescencji jako niezależnego parametru, co pozwala na prawidłową analizę komórek izolowanych z narządów litych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii oraz biologii komórek macierzystych, takie jak sposób identyfikacji rzadkich populacji komórek.Główną zaletą tej techniki jest jej unikalna zdolność do jednoczesnej analizy dużej liczby parametrów oraz do zarządzania autofluorescencją tkanek stałych. Chociaż metoda ta jest wykorzystywana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek pochodzących z jelita i serca, można ją również zastosować do innych organów, takich jak płuca, mięśnie szkieletowe, wątroba, tkanka tłuszczowa i nerki. W pierwszej kolejności należy wyizolować i wypłukać jelito cienkie dorosłej myszy.Następnie umieść tkankę na ręczniku papierowym i za pomocą ostrych nożyczek ostrożnie usuń kępki Peyera. Rozetnij jelito wzdłużnie i podziel je na jednocentymetrowe fragmenty. Następnie przenieś tkankę do zlewki wypełnionej 30 ml HBSS uzupełnionego o 10% FCS i inkubuj w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu przez 30 minut.Po zakończeniu inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i intensywnie wymieszać ją na wortexie przez pięć minut. Następnie inkubować zawiesinę w lodzie przez dziesięć minut, aby umożliwić sedymentację dużych, niedysocjowanych fragmentów. Po tym czasie przenieść nadsącz do nowej probówki i odwirować komórki z prędkością 120 ×g przez siedem minut.Po odwirowaniu osad komórek resuspendujemy w 10 ml 1% FCS w HBSS i przeliczamy je za pomocą komory Neubauera. Przed barwieniem komórek przenosimy 1 × 10⁶ komórek jelitowych do probówki o pojemności 5 ml w celu przygotowania kontroli negatywnej. Aby przygotować próbkę, do nowej probówki o pojemności 5 ml dodajemy 1 × 10⁶ komórek jelitowych, a następnie 2 ml HBSS z 1% FCS i wirujemy zawiesinę z prędkością 120 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.Po odlaniu supernatantu zawiesza się komórki w 50 µL roztworu przeciwciał. Probówkę należy owinąć folią aluminiową i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji do próbki dodaje się 2 mL 1% FCS w HBSS i odwirowuje ją z prędkością 120 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.Odlej supernatant i resuspendez osad w 200 µL roztworu jodku propidyny o stężeniu 0,5 µg/mL. Po zdekapitowaniu zarodka myszy, zanurz jego ciało w szalce Petriego wyłożonej wstępnie namoczonym ręcznikiem papierowym i wypełnionej 50 mL 1% FCS w HBSS. Pod stereomikroskopem wykonaj nacięcie po prawej stronie klatki piersiowej zarodka i ostrożnie otwórz klatkę piersiową, unikając uszkodzenia serca.Zaciśnij duże naczynia krwionośne i wyciągnij serce wraz z połączonymi z nim płucami oraz grasicą. Przenieś organy do szalki Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej 2 ml 1% FCS w HBSS. Następnie wyizoluj serce z otaczających organów i tkanki łącznej.Po wypłukaniu serca należy namoczyć je w 1 ml uprzednio ogrzanego roztworu enzymatycznego, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety i skalpela posiekać organ na kawałki o wielkości 1 mm³ pod stereomikroskopem. Należy dodać kolejny 1 ml uprzednio ogrzanego roztworu enzymatycznego i przenieść posiekaną tkankę do zakręcanej probówki o pojemności 5 ml. Próbkę należy inkubować w pozycji poziomej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.Po zakończeniu inkubacji homogenizować tkankę poprzez wielokrotne pipetowanie zawiesiny pipetą P1000. Następnie odstawić próbki w pozycji pionowej do czasu osadzenia się fragmentów niestrawionej tkanki. Nadsącz przenieść do probówki o pojemności 50 mililitrów.Dodaj 2 ml 10% FCS w HBSS i przechowuj wyizolowane komórki w lodzie. Następnie dodaj 2 ml uprzednio ogrzanego roztworu enzymatycznego do probówki o objętości 5 ml zawierającej nieprzetrawiony osad tkankowy i kontynuuj trawienie tkanki zgodnie z wcześniejszym opisem, aż do momentu, gdy nie będzie widocznych pozostałości tkanki. Odwiruj otrzymaną zawiesinę komórkową przy 120 ×g przez 10 minut.Następnie odrzuć supernatant i resuspenduj komórki w 1 ml 1% FCS w HBSS pozbawionym kationów wapnia i magnezu. Aby zabarwić komórki serca, przenieś 200 µl zawiesiny komórkowej do dołków okrągłej płytki 96-dołkowej. Odwiruj płytkę z prędkością 480 ×g przez jedną minutę i odrzuć supernatant.Następnie resuspenduj komórki serca w 100 µL roztworu przeciwciał. Owiń płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji przemyj komórki serca 200 µL 1% FCS w HBSS pozbawionym wapnia i magnezu, a następnie odwiruj zawiesinę przy 480 ×g przez jedną minutę.Następnie resuspendować komórki w 200 µL 1% FCS w HBSS pozbawionym jonów wapnia i magnezu, a zawiesinę przenieść do probówki o pojemności 5 mL wypełnionej uprzednio 200 µL 1% FCS w HBSS wolnym od wapnia i magnezu. Na koniec dodać 400 µL 1% FCS w HBSS pozbawionym kationów wapnia i magnezu, zawierającego 0,5 µg/mL jodu propidyny, i przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonowe sito o oczkach 70 µm. Aby zwizualizować komórki, załadować zabarwioną próbkę do cytometru przepływowego i kliknąć preview, a następnie zarejestrować do 2×10⁶ zdarzeń w próbce, klikając acquire.W karcie analizy otwórz okno palety kolorów i zarejestruj wszystkie badane parametry, dodając fluorochrom wraz z odpowiadającym mu markerem. Pamiętaj o uwzględnieniu parametrów autofluorescencji oraz żywotności. W oknie kontrolnym, w liście probówek, przeanalizuj pierwszą próbkę barwioną pojedynczo, zawierającą kulekowe kule kompensacyjne.Następnie w arkuszu wybierz narzędzie rysowania wielokątów i wyznacz bramkę dla populacji kulek na wykresie FSC SSC. Kliknij dwukrotnie bramkę, aby utworzyć wykres pochodny dla wybranych kulek. Następnie oddzielnie wyznacz bramki dla kulek pozytywnych i negatywnych.Zweryfikuj wybraną populację potomną poprzez sukcesywne bramkowanie i eliminację wartości odstających w każdej frakcji pozytywnej i negatywnej. Następnie prześlij bramki negatywne i pozytywne do okna un-mixingu. W dalszej kolejności wybierz próbkę niebarwionych komórek z listy probówek i wyznacz oddzielne bramki dla komórek autofluorescencyjnych i nieautofluorescencyjnych.Po zdefiniowaniu bramek negatywnych i pozytywnych dla wszystkich parametrów, w tym autofluorescencji i żywotności, należy kliknąć przycisk oblicz (calculate). Następnie zastosuj procedurę rozdzielania sygnałów (un-mixing) dla analizowanych próbek. Aby przeanalizować dane, wyodrębnij komórki na wykresie SSC względem FSC i wyklucz martwe komórki zabarwione jodkiem propidyny.Na koniec należy wyznaczyć bramki dla wszystkich interesujących nas populacji. Przedstawione tutaj wyniki analizy cytometrii przepływowej i cytometrii spektralnej dotyczą komórek wyizolowanych z płodowego serca i barwionych przeciwciałami anty-TER119, anty-CD45 oraz anty-Sca-1. Podzbiór komórek autofluorescencyjnych został wykryty przez dwa konwencjonalne cytometry, natomiast w cytometrii spektralnej komórki te nie zostały zdefiniowane jako autofluorescencyjne i zostały włączone do populacji CD45 TER119 negatywnej.Komórki zidentyfikowane w konwencjonalnej cytometrii przepływowej jako autofluorescencyjne, ale nie będące komórkami CD31-dodatnimi, zostały następnie poddane analizie pod kątem ekspresji transkryptów specyficznych dla kardiomiocytów. W populacji komórek autofluorescencyjnych stwierdzono wysokie poziomy troponiny sercowej oraz transkryptów typowych dla miocytów przedsionkowych, co potwierdziło, że w konwencjonalnej cytometrii przepływowej pomijany jest znaczny podzbiór kardiomiocytów. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje około ośmiu godzin, pod warunkiem prawidłowej realizacji.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wszystkie etapy powinny być przeprowadzane na lodzie i w sposób sprawny, aby zapewnić żywotność komórek. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić analizy białek wewnątrzkomórkowych oraz dodatkowych markerów powierzchniowych w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące specyficznych szlaków molekularnych. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii oraz biologii rozwoju lub komórek macierzystych do badania i izolowania rzadkich populacji z różnych organów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować i barwić komórki z tkanek komórkowych oraz jak analizować ekspresję markerów powierzchniowych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej, która pozwala pokonać ograniczenia wynikające z autofluorescencji komórek. Należy pamiętać, że praca z jodkiem propidyny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej (PPE).

analysis-cell-suspensions-isolated-from-solid-tissues-spectral-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę...

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Dostarczamy szczegółowy opis protokołu analizy cytometrycznej powierzchni i/lub antygenów wewnątrzkomórkowych w typach komórek nerwowych. Wyjaśniono kluczowe aspekty planowania eksperymentalnego, procedury metodologiczne krok po kroku i podstawowe zasady cytometrii przepływowej, aby umożliwić neurobiologom wykorzystanie tej potężnej technologii.

Protokoły cytometrii przepływowej do powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych analiz antygenowych typów komórek nerwowych

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania pojedynczych komórek z mysiej grasicy, węzła chłonnego drenującego trzustkę i śledziony do dalszego badania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto protokół ten wykorzystano do określenia podzbiorów regulatorowych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej.

Oznaczanie podzbiorów regulatorowych limfocytów T w grasicy myszy, węźle chłonnym drenującym trzustkę i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentowana jest wygodna, szybka i opłacalna metoda pomiaru proporcji komórek populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych.

Analiza populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.

Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj spektralną cytometrię przepływową do analizy zawiesin komórkowych z tkanek stałych, w tym jelita i serca myszy. Ta metoda umożliwia niezależne traktowanie autofluorescencji i identyfikację rzadkich populacji komórkowych w badaniach immunologicznych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów