Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej techniki cytometrii spektralnej jest rozróżnianie różnych fluorochromów przy użyciu ich pełnych widm emisji. Co więcej, niniejszy protokół umożliwia wykorzystanie autofluorescencji jako niezależnego parametru, co pozwala na prawidłową analizę komórek izolowanych z narządów litych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii oraz biologii komórek macierzystych, takie jak sposób identyfikacji rzadkich populacji komórek.

Główną zaletą tej techniki jest jej unikalna zdolność do jednoczesnej analizy dużej liczby parametrów oraz do zarządzania autofluorescencją tkanek stałych. Chociaż metoda ta jest wykorzystywana do przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek pochodzących z jelita i serca, można ją również zastosować do innych organów, takich jak płuca, mięśnie szkieletowe, wątroba, tkanka tłuszczowa i nerki. W pierwszej kolejności należy wyizolować i wypłukać jelito cienkie dorosłej myszy.

Następnie umieść tkankę na ręczniku papierowym i za pomocą ostrych nożyczek ostrożnie usuń kępki Peyera. Rozetnij jelito wzdłużnie i podziel je na jednocentymetrowe fragmenty. Następnie przenieś tkankę do zlewki wypełnionej 30 ml HBSS uzupełnionego o 10% FCS i inkubuj w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu przez 30 minut.

Po zakończeniu inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i intensywnie wymieszać ją na wortexie przez pięć minut. Następnie inkubować zawiesinę w lodzie przez dziesięć minut, aby umożliwić sedymentację dużych, niedysocjowanych fragmentów. Po tym czasie przenieść nadsącz do nowej probówki i odwirować komórki z prędkością 120 ×g przez siedem minut.

Po odwirowaniu osad komórek resuspendujemy w 10 ml 1% FCS w HBSS i przeliczamy je za pomocą komory Neubauera. Przed barwieniem komórek przenosimy 1 × 10⁶ komórek jelitowych do probówki o pojemności 5 ml w celu przygotowania kontroli negatywnej. Aby przygotować próbkę, do nowej probówki o pojemności 5 ml dodajemy 1 × 10⁶ komórek jelitowych, a następnie 2 ml HBSS z 1% FCS i wirujemy zawiesinę z prędkością 120 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.

Po odlaniu supernatantu zawiesza się komórki w 50 µL roztworu przeciwciał. Probówkę należy owinąć folią aluminiową i inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji do próbki dodaje się 2 mL 1% FCS w HBSS i odwirowuje ją z prędkością 120 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.

Odlej supernatant i resuspendez osad w 200 µL roztworu jodku propidyny o stężeniu 0,5 µg/mL. Po zdekapitowaniu zarodka myszy, zanurz jego ciało w szalce Petriego wyłożonej wstępnie namoczonym ręcznikiem papierowym i wypełnionej 50 mL 1% FCS w HBSS. Pod stereomikroskopem wykonaj nacięcie po prawej stronie klatki piersiowej zarodka i ostrożnie otwórz klatkę piersiową, unikając uszkodzenia serca.

Zaciśnij duże naczynia krwionośne i wyciągnij serce wraz z połączonymi z nim płucami oraz grasicą. Przenieś organy do szalki Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej 2 ml 1% FCS w HBSS. Następnie wyizoluj serce z otaczających organów i tkanki łącznej.

Po wypłukaniu serca należy namoczyć je w 1 ml uprzednio ogrzanego roztworu enzymatycznego, a następnie za pomocą precyzyjnej pęsety i skalpela posiekać organ na kawałki o wielkości 1 mm³ pod stereomikroskopem. Należy dodać kolejny 1 ml uprzednio ogrzanego roztworu enzymatycznego i przenieść posiekaną tkankę do zakręcanej probówki o pojemności 5 ml. Próbkę należy inkubować w pozycji poziomej w temperaturze 37 °C przez 15 minut.

Po zakończeniu inkubacji homogenizować tkankę poprzez wielokrotne pipetowanie zawiesiny pipetą P1000. Następnie odstawić próbki w pozycji pionowej do czasu osadzenia się fragmentów niestrawionej tkanki. Nadsącz przenieść do probówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj 2 ml 10% FCS w HBSS i przechowuj wyizolowane komórki w lodzie. Następnie dodaj 2 ml uprzednio ogrzanego roztworu enzymatycznego do probówki o objętości 5 ml zawierającej nieprzetrawiony osad tkankowy i kontynuuj trawienie tkanki zgodnie z wcześniejszym opisem, aż do momentu, gdy nie będzie widocznych pozostałości tkanki. Odwiruj otrzymaną zawiesinę komórkową przy 120 ×g przez 10 minut.

Następnie odrzuć supernatant i resuspenduj komórki w 1 ml 1% FCS w HBSS pozbawionym kationów wapnia i magnezu. Aby zabarwić komórki serca, przenieś 200 µl zawiesiny komórkowej do dołków okrągłej płytki 96-dołkowej. Odwiruj płytkę z prędkością 480 ×g przez jedną minutę i odrzuć supernatant.

Następnie resuspenduj komórki serca w 100 µL roztworu przeciwciał. Owiń płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji przemyj komórki serca 200 µL 1% FCS w HBSS pozbawionym wapnia i magnezu, a następnie odwiruj zawiesinę przy 480 ×g przez jedną minutę.

Następnie resuspendować komórki w 200 µL 1% FCS w HBSS pozbawionym jonów wapnia i magnezu, a zawiesinę przenieść do probówki o pojemności 5 mL wypełnionej uprzednio 200 µL 1% FCS w HBSS wolnym od wapnia i magnezu. Na koniec dodać 400 µL 1% FCS w HBSS pozbawionym kationów wapnia i magnezu, zawierającego 0,5 µg/mL jodu propidyny, i przefiltrować zawiesinę komórkową przez nylonowe sito o oczkach 70 µm. Aby zwizualizować komórki, załadować zabarwioną próbkę do cytometru przepływowego i kliknąć preview, a następnie zarejestrować do 2×10⁶ zdarzeń w próbce, klikając acquire.

W karcie analizy otwórz okno palety kolorów i zarejestruj wszystkie badane parametry, dodając fluorochrom wraz z odpowiadającym mu markerem. Pamiętaj o uwzględnieniu parametrów autofluorescencji oraz żywotności. W oknie kontrolnym, w liście probówek, przeanalizuj pierwszą próbkę barwioną pojedynczo, zawierającą kulekowe kule kompensacyjne.

Następnie w arkuszu wybierz narzędzie rysowania wielokątów i wyznacz bramkę dla populacji kulek na wykresie FSC SSC. Kliknij dwukrotnie bramkę, aby utworzyć wykres pochodny dla wybranych kulek. Następnie oddzielnie wyznacz bramki dla kulek pozytywnych i negatywnych.

Zweryfikuj wybraną populację potomną poprzez sukcesywne bramkowanie i eliminację wartości odstających w każdej frakcji pozytywnej i negatywnej. Następnie prześlij bramki negatywne i pozytywne do okna un-mixingu. W dalszej kolejności wybierz próbkę niebarwionych komórek z listy probówek i wyznacz oddzielne bramki dla komórek autofluorescencyjnych i nieautofluorescencyjnych.

Po zdefiniowaniu bramek negatywnych i pozytywnych dla wszystkich parametrów, w tym autofluorescencji i żywotności, należy kliknąć przycisk oblicz (calculate). Następnie zastosuj procedurę rozdzielania sygnałów (un-mixing) dla analizowanych próbek. Aby przeanalizować dane, wyodrębnij komórki na wykresie SSC względem FSC i wyklucz martwe komórki zabarwione jodkiem propidyny.

Na koniec należy wyznaczyć bramki dla wszystkich interesujących nas populacji. Przedstawione tutaj wyniki analizy cytometrii przepływowej i cytometrii spektralnej dotyczą komórek wyizolowanych z płodowego serca i barwionych przeciwciałami anty-TER119, anty-CD45 oraz anty-Sca-1. Podzbiór komórek autofluorescencyjnych został wykryty przez dwa konwencjonalne cytometry, natomiast w cytometrii spektralnej komórki te nie zostały zdefiniowane jako autofluorescencyjne i zostały włączone do populacji CD45 TER119 negatywnej.

Komórki zidentyfikowane w konwencjonalnej cytometrii przepływowej jako autofluorescencyjne, ale nie będące komórkami CD31-dodatnimi, zostały następnie poddane analizie pod kątem ekspresji transkryptów specyficznych dla kardiomiocytów. W populacji komórek autofluorescencyjnych stwierdzono wysokie poziomy troponiny sercowej oraz transkryptów typowych dla miocytów przedsionkowych, co potwierdziło, że w konwencjonalnej cytometrii przepływowej pomijany jest znaczny podzbiór kardiomiocytów. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje około ośmiu godzin, pod warunkiem prawidłowej realizacji.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wszystkie etapy powinny być przeprowadzane na lodzie i w sposób sprawny, aby zapewnić żywotność komórek. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić analizy białek wewnątrzkomórkowych oraz dodatkowych markerów powierzchniowych w celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące specyficznych szlaków molekularnych. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii oraz biologii rozwoju lub komórek macierzystych do badania i izolowania rzadkich populacji z różnych organów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować i barwić komórki z tkanek komórkowych oraz jak analizować ekspresję markerów powierzchniowych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej, która pozwala pokonać ograniczenia wynikające z autofluorescencji komórek. Należy pamiętać, że praca z jodkiem propidyny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej (PPE).