Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Ogólnym celem tego podejścia fosforotaniowego w RNA jest przeprowadzenie mutagenezy saturacji w jednym kroku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak regulacja genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednym kroku można osiągnąć mutagenezę saturacji miejsca wiązania białka w RNA.

Kluczowym krokiem w tym jednoetapowym protokole mutagenezy saturacji jest domieszkowanie matrycy DNA nukleotydami typu niedzikiego w miejscu wiązania białka. Najpierw zsyntetyzuj starter T7 przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA. Następnie zsyntetyzuj domieszkowany oligonukleotyd odpowiadający miejscu wiązania białka.

W tym przykładzie podkreślona sekwencja zawiera odwrotne dopełnienie miejsca wiązania białka płciowego drosophilas, przy czym każde miejsce dopingowania jest reprezentowane przez X.Użyj stosunku 90% nukleotydu typu dzikiego do 10% nukleotydu typu niedzikiego dla każdego miejsca domieszkowania. Sekwencja w kolorze zielonym jest komplementarna do sekwencji startera T7 i jest promotorem T7 do transkrypcji in vitro. Kolejnym krokiem w tym protokole jest synteza oddzielnych RNA z każdym nukleotydem fosforotionianowym, a następnie znakowanie radioaktywne 5-końca RNA.

Zsyntetyzuj RNA dla każdego fosforotionianu w 20-mikrolitrowej reakcji transkrypcji. Do każdej probówki do mikrowirówki dodaj następujące elementy: bufor transkrypcyjny T7, jeden mikromolowy oligonukleotyd T7, jeden mikromolowy oligonukleotyd domieszkowany, 10 milimolowy DTT, dwa milimolowe GTP, po jednym milimolowym ATP, CTP i UTP oraz dwie jednostki na mikrolitr polimerazy RNA T7. Dodaj 0,167 milimola alfa-tio ATP do jednej probówki i 0,05 milimola alfa-tio UTP do drugiej probówki.

Inkubować mieszaniny reakcyjne syntezy RNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach dodaj 2,5 mikrolitra termolabilnej alfa fosfatazy i 2,5 mikrolitra 10-krotnego buforu fosfatazy do każdej próbki RNA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 30 minut, aby usunąć 5-prime fosforany.

Dezaktywuj enzym fosfatazy alkalicznej, ogrzewając go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut. Pozostałe etapy wiążą się z użyciem radioaktywności i muszą być wykonywane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności i osłony z pleksiglasu w celu ochrony przed radioaktywnością. Aby znakować radioizotopowo 5-pierwszy koniec zdefosforylowanego RNA, użyj jednego mikrolitra kinazy polinukleotydowej T4 i jednego mikrolitra Gamma P32 ATP w 10-mikrolitrowej objętości reakcji.

Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Dezaktywuj enzym kinazy polinukleotydowej T4 przez ogrzewanie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Przeprowadzaj reakcje w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym.

Zlokalizuj RNA na żelu za pomocą autoradiografii i wytnij plasterek żelu zawierający znakowane radioaktywnie RNA. Zmiażdż plasterek żelu w probówce mikrowirówkowej, dociskając go do boku końcówką pipety, a następnie dodaj bufor proteinazy K. Obracaj rurki w temperaturze pokojowej od dwóch godzin do nocy.

Następnie odwirować zawiesinę żelu, zebrać roztwór buforowy i wyrzucić żel. Ekstrahować każdy roztwór dwukrotnie równą objętością chloroformu fenolowego. Następnie wyekstrahuj roztwór raz chloroformem.

Zebrać fazę wodną i dodać do niej 0,1 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,2, nośnika tRNA lub glikogenu i 2,5 objętości etanolu. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Odwirować próbki w mikrowirówce o wysokiej prędkości 16 873 razy g przez pięć do 10 minut.

Ostrożnie usunąć buforowy roztwór etanolu, nie naruszając osadu RNA. Umyj granulki 70% etanolem i odwiruj przez dwie do pięciu minut. Ostrożnie usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu.

Ponownie zawiesić każdą granulkę w 20 do 50 mikrolitrach wody uzdatnionej przez DEPC. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Koncepcja partycjonowania z powodu zakłóceń jest zilustrowana tutaj.

Podczas procesu wiązania białek cząsteczki RNA rozdzielają się między frakcją związaną z białkiem a frakcją niezwiązaną. Jeśli określony nukleotyd w danej pozycji zakłóca wiązanie białka, zostanie preferencyjnie wykluczony z frakcji związanej z białkiem. Następnie jod jest używany do rozszczepiania RNA w miejscach włączenia fosforotionianu.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy ustawić reakcje wiązania białko-RNA z każdą reakcją zawierającą 10 milimolowych Tris-HCl, jeden milimolowy DTT, 50 milimolowy chlorek potasu, 0,5 jednostki na mikrolitr inhibitora RNazy, 0,09 mikrograma na mikrolitr acetylowanej albuminy surowicy bydlęcej, jeden milimolowy EDTA, 0,15 mikrograma na mikrolitr tRNA, 5-prime-endowe znakowane radioaktywnie RNA i sześć mikrolitrów o odpowiednim stężeniu białka. Inkubować reakcje wiązania białek w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Oddzielić frakcję RNA związaną z białkiem od frakcji niezwiązanej za pomocą wiązania filtra nitrocelulozowego.

Zastosować reakcję wiązania na filtr nitrocelulozowy podłączony do kolektora próżniowego w temperaturze pokojowej. Tylko kompleks białkowy RNA zostanie zatrzymany na filtrze, podczas gdy niezwiązane RNA przepływa przez filtr. Pokrój część filtra nitrocelulozowego zawierającą zatrzymany radioaktywny RNA na mniejsze kawałki, aby zmieściły się w probówce mikrowirówki i dodaj wystarczającą ilość buforu proteinazy K, aby zanurzyć kawałki filtra.

Eluuj RNA z kawałków filtra przez dwie do trzech godzin lub przez noc. Następnie przenieś roztwór z każdej probówki do nowej probówki i ekstrahuj chloroformem fenolowym i chloroformem, jak pokazano wcześniej. Zebrać fazę wodną i dodać do niej 0,1 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości etanolu i inkubować w zamrażarce.

Po odwirowaniu, umyciu i wysuszeniu RNA, jak pokazano wcześniej, ponownie zawieś RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Wszystkie czynności związane z jodem muszą być wykonywane w okapie wyciągowym. Aby rozszczepić RNA w miejscach włączenia fosforotionianu, dodaj do każdej próbki RNA jednomilimolowy jod w 20 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC zawierającej do 10 mikrogramów nośnika tRNA.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wytrącić rozszczepione RNA, dodając octan sodu i etanol, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić rozszczepione RNA w barwniku ładującym do żeli denaturujących.

Po podgrzaniu załaduj próbki do 15-20% denaturującego żelu poliakrylamidowego i oddziel fragmenty RNA za pomocą elektroforezy. Wystaw żel poliakryloamidowy na kliszę rentgenowską i wykryj prążki we frakcji związanej w stosunku do całkowitej puli za pomocą autoradiografii. Ten schemat ilustruje koncepcję partycjonowania z powodu zakłóceń.

Na torze T, całkowita frakcja RNA, intensywność pasma jest w przybliżeniu równa dla wszystkich domieszkowanych pozycji. We frakcji RNA związanej z białkiem, w pozycjach 1, 4 i 7, nukleotyd nie ma wpływu na wiązanie. Jednak w pozycjach 3 i 6 zakłóca wiązanie i jest wyłączony z frakcji związanej.

W pozycji 5 interferencja jest częściowa. Porównania sparowanych torów dla każdego nukleotydu pozwalają na analizę wszystkich czterech nukleotydów. Ten autoradiogram pokazuje dwie pary pasów z żelu denaturującego.

Pas T to całkowite RNA, a tor B to RNA związany z białkiem. Pionowa linia wyznacza miejsce wiązania płciowo-letalnego. W przypadku pary alfa-tioalinowej prążki 1, 2, 3 i 5 są obecne w całkowitej frakcji RNA, ale nieobecne lub znacznie zmniejszone w związanej frakcji RNA.

W przypadku pary alfa-tiouliny pasma 7 i 8 są stosunkowo mniej intensywne we frakcji związanej. Pozostałości, które są preferencyjnie wykluczone z frakcji związanej, są ważne dla wiązania białek. Po zsyntetyzowaniu RNA i znakowaniu 5-prime-end, technikę tę można wykonać w ciągu 12 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ważnym czynnikiem jest odpowiedni poziom włączenia fosforotionianu i określenie odpowiedniego stężenia białka do wiązania. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak odpowiednie testy funkcjonalne lub testy in vivo, aby zweryfikować wynik podejścia mutagenezy i zrozumieć znaczenie biologiczne. Ta technika stanowi alternatywę dla innych metod, które są albo droższe, albo bardziej pracochłonne, albo jedno i drugie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować i syntetyzować bibliotekę mutantów, przeprowadzać reakcje wiązania, identyfikować zmutowane nukleotydy w każdej puli i analizować ilościowo wpływ nukleotydów typu innego niż dziki w każdej testowanej pozycji. Nie zapominaj, że praca z poliakrylamidem i radioaktywnością może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie rękawiczek, odpowiednie wydech i osłony radioaktywne.