Name: Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Poznaj jednoetapową mutagenezę saturacji miejsc wiązania białek w RNA przy użyciu fosforotionianów. Ta metoda upraszcza badanie interakcji RNA-białko i regulacji ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje National Institutes of Health za wcześniejsze finansowanie i dziękuje Michaelowi R. Greenowi za syntezę oligonukleotydów.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd mutagenezy fosforotionianów i podsumowuje kluczowe etapy tego procesu.
1. Generowanie biblioteki mutantów — Matryca dopingującego DNA z nukleotydami typu niedzikiego
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA.</li>
	<li>Zsyntetyzować domieszkowany oligonukleotyd (nić komplementarna) przez syntezę chemiczną na syntetyzatorze DNA odpowiadającym miejscu wiązania białka. Podczas syntezy chemicznej należy użyć odpowiedniej mieszaniny fosforamidytów dla każdego miejsca domieszkowania (X poniżej) o stosunku 90% A jako nukleotyd typu dzikiego i 10% T jako nukleotyd typu niedzikiego (więcej szczegółów na temat tego stosunku można znaleźć w reprezentatywnych wynikach). 
	Uwaga: Tutaj sekwencja domieszkowanego oligonukleotydu to 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3'. Podkreślona sekwencja jest odwrotnym dopełnieniem miejsca wiązania białka SXL oraz dodatkowymi nukleotydami poza miejscem wiązania, które zapewniają użyteczne kontrole potwierdzające, że nie każda zmiana w RNA wpływa na wiązanie, a także są kontrolami obciążenia dla porównania i normalizacji nukleotydów w miejscu wiązania. Do opracowania proponowanej metodologii wykorzystano sekwencję miejsca wiązania SXL UUUUUUUUUUUUUU, która jest obecna w transformatorze pre-mRNA14,15,16,17. Sekwencja pisana kursywą jest komplementarna do sekwencji startera T7 i jest promotorem T7 do transkrypcji in vitro.</li>
</ol>
2. Synteza RNA
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj RNA w reakcji transkrypcji 20 μl, jak opisano wcześniej18.
	<ol>
		<li>Wymieszaj bufor transkrypcyjny T7 i 1 μM oligonukleotydu T7, 1 μM domieszkowanego oligonukleotydu, 10 mM ditiotreitolu (DTT), 2 mM GTP, po 1 mM ATP, CTP i UTP (trifosforan guanozyny, adenozyny, cytydyny i urydyny) oraz 2 U/μL polimerazy RNA T7.</li>
		<li>Dodaj, w dwóch oddzielnych probówkach do mikrowirówek, 0,167 mM α-tio ATP lub 0,05 mM α-tio UTP, aby włączyć fosforotioniany (patrz schematy w <silna klasa="xfig">Rysunek 2) do RNA. 
		UWAGA: W przypadku alternatywnych protokołów dodać 0,2 mM α-tioCTP lub 0,2 mM α-tioGTP do odpowiedniej reakcji transkrypcji zawierającej domieszkowany oligonukleotyd w celu przetestowania dwóch pozostałych podstawień nukleotydów.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę reakcyjną syntezy RNA przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do próbki RNA dodać 2,5 μl termolabilnej fosfatazy alkalicznej i 2,5 μl buforu 10xfosfatazy. Inkubować tę reakcję 25 μl przez 10–30 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia 5' fosforanów.</li>
	<li>Enzym fosfatazy alkalicznej należy dezaktywować przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 2–5 minut.</li>
	<li>Znakować radioizotopowo koniec 5' zdefosforylowanego RNA (5 pmole) za pomocą 1 μl kinazy polinukleotydowej T4 i 1 μl γ-32P ATP w objętości reakcyjnej 10 μl. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 30–60 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dezaktywować enzym kinazy polinukleotydowej T4 przez ogrzewanie w temperaturze 65 °C przez 20–30 minut.</li>
	<li>Żel oczyszcza RNA przez elektroforezę w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym. Zlokalizuj RNA na żelu za pomocą autoradiografii. Wyciąć plasterek żelu zawierający znakowane radioaktywnie RNA, rozdrobnić w probówce do mikrowirówki, dociskając do ścianek końcówką pipety i zanurzyć w buforze proteinazy K (PK) (100 mM Tris, pH 7,5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% dodecylosiarczan sodu). Obracaj rurkę w temperaturze pokojowej od 2 godzin do nocy.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę żelu, wyrzucić żel i zebrać roztwór buforowy.</li>
	<li>Dwukrotnie ekstrahować roztwór równą objętością chloroformu fenolowego i raz chloroformem i zebrać fazę wodną.</li>
	<li>Dodać do fazy wodnej 0,1 objętości 3M octanu sodu o pH 5,2, nośnikowym tRNA lub glikogenu i 2,5 objętości etanolu. Utrzymywać próbkę w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Odwirowywać próbkę przez 5–10 minut w mikrowirówce wysokoobrotowej o sile 16 873 x g. Ostrożnie usunąć roztwór buforu/etanolu, nie naruszając osadu RNA.</li>
	<li>Umyj granulat 70% etanolem i odwiruj przez 2–5 minut. Ostrożnie usuń etanol. Wysuszyć pelety na powietrzu.</li>
	<li>Zawiesić granulat w 20–50 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki z radioznakowanym RNA, stosując odpowiednie środki ostrożności i osłonę z pleksiglasu w celu ochrony przed radioaktywnością. Obecnie kolumny wirowe są częściej stosowane i wygodniejsze do usuwania nieinkorporowanej radioaktywności, jako alternatywa dla żelowego oczyszczania RNA.</li>
</ol>
3. Reakcja wiązania białek i separacja związanego RNA
<ol>
	<li>Ekspresja rekombinowanego białka i oczyszczanie z E. coli.</li>
	<li>Oszacować stężenie białka rekombinowanego za pomocą spektrofotometrii lub przez rozdzielenie w żelu poliakryloamidowym SDS obok znanego wzorca białka, albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Zwizualizuj interesujące Cię białko i standard BSA, barwiąc żel Coomassie Brilliant Blue R-250. Określić ilościowo białko w porównaniu ze znanymi ilościami rozcieńczeń BSA na tym samym żelu. 
	UWAGA: Przechowywać białko rekombinowane w temperaturze -80 °C do czasu użycia i rozcieńczyć w 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES), pH 8,0, 1 mM ditiotreitolu (DTT), 0,2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,05% NP-40, 20% glicerolu. Stosowanie 0,5–1,0 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanu sulfonylu (PMSF) jest opcjonalne.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję wiązania RNA (20–100 μl) w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0,5 jednostki/μl inhibitora RNazy, 0,09 μg/μL acetylowanej albuminy surowicy bydlęcej, 1 mM EDTA, 0,15 μg/μL tRNA, 5'-końcu znakowanego radioaktywnie RNA i 6 μL o odpowiednim stężeniu (stężenie, w którym ~50% RNA wiąże się z białkiem) białka. 
	UWAGA: Ten bufor wiążący działa dla trzech białek wiążących RNA (SXL, U2AF65 i PTB), ale musi być standaryzowany dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Oszacuj stężenie białka empirycznie, stosując różne rozcieńczenia dla danego preparatu białkowego, które jest wymagane do uzyskania około 50% wiązania RNA. Ten warunek lub Kd reprezentuje najbardziej wrażliwą część krzywej wiązania RNA.</li>
	<li>Inkubować reakcję wiązania białek przez 20–30 minut w temperaturze 25 °C (lub na lodzie).</li>
	<li>Oddzielić frakcję RNA związaną z białkiem od frakcji niezwiązanej, stosując jedno z dwóch podejść:
	<ol>
		<li>Wiązanie filtra nitrocelulozowego
		<ol>
			<li>Reakcję wiązania (20–100 μl) nanieść na filtr nitrocelulozowy podłączony do kolektora próżniowego w temperaturze pokojowej. 
			UWAGA: Tylko kompleks RNA-białko jest zatrzymywany na filtrze, a niezwiązane RNA przepływa przez filtr. Podejście polegające na wiązaniu filtra pozwala na szybszy odzysk związanego RNA oraz jest szybsze i prostsze w porównaniu z testem przesunięcia ruchliwości żelu. Umieszczając membranę DEAE pod filtrem nitrocelulozowym, możliwe jest również zebranie niezwiązanej frakcji RNA lub wolnego RNA w celu porównania z frakcją związaną.</li>
			<li>Pokrój część filtra nitrocelulozowego zawierającą zatrzymany radioaktywny RNA na mniejsze kawałki, aby zmieściły się w probówce do mikrowirówki, zanurz w wystarczającej ilości buforu PK (300–500 μl zawierającego 10–20 μg PK), aby zanurzyć fragmenty filtra, i wymyj RNA z filtra na 2-3 godziny lub na noc.</li>
			<li>Ekstrakt z fenol-chloroformem, chloroformem i zebrać fazę wodną. Dodać octan sodu i etanol, a po inkubacji w zamrażarce odwirować, umyć, wysuszyć i ponownie zawiesić RNA w wodzie uzdatnionej przez DEPC. Wykonaj następujące kroki zgodnie z opisem w krokach od 2.10 do 2.14 powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmiana mobilności żelu
		<ol>
			<li>Przygotuj i polimeryzuj 5% natywny żel poliakryloamidowy (60:1 Akrylamid:bis-akrylamid) w 0,5x TBE (standardowy bufor Tris-Boran-EDTA) przed rozpoczęciem reakcji wiązania, jako alternatywę dla metody wiązania filtra.</li>
			<li>Żel należy wstępnie uruchomić przez 15 minut pod napięciem 250 V w chłodni (4 °C).</li>
			<li>Załaduj każdą reakcję wiązania (powyżej) do oddzielnych studzienek powyższego żelu wstępnego. 
			UWAGA: Bufor do przechowywania białka zapewnia wystarczającą ilość glicerolu do załadowania próbki do studzienek.</li>
			<li>Oddzielić RNA związane z białkiem za pomocą elektroforezy żelowej w chłodnym pomieszczeniu pod napięciem 250 V przez 1 do 2 godzin, w zależności od wielkości RNA i konkretnego białka.</li>
			<li>Zlokalizuj położenie kompleksu RNA-białko na żelu za pomocą autoradiografii. Wyciąć plasterek żelu zawierający kompleks RNA-białko. Eluować RNA z wycinka żelu, krusząc wycinek żelu i mocząc go w buforze PK.</li>
			<li>Ekstrahować fenol-chloroformem, chloroformem i zebrać fazę wodną. dodać octan sodu i etanol, a po inkubacji w zamrażarce odwirować, przemyć, wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Wykonaj następujące kroki zgodnie z opisem w krokach od 2.10 do 2.14 powyżej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza produktów fosforotanianu jodu w celu wykrycia pozycji zmutowanych nukleotydów
<ol>
	<li>Dodać 1 mM jodu do 20 μl wody uzdatnionej DEPC zawierającej do 10 μg nośnika tRNA, aby rozszczepić RNA (związane i całkowite RNA) w miejscach włączenia fosforotionianu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. 
	UWAGA: Więcej szczegółów na temat rozkładu jodu w nieco innych warunkach — 7% (v/v) jodoetanolu, ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 3 minuty — można znaleźć w Gish & Eckstein 198819.</li>
	<li>Wytrącić rozszczepiony RNA, dodając octan sodu/etanol, jak opisano powyżej. Zawiesić ponownie w barwniku ładującym do żeli denaturujących. Podgrzej i załaduj próbkę w celu oddzielenia fragmentów RNA za pomocą elektroforezy w 15–20% denaturującym żelu poliakrylamidowym.</li>
	<li>Żel poliakrylamidowy należy narazić na folię rentgenowską.</li>
	<li>Wykrywanie prążków we frakcji związanej w stosunku do całkowitej puli za pomocą autoradiografii. 
	UWAGA: Wykonaj wszystkie czynności z jodem w okapie. Do pokazanej tutaj separacji RNA stosuje się żel w kształcie klina, który uzyskuje się poprzez podwojenie grubości obu przekładek na dole płytek żelowych poprzez włożenie dodatkowego calowego elementu dystansowego na dnie żelu. Taki kształt pozwala na bardziej jednolite lub bliższe odstępy między krótszymi fragmentami RNA. Alternatywnie, zamiast klisz rentgenowskich można użyć luminowizora do wykrywania i ilościowego oznaczania radioaktywności.</li>
</ol>

<ol><li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li>
<li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li>
<li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+germ+cells+choose+their+sex%3F+Drosophila+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li>
<li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li>
<li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li>
<li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520(2007).</li>
<li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li>
<li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li>
<li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li>
<li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells%3A+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li>
<li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li>
<li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li>
<li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li>
<li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li>
<li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li>
<li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li>
<li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li>
<li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li>
<li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

Mutageneza od dawna jest stosowana do charakteryzowania miejsc wiązania białek. Po pierwsze, można skonstruować serię mutantów i indywidualnie przetestować je w testach wiązania, aby przeanalizować ich wpływ na powinowactwo wiązania. Podczas gdy standardowe podejście mutagenezy oferuje sposób analizy kilku sekwencji, wiele kroków związanych z podejściem standardowym, takich jak konstruowanie mutantów i przeprowadzanie serii reakcji wiązania dla każdego mutanta, jest pracochłonne i czasochłonne oraz może nie pozwalać na m...

Regulacja genów odgrywa ważną rolę w biologii. Geny mogą być regulowane na poziomie transkrypcji, splicingu przed mRNA, tworzenia końca 3', eksportu RNA, translacji, lokalizacji mRNA, rozpadu, modyfikacji/stabilności potranslacyjnej itp. Zarówno białka wiążące DNA, jak i RNA odgrywają kluczową rolę w regulacji genów. Podczas gdy molekularne analizy genetyczne zidentyfikowały wiele białek regulatorowych, tylko niewielka część z nich została w pełni scharakteryzowana pod kątem ich funkcji komórkowych lub miejsc wiązania in vivo. Analiza sekwencji filogenetycznej i mutageneza oferują uzupełniające się podejścia do charakteryzowania interakcji DNA-RNA-białko.
Białka wiążące RNA są ważne w procesach rozwojowych, w tym w różnicowaniu płciowym. Białko Drosophila Sex-lethal (SXL) lub główne białko zmiany płci jest nieobecne u mężczyzn, ale obecne u samic. Rozpoznaje sekwencje bogate w urydynę lub szlaki pirymidynowe sąsiadujące z określonymi miejscami splicingu w dalszych celach pre-mRNA (transformator, letalny dla płci i śmiertelny dla mężczyzn2) w komórkach somatycznych1,2,3,4. Ponadto reguluje przełączanie miejsc poliadenylacji poprzez wiązanie się z bogatymi w urydynę sekwencjami wzmacniającymi poliadenylację we wzmacniaczu szczątkowego (e(r)) transkryptu5,6. SXL prawdopodobnie reguluje dodatkowe cele w żeńskiej linii zarodkowej, które pozostają do zidentyfikowania1,7,8,9,10,11,12,13.
Zazwyczaj, charakterystyka miejsca wiązania obejmuje mutagenezę, na przykład poprzez delecję lub podstawienie pojedynczych lub wielokrotnych nukleotydów. Każde zmutowane miejsce wiązania, w stosunku do sekwencji RNA typu dzikiego, jest następnie analizowane przy użyciu serii stężeń białka w celu określenia jego powinowactwa wiązania (Kd lub równowagowa stała dysocjacji) dla białka będącego przedmiotem zainteresowania; Kd to stężenie białka wymagane do uzyskania 50% wiązania RNA. Ten pracochłonny proces szczegółowej mutagenezy obejmuje generowanie i analizę licznych mutantów - trzech nukleotydów typu niedzikiego dla każdej pozycji w miejscu wiązania. W związku z tym istnieje potrzeba alternatywnego podejścia do szybszej, prostszej i niedrogiej mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA.
Tutaj opisujemy jednoetapowe podejście, które pozwala na mutagenezę saturacji miejsca wiązania białka w RNA. Polega na domieszkowaniu matrycy DNA nukleotydami typu niedzikiego w miejscu wiązania, syntezie oddzielnych RNA z każdym nukleotydem fosforooctianowym oraz izolacji frakcji związanej po inkubacji z białkiem. Interferencja ze strony nukleotydów typu innego niż dziki powoduje ich preferencyjne wykluczenie z frakcji związanej z białkiem. Jest to monitorowane za pomocą elektroforezy żelowej po selektywnym rozszczepieniu chemicznym jodem wiązań fosfodiestrowych zawierających fosforotioniany (mutageneza fosfotionianów lub PTM). To jednoetapowe podejście mutagenezy saturacji ma zastosowanie do charakterystyki dowolnego miejsca wiązania białka w RNA.

<table><tbody><tr><td>Uridine 5' a-tiotrifosforan</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-017</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5' a-tiotrifosforan</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-016</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore&nbsp; 25&nbsp; mm Szklany mikroanalityczny filtr próżniowy</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Kolektor próżniowy do pobierania próbek</td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Milipora</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Schleicher & Zestaw do</td> defosforyzacji Schuell <td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>NEB</td><td></td><td>M0508</td><td></td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td></td><td>Inhibitor RNazy</td></tr><tr><td>Szklane płytki</td><td>Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do elektroforezy żelowej</td><td>Standardowy</td><td>Standardowe</td><td></td></tr><tr><td>filmy rentgenowskie</td><td>Standardowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardowe Roztwory żelu poliakrylamidowego</td><td>Standardowe</td><td>Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w rna przy użyciu fosforotionianów

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Regulacja genów odgrywa ważną rolę w rozwoju. Liczne białka wiążące DNA i RNA wiążą swoje sekwencje docelowe z wysoką specyficznością, aby kontrolować ekspresję genów. Te białka regulatorowe kontrolują ekspresję genów na poziomie DNA (transkrypcja) lub na poziomie RNA (splicing pre-mRNA, poliadenylacja, transport, rozpad i translacja). Identyfikacja sekwencji regulatorowych pomaga zrozumieć nie tylko, w jaki sposób gen jest włączany lub wyłączany, ale także to, które geny są regulowane przez określone białko regulatorowe. W tym miejscu opisujemy jednoetapowe podejście, które umożliwia mutagenezę saturacji miejsca wiązania białka w RNA. Polega na domieszkowaniu matrycy DNA nukleotydami typu niedzikiego w miejscu wiązania, syntezie oddzielnych RNA z każdym nukleotydem fosforooctianowym oraz izolacji frakcji związanej po inkubacji z białkiem. Interferencja ze strony nukleotydów typu innego niż dziki powoduje ich preferencyjne wykluczenie z frakcji związanej z białkiem. Jest to monitorowane za pomocą elektroforezy żelowej po selektywnym rozszczepieniu chemicznym jodem wiązań fosfodiestrowych zawierających fosforotioniany (mutageneza fosfotionianów lub PTM). To jednoetapowe podejście mutagenezy saturacji ma zastosowanie do charakterystyki dowolnego miejsca wiązania białka w RNA.

Zasada mutagenezy nasycającej z wykorzystaniem domieszkowania:
Aby uzyskać odpowiedni stosunek molowy nukleotydów typu dzikiego i pozostałych, należy zastosować równą mieszaninę wszystkich czterech nukleotydów, jeśli analizowana jest tylko jedna pozycja. Jednakże, w przypadku jednoczesnej analizy wielu pozycji, stosunek nukleotydów nietypowych do nukleotydów typu dzikiego musi zostać skorygowany, t.j. zmniejszony. W przeci...

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Ogólnym celem tego podejścia fosforotaniowego w RNA jest przeprowadzenie mutagenezy saturacji w jednym kroku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej, takie jak regulacja genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednym kroku można osiągnąć mutagenezę saturacji miejsca wiązania białka w RNA.Kluczowym krokiem w tym jednoetapowym protokole mutagenezy saturacji jest domieszkowanie matrycy DNA nukleotydami typu niedzikiego w miejscu wiązania białka. Najpierw zsyntetyzuj starter T7 przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA. Następnie zsyntetyzuj domieszkowany oligonukleotyd odpowiadający miejscu wiązania białka.W tym przykładzie podkreślona sekwencja zawiera odwrotne dopełnienie miejsca wiązania białka płciowego drosophilas, przy czym każde miejsce dopingowania jest reprezentowane przez X.Użyj stosunku 90% nukleotydu typu dzikiego do 10% nukleotydu typu niedzikiego dla każdego miejsca domieszkowania. Sekwencja w kolorze zielonym jest komplementarna do sekwencji startera T7 i jest promotorem T7 do transkrypcji in vitro. Kolejnym krokiem w tym protokole jest synteza oddzielnych RNA z każdym nukleotydem fosforotionianowym, a następnie znakowanie radioaktywne 5-końca RNA.Zsyntetyzuj RNA dla każdego fosforotionianu w 20-mikrolitrowej reakcji transkrypcji. Do każdej probówki do mikrowirówki dodaj następujące elementy: bufor transkrypcyjny T7, jeden mikromolowy oligonukleotyd T7, jeden mikromolowy oligonukleotyd domieszkowany, 10 milimolowy DTT, dwa milimolowe GTP, po jednym milimolowym ATP, CTP i UTP oraz dwie jednostki na mikrolitr polimerazy RNA T7. Dodaj 0,167 milimola alfa-tio ATP do jednej probówki i 0,05 milimola alfa-tio UTP do drugiej probówki.Inkubować mieszaniny reakcyjne syntezy RNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po dwóch godzinach dodaj 2,5 mikrolitra termolabilnej alfa fosfatazy i 2,5 mikrolitra 10-krotnego buforu fosfatazy do każdej próbki RNA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 30 minut, aby usunąć 5-prime fosforany.Dezaktywuj enzym fosfatazy alkalicznej, ogrzewając go w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie do pięciu minut. Pozostałe etapy wiążą się z użyciem radioaktywności i muszą być wykonywane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności i osłony z pleksiglasu w celu ochrony przed radioaktywnością. Aby znakować radioizotopowo 5-pierwszy koniec zdefosforylowanego RNA, użyj jednego mikrolitra kinazy polinukleotydowej T4 i jednego mikrolitra Gamma P32 ATP w 10-mikrolitrowej objętości reakcji.Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Dezaktywuj enzym kinazy polinukleotydowej T4 przez ogrzewanie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Przeprowadzaj reakcje w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym.Zlokalizuj RNA na żelu za pomocą autoradiografii i wytnij plasterek żelu zawierający znakowane radioaktywnie RNA. Zmiażdż plasterek żelu w probówce mikrowirówkowej, dociskając go do boku końcówką pipety, a następnie dodaj bufor proteinazy K. Obracaj rurki w temperaturze pokojowej od dwóch godzin do nocy.Następnie odwirować zawiesinę żelu, zebrać roztwór buforowy i wyrzucić żel. Ekstrahować każdy roztwór dwukrotnie równą objętością chloroformu fenolowego. Następnie wyekstrahuj roztwór raz chloroformem.Zebrać fazę wodną i dodać do niej 0,1 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,2, nośnika tRNA lub glikogenu i 2,5 objętości etanolu. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę. Odwirować próbki w mikrowirówce o wysokiej prędkości 16 873 razy g przez pięć do 10 minut.Ostrożnie usunąć buforowy roztwór etanolu, nie naruszając osadu RNA. Umyj granulki 70% etanolem i odwiruj przez dwie do pięciu minut. Ostrożnie usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu.Ponownie zawiesić każdą granulkę w 20 do 50 mikrolitrach wody uzdatnionej przez DEPC. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. Koncepcja partycjonowania z powodu zakłóceń jest zilustrowana tutaj.Podczas procesu wiązania białek cząsteczki RNA rozdzielają się między frakcją związaną z białkiem a frakcją niezwiązaną. Jeśli określony nukleotyd w danej pozycji zakłóca wiązanie białka, zostanie preferencyjnie wykluczony z frakcji związanej z białkiem. Następnie jod jest używany do rozszczepiania RNA w miejscach włączenia fosforotionianu.Aby rozpocząć tę procedurę, należy ustawić reakcje wiązania białko-RNA z każdą reakcją zawierającą 10 milimolowych Tris-HCl, jeden milimolowy DTT, 50 milimolowy chlorek potasu, 0,5 jednostki na mikrolitr inhibitora RNazy, 0,09 mikrograma na mikrolitr acetylowanej albuminy surowicy bydlęcej, jeden milimolowy EDTA, 0,15 mikrograma na mikrolitr tRNA, 5-prime-endowe znakowane radioaktywnie RNA i sześć mikrolitrów o odpowiednim stężeniu białka. Inkubować reakcje wiązania białek w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Oddzielić frakcję RNA związaną z białkiem od frakcji niezwiązanej za pomocą wiązania filtra nitrocelulozowego.Zastosować reakcję wiązania na filtr nitrocelulozowy podłączony do kolektora próżniowego w temperaturze pokojowej. Tylko kompleks białkowy RNA zostanie zatrzymany na filtrze, podczas gdy niezwiązane RNA przepływa przez filtr. Pokrój część filtra nitrocelulozowego zawierającą zatrzymany radioaktywny RNA na mniejsze kawałki, aby zmieściły się w probówce mikrowirówki i dodaj wystarczającą ilość buforu proteinazy K, aby zanurzyć kawałki filtra.Eluuj RNA z kawałków filtra przez dwie do trzech godzin lub przez noc. Następnie przenieś roztwór z każdej probówki do nowej probówki i ekstrahuj chloroformem fenolowym i chloroformem, jak pokazano wcześniej. Zebrać fazę wodną i dodać do niej 0,1 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości etanolu i inkubować w zamrażarce.Po odwirowaniu, umyciu i wysuszeniu RNA, jak pokazano wcześniej, ponownie zawieś RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Wszystkie czynności związane z jodem muszą być wykonywane w okapie wyciągowym. Aby rozszczepić RNA w miejscach włączenia fosforotionianu, dodaj do każdej próbki RNA jednomilimolowy jod w 20 mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC zawierającej do 10 mikrogramów nośnika tRNA.Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wytrącić rozszczepione RNA, dodając octan sodu i etanol, jak pokazano wcześniej. Ponownie zawiesić rozszczepione RNA w barwniku ładującym do żeli denaturujących.Po podgrzaniu załaduj próbki do 15-20% denaturującego żelu poliakrylamidowego i oddziel fragmenty RNA za pomocą elektroforezy. Wystaw żel poliakryloamidowy na kliszę rentgenowską i wykryj prążki we frakcji związanej w stosunku do całkowitej puli za pomocą autoradiografii. Ten schemat ilustruje koncepcję partycjonowania z powodu zakłóceń.Na torze T, całkowita frakcja RNA, intensywność pasma jest w przybliżeniu równa dla wszystkich domieszkowanych pozycji. We frakcji RNA związanej z białkiem, w pozycjach 1, 4 i 7, nukleotyd nie ma wpływu na wiązanie. Jednak w pozycjach 3 i 6 zakłóca wiązanie i jest wyłączony z frakcji związanej.W pozycji 5 interferencja jest częściowa. Porównania sparowanych torów dla każdego nukleotydu pozwalają na analizę wszystkich czterech nukleotydów. Ten autoradiogram pokazuje dwie pary pasów z żelu denaturującego.Pas T to całkowite RNA, a tor B to RNA związany z białkiem. Pionowa linia wyznacza miejsce wiązania płciowo-letalnego. W przypadku pary alfa-tioalinowej prążki 1, 2, 3 i 5 są obecne w całkowitej frakcji RNA, ale nieobecne lub znacznie zmniejszone w związanej frakcji RNA.W przypadku pary alfa-tiouliny pasma 7 i 8 są stosunkowo mniej intensywne we frakcji związanej. Pozostałości, które są preferencyjnie wykluczone z frakcji związanej, są ważne dla wiązania białek. Po zsyntetyzowaniu RNA i znakowaniu 5-prime-end, technikę tę można wykonać w ciągu 12 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ważnym czynnikiem jest odpowiedni poziom włączenia fosforotionianu i określenie odpowiedniego stężenia białka do wiązania. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak odpowiednie testy funkcjonalne lub testy in vivo, aby zweryfikować wynik podejścia mutagenezy i zrozumieć znaczenie biologiczne. Ta technika stanowi alternatywę dla innych metod, które są albo droższe, albo bardziej pracochłonne, albo jedno i drugie.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować i syntetyzować bibliotekę mutantów, przeprowadzać reakcje wiązania, identyfikować zmutowane nukleotydy w każdej puli i analizować ilościowo wpływ nukleotydów typu innego niż dziki w każdej testowanej pozycji. Nie zapominaj, że praca z poliakrylamidem i radioaktywnością może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie rękawiczek, odpowiednie wydech i osłony radioaktywne.

a-novel-saturation-mutagenesis-approach-single-step-characterization

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Poznaj jednoetapową mutagenezę saturacji miejsc wiązania białek w RNA przy użyciu fosforotionianów. Ta metoda upraszcza badanie interakcji RNA-białko i regulacji ekspresji genów.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów (Wideo) | JoVE Journal

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Przeglądaj więcej filmów