Name: Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metody izolacji monocytów ludzkich do generowania komórek dendrytycznych in vitro. Porównaj selekcję przylegania i separację magnetyczną przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, przyznając K99/R00 AA021264. Dodatkowe wsparcie laboratoryjne w ramach pakietu startowego otrzymano od Wydziału Immunologii, Instytutu Farmakologii Neuroimmunologicznej, Herbert Wertheim College of Medicine oraz FIU - Biura Badań i Rozwoju Gospodarczego. Gianna Casteleiro była wspierana przez NIH/NIGMS R25 GM061347. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Ogólne badania krwi ludzkiej zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board (IRB) FIU, zatwierdzenie protokołu IRB # IRB-13-0440. Ludzkie leukopaki zostały zakupione w lokalnym banku krwi w Miami na Florydzie.
1. Izolacja PBMC za pomocą techniki gradientu gęstości standardowej
<ol>
	<li>Wykonać rozcieńczenie krwi w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem w kolbie T75.</li>
	<li>Odpipetować 15 ml roztworu gradientu gęstości do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i ostrożnie nałożyć (25 - 30 ml na probówkę) rozcieńczoną krew na ten gradient</li>.
	<li>Wirować przez 20 minut przy 1 200 x g z przyspieszeniem 1 i opóźnieniem 0.</li>
	<li>Po odwirowaniu zebrać warstwę graniczną (białe krwinki) do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przemyć komórki dwukrotnie w PBS (3 minuty przy 1,080 x g). Za każdym razem należy odrzucić supernatant.</li>
	<li>Potraktuj komórki buforem lizującym chlorek amonu i potasu (ACK) (w celu lizy czerwonych krwinek). Dodać 10 ml buforu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS, odwirować przez 3 minuty przy 1,080 x g i za każdym razem odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zachowaj pastylkę, która będzie zawierała PBMC.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z wybraną metodą oczyszczania monocytów.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie monocytów metodą przylegania
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą L-glutaminę (300 mg/ml) i uzupełnioną penicyliną (50 U/ml)-streptomycyną (50 μg/ml) i 10% płodową surowicą bydlęcą.</li>
	<li>Pozostawić PBMC do przylegania przez około 2 godziny, hodując je w kolbie T75 o stężeniu 5 x 10,7 komórek na 10 ml kompletnej pożywki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć nieprzylegające pływające komórki z kolby hodowlanej i delikatnie przemyć przylegające komórki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Inkubować przylegające komórki w kompletnym pożywce do hodowli komórkowej uzupełnionej 2 μl/ml ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i interleukiny 4 (IL-4) przechowywanej w stężeniu podstawowym 10 μg/ml.</li>
	<li>Zmień połowę pożywki i uzupełniaj cytokiny co 48 godzin.</li>
	<li>Odczekaj 5 - 7 dni na różnicowanie monocytów w MDDC.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie monocytów metodą separacji magnetycznej
<ol>
	<li>Zebrać PBMC z techniki gradientu gęstości standardowej, przelać do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml i ponownie zawiesić w buforze PBS przy stężeniu komórek/ml.</li>
	<li>Dodać koktajl wzbogacający ludzkie monocyty przy użyciu komórek o objętości 50 μl/ml, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać cząstki magnetyczne za pomocą komórek o stężeniu 50 μl/ml, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Doprowadzić zawiesinę komórek do całkowitej objętości 2,5 ml przez dodanie buforu PBS, dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 2 - 3 razy.</li>
	<li>Umieść rurkę styropianową bez nakrętki w urządzeniu magnetycznym i odstaw na 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji i jednym ciągłym ruchem podnieś magnes i wlej żądaną oczyszczoną frakcję monocytów do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Inkubować przylegające komórki w kompletnym pożywce do hodowli komórkowej uzupełnionej 2 μl/ml ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i interleukiny 4 (IL-4) przechowywanej w stężeniu podstawowym 10 μg/ml.</li>
	<li>Co 48 godzin zmieniaj połowę pożywki, wiruj z prędkością 1,080 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad z nowymi pożywkami (CRPMI) i cytokinami.</li>
	<li>Odczekaj 5 - 7 dni na różnicowanie monocytów w MDDC.</li>
</ol>
4. Test żywotności wykluczenia błękitu trypanowego
Uwaga: Użyj tej techniki, aby uzyskać wydajność komórek i żywotność PBMC, monocytów i MDDC.
<ol>
	<li>Zebrać komórki przy użyciu standardowej trypsyny-EDTA i przeprowadzić płukanie kolb i osadu komórkowego za pomocą PBS. W zależności od wielkości osadu, należy ponownie zamieszać od 5 do 10 ml PBS w celu rozpuszczenia osadu.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówek rozcieńczyć odczynnik błękitu trypanowego w stosunku 1:1 z rozcieńczonym osadem komórkowym.</li>
	<li>Z tej mieszanki podamulować 10 μl na szkiełko do zliczania komórek i odczytać wyniki za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z protokołem producenta. Jeśli automatyczny licznik komórek nie jest dostępny, podobne zliczanie komórek jest możliwe przy użyciu hemocytometru lub licznika ręcznego.</li>
</ol>
5. Test MTT
<ol>
	<li>Płytki w stężeniu 4 x 104/100 μl kompletnych pożywek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Odczekaj 24 godziny, aż komórki dostosują się do hodowli.</li>
	<li>Inkubuj i wykonuj odczyty odpowiednio o godzinie 0 (dzień 0), 36 (dzień 3) i 84 (dzień 7).</li>
	<li>Po zakończeniu pożądanej inkubacji usunąć pożywkę i zastąpić ją 100 μl samego PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) (5 mg/ml) przez dodanie 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) do 1 g dodecylosiarczanu sodu (SDS).</li>
	<li>Dodać 10 μl (5 mg/ml) roztworu MTT do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 2 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji usunąć supernatanty zawierające PBS i nieprzekształconą mieszaninę MTT (roztwór o żółtym zabarwieniu).</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu SDS-DMSO do każdego dołka i inkubować przez dodatkową godzinę.</li>
	<li>Odczyt absorbancji przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
</ol>
6. Analiza barwienia powierzchni komórek za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Po 7 dniach różnicowania z oczyszczonymi monocytami należy dozować 1x106 porcji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów do odpowiedniej liczby probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Barwienie powierzchni komórek należy rozpocząć od zablokowania komórek za pomocą 50 μl inaktywowanej termicznie (HI) surowicy ludzkiej, inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować komórki w stężeniu 720 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant.</li>
	<li>Do osadu komórkowego dodać odpowiednie przeciwciała sprzężone z fluorochromem (np. anty-CD11c lub anty-CD14) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut, chroniąc przed światłem. W oddzielnych probówkach należy przygotować pojedyncze próbki barwione fluorochromem/ml), ponieważ są one potrzebne do kompensacji.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie w 1 ml buforu PBS i odwirować za każdym razem przy 720 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Chroniąc komórki przed światłem, ponownie zawiesić w buforze PBS przy stężeniu komórek/100 μl w celu analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Aby uzyskać bramkę na żywotnych komórkach, dodaj 1 μl DAPI do każdej probówki przed pobraniem komórek za pomocą przyrządu do obrazowania przepływowego pojedynczych komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wprowadź wszystkie dane do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Porównaj wyniki, korzystając z testu t studenta i/lub jednoczynnikowej ANOVA, w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Uznajmy, że różnice są statystycznie istotne, jeśli p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+maturation+and+antigen+presenting+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Imunol%22%5BJournal%5D)">Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells.</a> Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).</li>
<li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of Dendritic Cells.</a> Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Kaouther, M., Ridha, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Graft+Tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Graft Tolerance.</a> ISRN Pharmacol. , (2011).</li>
<li>Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+are+the+principal+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> J Exp Med. 157, 613-627 (1983).</li>
<li>Nair, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-directed+inhibition+of+DC-SIGN+by+dendritic+cells%3A+Prospects+for+HIV-1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy.</a> AAPS J. 7, E572-E578 (2005).</li>
<li>Agudelo, M., et al. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgudelo%2C+M+%22Dendritic+Cells%3A+Types%2C+Life+Cycles+and+Biological+Functions%22">Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions</a>. , Nova Publishers. 167-177 (2010).</li>
<li>Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+dendritic+cell-tumor+fusion+cells+on+cancer+vaccines+-+past+progress+and+future+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies.</a> Immunotherapy. , (2015).</li>
<li>Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+tissue+specific+tolerance+in+autoimmune+disease+with+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells.</a> Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).</li>
<li>Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+dendritic+cell+responses+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy.</a> Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).</li>
<li>Zwolak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+dendritic+cells+in+alcoholic+and+autoimmune+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders.</a> Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).</li>
<li>Agudelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+functional+role+of+cannabinoid+genes+in+alcohol+users%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Alcohol+Depend%22%5BJournal%5D)">Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users.</a> Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).</li>
<li>Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+Versus+Cannabinoids%3A+A+Review+of+Their+Opposite+Neuro-Immunomodulatory+Effects+and+Future+Therapeutic+Potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alcohol+Drug+Depend%22%5BJournal%5D)">Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials.</a> J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).</li>
<li>Boukli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+ER+Stress%2C+the+Unfolded+Protein+Response%2C+and+Pro-+and+Anti-Apoptotic+Protein+Fingerprints+in+Human+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+Treated+With+Alcohol%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol.</a> Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).</li>
<li>Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+Modulates+DC-SIGN+Expression+by+Mature+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).</li>
<li>Napuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Enhances+HIV-1+Infectivity+in+Monocyte+Derived+Dendritic+Cells+by+Suppressing+microRNA-155%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155.</a> PLoS ONE. 8, e83682(2013).</li>
<li>Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+methamphetamine+on+expression+of+HIV+coreceptors+and+CC-chemokines+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells.</a> Life Sciences. 88, 987-994 (2011).</li>
<li>Nair, M. P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+Modulates+Dendritic+Cell-Specific+C+Type+Intercellular+Adhesion+Molecule-3-Grabbing+Nonintegrin+Expression+by+Dendritic+Cells+in+HIV-1+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients.</a> J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).</li>
<li>Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+methamphetamine+%28METH%29-induced+differential+protein+expression+by+immature+dendritic+cells+%28IDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC).</a> Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).</li>
<li>Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dendritic+cells.+Enrichment+and+characterization+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood.</a> J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).</li>
<li>Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mac-1+and+p150%2C95+beta+2+integrins+bind+denatured+proteins+to+mediate+leukocyte+cell-substrate+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion.</a> Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).</li>
<li>Delirezh, N., Shojaeefar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+comparison+between+flask+adherent+and+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells.</a> Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).</li>
<li>Lehner, M., Holter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-Free+Purification+of+Monocytes+for+Dendritic+Cell+Generation+via+Discontinuous+Density+Gradient+Centrifugation+Based+on+Diluted+Ficoll-Paque+Plus%3Csup%3E%C2%AE%3C%2Fsup%3E%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®.</a> Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).</li>
<li>Van Brussel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting%3A+An+effective+approach+to+study+dendritic+cell+subsets+in+human+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques.</a> J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).</li>
<li>Mucci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methodological+approach+for+the+generation+of+humandendritic+cells+from+monocytes+affects+the+maturation+state+of+the+resultant+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells.</a> Biologicals. 37, 288-296 (2009).</li>
<li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuan%2C+N+%22The+American+Association+of+Immunologists+%28AAI%29%22">The American Association of Immunologists (AAI)</a>. , AAI. Miami Beach, FL. (2007).</li>
<li>Romani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+dendritic+cell+progenitors+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Proliferating dendritic cell progenitors in human blood.</a> J Exp Med. 180, 83-93 (1994).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS%C2%AE-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+magnetic+activated+cell+sorted+monocytes+and+monocyte+adherence+techniques+for+in+vitro+generation+of+immature+dendritic+cells%3A+an+Egyptian+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial.</a> Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).</li>
<li>Curry, C. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCurry%2C+CV+%22Differential+Blood+Count%22">Differential Blood Count</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview">http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview</a> (2015).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).</li>
<li>Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cell+Cultures+Is+Caused+by+Progenitor+Cells+Capable+of+Myeloid+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation.</a> Blood. 92, 1598-1607 (1998).</li>
<li>Ardeshna, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+proliferate+and+are+not+susceptible+to+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction.</a> Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).</li>
<li>Chapuis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+dendritic+cells+from+monocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.</a> Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).</li>
<li>Zhou, L. J., Tedder, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B+blood+monocytes+can+differentiate+into+functionally+mature+CD83%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie ujawniają żadnych sprzecznych interesów finansowych.

Opierając się na znanych trudnościach związanych z izolowaniem i wytwarzaniem MDDC z ludzkiej krwi, niniejsze badanie miało na celu zapewnienie kompleksowego porównania dwóch dobrze znanych metod wytwarzania MDDC. Pierwsza porównana metoda jest dobrze ugruntowaną tradycyjną metodą generowania MDDC poprzez wykorzystanie zdolności monocytów do przylegania do szkła lub tworzywa sztucznego (metoda przylegania) 21,22,27. Metoda przylegania jest szybka i opłacalna oraz nie wymaga użycia skomplikowanego sprzętu. Jedn...

Komórki dendrytyczne (DC) są niezbędnymi mediatorami wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego. Ich zadaniem jest wywoływanie pierwotnych odpowiedzi immunologicznych i ułatwianie rozwoju pamięci immunologicznej. Komórki te są przede wszystkim odpowiedzialne za wychwytywanie antygenu, migrację i stymulację limfocytów T i dlatego są określane jako profesjonalne komórki prezentujące antygen (APC) 1. Manipulacja DC może być wykorzystywana w wielu różnych dziedzinach badawczych i w warunkach klinicznych do leczenia różnych chorób zapalnych, takich jak HIV 6,7, rak 8, choroby autoimmunologiczne 9 i reakcje alergiczne 10. DC są również wykorzystywane do badań nad nadużywaniem substancji w celu rozwiązania nieznanych mechanizmów i ścieżek, takich jak te związane z uzależnieniem od alkoholu 11-14, uzależnieniem od narkotyków 13,15 oraz połączeniem zakażenia HIV i nadużywania substancji 16-19. Te trwające badania i przyszłe badania naukowe w dziedzinie immunologii sprawiają, że wytwarzanie DC in vitro jest niezwykle ważne dla badań. Istnieje jednak kilka trudności związanych z izolacją DC od ludzkiej krwi, ponieważ stanowią one tylko 0,1 - 1% wszystkich komórek jednojądrzastych krwi 20.
Do tej pory, niektóre z dobrze znanych metod generowania DC in vitro obejmują przyleganie monocytów do plastiku lub szkła 21,22, wirowanie w gradionym gradinie gęstości 23, separację opartą na specyficznych markerach, taką jak sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie 22, sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie 24, pozytywną selekcję monocytów CD14+ przy użyciu nanocząstek magnetycznych pokrytych dektranem 25oraz szybka izolacja wysoce oczyszczonych monocytów przy użyciu w pełni zautomatyzowanej selekcji komórek ujemnych 26. Jednak najlepsza metoda z wyboru pozostaje kontrowersyjna. Dlatego, aby ulepszyć techniki generowania prądu stałego, opracowano kilka metod, w których czystość tych komórek można znacznie zwiększyć poprzez różnicowanie z oczyszczonymi komórkami progenitorowymi CD34 + i monocytami wyizolowanymi z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) 27. Jak wspomniano wcześniej, szeroko stosowaną i popularną metodą generowania komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (MDDC) jest zbadanie zdolności monocytów do przylegania do szkła lub plastiku (metoda przylegania) 21,22,27. Metoda adherencji jest szybką i prostą metodą, która nie wymaga użycia skomplikowanego sprzętu. Jednak niektóre wady tego procesu obejmują zanieczyszczenie limfocytami, niską elastyczność i przejściową manipulację monocytami 28. Alternatywną metodą do metody adherencji jest izolacja magnetyczna monocytów od wszystkich PBMC , w szczególności przy użyciu zestawu do wzbogacania monocytów ludzkich, który jest przeznaczony do izolowania monocytów od PBMC metodą selekcji negatywnej 26. Podczas tej procedury niechciane komórki są kierowane do usunięcia za pomocą tetramerycznych kompleksów przeciwciał i cząstek magnetycznych pokrytych dekstranem. Zaletą tej metody izolacji jest to, że niechciane oznakowane komórki są oddzielane za pomocą magnesu, podczas gdy komórki docelowe można swobodnie wylewać do nowej probówki bez konieczności stosowania kolumn. Do tej pory, dzięki dostępności specyficznych przeciwciał monoklonalnych, które mogą znakować unikalne populacje komórek, technika separacji magnetycznej stała się nie tylko dodatkową metodą, ale koniecznością izolacji rzadkich komórek w dziedzinie immunologii. Na przykład techniki takie jak magnetyczne sortowanie komórek za pomocą dostępnych na rynku paramagnetycznych nanocząstek MAC ułatwiły opracowanie nowych podejść do badań i zastosowań klinicznych 22,29. Co więcej, ostatnie badania porównujące wytwarzanie prądu stałego z adherencji monocytów i metod technologii MACS wykazały wyższą czystość i żywotność DC przy użyciu monocytów oddzielonych MACS 22,30.
Obecne badanie przedstawia porównanie dwóch metod generowania ludzkich DC z monocytów wyizolowanych z PBMC: 1) izolacja monocytów przez adherencję i 2) izolacja monocytów przez selekcję negatywną przy użyciu komercyjnego zestawu do wzbogacania ludzkich monocytów. Badanie to dostarcza dowodów na to, że procedura separacji magnetycznej selekcji negatywnej w celu wyizolowania monocytów generuje najwyższą wydajność monocytów bez znaczących różnic w żywotności monocytów w porównaniu z monocytami wyizolowanymi metodą adherencji. Z kolei po siedmiu dniach monocyty wyizolowane metodą separacji magnetycznej różnicowały się w MDDC o istotnie wyższej zdolności proliferacyjnej i większej liczbie komórek wyrażających fenotyp podwójnie dodatni (CD11c+/CD14+) bez wpływu na żywotność MDDC. Ogólnie rzecz biorąc, obecne badanie różni się od poprzednich badań, o których mowa powyżej, ponieważ pokazuje zdolność obu technik do jednoczesnego generowania monocytów, które są zdolne do proliferacji i różnicowania się w MDDC CD11c + (> 70%) po siedmiu dniach w hodowli bez uszczerbku dla ich żywotności. Ponadto obecne podejście umożliwia po raz pierwszy scharakteryzowanie różnych populacji MDDC CD11c/CD14 za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.
Podsumowując, ponieważ DC odgrywają kluczową rolę w badaniach w dziedzinie immunologii, różne parametry muszą być brane pod uwagę przy rozważaniu, w jaki sposób są one uzyskiwane i jakie metody są używane do ich izolacji i hodowli in vitro. Dlatego badanie to ma na celu dostarczenie wglądu w dwie różne metody izolacji monocytów oraz sposób, w jaki metody te w różny sposób wpływają na żywotność i wydajność monocytów, ostatecznie wpływając na żywotność komórek dendrytycznych, proliferację i fenotyp. Odkrycia te wniosą ogromny wkład w dziedzinę immunologii i zapewnią szczegółowy protokół izolacji, oczyszczania i charakterystyki DC.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Należy stosować w RT</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor lizujący</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td>RoboSep StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania monocytów ludzkich EasySep</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik wielomodowy Synergy 2</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Bioodczynnik soli sodowej (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Bioreagent do dimetylosulfotlenku (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromek tetrazolowy błękitu tiazolylowego (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Metosiarczan fenazyny (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana (HI) surowica ludzka</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Accuri C6</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Cytometr przepływowy Amnis</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Komórki dendrytyczne (DCs) to komórki układu odpornościowego prezentujące antygen, które odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach limfocytów, mechanizmach obronnych gospodarza i patogenezie stanu zapalnego. Izolacja i badanie DC były ważne w badaniach biologicznych ze względu na ich charakterystyczne cechy. Chociaż są one niezbędnymi kluczowymi mediatorami układu odpornościowego, DC są bardzo rzadkie we krwi, stanowiąc około 0,1 - 1% wszystkich komórek jednojądrzastych krwi. Dlatego alternatywy dla metod izolacji opierają się na różnicowaniu DC od monocytów wyizolowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Konieczne jest rozważenie zastosowania odpowiednich technik izolacji, które łączą prostotę, przystępność cenową, wysoką czystość i wysoką wydajność komórek. W niniejszym badaniu porównane zostaną dwie odrębne metody wytwarzania prądów stałych. Monocyty wybierano przez adherencję lub ujemnie wzbogacano za pomocą procedury separacji magnetycznej, a następnie różnicowano w DC z IL-4 i GM-CSF. Żywotność, proliferację i fenotyp monocytów i MDDC oceniano za pomocą barwników żywotności, testu MTT i analizy markerów powierzchniowych CD11c/CD14 za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej. Chociaż metoda separacji magnetycznej pozwoliła uzyskać znacznie wyższy odsetek monocytów o wyższej zdolności proliferacyjnej w porównaniu z metodą adhezyjną, odkrycia wykazały zdolność obu technik do jednoczesnego generowania monocytów, które są zdolne do proliferacji i różnicowania się w żywotne MDDC CD11c+ po siedmiu dniach w hodowli. Obie metody dały > 70% MDDC CD11c+. Dlatego nasze wyniki dostarczają spostrzeżeń, które przyczyniają się do opracowania wiarygodnych metod izolacji i charakterystyki ludzkich DC.

Wydajność izolacji monocytów metodą separacji magnetycznej jest wyższa w porównaniu z wydajnością izolacji monocytów metodą adhezji
Dane przedstawione na Rysunku 1 obrazują liczbę komórek PBMC i monocytów wyznaczoną metodą wykluczania błękitu trypanowego w dniu izolacji PBMC i separacji monocytów. Średnio monocyty izolowane metodą adhezyjną stanowiły około 6,2 procent całkowitej liczby PBMC, pod...

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Ogólnym celem niniejszego badania jest porównanie dwóch różnych metod izolacji ludzkich monocytów w celu generowania komórek dendrytycznych in vitro oraz charakterystyka ekspresji powierzchniowej CT11c i CT14 w wynikających z tego populacjach pochodnych monocytów za pomocą obrazującej cytometrii przepływowej. Te protokoły izolacji monocytów mogą przyczynić się do opracowania wiarygodnych metod oczyszczania ludzkich komórek dendrytycznych do zastosowań badawczych i klinicznych. Główną zaletą tych protokołów jest to, że ułatwiają one izolację ludzkich monocytów oraz ich różnicowanie w żywotne i funkcjonalne komórki pochodzenia monocytowego.Ponadto jest to pierwsze badanie, w którym scharakteryzowano specyficzną populację komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego przy użyciu wieloparametrycznej cytometrii przepływowej z obrazowaniem pojedynczych komórek. Metoda ta może być również zastosowana jako alternatywa dla izolacji innych rzadkich komórek z uzyskaniem odpowiedniej wydajności dla dalszych zastosowań badawczych. Wizualna prezentacja tych metod jest kluczowa, ponieważ bezpieczna obsługa próbek krwi bez odpowiednich instrukcji i doświadczenia może być trudna.Zacznij od rozcieńczenia próbki krwi w stosunku jeden do jednego z PBS w kolbie T75. Następnie wlej 15 mililitrów roztworu gradientu gęstości do probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów i ostrożnie nanieś od 25 do 30 mililitrów rozcieńczonej krwi na gradient. Aby uzyskać prawidłową separację monocytów i limfocytów krwi obwodowej, nanieś krew na roztwór gradientu gęstości szybko, lecz ostrożnie, nie mieszając warstw.Oddziel komórki poprzez wirowanie, a następnie przenieś warstwę przejściową z leukocytami do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Przemyj komórki dwukrotnie w PBS, resuspendując końcowy osad w 10 ml buforu lizującego z chlorkiem amonu i potasem przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przemyj komórki jeszcze dwukrotnie w PBS.Aby wyizolować monocyty metodą adhezji, należy wysiać 5 × 10⁷ komórek z otrzymanego osadu PBMC na 10 ml kompletnego medium w nowej kolbie T75 i inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze z nawilżaczem. Po zakończeniu inkubacji należy usunąć nieprzylegające komórki pływające i delikatnie przemyć dwukrotnie przylegające komórki roztworem PBS. Następnie komórki przylegające należy zasilić kompletnym medium hodowlanym uzupełnionym o ludzkie GMCSF oraz IL4 i przenieść hodowlę z powrotem do inkubatora na okres od pięciu do siedmiu dni.Aby wyizolować monocyty za pomocą separacji magnetycznej, po zebraniu PBMC metodą separacji w gradiencie gęstości, przenieś warstwę leukocytów do pięciomililitrowej probówki polistyrenowej i resuspenduj komórki w PBS do stężenia 5×10⁷ komórek/ml. Następnie do komórek dodaj 50 µL koktajlu do wzbogacania monocytów ludzkich na każdy mililitr, wymieszaj i inkubuj komórki z koktajlem w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie dodaj 50 µL cząsteczek magnetycznych na każdy mililitr komórek, uważnie wymieszaj i inkubuj komórki w temperaturze 4 °C przez pięć minut.Po zakończeniu drugiej inkubacji dodać do komórek PBS, tak aby całkowita objętość wyniosła 2,5 ml, i wymieszać poprzez dwu- lub trzykrotne pipetowanie. Następnie umieścić probówkę polistyrenową w odpowiednim urządzeniu magnetycznym w temperaturze pokojowej. Po dwóch i pół minutach, gdy probówka wciąż znajduje się w magnesie, przelać oczyszczoną frakcję monocytów do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Następnie należy hodować oczyszczone monocyty w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej uzupełnionej o GMCSF i IL4 przez okres od pięciu do siedmiu dni, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po siedmiu dniach różnicowania należy przenieść alikwoty komórek dendrytycznych pochodzenia monocytarnego w ilości 1×10⁶ do odpowiedniej liczby probótek o pojemności 1,5 ml i dodać 50 µL inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy do każdej próbki w celu zablokowania niespecyficznego wiązania. Po 10 minutach należy odwirować komórki i resuspender osady w odpowiednich przeciwciałach pierwszorzędowych sprzężonych z fluorescencją przez 20 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem.Następnie przemyj komórki dwukrotnie w 1 ml PBS, resuspending osady w 100 µL PBS na 1×10⁶ komórek. Bezpośrednio przed analizą dodaj 1 µL DAPI do każdej probówki. Następnie przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym z obrazowaniem pojedynczych komórek zgodnie z instrukcjami producenta.Średnio monocyty izolowane metodą adhezyjną stanowią około 6,2% całkowitej populacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC), podczas gdy monocyty izolowane za pomocą separacji magnetycznej stanowią do 25% całkowitej liczby PBMC. Monocyty izolowane obiema metodami wykazują taką samą żywotność. MDDC zróżnicowane z monocytów oczyszczonych obiema metodami poddano w pierwszej kolejności bramkowaniu w celu wyłonienia komórek żywotnych (DAPI-ujemnych) z całkowitej liczby pojedynczych komórek, a następnie dokonano bramkowania dla każdej populacji komórkowej.Obie metody izolacji pozwoliły na uzyskanie niewielkiej, pojedynczej populacji CD14-dodatniej, a obie metody pozwoliły na uzyskanie wysokiej całkowitej populacji CD11c-dodatniej. Dalsza analiza fenotypowa została przeprowadzona na wszystkich komórkach CD11c-dodatnich i mimo że izolacja magnetyczna daje wyższy odsetek komórek podwójnie dodatnich CD11c-dodatnich i CD14-dodatnich, efekt ten był nieistotny w porównaniu z metodą adhezyjną. Te podwójnie dodatnie komórki CD11c-dodatnie i CD14-dodatnie mogą być wczesnym etapem zróżnicowania MDDC, które nie utraciły jeszcze monocytowego markera CD14.Podczas analizy pojedynczych komórek CD11c-dodatnich metoda adhezji zapewnia najwyższą wydajność otrzymywania komórek CD11c-dodatnich i CD14-ujemnych. Te pojedynczo dodatnie komórki mogą być MDDC na późnym etapie różnicowania. Po opanowaniu techniki, metody adhezyjnej oraz izolacji magnetycznej można przeprowadzić odpowiednio w ciągu trzech do czterech oraz jednej do dwóch godzin, pod warunkiem ich prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dostarczeniu świeżych cytokin różnicujących komórki dendrytyczne co 48 godzin, podczas uzupełniania pożywki. Praca z płynami biologicznymi o charakterze niebezpiecznym, takimi jak krew, może być niezwykle szkodliwa, dlatego podczas przeprowadzania tych procedur należy zawsze stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej oraz właściwe metody utylizacji. Niniejsze badanie otwiera drogę badaczom z dziedziny immunologii do eksploracji zastosowania ludzkich monocytów i komórek dendrytycznych w leczeniu terapeutycznym.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak zoptymalizować izolację ludzkich monocytów w celu generowania różnych populacji komórek pochodzenia monocytarnych in vitro.

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metody izolacji monocytów ludzkich do generowania komórek dendrytycznych in vitro. Porównaj selekcję przylegania i separację magnetyczną przy użyciu cytometrii przepływowej z obrazowaniem.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Przeglądaj więcej filmów