Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Ogólnym celem tego badania jest porównanie dwóch różnych metod izolacji ludzkich monocytów do generowania komórek dendrytycznych in vitro oraz scharakteryzowanie ekspresji powierzchni komórek CT11c, CT14 w powstałych populacjach pochodzących z monocytów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej. Te protokoły izolacji monocytów mogą przyczynić się do opracowania niezawodnych metod oczyszczania ludzkich komórek dendrytycznych do zastosowań badawczych i klinicznych. Główną zaletą tych protokołów jest to, że ułatwiają izolację ludzkich monocytów i ich różnicowanie w żywotne i funkcjonalne komórki pochodzące z monocytów.

Ponadto jest to pierwsze badanie, w którym scharakteryzowano specyficzną populację komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania pojedynczych komórek. Metoda ta może być również stosowana jako alternatywa dla izolacji innych rzadkich komórek z odpowiednią wydajnością do dalszych zastosowań badawczych. Wizualna demonstracja tych metod ma kluczowe znaczenie, ponieważ bezpieczne obchodzenie się z próbkami krwi bez odpowiednich instrukcji i doświadczenia może być trudne.

Rozpocząć od rozcieńczenia próbki krwi w stosunku jeden do jednego za pomocą PBS w kolbie T75. Następnie dodaj 15 mililitrów roztworu gradientu gęstości do 50-mililitrowej probówki wirówkowej i ostrożnie ułóż 25 do 30 mililitrów rozcieńczonej krwi na gradiencie. Aby uzyskać prawidłowe oddzielenie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, należy szybko załadować krew do roztworu gradientu gęstości, ale ostrożnie i bez mieszania warstw.

Oddziel komórki przez odwirowanie, a następnie przenieś warstwę interfejsu białych krwinek do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj komórki dwa razy w PBS, ponownie zawieszając ostatnią osadkę w 10 mililitrach buforu lizującego chlorek amonu i potasu na 15 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki jeszcze dwa razy w PBS.

Aby wyizolować monocyty metodą adherencji, należy hodować pięć razy 10 do siedmiu komórek powstałego osadu PBMC na 10 mililitrów kompletnej pożywki w nowej kolbie T75 przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla w wilgotnym inkubatorze. Pod koniec inkubacji wyrzucić nieprzylegające pływające komórki i delikatnie przemyć przylegające komórki dwa razy PBS. Następnie nakarm przylegające komórki kompletną pożywką do hodowli komórkowych uzupełnioną ludzkim GMCSF i IL4 i zwróć hodowlę do inkubatora na pięć do siedmiu dni.

Aby wyizolować monocyty przez separację magnetyczną, po zebraniu PBMC przez separację gradientu gęstości przenieś warstwę białych krwinek do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej i ponownie zawiesić komórki w PBS przy stężeniu pięć razy 10 do siedmiu komórek na mililitr. Następnie dodaj 50 mikrolitrów ludzkiego koktajlu wzbogacającego monocyty na mililitr do komórek z mieszaniem i inkubuj komórki z koktajlem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów cząstek magnetycznych na mililitr komórek, starannie mieszając i inkubuj komórki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Pod koniec drugiej inkubacji dodać PBS do komórek, aby zwiększyć całkowitą objętość do dwóch przecinków i mililitrów i wymieszać, pipetując dwa do trzech razy. Następnie umieść rurkę styropianową w odpowiednim urządzeniu magnetycznym w temperaturze pokojowej. Po dwóch i pół minutach, gdy probówka nadal znajduje się w magnesie, zdekantuj oczyszczoną frakcję monocytów do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie hoduj oczyszczone monocyty i kompletną pożywkę do hodowli komórkowej uzupełnioną GMCSF i IL4 przez pięć do siedmiu dni, jak właśnie pokazano. Po siedmiu dniach różnicowania dozuj jeden razy 10 do sześciu licytów komórkowych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów do odpowiedniej liczby jednopunktowych pięciomililitrowych probówek i dodaj 50 mikrolitrów inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej do każdej próbki, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wyniki. Po 10 minutach odwirować komórki i ponownie zawiesić granulki w odpowiednich fluorescencyjnych sprzężonych przeciwciałach pierwszorzędowych na 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza chronionych przed światłem.

Następnie umyj komórki dwa razy w jednym mililitrze PBS, ponownie zawieszając granulki w 100 mikrolitrach PBS na jeden razy dziesięć do sześciu komórek. Tuż przed analizą dodaj jeden mikrolitr DAPI do każdej probówki. Następnie odczytaj próbki na cytometrze przepływowym do obrazowania pojedynczej komórki zgodnie z instrukcjami producenta.

Średnio monocyty wyizolowane metodą adherencji stanowią około sześciu lub dwóch procent całkowitej populacji komórek monocytów krwi obwodowej lub PBMC, podczas gdy monocyty wyizolowane przez separację magnetyczną stanowią do 25 procent całkowitego PBMC. Monocyty wyizolowane którąkolwiek metodą są równie żywotne. MDDC zróżnicowane z monocytów oczyszczonych obiema metodami były najpierw bramkowane na podstawie ujemnych lub żywotnych komórek DAPI z całkowitej liczby pojedynczych komórek, a następnie bramkowane dla każdej populacji komórek.

Obie metody izolacji dały niską pojedynczą populację CD14 dodatnią, a obie metody dały wysoką całkowitą populację CD11c dodatnią. Dalsza analiza fenotypowa została przeprowadzona na wszystkich komórkach CD11c dodatnich i mimo że izolacja magnetyczna daje wyższy odsetek podwójnie dodatnich komórek CD11c dodatnich CD14, efekt ten był nieistotny w porównaniu z metodą adherencji. Te podwójnie dodatnie komórki CD11c-dodatnie, CD14-dodatnie mogą być MDDC zróżnicowanymi we wczesnym stadium, które jeszcze nie upuściły markera monocytowego CD14.

Podczas analizy pojedynczych komórek CD11c dodatnich, metoda adherencji daje najwyższą wydajność komórek CD11c dodatnich, CD14 ujemnych. Te pojedyncze dodatnie komórki mogą być MDDC w późnym stadium. Po opanowaniu, techniki przylegania i izolacji magnetycznej można wykonać odpowiednio w ciągu trzech do czterech i jednej do dwóch godzin, jeśli są wykonywane prawidłowo.

Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby co 48 godzin po uzupełnieniu pożywki mieć świeże cytokiny różnicowania komórek dendrytycznych. Praca z płynami stanowiącymi zagrożenie biologiczne, takie jak krew, może być niezwykle szkodliwa, a podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i metody utylizacji. Badanie to toruje drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania możliwości wykorzystania ludzkich monocytów i komórek dendrytycznych w leczeniu terapeutycznym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zoptymalizować izolację ludzkich monocytów w celu generowania różnych populacji komórek pochodzących z monocytów in vitro.