Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Protokół ten może pomóc nam scharakteryzować odpowiedź immunologiczną gospodarza na różne biomateriały, co z kolei może pomóc w projektowaniu lepszych przyszłych implantów medycznych. Cytometria przepływowa dostarcza nam informacji o komórkach odpornościowych infiltrujących biomateriał, co pomaga nam określić mechanizmy reakcji komórek na uraz i implantację materiału, a także cele dla ulepszonych terapii. Ten sam protokół może być modyfikowany w celu scharakteryzowania odpowiedzi immunologicznej w różnych ustawieniach.

Przeprowadź sekcję mięśnia czworogłowego myszy, które tydzień temu otrzymały implant ECM i zebrały się w 50-mililitrowej probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki wolnej od surowicy. Na koniec pokrój tkankę w kostkę za pomocą nożyczek. Następnie dodaj do probówki pięć mililitrów pożywki enzymów trawiennych.

Umieść probówkę zawierającą pożywkę trawienną i pokrojone w kostkę tkanki w inkubatorze z wytrząsaniem na 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 100 obr./min. Pod koniec inkubacji przefiltrować strawioną zawiesinę tkankową przez sitko o średnicy 70 mikronów do pojedynczej probówki o pojemności 50 mililitrów. Użyj pięciomililitrowej głowicy strzykawki, aby zetrzeć dowolny stały kawałek chusteczek i umyć sitko PBS o temperaturze pokojowej.

Wyrzuć wszelkie pozostałe pozostałości z sitka i dostosuj objętość probówki do 50 mililitrów za pomocą PBS o temperaturze pokojowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach zimnego pięciomilimolowego roztworu EDTA w PBS. Jeśli w próbce obecne są krwinki, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu do lizy RBC, inkubuj przez 10 minut, a następnie dodaj dziewięć mililitrów EDTA.

Pozostawić zawiesinę na lodzie na 10 minut. Następnie dostosuj objętość do 50 mililitrów za pomocą zimnego PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki i 100 mikrolitrów zimnego PBS.

Przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny do pojedynczych mikroprobówek wirówkowych i wymieszaj z 10 mikrolitrami tripu i niebieskim do liczenia. Dozować pozostałą objętość komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Usuń 20 mikrolitrów komórek ze studzienki i dodaj je do nowej studzienki, aby użyć jej jako niebarwionej kontroli.

Następnie użyj PBS, aby doprowadzić końcową objętość w każdym dołku do 200 mikrolitrów. Zebrać komórki na dnie dołków płytkowych przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach barwnika żywotności o stężeniu od 1 do 1000 na studzienkę. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę 100 mikrolitrami świeżego PBS i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego na studzienkę.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawieś komórki w 50 mikrolitrach rozcieńczenia od jednego do 100 blokera monocytów. Inkubować zawiesinę komórkową przez pięć minut na lodzie, a następnie dodać 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał. Inkubować przez 30 minut na lodzie chronionym przed światłem.

Następnie umyj studzienki 100 mikrolitrami buforu barwiącego na studzienkę. Ponownie odwirować komórki i przemyć 200 mikrolitrami buforu barwiącego. Powtórz proces jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawiesij komórki w 400 mikrolitrach buforu barwiącego.

Przed analizą próbki należy uruchomić niebarwioną próbkę, aby umożliwić dostosowanie populacji komórek na wykresie rozrzutu bocznego w porównaniu z wykresem punktowym do przodu. Następnie uruchom poplamioną próbkę. Wyodrębnij sygnaturę autofluorescencyjną.

Następnie zaimportuj pliki FCS, aby użyć ich jako kontrolki do rozmieszania. Kliknij ikonę rozmieszania, aby otworzyć kreatora rozmieszania i wykonać rozmieszanie przy użyciu wszystkich kontrolek pojedynczego koloru, bramkując populacje dodatnie i ujemne. Następnie kliknij sekcję QC i spójrz na indeks złożoności.

Wskaźnik złożoności jest miarą tego, jak rozróżnialny jest zbiór sygnatur spektralnych, gdy sygnatury spektralne nie są ze sobą wymieszane. Na koniec odmiksuj próbkę, klikając live unmix. Tutaj można zaobserwować wyniki 14 faktów kolorystycznych na tkance myszy kontrolnej.

W tej analizie można było zaobserwować kilka populacji lobbystów, takich jak neutrofile dodatnie ly6g oraz klasy monocytów ly6c o średniej i wysokiej ekspresji. Dwie dodatnie komórki dendrytyczne CD11c o wysokim MHC były łatwo widoczne po bramkowaniu przeciwko CD11b, aby wykluczyć makrofagi i inne komórki linii szpikowej, takie jak neutrofile i monocyty. Podzbiór CD206 dodatnich komórek dendrytycznych CD86 można zidentyfikować, koncentrując się na tej populacji CD11c dodatniej, która obejmuje zarówno populacje komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości M1 CD86, jak i populacje komórek dendrytycznych o wysokiej M2 CD206.

F4/80 wykazał gradient ekspresji, który jest powszechnie obserwowany w różnych populacjach makrofagów. Siglec-F był obecny zarówno w populacjach dodatnich, jak i ujemnych F4-80, najprawdopodobniej odpowiadających odpowiednio podzbiorowi makrofagów i eozynofili. Chociaż barwienie markerami powierzchni komórek pozwala na dokonanie tych oznaczeń typów komórek, ważne jest, aby pamiętać, że komórki wyrażające różne markery powinny być postrzegane w sposób funkcjonalny, a nie w bardziej binarnej klasyfikacji.

Wypróbowując ten protokół, należy pamiętać, że zrozumienie sygnatury autofluorescencyjnej niedobarwionych próbek przed zaprojektowaniem panelu jest kluczem do uzyskania lepszego i mieszania. Oprócz analizy komórek, izolowane komórki można sortować w określone populacje w celu dalszej oceny za pomocą testów komórkowych, in vitro, analizy transkryptomicznej lub analizy mikroskopowej w celu oceny morfologii komórki. Rosnąca złożoność analiz biomateriałów za pomocą cytometrii przepływowej pomaga wypełnić lukę między podstawowymi badaniami immunologicznymi a inżynierią nowych środków terapeutycznych.