Name: Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej białek. Technika ta pozwala oceniać aktywatory, inhibitory i określać funkcjonalne role domen białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za dofinansowanie z grantu National Institutes of Health RO1AI049294 (dla M. S.).

1. Przeprowadź reakcję hydrolizy ATP z oczyszczonym białkiem
<ol>
	<li>Przygotować zapasy wszystkich niezbędnych odczynników do inkubacji z oczyszczonym białkiem.
	<ol>
		<li>Przygotować 5x bufor HEPES/NaCl/glicerol (HNG) zawierający 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl i 5% glicerolu (lub inny bufor do oznaczania, jeśli dotyczy).</li>
		<li>Przygotuj 100 mM MgCl2 (lub inny metal, jeśli ATPaza jest zależna od metalu) w wodzie.</li>
		<li>Przygotuj świeże 100 mM ATP w 200 mM Tris Base (nie dostosowuj dalej pH) przy użyciu ATP o wysokiej czystości. Podziel i przechowuj zapas ATP w temperaturze -20 °C nie dłużej niż kilka tygodni, ponieważ ATP rozkłada się z czasem, i powstrzymaj się od zamrażania i rozmrażania zapasów ATP.</li>
		<li>Premiks MgCl2 i ATP w stosunku 1:1 tuż przed rozpoczęciem reakcji hydrolizy ATP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować i oznaczyć probówki o pojemności 1,5 ml do pobierania próbek w regularnych odstępach czasu przez cały czas trwania reakcji. Przygotować probówki do pobierania próbek o czasie 0 oraz o czasie 15, 30, 45 i 60 min. 
	UWAGA: Alternatywnie próbki należy pobierać tylko w czasie 0 i w punkcie końcowym.
	<ol>
		<li>Dodać 245 μl 1x bufor HNG do każdej probówki w celu rozcieńczenia próbek pobranych z reakcji hydrolizy ATP w stosunku 1:50.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kąpiel z suchego lodu i etanolu do szybkiego zamrażania próbek, aby zatrzymać reakcję. W gumowym wiaderku na lód lub innym bezpiecznym (nieplastikowym) pojemniku dodaj kilka kawałków suchego lodu i ostrożnie wlej tyle 70-100% etanolu, aby pokryć suchy lód.</li>
	<li>Rozcieńczyć oczyszczone białko w 1x buforze HNG, w zależności od potrzeb (zwykle 5-10 μM) i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Ustaw reakcje hydrolizy ATP.
	<ol>
		<li>W oddzielnych probówkach o pojemności 0,5 ml do każdej próbki dodać następujące odczynniki (w kolejności):H2O, (do końcowej objętości 30 μl), 6 μl 5x HNG lub innego buforu, 3 μl 100 mM mieszaniny MgCl2-ATP i 0,25-5 μM białka.</li>
		<li>Obejmują one warunek kontroli ujemnej tylko buforu, w którym nie dodaje się białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć 5 μl z reakcji w czasie 0, rozcieńczyć w stosunku 1:50 w przygotowanej probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 245 μl buforu HNG i natychmiast zamrozić próbkę w łaźni suchego lodu/etanolu.</li>
	<li>Inkubować reakcje w temperaturze 37 °C, aby umożliwić hydrolizę ATP przez 1 godzinę. W każdym odstępie czasu (15, 30, 45 i 60 min) usunąć 5 μl podwielokrotności z reakcji i dodać do znakowanych probówek zawierających bufor HNG, jak w kroku 1.6.</li>
	<li>Po zakończeniu reakcji hydrolizy ATP rozcieńczone próbki przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania. Aby upewnić się, że wszystkie próbki są całkowicie zamrożone, odczekaj co najmniej 10 minut przed kontynuowaniem.</li>
</ol>
2. Inkubuj próbki zawierające wolne Pi za pomocą odczynnika do wykrywania
<ol>
	<li>Rozcieńczone próbki zawierające podwielokrotności reakcji hydrolizy ATP rozmrozić w każdym punkcie czasowym (otrzymanym z etapów 1.6 i 1.7) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ustawić 96-dołkową płytkę zawierającą próbki i wzorce fosforanów.
	<ol>
		<li>W probówce o pojemności 0,5 ml rozcieńczyć wzorzec fosforanowy (dostarczony z odczynnikiem do wykrywania liczby Pi) od 800 μM do 40 μM, dodając 5,5 μl wzorca 800 μM do 104,5 μl buforu HNG. Dobrze wymieszać i dodać 100 μl tego 40 μM wzorca Pi do dołka A1 na 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Dodać 50 μl buforu HNG do studzienek B1-H1 w celu szeregowych rozcieńczeń 1:1 wzorca Pi.</li>
		<li>Usunąć 50 μl z 40 μM Pi z dołka A1 i dodać do 50 μl buforu do oznaczania w basenie B1, wymieszać i usunąć 50 μl z basenika B1 i dodać do dołka C1, kontynuując rozcieńczenia przez basenik G1. Po wymieszaniu wyrzucić 50 μl z dołka G1, aby upewnić się, że każda studzienka ma taką samą objętość. Cóż, H1 powinien zawierać tylko bufor, aby utworzyć standard Pi od 40 do 0 μM. 
		UWAGA: Jeśli do próbek dodano dodatkowy czynnik (taki jak inhibitor), należy utworzyć krzywą wzorcową zawierającą ten czynnik w celu kontroli zmian w uwalnianiu lub absorbancji fosforanów w tych warunkach.</li>
		<li>Dodać 50 μl każdej próbki w dwóch egzemplarzach do płytki. Dodaj próbki z tego samego punktu czasowego w kolumnach pionowo (próba 1 raz 0 = A2, A3; próbka 2 raz 0 = B2, B3) i różne punkty czasowe poziomo. Pozwala to na uzyskanie do 8 próbek i 5 punktów czasowych na płytkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj sterylnego pipetu, aby usunąć wystarczającą ilość odczynnika do wykrywania Pi w kolorze zieleni malachitowej/molibdenianu, aby dodać 100 μl do każdej z studzienek zawierających próbki i wzorce (potrzebny odczynnik (ml) = 0,1 x liczba próbek i wzorców) i dodać do naczynia w celu łatwego pipetowania za pomocą pipety wielokanałowej. Nie wlewaj odczynnika detekcyjnego bezpośrednio do naczynia, ponieważ istnieje prawdopodobieństwo zanieczyszczenia Pi.</li>
	<li>Używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 μl odczynnika do wykrywania liczby Pi do każdej studzienki i wymieszaj, ostrożnie pipetując w górę i w dół stałą liczbę razy bez wprowadzania pęcherzyków, najlepiej w kolejności od ostatnich punktów czasowych do pierwszych punktów czasowych.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 25 minut w temperaturze pokojowej lub zgodnie ze wskazówkami producenta.</li>
</ol>
3. Ilościowe określanie wyników za pomocą czytnika mikropłytek
<ol>
	<li>Odczytać absorbancję próbek przy długości fali 650 nm za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji.</li>
	<li>Utwórz krzywą standardową liczby Pi. Korzystając z oprogramowania do tworzenia wykresów, narysuj na wykresie wartości absorbancji dla próbek wzorcowych Pi w funkcji stężenia, aby znaleźć równanie użyte do rozwiązania ilości fosforanu w każdej próbce.</li>
	<li>Obliczyć aktywność ATPazy dla każdej próbki, kalibrując ją z wzorcem fosforanowym. Uwolniony fosforan = (OD650 - punkt przecięcia Y)/nachylenie.
	<ol>
		<li>Uśrednij całkowitą liczbę Pi z duplikatów każdej próbki. Od tej liczby odejmij odczyt absorbancji kontroli tylko z buforem. Pomnóż to przez współczynnik rozcieńczenia (w naszym przykładzie 50).</li>
		<li>Określ nmol Pi uwalniane na μmol białka. Wykres tych wartości dla każdego punktu czasowego w teście kinetycznym powinien dać pasowania liniowe co najmniej R = 0,99 (rysunek 1); W przeciwnym razie test można dostosować z większą lub mniejszą ilością białka lub dłuższym lub krótszym czasem inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W razie potrzeby należy przedstawić wyniki jako nmol Pi/μmol białka/min (rysunki 2, 3) lub jako nmol Pi/μg białka/min.</li>
</ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
<li>Baker, T. A., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP%2C+an+ATP-powered+unfolding+and+protein-degradation+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15-28 (2012).</li>
<li>Maxson, M. E., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vacuolar-type+H%2B-ATPase+at+a+glance+-+more+than+a+proton+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The vacuolar-type H+-ATPase at a glance - more than a proton pump.</a> J Cell Sci. 127 (23), 4987-4993 (2014).</li>
<li>Planet, P. J., Kachlany, S. C., DeSalle, R., Figurski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+genes+for+secretion+NTPases%3A+Identification+of+the+widespread+tadA+subfamily+and+development+of+a+diagnostic+key+for+gene+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of genes for secretion NTPases: Identification of the widespread tadA subfamily and development of a diagnostic key for gene classification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2503-2508 (2001).</li>
<li>Robien, M. A., Krumm, B. E., Sandkvist, M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Extracellular+Protein+Secretion+NTPase+EpsE+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Extracellular Protein Secretion NTPase EpsE of Vibrio cholerae.</a> J Mol Biol. 333 (3), 657-674 (2003).</li>
<li>Camberg, J. L., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+Vibrio+cholerae+type+II+secretion+ATPase+EpsE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the Vibrio cholerae type II secretion ATPase EpsE.</a> J Bacteriol. 187 (1), 249-256 (2005).</li>
<li>Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+secretion+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Type II secretion and pathogenesis.</a> Infect Immun. 69 (6), 3523-3535 (2001).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct%2C+Real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Direct, Real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+An+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: An improvement and evaluation.</a> J Biochem Biophys Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Anal Biochem. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Harder, K. W., Owen, P., Wong, L. K. H., Aebersold, R., Clark-Lewis, I., Jirik, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+kinetic+analysis+of+the+intracellular+domain+of+human+protein+tyrosine+phosphatase+%CE%B2+%28HPTP+%CE%B2%29+using+synthetic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Characterization and kinetic analysis of the intracellular domain of human protein tyrosine phosphatase β (HPTP β) using synthetic phosphopeptides.</a> Biochem J. 298 (2), 395-401 (1994).</li>
<li>Camberg, J. L., Johnson, T. L., Patrick, M., Abendroth, J., Hol, W. G., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+stimulation+of+EpsE+ATP+hydrolysis+by+EpsL+and+acidic+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synergistic stimulation of EpsE ATP hydrolysis by EpsL and acidic phospholipids.</a> EMBO J. 26 (1), 19-27 (2006).</li>
<li>McLaughlin, S. H., Smith, H. W., Jackson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+weak+ATPase+activity+of+human+Hsp90+by+a+client+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the weak ATPase activity of human Hsp90 by a client protein.</a> J Mol Biol. 315 (4), 787-798 (2002).</li>
<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jest to ogólny protokół pomiaru aktywności ATPazy in vitro oczyszczonych białek w celu charakterystyki biochemicznej. Ta metoda jest łatwa do optymalizacji; Na przykład dostosowanie ilości białka, składu i soli, temperatury oraz zmiana długości i interwałów testu (w tym zwiększenie całkowitej liczby interwałów) może poprawić ilościową ocenę aktywności. Dostępne na rynku odczynniki na bazie zieleni malachitowej są bardzo czułe i mogą wykrywać niewielkie ilości wolnego fosforanu (~50 pmol w 100 μl). Ze względu na ...

ATPazy są integralnymi enzymami w wielu procesach we wszystkich królestwach życia. ATPazy działają jak silniki molekularne, które wykorzystują energię hydrolizy ATP do zasilania tak różnorodnych reakcji, jak transport, rozwijanie i składanie białek; replikacja i transkrypcja; metabolizm komórkowy; ruch mięśni; ruchliwość komórek; i pompowanie jonów1-3. Niektóre ATPazy są białkami transbłonowymi zaangażowanymi w transport substancji rozpuszczonych przez błony, inne są cytoplazmatyczne i mogą być związane z błoną biologiczną, taką jak błona plazmatyczna lub błony organelli.
ATPazy AAA+ (ATPazy związane z różnymi aktywnościami komórkowymi) tworzą dużą grupę ATPaz, które mają pewną sekwencję i konserwację strukturalną. Białka te zawierają konserwatywne motywy wiążące nukleotydy, takie jak pudełka Walker-A i -B, i tworzą oligomery (zwykle heksamery) w stanie aktywnym1. Duże zmiany konformacyjne w tych białkach po wiązaniu nukleotydów zostały scharakteryzowane wśród różnych członków rodziny AAA+. EpsE jest ATPazą AAA + i należy do podrodziny wydzielania bakteryjnego typu II/IV NTPaz4-6. EpsE zasila wydzielanie typu II (T2S) w Vibrio cholerae, czynniku wywołującym cholerę. Układ T2S jest odpowiedzialny za wydzielanie szerokiej gamy białek, takich jak czynnik wirulencji toksyna, który powoduje obfitą wodnistą biegunkę, gdy V. cholerae kolonizuje ludzkie jelito cienkie7. 
Techniki ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro są zróżnicowane, ale zazwyczaj mierzą uwalnianie fosforanów za pomocą barwników, fluorescencyjnych lub radioaktywnych substratów8-11. Opisujemy podstawową metodę oznaczania aktywności ATPazy in vitro oczyszczonych białek za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na dostępnym na rynku substracie zawierającym zieleń malachitową, który mierzy uwolniony fosforan nieorganiczny (Pi). Przy niskim pH zielony molibdenian malachitu tworzy kompleks z liczbą Pi, a poziom tworzenia kompleksu można zmierzyć przy 650 nm. Ten prosty i czuły test może być wykorzystany do funkcjonalnego scharakteryzowania nowych ATPaz i oceny ról potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów, do określenia znaczenia domen i / lub specyficznych reszt lub do oceny wpływu poszczególnych zabiegów na aktywność enzymatyczną.

<table><tbody><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki (przezroczyste, płaskodenne)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-AK111</td><td>Preferowany odczynnik do wykrywania fosforanów. Uwaga: działa drażniąco.</td></tr><tr>Czytnik <td></td><td></td><td>mikropłytek</td><td>BioTek Synergy lub porównywalne</td></tr><tr>oprogramowanie <td></td><td></td><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td></tr></tbody></table>

pomiar aktywności atpazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Enzymy hydrolizujące adenozynotrifosforan lub ATPazy odgrywają kluczową rolę w różnorodnym wachlarzu funkcji komórkowych. Te dynamiczne białka mogą generować energię do prac mechanicznych, takich jak transport i degradacja białek, transport substancji rozpuszczonych i ruchy komórkowe. Opisany tutaj protokół jest podstawowym testem do pomiaru aktywności in vitro oczyszczonych ATPaz w celu charakterystyki funkcjonalnej. Białka hydrolizują ATP w reakcji, w wyniku której uwalnia się nieorganiczny fosforan, a ilość uwolnionego fosforanu jest następnie oznaczana ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego. Ten wysoce elastyczny protokół można dostosować do pomiaru aktywności ATPazy w testach kinetycznych lub końcowych. Przedstawiono tutaj reprezentatywny protokół oparty na aktywności i wymaganiach EpsE, ATPazy AAA+ biorącej udział w wydzielaniu typu II w bakterii Vibrio cholerae. Ilość oczyszczonego białka potrzebna do pomiaru aktywności, długość testu oraz czas i liczba odstępów między próbkami, skład buforu i soli, temperatura, kofaktory, stymulanty (jeśli występują) itp. mogą różnić się od opisanych tutaj, a zatem konieczna może być pewna optymalizacja. Protokół ten zapewnia podstawowe ramy do charakteryzowania ATPaz i może być wykonywany szybko i łatwo dostosowywany w razie potrzeby.

Aktywność in vitro ATPazy EpsE typu T2S może być stymulowana poprzez kopuryfikację EpsE z domeną cytoplazmatyczną EpsL (EpsE-cytoEpsL) oraz dodatek kwaśnego fosfolipidu – kardiolipiny12. Wykorzystując ten test, możliwe jest również określenie roli konkretnych reszt EpsE w hydrolizie ATP poprzez porównanie aktywności typu dzikiego (WT) z wariantowymi formami białka. W niniejszym przypadku mierzony jest efekt podstawienia dwóch reszt lizyny w domenie wiążącej cynk EpsE p...

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie aktywności ATPase in vitro oczyszczonych białek w celu ich charakterystyki funkcjonalnej. Metoda ta może być wykorzystana do charakterystyki nowych domniemanych ATPaz, oceny skuteczności potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów oraz do określenia wpływu konkretnych domen lub reszt na aktywność ATPase. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona prostą i czułą metodę pomiaru aktywności ATPase in vitro, którą można łatwo zoptymalizować.Przygotować roztwory zapasowe wszystkich niezbędnych odczynników do inkubacji z oczyszczonym białkiem zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym. Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji hydrolizy ATP wymieszać 100 millimolar chlorku magnezu i 100 millimolar ATP w stosunku jeden do jednego. Przygotować i opisać probówki o pojemności 1,5 mililitra do pobierania próbek w regularnych odstępach czasu w trakcie trwania reakcji.Przygotować probówki do pobierania próbek w czasie zero oraz w odstępach 15, 30, 45 i 60 minut. Do każdej probówki dodać 245 µL buforu HNG 1x, aby rozcieńczyć próbki pobrane z reakcji hydrolizy ATP w stosunku 1:50. Następnie przygotować kąpiel z suchego lodu i etanolu do szybkiego zamrażania próbek w celu zatrzymania reakcji.Do gumowego wiadra z lodem lub innego bezpiecznego pojemnika włóż kilka kawałków suchego lodu i ostrożnie wlej tyle etanolu o stężeniu od 70% do 100%, aby przykryć suchy lód. Rozcieńcz oczyszczone białko w buforze 1X HNG i przechowuj je w lodzie. Przygotuj reakcje hydrolizy ATP w przygotowanych probówkach o pojemności 0,5 ml, dodając wcześniej obliczoną objętość wody, aby uzyskać końcową objętość reakcji 30 µL.Następnie dodaj 6 µL 5X HNG lub innego buforu, 3 µL mieszaniny 100 mM chlorku magnezu i ATP oraz od 0,25 do 5 µM białka. Inkubuj negatywną kontrolę zawierającą sam bufor, do której nie dodano białka. Następnie pobierz 5 µL z reakcji w czasie zero.Następnie rozcieńcz alikwot w stosunku 1:50 w przygotowanej probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 245 µL buforu HNG. Natychmiast zamroź próbkę w kąpieli z etanolu i suchego lodu. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, aby umożliwić hydrolizę ATP.W każdym odstępie czasu należy pobrać pięć mikrolitrów ($\text{5 µL}$) alikwotów z reakcji i przenieść je do opisanych probówek z próbkami zawierających bufor HNG, analogicznie jak poprzednio. Po zakończeniu reakcji hydrolizy ATP należy przenieść rozcieńczone próbki do zamrażarki ustawionej na $\text{80 °C}$ w celu ich przechowywania. Aby upewnić się, że wszystkie próbki są całkowicie zamrożone, należy odczekać co najmniej $\text{10}$ minut przed przejściem do kolejnego etapu.Rozmrozić w temperaturze pokojowej rozcieńczone próbki zawierające alikwoty reakcji hydrolizy ATP z każdego punktu czasowego. Następnie przygotować płytkę 96-dołkową zawierającą próbki oraz wzorce fosforanowe. W probówce 0,5 ml rozcieńczyć wzorzec fosforanowy z 800 µM do 40 µM, dodając 5,5 µl wzorca do 104,5 µl buforu HNG.Dokładnie wymieszać i dodać 100 µL tego 40 µM standardu fosforanowego do dołka A1 płytki 96-dołkowej. Do dołków od B1 do H1 dodać 50 µL buforu HNG w celu wykonania seryjnych rozcieńczeń standardu fosforanowego w stosunku jeden do jednego. Odpić 50 µL 40 µM fosforanu z dołka A1, dodać do 50 µL buforu do analizy w dołku B1 i wymieszać.Następnie odpipetuj 50 µl z dołka B1 i dodaj do dołka C1, kontynuując rozcieńczenia aż do dołka G1. Po wymieszaniu odrzuć 50 µl z dołka G1, aby zapewnić taką samą objętość w każdym dołku. Dołek H1 powinien zawierać wyłącznie bufor w celu stworzenia standardu fosforanowego od 40 do zero µM. Następnie nanieś na płytkę po 50 µl każdej próbki w dwóch powtórzeniach.Próbki z tego samego punktu czasowego należy nanosić w kolumnach pionowo, a z różnych punktów czasowych poziomo. Pozwala to na analizę do ośmiu próbek i pięciu punktów czasowych na jednej płytce. Za pomocą sterylnej pipety należy odmierzyć odpowiednią ilość odczynnika detekcyjnego fosforanu meliptatu zieleni malachitowej i dodać 100 µL do każdego dołka zawierającego próbki oraz standardy.Przenieś odczynnik detekcyjny do naczynia, aby ułatwić pipetowanie za pomocą pipety wielokanałowej. Nie wlewaj odczynnika detekcyjnego bezpośrednio do płytki, ponieważ może dojść do zanieczyszczenia fosforanami. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 100 µL odczynnika do detekcji fosforanów do każdego dołka i wymieszaj ostrożnie, pipetując w górę i w dół stałą liczbę razy, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, pracując w kolejności od ostatniego do pierwszego punktu czasowego.Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej przez 25 minut lub zgodnie z instrukcjami producenta. Aby dokonać ilościowego oznaczenia wyników, odczytaj absorbancję próbek przy 650 nanometrach za pomocą mikroczytnika płytek do pomiaru absorbancji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla ATPaz kinetycznych i końcowych, w których określono aktywność formy dzikiego typu oraz form mutantów ATPazy/EPSE sekrecji typu drugiego w obecności i braku stymulatora w postaci kardiolipiny.Przedstawione tutaj wyniki kinetycznego pomiaru aktywności ATPase stymulowanej kardiolipiny wykazują liniowe uwalnianie fosforanu w czasie dla typu dzikiego EPSE oraz podwójnego mutanta lizyny, przy czym serym albuminy wołowej posłużyło jako kontrola negatywna. Dane te można przedstawić jako ilość uwolnionego fosforanu na minutę podzieloną przez stężenie białka, aby ilościowo określić i porównać aktywność ATPase każdego białka. Dane wskazują, że dwie reszty lizyny, K417 i K419, przyczyniają się do stymulowanej kardiolipiną aktywności ATPase białka EPSE.Porównanie aktywności ATPase tych samych białek bez stymulacji kardiolipina wykazuje, że te dwie reszty lizyny nie przyczyniają się do niskiej aktywności podstawowej EPSE, lecz raczej do zdolności białka do stymulacji przez kardiolipinę. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko i dokładnie określić ilościowo aktywność ATPase oczyszczonych białek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest uwzględnienie czułości odczynnika do detekcji fosforanów.Aby uniknąć zanieczyszczenia fosforanami, zalecamy stosowanie jednorazowych wyrobów plastikowych oraz wody ultrapure oraz przeprowadzenie chromatografii wykluczania cząsteczkowego lub jonowymiennej po oczyszczaniu białek.

measuring-in-vitro-atpase-activity-for-enzymatic-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Ten film pokazuje pomiar in vitro aktywności enzymu dla α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy w próbkach używających syntetycznych substratów 4-metylulumbelliferylu.

Pomiar in vitro aktywności enzymów α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Poznaj metodę pomiaru aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej białek. Technika ta pozwala oceniać aktywatory, inhibitory i określać funkcjonalne role domen białkowych.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Przeglądaj więcej filmów