Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie aktywności ATPazy in vitro oczyszczonych białek w celu charakterystyki funkcjonalnej. Metoda ta może być stosowana do charakteryzowania nowych przypuszczalnych ATPaz, oceny skutecznych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów oraz do określenia udziału poszczególnych domen lub reszt w aktywności ATPazy. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta, czuła metoda pomiaru aktywności ATPazy in vitro i może być łatwo zoptymalizowana.

Przygotować zapasy wszystkich niezbędnych odczynników do inkubacji z oczyszczonym białkiem zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole tekstowym. Wymieszaj 100 milimolowy chlorek magnezu i 100 milimolowy ATP w stosunku jeden do jednego tuż przed rozpoczęciem reakcji hydrolizy ATP. Przygotuj i oznacz 1,5 mililitra probówki do pobierania próbek w regularnych odstępach czasu podczas reakcji.

Przygotować probówki do pobierania próbek w czasie zero, jak również w czasie 15, 30, 45 i 60 minut. Dodaj 245 mikrolitrów 1x buforu HNG do każdej probówki, aby rozcieńczyć próbki pobrane z reakcji hydrolizy ATP w rozcieńczeniu od jednego do 50. Następnie przygotuj kąpiel z suchego lodu i etanolu do szybkiego zamrożenia próbek, aby zatrzymać reakcję.

W gumowym wiaderku na lód lub innym bezpiecznym pojemniku dodaj kilka kawałków suchego lodu i ostrożnie wlej tyle od 70% do 100% etanolu, aby pokryć suchy lód. Rozcieńczyć oczyszczone białko w buforze 1X HNG i trzymać je na lodzie. Ustaw reakcje hydrolizy ATP w przygotowanych probówkach o pojemności 0,5 mililitra, dodając wstępnie obliczoną objętość wody, aby osiągnąć końcową objętość reakcji 30 mikrolitrów.

Następnie sześć mikrolitrów 5X HNG lub innego buforu, trzy mikrolitry 100-milimolowej mieszaniny ATP chlorku magnezu i 0,25 do pięciu mikromolowych białek. Inkubować tylko bufor w warunkach kontroli ujemnej, w których nie dodaje się białka. Następnie usuń pięć mikrolitrów z reakcji w czasie zero.

Następnie rozcieńczyć podwielokrotność jeden do 50 w przygotowanej 1,5 mililitrowej probówce zawierającej 245 mikrolitrów buforu HNG. Natychmiast zamrozić próbkę w kąpieli etanolowej z suchym lodem. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić hydrolizę ATP przez jedną godzinę.

W każdym odstępie czasu usunąć z reakcji pięć mikrolitrowych podwielokrotności i dodać do znakowanych probówek zawierających bufor HNG, jak poprzednio. Pod koniec reakcji hydrolizy ATP rozcieńczone próbki przenieść do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu przechowywania. Aby upewnić się, że wszystkie próbki są całkowicie zamrożone, odczekaj co najmniej 10 minut przed kontynuowaniem.

Rozcieńczone próbki zawierające podwielokrotności reakcji hydrolizy ATP rozmrozić z każdego punktu czasowego w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować 96-dołkową płytkę zawierającą próbki i wzorce fosforanów. W probówce o pojemności 0,5 mililitra rozcieńczyć wzorzec fosforanowy od 800 mikromolowych do 40 mikromolowych, dodając 5,5 mikrolitra wzorca do 104,5 mikrolitrów buforu HNG.

Dobrze wymieszaj i dodaj 100 mikrolitrów tego 40-mikromolowego wzorca fosforanowego do dołka A1 z 96-dołkowej płytki. Dodać 50 mikrolitrów buforu HNG do studzienek od B1 do H1 w celu seryjnego rozcieńczenia wzorca fosforanowego jeden do jednego. Usunąć 50 mikrolitrów 40 mikromolowych fosforanów z dołka A1, dodać do 50 mikrolitrów buforu do oznaczania w basenie B1 i wymieszać.

Następnie usunąć 50 mikrolitrów z dołka B1 i dodać go do dołka C1, kontynuując rozcieńczanie przez studzienkę G1. Po wymieszaniu wyrzuć 50 mikrolitrów z dołka G1, aby upewnić się, że każda studzienka ma taką samą objętość. Cóż, H1 powinien zawierać tylko bufor, aby utworzyć wzorzec fosforanowy od 40 do zera mikromolowego. Następnie dodaj 50 mikrolitrów każdej próbki w dwóch egzemplarzach do płytki.

Dodaj próbki z tego samego punktu czasowego w kolumnach w pionie i z różnych punktów czasowych w poziomie. Pozwala to na uzyskanie do ośmiu próbek i pięciu punktów czasowych na płytkę. Użyj sterylnej pipety, aby usunąć wystarczającą ilość odczynnika do wykrywania fosforanu malachitowo-zielonego meliptynianu, aby dodać 100 mikrolitrów do każdej z studzienek zawierających próbki i wzorce.

Dodaj odczynnik do wykrywania do naczynia, aby ułatwić pipetowanie za pomocą pipety wielokanałowej. Nie wlewaj odczynnika detekcyjnego bezpośrednio do naczynia, ponieważ może dojść do zanieczyszczenia fosforanami. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 mikrolitrów odczynnika do wykrywania fosforanów do każdej studzienki i dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół stałą liczbę razy bez wprowadzania pęcherzyków, pracując w kolejności od ostatniego punktu czasowego do pierwszego punktu czasowego.

Pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na 25 minut lub zgodnie ze wskazówkami producenta. Aby określić ilościowo wyniki, odczytaj absorbancję próbek przy 650 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki ATPaz kinetycznych i końcowych, w których określa się aktywność dzikich i zmutowanych form wydzielania ATPazy typu drugiego/EPSE w obecności i bez stymulantu kardiolipiny.

Pokazano tutaj wyniki kinetycznej ATPazy stymulowanej kardiolipiną, wykazujące liniowe uwalnianie fosforanów w czasie dla EPSE typu dzikiego i podwójnego mutanta lizyny, z albuminą surowicy bydlęcej służącą jako kontrola ujemna. Dane te można przedstawić jako ilość fosforanu uwalnianego na minutę podzieloną przez stężenie białka w celu ilościowego określenia i porównania aktywności ATPazy każdego białka. Dane wskazują, że dwie reszty lizyny, K417 i K419, przyczyniają się do stymulowanej przez kardiolipinę aktywności ATPazy EPSE.

Porównanie aktywności ATPazy tych samych białek bez stymulacji kardiolipiną pokazuje, że te dwie reszty lizyny nie przyczyniają się do niskiej podstawowej aktywności EPSE, ale raczej do zdolności białka do stymulacji przez kardiolipinę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko i dokładnie określić ilościowo aktywność ATPazy w oczyszczonych białkach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wziąć pod uwagę czułość odczynnika do wykrywania fosforanów.

Aby uniknąć zanieczyszczenia fosforanami, zalecamy używanie jednorazowych naczyń z tworzyw sztucznych i ultraczystej wody oraz przeprowadzenie wykluczenia wielkości lub chromatografii jonowymiennej po oczyszczeniu białka.