Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

Najpierw odwiruj jednokomórkową ludzką pluripotencjalną komórkę macierzystą lub zawiesinę HPSC w ilości 200 razy g przez pięć minut. Po odwirowaniu odessać pożywkę płuczącą i ponownie zawiesić komórki w pożywce agregującej o gęstości 1,2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie wysiewaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka na przygotowanej płytce mikrodołkowej i równomiernie rozprowadź komórki.

Aby zasiać dużą liczbę dołków, okresowo wiruj zawiesinę komórek, aby zapobiec osiadaniu. Po wysianiu odwirować płytkę 200 razy g przez pięć minut. Po wirowaniu obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki obróciły się na dno każdej mikrostudzienki.

Następnie inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze hipoksyjnym 5% C-O dwa, 5%O dwa. Jednego dnia po agregacji należy sprawdzić kruszywa pod mikroskopem. W porównaniu z bezpośrednią agregacją po wirówce powinny wydawać się nienaruszone z gładkimi krawędziami.

Usunąć supernatant, trzymając płytkę mikrodołka poziomo i umieszczając końcówkę mikropipetora P-1000 na powierzchni pożywki hodowlanej i przy krawędzi studzienki. Następnie powoli usuń pożywkę, uważając, aby nie naruszyć agregatów na dnie mikrostudzienek. Po zmniejszeniu poziomu pożywki do około jednego do dwóch milimetrów od teksturowanej powierzchni mikrostudzienki, powoli przechyl płytkę i powoli zasysaj pozostałe medium ze studzienki.

Dodać jeden mililet świeżo przygotowanej, wstępnie podgrzanej pożywki indukcyjnej pierwszego stopnia, przytrzymując końcówkę pipety przy wewnętrznej krawędzi studzienki i bardzo powoli dozując pożywkę do wewnętrznej ścianki studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w warunkach niedotlenienia na trzy dni. Czwartego dnia użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby zebrać kruszywa z każdej studzienki płytki mikrodołkowej.

Zbierz do 10 studzienek zawiesiny kruszywa w 15-mililitrowej stożkowej rurce. Pozostawić agregaty na 15 minut w inkubatorze do hipoksyi. Po osiadaniu agregatów ostrożnie zaaspiruj supernatant i ponownie zawiesić agregaty w dziesięciu mililitrach wstępnie podgrzanego medium myjącego, aby usunąć resztki cytokin indukcyjnych.

Odwirować agregaty w ilości 50 razy g przez dwie minuty. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane agregaty we wstępnie podgrzanym pożywce indukcyjnej drugiego stopnia. Przenieś zawiesinę kruszywa na 24-dołkową płytę mocującą o bardzo niskiej zawartości w ilości jednego mililitra na studzienkę.

Obserwuj agregaty pod mikroskopem jako jednolite skupiska o ciasnych komórkach. Inkubować w warunkach niedotlenienia do szóstego dnia. Szóstego dnia zbierz do 10 mililitrów kruszywa na 15-mililitrową stożkową rurkę, tak jak poprzednio.

Po ustabilizowaniu się agregatów, odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty w podgrzanym pożywce indukcyjnej trzeciego stopnia. Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej rozprowadź agregaty na 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu, w ilości jednego mililitra na studzienkę. Wykonaj całkowitą zmianę podłoża w 10 dniu hodowli.

W dniu 12 przenieś komórki do normoksycznych warunków hodowli składających się z 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez pozostałą część okresu hodowli. Po 12 dniach różnicowania, co odpowiada sześciu dniom w stadium indukcji serca, zaobserwowano trzy średnie, silne skurcze o dużej skupisku. W dniu 17 74,8% komórek jest dodatnich na obecność troponiny T serca w cytometrii przepływowej, jak wskazuje wypełniona część histogramu.

Pokazane są również komórki wybarwione samym przeciwciałem drugorzędowym, pokazane przez niewypełniony odcinek histogramu. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby dobrze umyć agregaty czwartego dnia, aby usunąć śladowe ilości cytokin, w szczególności aktywiny-A, która sprzyja różnicowaniu endodermy, kosztem indukcji serca. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak chłodna hodowla komórek indukcyjnych w agregacie, aby odpowiedzieć na inne pytania, takie jak to, w jaki sposób sygnalizacja parakrynna z sąsiednich tkanek embrionalnych wpływa na różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w linii serca.