Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny
25 września 2016
Konwencjonalne metody inicjowania różnicowania sercowego ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na podstawie agregatu zawiesinowego są nękane niejednorodnością hodowli pod względem wielkości i kształtu agregatu. W tym miejscu opisujemy solidną metodę różnicowania serca wykorzystującą mikrostudzienki do generowania agregatów hPSC o kontrolowanej wielkości, hodowanych w warunkach sprzyjających pracy serca.
Najpierw odwiruj jednokomórkową ludzką pluripotencjalną komórkę macierzystą lub zawiesinę HPSC w ilości 200 razy g przez pięć minut. Po odwirowaniu odessać pożywkę płuczącą i ponownie zawiesić komórki w pożywce agregującej o gęstości 1,2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie wysiewaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka na przygotowanej płytce mikrodołkowej i równomiernie rozprowadź komórki.
Aby zasiać dużą liczbę dołków, okresowo wiruj zawiesinę komórek, aby zapobiec osiadaniu. Po wysianiu odwirować płytkę 200 razy g przez pięć minut. Po wirowaniu obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki obróciły się na dno każdej mikrostudzienki.
Następnie inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze hipoksyjnym 5% C-O dwa, 5%O dwa. Jednego dnia po agregacji należy sprawdzić kruszywa pod mikroskopem. W porównaniu z bezpośrednią agregacją po wirówce powinny wydawać się nienaruszone z gładkimi krawędziami.
Usunąć supernatant, trzymając płytkę mikrodołka poziomo i umieszczając końcówkę mikropipetora P-1000 na powierzchni pożywki hodowlanej i przy krawędzi studzienki. Następnie powoli usuń pożywkę, uważając, aby nie naruszyć agregatów na dnie mikrostudzienek. Po zmniejszeniu poziomu pożywki do około jednego do dwóch milimetrów od teksturowanej powierzchni mikrostudzienki, powoli przechyl płytkę i powoli zasysaj pozostałe medium ze studzienki.
Dodać jeden mililet świeżo przygotowanej, wstępnie podgrzanej pożywki indukcyjnej pierwszego stopnia, przytrzymując końcówkę pipety przy wewnętrznej krawędzi studzienki i bardzo powoli dozując pożywkę do wewnętrznej ścianki studzienki. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w warunkach niedotlenienia na trzy dni. Czwartego dnia użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby zebrać kruszywa z każdej studzienki płytki mikrodołkowej.
Zbierz do 10 studzienek zawiesiny kruszywa w 15-mililitrowej stożkowej rurce. Pozostawić agregaty na 15 minut w inkubatorze do hipoksyi. Po osiadaniu agregatów ostrożnie zaaspiruj supernatant i ponownie zawiesić agregaty w dziesięciu mililitrach wstępnie podgrzanego medium myjącego, aby usunąć resztki cytokin indukcyjnych.
Odwirować agregaty w ilości 50 razy g przez dwie minuty. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić granulowane agregaty we wstępnie podgrzanym pożywce indukcyjnej drugiego stopnia. Przenieś zawiesinę kruszywa na 24-dołkową płytę mocującą o bardzo niskiej zawartości w ilości jednego mililitra na studzienkę.
Obserwuj agregaty pod mikroskopem jako jednolite skupiska o ciasnych komórkach. Inkubować w warunkach niedotlenienia do szóstego dnia. Szóstego dnia zbierz do 10 mililitrów kruszywa na 15-mililitrową stożkową rurkę, tak jak poprzednio.
Po ustabilizowaniu się agregatów, odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty w podgrzanym pożywce indukcyjnej trzeciego stopnia. Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej rozprowadź agregaty na 24-dołkowej płytce o bardzo niskim mocowaniu, w ilości jednego mililitra na studzienkę. Wykonaj całkowitą zmianę podłoża w 10 dniu hodowli.
W dniu 12 przenieś komórki do normoksycznych warunków hodowli składających się z 20% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez pozostałą część okresu hodowli. Po 12 dniach różnicowania, co odpowiada sześciu dniom w stadium indukcji serca, zaobserwowano trzy średnie, silne skurcze o dużej skupisku. W dniu 17 74,8% komórek jest dodatnich na obecność troponiny T serca w cytometrii przepływowej, jak wskazuje wypełniona część histogramu.
Pokazane są również komórki wybarwione samym przeciwciałem drugorzędowym, pokazane przez niewypełniony odcinek histogramu. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby dobrze umyć agregaty czwartego dnia, aby usunąć śladowe ilości cytokin, w szczególności aktywiny-A, która sprzyja różnicowaniu endodermy, kosztem indukcji serca. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak chłodna hodowla komórek indukcyjnych w agregacie, aby odpowiedzieć na inne pytania, takie jak to, w jaki sposób sygnalizacja parakrynna z sąsiednich tkanek embrionalnych wpływa na różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w linii serca.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia niezawodną metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) w kierunku kardiomiocytów z wykorzystaniem mikrowycinków do generowania agregatów o kontrolowanej wielkości. Metoda ta rozwiązuje problemy niejednorodności hodowli związanych z technikami konwencjonalnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Dyferencjację kardiomyocytów
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mogą różnicować się w różne typy komórek, w tym w komórki serca.
- Konwencjonalne metody często prowadzą do powstawania agregatów o różnych rozmiarach i kształtach, co wpływa na wyniki różnicowania.
- Technologia mikroszczelin oferuje rozwiązanie pozwalające na generowanie jednolitych agregatów.
- Warunki sprzyjające kardiogenezie są niezbędne do efektywnego różnicowania.
Cel badania
- Opracowanie metody generowania agregatów hPSC o kontrolowanym rozmiarze.
- Poprawa powtarzalności wyników różnicowania w kierunku kardiomiocytów.
- Ułatwienie dalszych badań nad inżynierią tkanki serca.
Zastosowane metody
- Wirowanie zawiesiny hPSC w celu utworzenia agregatów.
- Zastosowanie płytek z mikrootworami do kontrolowania wielkości agregatów.
- Inkubacja w warunkach hipoksji w celu promowania różnicowania kardiogenicznego.
- Sekwencyjne zmiany pożywki w celu indukcji poszczególnych etapów różnicowania.
Główne wyniki
- W trakcie procesu różnicowania formowano i utrzymywano jednorodne agregaty.
- W zróżnicowanych komórkach zaobserwowano znaczną ekspresję troponiny T mięśnia sercowego.
- Usprawnione usuwanie cytokin indukcyjnych zwiększyło zaangażowanie w linię kardiologiczną.
- Skurcze obejmujące całe agregaty odnotowano po 12 dniach różnicowania.
Wnioski
- Metoda mikroprzewotowa zapewnia niezawodne podejście do różnicowania hPSCs w kierunku kardiologicznym.
- Agregaty o kontrolowanym rozmiarze prowadzą do bardziej spójnych wyników różnicowania.
- Technikę tę można zastosować do dalszych badań nad rozwojem serca oraz modelowaniem chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe znaczenie wykonawcze
Kontrola wielkości agregatów w różnicowaniu kardiologicznym w zawiesinie rozwiązuje kluczowy problem w produkcji kardiomiocytów pochodzących z hPSC: heterogenność hodowli prowadzącą do zmiennej wydajności. Poprzez wymuszenie jednorodnego tworzenia agregatów z wykorzystaniem technologii mikrowyżyn, metoda ta zwiększa pewność przewidywania wyników różnicowania, wspierając generowanie skalowalnych i powtarzalnych modeli przedklinicznych. Pozycjonuje to dane podejście jako strategiczne narzędzie w celu minimalizacji ryzyka determinacji linii kardiologicznej w wczesnych etapach odkryć oraz w procesach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależnych od rozmiaru szlaków sygnalizacyjnych w indukcji kardiologicznej, wyjaśniając mechanizmy sterujące specyfikacją linii komórkowych.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność w tworzeniu agregatów, poprawiając powtarzalność między eksperymentami i zespołami.
- Wartość prognostyczna: Wspiera modelowanie zależności dawka-odpowiedź w ekspozycji na morfogeny poprzez standaryzację geometrii agregatu jako zmiennej kontrolowanej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie jednolitych mikrotkanek odpowiednich do obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) oraz ilościowego oznaczania kardiomiocytów metodą cytometrii przepływowej.
- Skalowalność: Format płytki z mikrootworami umożliwia równoległe przetwarzanie wielu warunków lub wariantów genetycznych w celu przeprowadzenia przesiewu porównawczego.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia spójny pomiar komórek wykazujących obecność troponiny T serca, co służy jako funkcjonalny odczyt w badaniach nad wpływem związków chemicznych lub zaburzeń genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Generuje skalowalne, homogeniczne agregaty kardiologiczne do modelowania dziedzicznych kardiomiopatii lub toksyczności leków dla serca.
- Ciągłość translacyjna: Łączy różnicowanie na etapie odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zapewnienie spójnego między partiami materiału komórkowego.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Minimalizuje zmienne zakłócające wynikające z heterogeniczności rozmiaru agregatów, zwiększając pewność powiązań fenotyp-genotyp.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając standaryzowaną różnicowanie hPSC, co znajduje zastosowanie w kolejnych etapach, takich jak modelowanie chorób, farmakologia bezpieczeństwa oraz ocena kandydatów do medycyny regeneracyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących biofizycznych sygnałów w determinacji linii kardiologicznej dzięki precyzyjnej kontroli rozmiaru i kształtu agregatów.
- Screening: Umożliwia uzyskanie powtarzalnych macierzy mikrotkanek do screeningu bibliotek związków, z ograniczonym szumem wynikającym ze zmienności agregacji.
- Analityka: Ułatwia ilościowe odczyty z cytometrii przepływowej i obrazowania (np. troponiny T serca) z poprawionym stosunkiem sygnału do szumu dzięki homogeniczności populacji.
- Badania translacyjne: Zapewnia skalowalne źródło kardiomiocytów do przedklinicznych testów funkcjonalnych, w tym kurczliwości i elektrofizjologii.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Płytki mikrodofelkowe mogą być ponownie wykorzystywane w różnych projektach i liniach komórkowych, wspierając standaryzację na poziomie platformy w procesach różnicowania komórek macierzystych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie wyników różnicowania poprzez minimalizację szumu biologicznego wynikającego ze zmienności wielkości agregatów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i wydajność dzięki standaryzowanemu, skalowalnemu tworzeniu agregatów.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność podejmowania decyzji go/no-go we wczesnych programach kardiologicznych poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych spowodowanych niewydajnym różnicowaniem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie alokacji zasobów do ryzyka w oparciu o wiarygodne wskaźniki wydajności kardiomiocytów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli hPSC, obchodzeniu się z agregatami oraz obsłudze systemów inkubacji hipoksyjnej.
- Zależy od dostępu do płytek mikrodofowych o określonych wymiarach dołków i powierzchniach o niskiej adhezji.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów wymiany medium, aby uniknąć rozpadu agregatów podczas etapów płukania.
- Wymaga walidacji na różnych liniach hPSC w celu potwierdzenia spójności zależności między rozmiarem a wydajnością różnicowania.
- Ograniczone koniecznością posiadania specjalistycznego sprzętu (inkubatory hipoksyjne, płytki o niskiej adhezji) oraz zoptymalizowanych etapów płukania cytokinami w celu zapobiegania różnicowaniu pozatargetowemu.
