Name: Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę różnicowania kardiomiocytów z ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych przy użyciu mikrostudzienek do kontroli wielkości agregatów. Technika ta zapewnia jednorodne wyniki różnicowania serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Peterowi Zandstra, w którego laboratorium ten protokół został opracowany, oraz dr Markowi Gagliardiemu i Gordonowi Kellerowi, którzy udzielili pomocy w ustaleniu początkowych metod, na których opierał się ten proces. Opracowanie protokołu było wspierane przez stypendium Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology dla C.B. oraz grant z Heart and Stroke Foundation of Ontario dla Petera Zandstra.

1. Przygotowanie składników medium
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże myjące. Na 100 ml DMEM/F12 dodać 1 ml 100x penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep), 1 ml 100x L-glutaminy i 5 ml zamiennika surowicy.</li>
	<li>Przygotować chemicznie zdefiniowaną pożywkę do indukcji podstawowego krążenia zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki podstawowe dla pożywek, które będą używane w tym protokole.
	<ol>
		<li>Kwas L-askorbinowy: Przygotować roztwór podstawowy 5 mg na ml w 4 °C, sterylną ultraczystą wodę destylowaną w stożkowej probówce.
		<ol>
			<li>Pozostaw ten roztwór na lodzie i okresowo obracaj probówkę, aż substancja rozpuszczona całkowicie się rozpuści. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór kwasu askorbinowego za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.</li>
			<li>Przygotować 1 ml podwielokrotności roztworu kwasu askorbinowego i przechowywać te podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Za każdym razem, gdy przygotowywana jest pożywka, należy użyć świeżo rozmrożonej podwielokrotności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W dniu przygotowania pożywki rozcieńczyć 13 μl monotioglicerolu (MTG) w 1 ml podstawowej pożywki do indukcji serca. Wyrzuć niewykorzystany, rozcieńczony MTG.</li>
		<li>Przygotować 1 ml porcji transferyny (30 mg/ml) do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrożone podwielokrotności przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
		<li>Przygotować 4 mM kwasu solnego (HCl) zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). W dygestorium dodać 30 μl 6,0 N roztworu HCl do 50 ml ultraczystej wody destylowanej. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Dodać 2 ml 25% roztworu BSA do 50 ml roztworu HCl.</li>
		<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,1% BSA. Dodać 20 μl 25% roztworu BSA na ml PBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy białka morfogenetycznego 4 (BMP-4) dla ludzkiej kości (10 ng/μl). Rozpuścić 10 μg liofilizowanego BMP-4 w 1 ml 4 mM roztworu buforowego HCl zawierającego 0,1% BSA. Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (bFGF) (10 ng/μl). Rozpuścić 10 μg liofilizowanego bFGF w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 0,1% BSA. Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) (5 ng/μl). Rozpuścić 5 μg liofilizowanego VEGF w 1 ml PBS zawierającego 0,1% BSA. Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy Activin A (10 ng/μl). Rozpuścić 10 μg liofilizowanej aktywiny A w 1 ml PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przygotować 50 μl porcji do przechowywania w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy inhibitora produkcji Wnt-2 (IWP-2) (10 mM). Rozpuścić 2 mg IWP-2 w 429 μl dimetylosulfotlenku (DMSO). Przygotować 10 μl porcji do przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę do indukcji pracy serca. Do 100 ml podstawowej pożywki do indukcji serca dodać 1 ml 100x Pen/Strep, 1 ml 100x L-glutamina, 500 μl transferyny, 1 ml świeżo rozmrożonego kwasu askorbinowego i 300 μl MTG. Wyrzuć niewykorzystane podłoże.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytki Microwell
UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Dodaj 0,5 ml roztworu płuczącego (składnik zestawu) do każdej studzienki, która zostanie użyta na płytce. Aby upewnić się, że roztwór styka się z całą powierzchnią wewnątrz każdej mikrostudzienki, odwiruj płytkę przy 840 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór płuczący ze studzienek. Umyć każdą studzienkę dwukrotnie w następujący sposób: Dodać 1 ml PBS do każdej studzienki, odwirować płytkę o sile 840 x g przez 2 minuty, a następnie odessać PBS.</li>
</ol>
3. Tworzenie agregatów hPSC w płytce mikrodołkowej
UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Umieść medium myjące w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Wymagana objętość = 1 ml x liczba studzienek hPSC, które zostaną zdysocjowane.</li>
	<li>Dysocjacja hPSC na pojedyncze komórki 
	UWAGA: Te kroki opisują dysocjację komórek hodowanych na płytkach 6-dołkowych — objętości odczynników można skalować proporcjonalnie dla różnych formatów hodowli.
	<ol>
		<li>Dobrze odessać pożywkę hodowlaną z każdej kultury hPSC w celu dysocjacji. Przepłukać każdą studzienkę 1 ml enzymu dysocjacyjnego, a następnie natychmiast odessać enzym dysocjacyjny z każdej studzienki. 
		UWAGA: Resztkowy enzym dysocjacyjny powinien być wystarczający do dysocjacji komórek.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 1 ml pożywki płuczącej do każdej studzienki i mechanicznie oddzielić komórki od powierzchni hodowli tkankowej, pipetując pożywkę płuczącą za pomocą mikropipetora P1000 na powierzchnię kultury tkankowej. Jeśli dysocjacja wydaje się być niepełna i pozostają grudki komórek, w tym momencie przepuść zawiesinę przez sitko.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać probówkę w inkubatorze do czasu zliczania komórek w następnym etapie.</li>
		<li>Wykonaj zliczanie komórek:
		<ol>
			<li>Pobrać 10 μl próbki zawiesiny komórek pobranej w poprzednim kroku. Dodać 30 μl błękitu trypanowego i dobrze wymieszać zawiesinę za pomocą pipetowania.</li>
			<li>Przenieś 10 μl komórek barwionych błękitem trypanowym do każdej komory hemocytometru i zwizualizuj pod odwróconym mikroskopem za pomocą obiektywu 10X. Policz komórki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na podstawie wyników zliczania komórek oblicz, ile dołków można wysiać przy 1,2 x 106 komórek na dołek płytki mikrodołkowej. Obliczać Pożywka agregacyjna wymagana do wysiewu komórek w ilości 1 ml na studzienkę.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę agregacyjną. Na 10 ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 0,5 μl roztworu podstawowego BMP4 (stężenie końcowe = 0,5 ng/ml) i inhibitora Y-27632 ROCK (stężenie końcowe = 10 μM).</li>
		<li>Wyjąć stożkową probówkę zawierającą hPSC z inkubatora i odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę płuczącą i ponownie zawiesić komórki w pożywce agregującej o gęstości 1,2 x10,6 komórek na ml.</li>
		<li>Zassać roztwór płuczący PBS z każdej studzienki płytki mikrodołkowej. Za pomocą mikropipetora P1000 równomiernie rozprowadzić i rozsiać 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka na płytce mikrodołkowej. Aby zasiać dużą liczbę dołków, okresowo wiruj zawiesinę komórek, aby zapobiec osiadaniu.</li>
		<li>Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 5 minut. Obserwuj płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki odwirowały na dnie każdej mikrostudzienki.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2, 5 % O2 (hipoksji).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Etap indukcji serca 1
<ol>
	<li>Jednego dnia po agregacji (dzień 1) należy przygotować wymaganą objętość pożywki indukcyjnej etapu 1 (dla płytki 24-dołkowej objętość = 1 ml x liczba dołków). Na 1 ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 1 μl roztworu podstawowego BMP4 (stężenie końcowe = 10 ng/ml), 0,5 μl roztworu podstawowego bFGF (stężenie końcowe = 5 ng/ml) i 0,6 μl aktywiny A (stężenie końcowe = 6 ng/ml). Umieścić pożywkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Wyjąć płytkę mikrodołkową z inkubatora. Sprawdź kruszywa pod mikroskopem. W porównaniu z agregacją bezpośrednio po wirówce powinny wydawać się nienaruszone z gładkimi krawędziami (bardziej okrągłe i mniej kwadratowe niż poprzedniego dnia).</li>
	<li>Usunąć supernatant bez naruszania agregatów wewnątrz mikrostudzienek:
	<ol>
		<li>Trzymaj płytkę mikrodołkową poziomo poziomo (tj. nie przechylaj jej). Dla każdego dołka na płytce mikrodołkowej umieścić końcówkę mikropipetora P1000 na powierzchni pożywki hodowlanej i przy krawędzi studzienki.</li>
		<li>Powoli usuwaj pożywkę, uważając, aby nie naruszyć agregatów na dnie mikrostudzienek. Po zmniejszeniu poziomu medium do około 1 do 2 mm od teksturowanej powierzchni mikrostudzienki, powoli przechyl płytkę, aby zebrać medium po jednej stronie studzienki (gdy objętość jest wystarczająco niska, ruch płynu jest znacznie zmniejszony i łatwiej jest uniknąć podnoszenia agregatów z ich indywidualnych mikrostudzienek). Powoli odpipetować pozostałą pożywkę w studzience.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby dodać świeżą pożywkę indukcyjną etapu 1, upewniając się, że agregaty pozostają w swoich indywidualnych mikrostudzienkach: Pobrać 1 ml pożywki indukcyjnej etapu 1 za pomocą mikropipetora P1000. Przytrzymać końcówkę pipety przy wewnętrznej krawędzi studzienki i bardzo powoli dozować pożywkę do wewnętrznej ścianki studzienki. Powtórz dla pozostałych dołków.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w warunkach niedotlenienia na 3 dni.</li>
</ol>
5. Etap indukcji serca 2
<ol>
	<li>W dniu 4 umieścić pożywkę do płukania (objętość = liczba studzienek x 2 ml) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Przygotować niezbędną objętość pożywki indukcyjnej etapu 2 (objętość = liczba studzienek x 1 ml): Na ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 2 μl roztworu podstawowego VEGF (stężenie końcowe = 10 ng/ml) i 0,5 μl roztworu podstawowego IWP-2 (stężenie końcowe = 5 μM). Umieść przygotowane medium indukcyjne Stage 2 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml zebrać agregaty z każdej studzienki płytki mikrodołkowej i zawiesinę kruszywy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (zebrać do 10 studzienek na probówkę o pojemności 15 ml).</li>
	<li>Pozostawić agregaty na 15 minut do osadzenia się w inkubatorze do hipoksyji. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny, aby oddzielić pojedyncze komórki i szczątki komórkowe od nienaruszonych agregatów.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty w 10 ml wstępnie podgrzanego medium do płukania w celu usunięcia pozostałości cytokin indukcyjnych (np. aktywina A jest silną cząsteczką sygnałową nawet w bardzo niskich stężeniach).</li>
	<li>Odwirować agregaty przy 50 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić granulowane agregaty we wstępnie podgrzanym medium Induction 2.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę kruszywa na 24-dołkową płytkę o bardzo niskim stopniu mocowania (ULA) w ilości 1 ml na studzienkę. Obserwuj agregaty pod mikroskopem jako jednolite, ciasne skupiska komórek. Inkubować w warunkach niedotlenienia do 6 dnia.</li>
</ol>
6. Etap indukcji serca 3
<ol>
	<li>W dniu 6 przygotuj niezbędną objętość pożywki indukcyjnej etapu 3 (objętość = liczba studzienek x 1 ml). Na 1 ml kompletnej pożywki do indukcji serca dodać 2 μl roztworu podstawowego VEGF (stężenie końcowe = 10 ng/ml) i 0,5 μl roztworu podstawowego bFGF (stężenie końcowe = 5 ng/ml). Przygotować pożywkę indukcyjną Stage 3 umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieść osady do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, uzyskując do 10 ml kruszywa na probówkę.</li>
	<li>Odczekaj 10 minut, aż agregaty się uspokoją. Odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty we wstępnie podgrzanym pożywce indukcyjnej etapu 3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml rozprowadzić agregaty na 24-dołkowej płytce ULA w ilości 1 ml na studzienkę.</li>
	<li>W dniu 10 przygotuj niezbędną objętość pożywki indukcyjnej etapu 3 (objętość = liczba studzienek x 1 ml) zgodnie z krokiem 6.1.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieść osady do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, uzyskując do 10 ml kruszywa na probówkę.</li>
	<li>Odczekaj 10 minut, aż agregaty się uspokoją. Odessać supernatant i ponownie zawiesić agregaty w pożywce indukcyjnej etapu 3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml rozprowadzić agregaty na 24-dołkowej płytce ULA w ilości 1 ml na studzienkę.</li>
	<li>Inkubować w warunkach niedotlenienia przez dwa dni. W dniu 12 rozpocząć inkubację komórek przy normoksyjnym poziomie tlenu przez pozostałą część okresu hodowli (37 °C, 20% O2, 5 % CO2 ). 
	UWAGA: Po upływie tego czasu komórki nie są już hodowane w warunkach niedotlenienia.</li>
	<li>Powtarzaj tę pełną wymianę pożywki (kroki 6.2 i 6.3) co 4 dni, począwszy od 14 dnia aż do pobrania komórek (zazwyczaj maksymalne stężenie kardiomiocytów obserwuje się po 14 dniu różnicowania).</li>
</ol>
7. Analiza cytometrii przepływowej częstotliwości ekspresji troponiny sercowej T (cTnT) w wyniku hodowli mikrostudzienki
<ol>
	<li>Oddziel agregacje w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml przenieść 1 studzienkę kruszywa do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować agregaty o masie 50 x g przez 2 minuty i ostrożnie zassać supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 ml świeżo rozpuszczonego 1 mg/ml roztworu kolagenazy typu II do kruszyw. Przenieść zawiesinę zbiorczą do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Inkubować agregaty w kolagenazie typu II przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Następnego dnia użyj mikropipetora P1000, aby delikatnie zdysocjować agregaty w jednorodną zawiesinę jednokomórkową. Jeżeli agregaty nie ulegają łatwej dysocjacji, należy je osadzić, odessać supernatant i inkubować agregaty w 700 μl enzymu dysocjacyjnego przez 1 do 2 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie odpipetować agregaty 1 do 2 razy mikropipetorem P1000 w celu dysocjacji.</li>
		<li>Rozcieńczyć enzym dysocjacyjny: Dodać 700 μl pożywki płuczącej zawierającej 14 μl roztworu podstawowego DNAzy o stężeniu 1 mg/ml. Pobrać próbkę o objętości 10 μl w celu zliczenia komórek i odwirować pozostałą zawiesinę za pomocą mikrowirówki laboratoryjnej o stężeniu 300 x g przez 2 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić zliczanie komórek: Wybarwić próbkę liczącą 10 μl równą objętością błękitu trypanowego i policzyć za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wyjąć z mikrowirówki probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe komórki. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu od 200 000 do 500 000 komórek na 100 μl, w zrównoważonym roztworze soli Hanksa zawierającym 2% płodową surowicę bydlęcą (HF).</li>
	<li>Dla każdego warunku przenieś 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do 2 dołków 96-dołkowej płytki (jedna studzienka zostanie wybarwiona przeciwciałem cTnT, a druga będzie drugorzędową kontrolą przeciwciała).</li>
	<li>Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant za pomocą mikropipetora wielokanałowego.</li>
	<li>Utrwalenie komórek: Dodać 200 μl roztworu utrwalającego (składnik zestawu) do dołka i inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 2 minuty. Za pomocą mikropipetora wielokanałowego ostrożnie pobrać supernatant z dołków. Supernatant należy wyrzucić do pojemnika na odpady paraformaldehydu.</li>
	<li>Umyj utrwalone komórki dwukrotnie: Dodaj 200 μl HF do każdej studzienki. Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 min. Odessać supernatant i powtórzyć etap płukania jeszcze raz. Stałe ogniwa mogą być przechowywane przez okres do jednego tygodnia w wysokiej temperaturze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek:
	<ol>
		<li>Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 min.</li>
		<li>Dodać 100 μl roztworu przepuszczalnego (składnik zestawu) do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Odwirować płytkę o masie 300 x g przez 2 minuty i odessać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować główną mieszaninę anty-cTnT w HF w optymalnym stężeniu dla danego numeru partii (optymalne rozcieńczenie musi być określone przez miareczkowanie i zwykle mieści się w zakresie od 1:500 do 1:2 000).</li>
	<li>Dla każdego warunku (2 studzienki na warunek) dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do jednego dołka (wybarwiona próbka) i 100 μl zwykłego HF do drugiego dołka (kontrola przeciwciał wtórnych). Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i dodać 200 μl HF do dołka. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę wzorcową przeciwciała drugorzędowego. Przenieść objętość HF odpowiadającą 100 μl dla każdego studzienki (drugorzędowa kontrola przeciwciał i barwione cTnT) poddawanej obróbce. Dodać 1 μl koziego przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego APC na 200 μl HF (rozcieńczenie 1:200).</li>
	<li>Zabarwić próbki. Dodać 100 μl roztworu barwiącego do każdej studzienki (zarówno drugorzędowej kontroli przeciwciał, jak i studzienek barwionych anty-cTnT). Inkubować komórki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut (po dodaniu fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego przechowywać płytkę pod przykryciem lub w ciemności, aby uniknąć fotowybielania).</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i dodać 200 μl HF do dołka. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.</li>
	<li>Przenieść próbki do probówek do analizy cytometru z przepływem okrągłym o pojemności 5 ml i wykonać cytometrię przepływową w celu uzyskania sygnału w kanale APC, korzystając ze standardowych protokołów dla przyrządu19.</li>
</ol>

<ol><li>Wintermantel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+scaffolds+using+superstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering scaffolds using superstructures.</a> Biomaterials. 17, 83-91 (1996).</li>
<li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+for+use+in+a+bioartificial+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Formation of porcine hepatocyte spheroids for use in a bioartificial liver.</a> Cell Transplant. 4, 259-268 (1995).</li>
<li>Sachlos, E., Auguste, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+body+morphology+influences+diffusive+transport+of+inductive+biochemicals%3A+a+strategy+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Embryoid body morphology influences diffusive transport of inductive biochemicals: a strategy for stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 29, 4471-4480 (2008).</li>
<li>Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., Yoo, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+chondrogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells.</a> Exp. Cell Res. 238, 265-272 (1998).</li>
<li>Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+differential+adhesion+govern+self-assembly+processes+in+histogenesis%3F+Equilibrium+configurations+and+the+emergence+of+a+hierarchy+among+populations+of+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Does differential adhesion govern self-assembly processes in histogenesis? Equilibrium configurations and the emergence of a hierarchy among populations of embryonic cells.</a> J. Exp. Zool. 173, 395-433 (1970).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 26, 2300-2310 (2008).</li>
<li>Koike, M., Kurosawa, H., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Round-bottom+96-well+Polystyrene+Plate+Coated+with+2-methacryloyloxyethyl+Phosphorylcholine+as+an+Effective+Tool+for+Embryoid+Body+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A Round-bottom 96-well Polystyrene Plate Coated with 2-methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine as an Effective Tool for Embryoid Body Formation.</a> Cytotechnology. 47, 3-10 (2005).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 25, 929-938 (2007).</li>
<li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible%2C+ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PloS One. 3, e1565(2008).</li>
<li>Kozhich, O. A., Hamilton, R. S., Mallon, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+generation+and+differentiation+of+neural+precursor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Standardized generation and differentiation of neural precursor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 9, 531-536 (2013).</li>
<li>Ungrin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 853-866 (2012).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 1901-1909 (2011).</li>
<li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation%3A+progress%2C+opportunities%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reprod. Camb. Engl. 140, 3-9 (2010).</li>
<li>Markway, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplant. 19, 29-42 (2010).</li>
<li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci.+Off.+J.+Soc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell.</a> Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).</li>
<li>Wallace, L., Reichelt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+3D+culture+to+investigate+the+role+of+mechanical+signaling+in+keratinocyte+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol.+Clifton+NJ%22%5BJournal%5D)">Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).</li>
<li>Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of human embryonic stem cells.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. JoVE. , e52010(2014).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGF%CE%B2+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFβ family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).</li>
<li>Niebruegge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+mesoderm+and+cardiac+cells+using+size-specified+aggregates+in+an+oxygen-controlled+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).</li>
</ol>

M.U. ma interes finansowy w leżącej u podstaw technologii mikrostudzienek.

Zaobserwowano, że efektywne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w sercu jest procesem bardzo zmiennym. Chociaż nie jest zaskakujące, że różne linie komórkowe wykazują różne skłonności do różnicowania się do określonych typów komórek, zaobserwowano, że skuteczność różnicowania serca waha się dramatycznie między seriami replikacji przy użyciu tej samej linii komórkowej6. Opisany tutaj protokół odnosi się do jednego z głównych źródeł tej zmienności poprzez bezpośrednie kontrolowanie liczby komórek wejściowych na agregację. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć zmienność między seriami, zaleca się stosowanie linii hPSC przystosowanych do pasażowania pojedynczych komórek, ponieważ ta forma ekspansji i utrzymania hPSC skutkuje bardziej spójnymi populacjami pluripotencjalnymi w odniesieniu do częstości ekspresji markerów pluripotencji (np. Oct4, Nanog, Tra-1-60 itp.).
Protokół, jak napisano tutaj, określa łączną wielkość 1000 komórek dla optymalnej indukcji serca z linii embrionalnych komórek macierzystych HES-2. Aby zastosować ten protokół do różnych linii komórkowych, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego badania przesiewowego wielkości agregatu w celu określenia optymalnego rozmiaru agregatu specyficznego dla linii komórkowej. Chociaż nie ma to bezpośredniego wpływu na procedury, których należy tutaj przestrzegać, przypominamy czytelnikowi, że oczekuje się, że zmiany w zagregowanej wielkości i ogólnej gęstości komórek wpłyną na dostarczanie tlenu. Może to stać się istotnym czynnikiem branym pod uwagę w dalszych zastosowaniach. Ponadto apoptoza śmierci komórek jest problemem podczas dysocjacji hPSC do pojedynczych komórek. Dlatego bardzo ważne jest, aby upewnić się, że inhibitor ROCK jest obecny podczas wymuszonej agregacji komórek w mikrostudzienkach. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby w 4 dniu różnicowania agregaty zostały dobrze umyte w celu usunięcia śladowych ilości aktywiny A, obecnej w pożywce indukcyjnej 1, przed ponownym zawieszeniem w pożywce indukcyjnej 2. Po 4 dniu różnicowania Activina A wspomaga różnicowanie endodermy kosztem indukcji mezodermy20.
Głównym zastosowaniem tej techniki jest badanie przesiewowe wielkości agregatów, które sprzyjają efektywnemu różnicowaniu serca. Jednak jednym z ograniczeń obecnej techniki jest to, że trudno jest skalować produkcję serca do klinicznie istotnych poziomów przy użyciu płytek mikrodołkowych. Zwiększenie skali różnicowania serca jest zwykle przeprowadzane w warunkach hodowli masowej w bioreaktorach zawiesinowych z mieszadłem21. W związku z tym, gdy system mikrostudzienki zostanie wykorzystany do określenia dopuszczalnych zakresów wielkości agregatu w celu efektywnej indukcji serca, następnym krokiem w celu zwiększenia skali jest określenie prędkości wirnika bioreaktora, które mogą wygenerować pożądany rozmiar agregatu komórkowego.
Jedną z istotnych różnic tej techniki w stosunku do innych metod różnicowania serca na podstawie agregatów jest to, że umożliwia ona bezpośrednie badania nad modulacją efektów endogennej sygnalizacji w agregatach, a także kohodowlą indukcyjnych/hamujących typów tkanek z hPSC w sumie13. Tego typu badania mogą dostarczyć informacji na temat rozwoju procesu produkcji serca na dużą skalę.

Hodowla komórkowa in vitro może być przeprowadzana na wiele sposobów, ale zazwyczaj przeprowadzana jest albo w dwuwymiarowych warunkach przylegania, albo w trójwymiarowych warunkach zawiesinowych, które pełniej rekapitulują systemy in vivo. W związku z tym w wielu dziedzinach badań naukowych rośnie tendencja do opracowywania solidnych metod generowania trójwymiarowych konstruktów tkankowych. W scenariuszach, w których typy komórek i procesy wymagają podporowej powierzchni macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i sygnałów adhezji, hodowla trójwymiarowa może być możliwa za pomocą konstruktów rusztowaniowych, w których komórki są hodowane na lub w egzogennej macierzy nośnej1. Komórki i procesy, które nie wymagają adhezji do macierzy podporowej, mogą być przeprowadzane w zawiesinie jako nierusztowane systemy złożone głównie lub wyłącznie z komórek (które mogą następnie przystąpić do wytwarzania własnych matryc endogennych)2,3. W tym artykule przedstawiamy protokół różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC - komórek macierzystych zdolnych do przekształcenia się w dowolny typ komórek w organizmie, zarówno z embrionalnych, jak i innych źródeł) w kontrolowanych wielkości, jednolitych, nierusztowanych agregatach.
Różnicowanie hPSC jako agregatów zawiesinowych jest nękane przez duże różnice w wielkości agregatów zarówno w trakcie jak i między przebiegami. Ta zmienność jest konsekwencją metody zwykle stosowanej do generowania tych agregatów, która polega na mechanicznej dysocjacji kolonii komórkowych. Aby zmniejszyć tę zmienność, zastosowano szereg podejść do kontrolowania liczby komórek w agregacji, a także średnicy i jednorodności agregatu. Przykłady obejmują tworzenie agregatów w probówkach do mikrowirówek4 lub w postaci wiszących kropli5, mikrowzorcowanie zdefiniowanych dwuwymiarowych kolonii hPSC6, które można następnie przenieść do zawiesiny, lub odwirowanie komórek na wielodołkowe płytki z dnem U lub V7,8,9. Wszystkie te podejścia są jednak ograniczone ze względu na niską przepustowość zagregowanej generacji. Systemy oparte na studniach wykorzystują podobne podejście do systemów płytek z dnem w kształcie litery V, jednak mniejszy rozmiar mikrostudzienek (w tym protokole każda o szerokości 400 μm) umożliwia generowanie większej liczby jednorodnych agregatów z pojedynczej studzienki hodowlanej (standardowa średnica ~ 15,5 mm zawierająca ~ 1200 mikrostudzienek) niż zostałaby wygenerowana z całej płytki z dnem V10. Dobrze oparte tworzenie agregatów stosowano w wielu warunkach, w tym w różnicowaniu hPSC na losy ektodermalne11, endodermalne12, mezodermalne13 i pozaembrionalne14; chondrogeneza z mezenchymalnych komórek macierzystych15; wytwarzanie jednolitych substratów do toksykologicznych badań przesiewowych16; i badania mechanobiologii17.
Jednym z głównych wyzwań w opracowaniu solidnych protokołów produkcyjnych do produkcji kardiomiocytów pochodzących z hPSC był brak powtarzalności w efektywności różnicowania serca między seriami. Wcześniej wykazaliśmy, że tę zmienność można przypisać niejednorodności w wyjściowej populacji hPSC, która obejmuje zarówno samoodnawiające się hPSC, jak i różnicujące się komórki, które wyrażają geny związane z endodermą i różnicowaniem neuronalnym6,18. Sygnały wydzielane przez te różnicujące się komórki wpływają na indukcję serca. W szczególności endoderma pozaembrionalna wspomaga indukcję serca, podczas gdy progenitorzy neuronalni hamują indukcję serca. Po agregacji hPSC komórki w agregacie różnicują się i organizują w taki sposób, że niezróżnicowane hPSC są otoczone warstwą pozazarodkowych komórek endodermy, które rozwijają się na powierzchni agregatu13. Kontrolując wielkość agregatu, możemy modulować stosunek komórek endodermy indukujących serce do niezróżnicowanych hPSC (stosunek powierzchni do objętości) i zoptymalizować ten stosunek w celu uzyskania maksymalnej indukcji serca13.

<table><tbody><tr>Szafa <td></td><td></td><td></td><td>bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Pomoc do</td><td></td><td></td><td></td>pipet</tr><tr><td>Pipety serologiczne (od 5 do 25 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirator lub pipety Pasteura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 i 50 ml rurki stożkowe Wyciąg</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m filtr</td><td></td><td></td><td></td>strzykawkowy</tr><tr><td>5% CO2, 5% O2, i inkubator do hodowli komórkowych z kontrolowaną wilgotnością&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Inkubator hipoksyjny (o niskiej zawartości tlenu)</td></tr><tr><td>5% CO2, 20% O2, i inkubator do hodowli komórkowych z kontrolowaną wilgotnością&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka wolnoobrotowa z wahliwym wirnikiem kubełkowym wyposażonym w uchwyt na płytki&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety P2, P20, P200 i P1000 oraz związane z nimi końcówki&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony z obiektywami fazowymi 4X, 10X i 20X&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe Ultra-Low Attachment (ULA)&nbsp;</td><td>Corning/Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr>Probówki <td></td><td></td><td></td><td>do mikrowirówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa</tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna Ultraczysta woda destylowana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &stopni; C zamrażarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Toksyczny; Zdecydowanie zaleca się podawanie MTG w celu zminimalizowania utleniania spowodowanego wielokrotnym otwieraniem. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C do 3 miesięcy, -20 &deg; C jest zalecany do długotrwałego przechowywania.</td></tr><tr><td>StemPro-34 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10639-011</td><td>Podstawowa pożywka do indukcji serca; Suplement jest przechowywany w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C i podłoże podstawowe w temperaturze 4 & st. C.</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Roche</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D Technologies</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Technologies</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Technologies</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Activin A R</td><td>& D Technologies</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Odczynniki Direct</td><td>57-G89</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>100x L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Zamiennik serum nokautującego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td></td><td></td><td></td></tr> enzymu dysocjacyjnego <tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 płytek</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td>Płytki Microwell</td></tr><tr><td>Roztwór do płukania Aggrewell</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td>Roztwór do płukania Microwell</td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibitor ROCK</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher Scientific</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka (do barwienia FACS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do permeabilizacji Intraprep</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM2389</td><td>Zestaw z 2 częściami: roztwór utrwalający i roztwór przepuszczalny; Toksyczne</td></tr><tr><td>przeciwciała cTnT</td><td>Neomarkery&nbsp;</td><td>MS-295</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie-IgG APCSondy</td><td>molekularne</td> ThermoFisher <td>A865</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki do cytometrii z przepływem okrągłym dnem zależne</td><td>od</td><td></td><td></td> maszyny FACS</tr></tbody></table>

optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Sercowe różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest zazwyczaj przeprowadzane w zawiesinowych agregatach komórkowych. Konwencjonalne tworzenie agregatów hPSC polega na dysocjacji kolonii komórkowych na mniejsze grudki, przy czym kontrola wielkości grudek jest z grubsza kontrolowana poprzez pipetowanie zawiesiny komórkowej aż do osiągnięcia pożądanej wielkości grudki. Jednym z głównych wyzwań związanych z konwencjonalnym zagregowanym różnicowaniem komórek hPSC w sercu jest to, że heterogeniczność hodowli i dezorganizacja przestrzenna prowadzą do zmiennej i nieefektywnej wydajności kardiomiocytów. My i inni wcześniej informowaliśmy, że wielkość zagregowanej ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC) może być modulowana w celu optymalizacji wydajności indukcji serca. Sprostaliśmy temu wyzwaniu, stosując skalowalne, oparte na mikrostudzienkach podejście do kontroli parametrów fizycznych tworzenia kruszywa, w szczególności wielkości i kształtu kruszywa. Opisana przez nas metoda polega na wymuszonej agregacji zdefiniowanych liczb hPSC w mikrostudzienkach, a następnie hodowli tych agregatów w warunkach kierujących indukcją serca. Protokół ten można łatwo skalować w zależności od wielkości i liczby użytych odwiertów. Stosując tę metodę, możemy konsekwentnie osiągać wyniki hodowli z częstością występowania kardiomiocytów większą niż 70%.

Agregaty hPSC o kontrolowanym rozmiarze można skutecznie formować przy użyciu systemu mikrowycieków, co zależy wyłącznie od stężenia komórek i powierzchni mikrowycieku. Po krótkim wirowaniu odpowiednia liczba komórek (1 000 w niniejszym protokole) zostaje zgromadzona w każdym mikrowycieku (Ryc. 1A). Co istotne, komórki te odtwarzają połączenia wewnątrzkomórkowe w ciągu 24 h i nie powinny już wypełniać całego wycieku, lecz przybrać postać zwartych agregatów o gładkich krawędziach (Ryc. 1B). Agregaty te stanowią materiały wyjściowe do dalszego różnicowania w kierunku linii kardiologicznej. Jeśli komórki nie utworzą zwartych klastrów, może to sugerować śmierć komórek po dysocjacji i reaggregacji; w takim przypadku należy zbadać przydatność pasażowania pojedynczych komórek oraz stężenia inhibitora ROCK dla danej linii komórkowej. Przez kolejne trzy dni w mikrowyciekach morfologia agregatów wykazuje niewielkie zmiany, choć widoczny jest pewien wzrost. Po usunięciu z mikrowycieków agregaty powinny zachować okrągłą, zwartą morfologię i mieć zbliżony do siebie rozmiar (Ryc. 1C). Hodowla w 24-dołkowych płytkach ULA umożliwi dalszą ekspansję i wzrost komórek.
W 8. dniu, po wstępnej ekspozycji na sygnalizację aktywiny oraz inhibicję szlaku Wnt, agregaty zaczną sprawiać wrażenie większych i jaśniejszych (Rycina 1D). W tym okresie na dnie każdej studzienki pojawi się znaczna ilość debris komórkowego, który należy usunąć, pozwalając agregatom opaść przed odessaniem medium. Sporadycznie wiele agregatów może się ze sobą połączyć. Nie będzie to hamować różnicowania pozostałych agregatów w studzience, choć takie „superagregaty” wykazują tendencję do braku zmian morfologicznych obserwowanych w mniejszych agregatach i rzadziej ulegają pełnemu różnicowaniu.
Dalsze różnicowanie prowadzi do wyraźnych zmian morfologicznych w agregatach, objawiających się zwiększeniem ich rozmiaru oraz pojawieniem się zorganizowanych obszarów włóknistych. Do 12. dnia można zaobserwować kurczące się agregaty. Składają się one zawsze z dużych, przezroczystych komórek i często zawierają rozległą macierz zewnątrzkomórkową poza obszarem agregatu (Rycina 2). Choć skurcze obejmujące cały agregat wskazują na pomyślne różnicowanie, ekspresja markerów kardiologicznych może być obserwowana również w agregatach, które nie wykazują tendencji do kurczenia się. Po dysocjacji agregatów i immunoznakowaniu, większość komórek wykazuje pozytywny wynik dla markera kardiomiocytów cTnT w badaniu cytometrii przepływowej (Rycina 3). Ekspresja tego markera w komórkach jest stabilna i może być obserwowana w agregatach nawet do 19. dnia różnicowania.
<img alt="Obrazy mikroskopowe wzrostu komórek; A-D: etapy agregacji i proliferacji komórek w hodowli." src="/files/ftp_upload/54308/54308fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Oś czasu różnicowania hPSC w kierunku linii kardiologicznej. Bezpośrednio po agregacji komórki niemal całkowicie wypełniają każdy mikrododatkowo (A). Dzień później agregaty wydają się skondensowane i gładkie (B). Taka morfologia utrzymuje się nawet po usunięciu agregatów z mikrododatków i przesianiu ich do płytek wielodołkowych (C). Do 8. dnia agregaty zaczynają się powiększać i stają się jaśniejsze (D). Pasek skali: 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces apoptozy komórek, obraz mikroskopowy, dezintegracja komórkowa, badania biologiczne, kontrast fazowy." src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Agregaty zaczynają kurczyć się w 12. dniu różnicowania. Po sześciu dniach w pożywce etapu 3 indukcji kardiologicznej zaobserwowano silne skurcze obejmujące cały agregat (panel górny: rozkurcz, panel środkowy: skurcz). Panel dolny powstał poprzez odjęcie paneli górnego i środkowego, przy czym najistotniejsze różnice są widoczne jako obszary czarne lub białe (groty strzałek). Pasek skali: 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Histogram cytometrii przepływowej, Troponina APC-A, wykazujący porównanie liczby komórek na poziomie 74,8%, wykres analizy danych." src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Immunoznakowanie troponiny T serca w zróżnicowanych hPSC. W 17. dniu większość komórek wykazuje pozytywny wynik w kierunku troponiny T serca w badaniu cytometrii przepływowej (histogram wypełniony). Przedstawiono również komórki zabarwione wyłącznie przeciwciałem wtórnym (histogram niewypełniony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Konwencjonalne metody inicjowania różnicowania sercowego ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na podstawie agregatu zawiesinowego są nękane niejednorodnością hodowli pod względem wielkości i kształtu agregatu. W tym miejscu opisujemy solidną metodę różnicowania serca wykorzystującą mikrostudzienki do generowania agregatów hPSC o kontrolowanej wielkości, hodowanych w warunkach sprzyjających pracy serca.

Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Najpierw odwiruj zawiesinę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (HPSC) w układzie jednokomórkowym przy 200 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu odessaj medium płuczące i ponownie zawieś komórki w medium do agregacji, osiągając gęstość 1,2 × 10⁶ komórek/ml. Następnie nanieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka na przygotowanej płytce mikrodofkowej i równomiernie rozprowadź komórki.Aby zasiać dużą liczbę dołków, należy okresowo mieszać zawiesinę komórkową w wirówce typu vortex, aby zapobiec sedymentacji. Po zasianiu wiruj płytkę z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu obejrzyj płytkę pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki opadły na dno każdego mikrodołka.Następnie inkubuj płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze hipoksycznym z zawartością 5% CO₂ i 5% O₂. Dzień po agregacji sprawdź agregaty pod mikroskopem. W porównaniu do stanu bezpośrednio po wirowaniu, powinny one wyglądać na nienaruszone i mieć gładkie krawędzie.Usuń nadsącz, trzymając płytkę mikrowyżłobioną poziomo i umieszczając końcówkę mikropipety P-1000 na powierzchni pożywki hodowlanej, przy krawędzi dołka. Następnie powoli usuń pożywkę, uważając, aby nie naruszyć agregatów znajdujących się na dnie mikrowyżłobień. Po obniżeniu poziomu pożywki do około jednego do dwóch milimetrów od teksturowanej powierzchni mikrowyżłobienia, powoli przechyl płytkę i powoli odessij pozostałą z dołka pożywkę.Dodaj 1 mL świeżo przygotowanego, uprzednio ogrzanego medium indukcyjnego etapu pierwszego, przykładając końcówkę pipety do wewnętrznej krawędzi dołka i bardzo powoli dozując medium po wewnętrznej ściance dołka. Wróć z płytką do inkubatora w warunkach hipoksji na trzy dni. W czwartym dniu użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby zebrać agregaty z każdego dołka płytki mikrowypustkowej.Przenieść zawiesinę agregatów z maksymalnie 10 dołków do 15-mililitrowej probówki stożkowej. Pozostawić agregaty do osadzenia na 15 minut w inkubatorze hipoksycznym. Po osadzeniu agregatów ostrożnie odessać nadsącz i ponownie zawiesić agregaty w dziesięciu mililitrach uprzednio ogrzanego medium piorzącego, aby usunąć pozostałości cytokin indukcyjnych.Odwiruj agregaty przy 50 ×g przez dwie minuty. Po wirowaniu odessij nadsącz i ponownie zawieś osad z agregatów w uprzednio ogrzanym medium indukcyjnym do drugiego etapu. Przenieś zawiesinę agregatów do płytki 24-dołkowej o ultra-niskiej adhezji, dozując 1 mL na dołek.Obserwuj agregaty pod mikroskopem jako jednorodne, gęste skupiska komórek. Inkubuj w warunkach hipoksji do szóstego dnia. Szóstego dnia zbierz do 10 mililitrów agregatów do każdej 15-mililitrowej probówki stożkowej, analogicznie jak poprzednio.Po osadzeniu się agregatów odessać nadsącz i ponownie zawiesić agregaty w uprzednio podgrzanym medium indukcyjnym do trzeciego etapu. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml rozdzielić agregaty do 24-dołkowej płytki o ultra-niskim przywieraniu (ultra-low attachment), dozując 1 ml na dołek. W 10. dniu hodowli przeprowadzić całkowitą wymianę medium.W 12. dniu przenieś komórki do normoksycznych warunków hodowli (20% tlenu i 5% dwutlenku węgla) na pozostały czas trwania inkubacji. Po 12 dniach różnicowania, co odpowiada sześciu dniom w pożywce trzeciego etapu indukcji kardiogennej, zaobserwowano silne skurcze obejmujące całe agregaty. W 17. dniu, zgodnie z wynikami cytometrii przepływowej, 74,8% komórek wykazuje pozytywną ekspresję troponiny T serca, co jest wskazane przez wypełnioną część histogramu.Przedstawiono również komórki barwione samym przeciwciałem wtórnym, co obrazuje niezamalowany obszar histogramu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest dokładne przemycie agregatów w czwartym dniu, aby usunąć śladowe ilości cytokin, a konkretnie aktywiny-A, która promuje różnicowanie w kierunku endodermy kosztem indukcji kardiologicznej. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak hodowla chłodnicza indukcją typów komórek w obrębie agregatu, aby odpowiedzieć na inne pytania, na przykład dotyczące tego, jak sygnalizacja parakrynna z sąsiednich tkanek embrionalnych wpływa na różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kierunku linii kardiologicznej.

aggregate-size-optimization-microwells-for-suspension-based-cardiac

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy solidny, szybki i skalowalny protokół różnicowania kardiomiocytów dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty uzyskane przy użyciu tej metody na dużą skalę mogą zapewnić wystarczającą liczbę komórek do ich skutecznego wykorzystania w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i potencjalnie zastosowaniach klinicznych.

Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Tutaj opisujemy optyczne pozyskiwanie i charakterystykę potencjałów czynnościowych z indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą szybkiego modułowego systemu fotometrycznego.

Pomiar potencjału czynnościowego optycznego pojedynczej komórki w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania kardiomiocytów z ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych przy użyciu mikrostudzienek do kontroli wielkości agregatów. Technika ta zapewnia jednorodne wyniki różnicowania serca.

Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny (Wideo) | JoVE Journal

Optymalizacja wielkości agregatu w mikrostudzienkach do różnicowania serca ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na podstawie zawiesiny

Przeglądaj więcej filmów