Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chloroplastów, na przykład dotyczące składu maszyn do importu białek chloroplastowych. Jest niezbędny do zazieleniania i fotosyntezy, a tym samym do produkcji żywności na naszej planecie. Maszyna molekularna składa się z dwóch oddzielnych kompleksów w zewnętrznym i wewnętrznym członku chloroplastu zwanych TOC i TIC, ale skład nie jest w pełni znany.

Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczanie kompleksu Arabidopsis TOC/TIC można przeprowadzić w jednoetapowej metodzie oczyszczania, oczyszczaniu TAP-TOC. Jest to specyficzna i skuteczna metoda. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowi w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ nie są zaznajomieni z izolacją frakcji błonowych chloroplastów, detergentem, solubilizacją lub oczyszczaniem powinowactwa.

Po przygotowaniu roślin Arabidopsis zmiel 10 gramów trzytygodniowych sadzonek w ciekłym azocie, używając zimnego moździerza i tłuczka z piaskiem. Dodaj 20 mililitrów zimnego buforu do mielenia do zmielonych tkanek. Dobrze wymieszaj i pozwól mieszaninie rozmrozić się na lodzie.

Następnie namocz dwie warstwy materiału do szybkiej filtracji za pomocą bufora do mielenia. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy materiału filtracyjnego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Odwirować filtrat o ciśnieniu 1 500 g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut i przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.

Powtórzyć wirowanie jeszcze raz w tych samych warunkach. Przenieś supernatant do zimnej probówki ultrawirówki o pojemności 38,50 mililitra i uzupełnij do 35 mililitrów zimnym buforem do mielenia. Za pomocą ultrawirówki odwirować próbkę w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.

Za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego ponownie zawieś zielone granulki w buforze do mielenia. Odwirować w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę i wyrzucić supernatant. Użyj szklanego homogenizatora teflonowego, aby ponownie zawiesić zielony granulat w 18,75 mililitrach jednego bufora do mielenia.

Następnie dodaj kolejne 9,375 mililitra jednego x bufora mielącego. Dodaj 9,375 mililitra czterech x roztworu solubilizacyjnego, aby doprowadzić końcową objętość do 37,5 mililitra i inkubować na obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie użyj ultrawirówki, aby odwirować próbkę w temperaturze 100 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.

Przenieść supernatant zawierający rozpuszczone membrany do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Po przygotowaniu żywicy agarozowej IGG przenieś wcześniej umytą żywicę agarozową IGG do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 37,5 mililitra rozpuszczonych membran. Inkubować przez noc na obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia osadź żywicę agarozową IGG w temperaturze 100 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Czy żywica agarozowa IGG w 37,5 mililitrach buforu A i inkubować na obracającej się wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Kontynuować sedymentację i mycie żywicy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś żywicę agarozową IGG do kolumny wirowej o pojemności 500 mikrolitrów z filtrem 35 mikronów. Przemyć kulki dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu elucyjnego TEV w celu zrównoważenia.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu elucyjnego TEV zawierającego 10 mikrolitrów proteazy TEV. Inkubować kolumnę wirową z kulkami w termomikserze w temperaturze 16 stopni Celsjusza i 350 obr./min przez dwie godziny. Następnie otwórz kolumnę wirującą i umieść ją w nowej, czystej tubie o pojemności 1,5 mililitra.

Wiruj tę probówkę z prędkością 100 razy g i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zebrać eluat. W tym badaniu oczyszczony jest oczyszczony kompleks białkowy otoczki chloroplastowej znakowany TAP z transgenicznych roślin A. thaliana. Analiza immunoblot potwierdza, że izolat TAP-TOC159 oddziałuje z TOC75 i TOC33 kompleksu TOC.

Kinaza błony zewnętrznej chloroplastów, KOC1, o której wiadomo, że fosforyluje TOC159, jest również współizolowana. Obecność TIC110 ujawnia, że wyizolowany kompleks TAP-TOC159 zawiera również składniki kompleksu TIC. Przeciwciało FBN1A nie rozpoznało kompleksu TAP-TOC159, co wskazuje na brak zanieczyszczeń.

W kontroli ujemnej immunoprecypitowane białko NTAP nie izolowało się jednocześnie z żadnym z białek TOC, TIC i potwierdza swoistość oczyszczania TAP-TOC159. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat importu białek chloroplastowych, może być potencjalnie zastosowana do każdego innego kompleksu w systemie butelek Arabidopsis thaliana. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak western blot lub spektrometria mas, aby wykazać obecność znanych składników lub zidentyfikować nowe składniki kompleksów TOC i TIC.

Technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie importu białek chloroplastowych w celu zbadania funkcji nowych składników kompleksów TOC i TIC.