Name: Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP w Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia identyfikację nowych partnerów interakcyjnych poprzez spektrometrię masową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez granty ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (31003A_156998 i 31003A_176191) oraz przez Uniwersytet w Neuchâtel.

1. Przygotowanie roślin Arabidopsis
<ol>
	<li>Przygotować 1 l pożywki o połowie objętości pożywki Murashige i Skoog (MS) zawierającej witaminy z 1% sacharozą i dostosować pH do 5,7 za pomocą wodorotlenku potasu (KOH). Dodać 0,8% fitoagaru i autoklaw przez 20 minut w temperaturze 120 °C.</li>
	<li>Wlać 75 ml pożywki MS na płytkę Petriego (średnica 14,5 cm, wysokość 3 cm) i pozostawić do zestalenia na 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 30 mg nasion Arabidopsis thaliana do probówki do mikrokrówki o pojemności 1,5 ml i sterylizować powierzchnię 70% (v/v) etanolem zawierającym 0,05% (v/v) Triton X-100 przez 5 minut, a następnie 100% (v/v) etanolem przez 10 min. Usunąć etanol.</li>
	<li>Przenieś nasiona na sterylną bibułę filtracyjną w celu wysuszenia. Wysterylizowane nasiona rozsyp równomiernie na płytce MS (każdy genotyp wymaga co najmniej 8-10 płytek) i zaklej każdą płytkę taśmą chirurgiczną.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez dwa dni w ciemności, aby zsynchronizować kiełkowanie nasion. Przenieść do komory wzrostowej z następującym cyklem świetlnym: 8 godzin światła 120 μmol m−2 s−1 i 16 godzin ciemności w temperaturze 22–20 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie koralików agarozowych HsIgG
<ol>
	<li>Zawiesić kulki agarozy aktywowane CNBr (4 g) w 100 ml 1 mM HCl i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś kulki agarozy do filtra ze szkła spiekanego, umyj w próżni 100 ml 100 mM HCl i powtórz 2-3 razy. 
	UWAGA: Wstępnie schłodzić roztwór myjący do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić kulki agarozy w 1 ml zimnego 100 mM HCl i przenieść do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyć filtr ze szkła spiekanego 3 ml 100 mM HCl i przenieść ciecz do tej samej probówki.</li>
	<li>Wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety. 
	UWAGA: Nie dekantować probówki.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 50 ml buforu sprzęgającego (tabela 1); krótko wymieszać, a następnie wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozpuścić 50 mg liofilizowanej Homo sapiens IgG (Hs-IgG) w 10 ml buforu sprzęgającego, delikatnie wymieszać kulki agarozy i inkubować w wytrząsarce obrotowej przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Przemyć kulki IgG-agarozy 50 ml buforu sprzęgającego i wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Zawiesić kulki IgG-agarozy w 50 ml buforu blokującego (Tabela 1) i wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć raz.</li>
	<li>Zawiesić ponownie kulki IgG-agarozy w 50 ml buforu blokującego, obracać mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i wirować w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki IgG-agarozy w 200 ml buforu sprzęgającego NaCl (Tabela 1).</li>
	<li>Aby zablokować wszelkie pozostałe sieciujące grupy CNBr, przemyj kulki IgG-agarozy 100 ml 0,1 M glicyny-HCl, pH 2,8. Wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Przemyć 0,2 M glicyny-HCl o pH 2,8, wirować z prędkością 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Na koniec umyj kulki IgG-agarozy 200 ml ultraczystej wody.</li>
	<li>Przemyć kulki IgG-agarozy 200 ml ultraczystej wody, a następnie 200 ml buforu PBS (Tabela 1).</li>
	<li>Zawiesić kulki IgG-agarozy w 20 ml buforu PBS z 0,01% NaN3 (azydek sodu) i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Izolacja i solubilizacja frakcji membranowej
<ol>
	<li>Zmielić 10 g trzytygodniowych sadzonek A. thaliana w ciekłym azocie za pomocą zimnego moździerza i tłuczka z piaskiem.</li>
	<li>Dodać 20 ml zimnego buforu do mielenia (Tabela 1) do 10 g zmielonej tkanki, dobrze wymieszać i rozmrozić na lodzie.</li>
	<li>Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy materiału do szybkiej filtracji do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przed filtracją namocz materiał do szybkiej filtracji buforem do mielenia.</li>
	<li>Odwirować filtrat przez 10 minut w temperaturze 1 500 × g w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, powtórzyć ten sam krok jeszcze raz i zebrać supernatant. Zachować próbkę "frakcji całkowitej" o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy</li>
	<li>Przenieść supernatant do zimnych probówek ultrawirówek o pojemności 38,50 ml i uzupełnić do 35 ml zimnym buforem do mielenia. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce.</li>
	<li>Przenieść sklarowany osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zachować próbkę "frakcji rozpuszczalnej" o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zielony granulat za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego, w buforze mielącym. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zielony granulat w 18,75 ml 1x buforu do mielenia za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego i dodać 9,375 ml 1x buforu do mielenia.</li>
	<li>Dodać 9,375 ml 4-krotnego roztworu do solubilizacji (Tabela 1) (zawierającego detergent TX-100), aby uzyskać 37,5 ml i inkubować przez 30 minut na "obrotowym wytrząsarce" w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C w ultrawirówce. Przenieść sklarowany osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Zachować próbkę supernatantu o objętości 200 μl (przyszła "frakcja obciążeniowa") i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	<li>Zawiesić osad w 37,5 ml bufora do mielenia. Zachować próbkę części nierozpuszczalnej i przechowywać w temperaturze -80 °C</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Zrównoważyć 100 μl upakowanej żywicy IgG-agarozy w buforze A (tabela 1) i wirować w temperaturze 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić żywicę IgG-agarozy w 100 μl buforu A w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść przemytą żywicę IgG-agarozy do 37,5 ml rozpuszczonych membran i inkubować przez noc na obracającej się wytrząsarce w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Osadzać żywicę IgG-agarozy w stężeniu 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant za pomocą pipety. Zachować 200 μl próbki "przepływowej" i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	<li>Przemyć żywicę IgG-agarozy w 37,5 ml buforu A i inkubować przez 10 minut na obrotowej wytrząsarce.</li>
	<li>Osadzać żywicę IgG-agarozy w temperaturze 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant za pomocą pipety, dodać 5 ml buforu A do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 100 × g, 4 °C, 5 min. Zachować próbkę "Wash 1" o objętości 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	<li>Powtórz etap płukania 5 ml trzy razy z buforem A.</li>
	<li>Przeprowadzić dwa ostatnie etapy płukania bez inhibitorów (NaF, inhibitor proteazy i PMSF) 
	UWAGA: Na tym etapie inhibitory nie są już wymagane i pominięte w celu obniżenia kosztów. Zatrzymać próbkę o objętości 200 μl z ostatniego etapu prania "pranie końcowe (W6)" i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	<li>Przenieść żywicę IgG-agarozy do kolumny wirowej o pojemności 500 μl z filtrem 35 μm i przepłukać kulki dwukrotnie 300 μl buforu elucyjnego TEV (tabela 1) (niezawierającego AcTEV) w celu zrównoważenia. Zamknij kolumnę wirowania.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu elucyjnego TEV zawierającego 50 jednostek (10 μl) AcTEV. Przygotuj mieszankę w tubie przed dodaniem do żywicy.</li>
	<li>Inkubować kolumnę wirową z kulkami w termomikserze w temperaturze 16 °C, 350 obr./min przez 2 godziny. Delikatnie odwracać kolumnę kilka razy co 30 minut.</li>
	<li>Otworzyć kolumnę wirową, umieścić ją w nowej, czystej probówce o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 100 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania eluatu.</li>
	<li>Wysuszyć (na przykład) 10% (v/v) eluowanej próbki (~25 μL) w parowniku odśrodkowym i użyć do spektrometrii mas lub innej dalszej analizy.</li>
	<li>Pozostałą część eluatu (~275 μl) podzielić na jedenaście probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (każda po 25 μl), wysuszyć w parowniku odśrodkowym i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Analizować próbki zatrzymane przez cały czas trwania procedury, jak również eluaty za pomocą standardowej SDS-PAGE, a następnie immunoblotting. W celu przygotowania próbki należy wytrącić 50 μg całkowitej (T), ładunku (L), przepływu (FT), przepłukania 1 (W1) i 200 μl przepłukania 6 (W6) przez ekstrakcję chloroformem/metanolem16.</li>
	<li>Dodać 10 μl buforu ładującego 2x SDS-PAGE (Tabela 1) do wytrąconych próbek i 25 μl eluowanej wysuszonej próbki. Wirować i gotować przez 10 minut w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym.</li>
	<li>Przeanalizować całkowitą (T), ładunek (L), przepływ (FT), płukanie 1 (W1), płukanie 6 (W6) i elucję (E) przez immunoblotting przy użyciu przeciwciał anty-TOC159 w celu określenia skuteczności procedury izolacji.</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., López-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Kessler, F., Schnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+biogenesis%3A+diversity+and+regulation+of+the+protein+import+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus.</a> Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).</li>
<li>Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+components+of+the+chloroplast+protein+import+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of components of the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).</li>
<li>Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+GTP-binding+proteins+in+the+chloroplast+protein+import+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery.</a> Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).</li>
<li>Jarvis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+plastid+general+protein+import+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus.</a> Science. 282 (5386), 100-103 (1998).</li>
<li>Bauer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+the+G-domain+in+targeting+of+the+protein+import+receptor+atToc159+to+the+chloroplast+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane.</a> The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).</li>
<li>Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+into+chloroplasts%3A+the+Tic+complex+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation.</a> Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).</li>
<li>Nakai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIC+complex+uncovered%3A+The+alternative+view+on+the+molecular+mechanism+of+protein+translocation+across+the+inner+envelope+membrane+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts.</a> Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).</li>
<li>Kikuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+protein+translocon+at+the+chloroplast+inner+envelope+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane.</a> Science. 339 (6119), 571-574 (2013).</li>
<li>Kohler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+chloroplast+protein+import+without+Tic56%2C+a+component+of+the+1-megadalton+translocon+at+the+inner+envelope+membrane+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts.</a> Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).</li>
<li>Zufferey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+chloroplast+outer+membrane+kinase+KOC1+is+a+required+component+of+the+plastid+protein+import+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery.</a> The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tandem+affinity+purification+tag+and+methods+for+isolation+of+protein+heterocomplexes+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal%22%5BJournal%5D)">Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants.</a> The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).</li>
<li>Rohila, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+of+tandem+affinity+purified+protein+kinases+from+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice.</a> PloS one. 4 (8), 6685(2009).</li>
<li>Agne, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acidic+A-domain+of+Arabidopsis+TOC159+occurs+as+a+hyperphosphorylated+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein.</a> Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).</li>
<li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wykazaliśmy, że jednoetapowe oczyszczanie znaczników TAP jest specyficzną i skuteczną metodą oczyszczania kompleksu Arabidopsis TOC-TIC. Chociaż znacznik TAP pozwoliłby na dwa kolejne etapy oczyszczania (IgG-, a następnie oczyszczanie powinowactwa kalmoduliny po rozszczepieniu proteazy TEV), uważamy, że w wielu przypadkach pierwszy etap powinowactwa, po którym następuje rozszczepienie proteazy TEV, będzie wystarczający. Nasz cel, TOC159, jest mało obfity, a włączenie drugiego etapu powinowactwa do kalmoduliny nadmiernie zmniejszyło wydajność białka, co było głównym powodem wykluczenia go z naszego obecnego protokołu. Elucja TEV sama w sobie jest wysoce specyficznym i delikatnym etapem oczyszczania, który uwolni tylko cel oznaczony TAP wraz z powiązanymi partnerami interakcji, podczas gdy białka przylegające niespecyficznie do żywicy IgG pozostaną tam. Tak więc, w połączeniu z etapem powinowactwa IgG, elucja TEV skutkuje wystarczająco skutecznym oczyszczaniem dla naszych i prawdopodobnie wielu innych celów.
Należy zadbać o to, aby konstrukt oznaczony TAP był w pełni funkcjonalny in vivo. Znakowanie TAP może mieć potencjalnie szkodliwy wpływ na aktywność, stabilność lub lokalizację białek. TOC159 składa się z trzech domen, N-końcowej domeny kwasowej, centralnej domeny wiążącej GTP i C-końcowej domeny błonowej, która zakotwicza TOC159 w zewnętrznej błonie chloroplastowej2. Aby uniknąć potencjalnych zakłóceń we wprowadzaniu membrany, połączyliśmy znacznik TAP z N-końcem TOC159. Fuzja z N-końcem jest raczej wyjątkiem niż regułą. Wiele białek zawiera N-końcową informację o celowaniu i dlatego powinny być oznaczone na C-końcu. Zapewniliśmy, że TOC159 działa in vivo poprzez uzupełnienie mutanta ppi2 (mutanta albinosa pozbawionego TOC159) TAP-TOC159. Uratowanie zielonego, dzikiego fenotypu wykazało, że TAP-TOC159 był funkcjonalny15.
Protokół oczyszczania wykorzystano do identyfikacji nowych partnerów interakcji TOC159, w tym KOC1 i TIC5610,11. W sumie około 30 białek było związanych z kompleksem, co sugeruje, że w niedalekiej przyszłości zostaną wyizolowani i scharakteryzowani nowi partnerzy interakcji. Chociaż zdecydowanie zalecamy TAP-tag do kompleksowego oczyszczania, nadal chcielibyśmy zwrócić uwagę, że istnieją dodatkowe wersje do przedstawionej tutaj i mogą być bardzo przydatne dla niektórych zastosowań.

Rośliny są zależne od chloroplastów do fotosyntezy i wzrostu fotoautotroficznego1. Zdecydowana większość białek chloroplastowych jest kodowana w jądrze, syntetyzowana w cytozolu i importowana do chloroplastu przez kompleksy TIC i TOC w błonach otoczki2. Rdzeń kompleksu TOC składa się z kanału przewodzącego białko Toc75 i dwóch GTPaz receptora: Toc33 i Toc1593,4,5. TOC159 jest niezbędny do biogenezy chloroplastów i pośredniczy w masowej akumulacji białek związanych z fotosyntezą6. Kompleks TIC składa się z kanału przewodzącego białko TIC20 oraz TIC110 i TIC407,8. Niedawno wyizolowano kompleks translokacji białka 1MD na wewnętrznej błonie otoczki, który zawierał wcześniej niezidentyfikowane składniki9, z których jednym był TIC56. Niedawno wspólnie wyizolowaliśmy TIC56 kompleksu 1 MDa przy użyciu protokołu oczyszczania powinowactwa TAP-TOC159. Dane wskazują na strukturalne nakładanie się "kanonicznych" kompleksów TOC/TIC i 1 MDa complex10. Wcześniej nieznane komponenty, takie jak KOC1, zostały również zidentyfikowane jako nowi partnerzy interakcji kompleksów TOC i TIC przy użyciu metody TAP opisanej tutaj10,11.
Tak więc, oczyszczanie znacznika TAP jest skuteczną metodą izolacji kompleksów białkowych i identyfikacji oddziałujących partnerów poprzez późniejszą analizę spektrometryczną mas12. Znacznik TAP składa się z dwóch powtórzeń wiązania IgG oddzielonych od peptydu wiążącego kalmodulinę (CBP) przez miejsce rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Pierwotna metoda, składająca się z etapu oczyszczania z powinowactwem IgG, po którym następuje rozszczepienie TEV, a następnie chromatografia z powinowactwem do kalmoduliny, pozwoliła na natywne oczyszczanie dużych i wysoce czystych kompleksów białkowych13,14. Uprościliśmy procedurę i wykazaliśmy, że kompleksy białkowe zawierające TOC159 mogą być również skutecznie oczyszczane przy użyciu tylko etapu oczyszczania powinowactwa IgG, po którym następuje rozszczepienie TEV w celu elucji15. Z naszego doświadczenia wynika, że pominięcie etapu powinowactwa do kalmoduliny skutkowało wyższymi plonami i dlatego może być odpowiednie dla białek o niskiej obfitości.
Krótko mówiąc, zaprojektowaliśmy stabilne transgeniczne linie A. thaliana wyrażające TAP-TOC159 w tle ppi2 (mutant toc159 KO) i ustaliliśmy je jako wiarygodne źródło do oczyszczania kompleksów TOC-TIC. Protokół izolacji kompleksu TOC-TIC rozpoczyna się od homogenizacji materiału roślinnego w buforze wolnym od detergentów. Po odwirowaniu supernatant jest odrzucany. Osad zawierający całkowitą frakcję membranową jest rozpuszczany przy użyciu buforu zawierającego detergent. Po etapie ultra-wirowania, supernatant zawierający rozpuszczone kompleksy TOC-TIC nakłada się na żywicę IgG w celu oczyszczenia powinowactwa. Po kilku etapach płukania elucję przeprowadza się przy użyciu buforu zawierającego proteazę TEV w celu selektywnego rozszczepienia domen wiążących IgG i delikatnego uwolnienia natywnych kompleksów zawierających TOC159. Eluat TEV może być analizowany bezpośrednio za pomocą Western blot lub spektrometrii mas w celu identyfikacji partnerów interakcji TOC15910,11,15. Metoda ta została również wykorzystana do identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych TOC15915. W przyszłości natywne kompleksy zawierające TOC159 mogą być wykorzystywane do badań strukturalnych z wykorzystaniem mikroskopii krioelektronowej.

<table><tbody><tr><td>NaHCO3</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A0384</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7909</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A2946</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S1509</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A0999</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteazy roślinnej</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A0970</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roche</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A0675</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252-290</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>PanReac&nbsp; AppliChem</td><td>A3935</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Murashige and Skoog z witaminami</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>Fitoagar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Petriego</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639102</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrofuge</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>chemiczny Fisher</td><td>E/0600DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>10311804</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Kulki agarozy aktywowane CNBr (sefaroza 4B)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0430-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtr ze szkła spiekanego</td><td>DURAN</td><td>2515703</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczona immunoglobulina G (HsIgG)</td><td>MP Biomedicals</td><td>855908</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa</td><td>IKA</td><td>4016000</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (azydek sodu)</td><td>Sigma</td><td>71290</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>materiał do szybkiej filtracji (Miracloth)</td><td>Merk-Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka XNP-80</td><td>Redlica Beckman</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW 32 Ti</td><td>Redlica Beckman</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>Probówki ultrawirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Szklany homogenizator teflonowy (Potter)</td><td>Wheaton</td><td>357426</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wirowa (Mobicol)</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M1003</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 35&micro; m dla kolumny wirującej (Mobicol)</td><td>Mo Bi Tec</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Parownik odśrodkowy (Speed Vac)</td><td>Eppendorf</td><td>5305000100</td><td></td></tr><tr><td>FBN1A(PGL35) przeciwciało</td><td>AgriSera</td><td>AS06 116</td><td>RRID:AB_2247012</td></tr><tr><td>Piasek, Fontainebleau</td><td>VWR</td><td>27460.295</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika tap

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Biogeneza chloroplastów wymaga importu tysięcy białek kodowanych przez jądro do plastydu. Import tych białek zależy od translokonu na zewnętrznej (TOC) i wewnętrznej (TIC) błonie chloroplastowej. Kompleksy TOC i TIC są multimeryczne i prawdopodobnie zawierają jeszcze nieznane składniki. Jednym z głównych celów w tej dziedzinie jest stworzenie pełnej inwentaryzacji składników TOC i TIC. W celu wyizolowania kompleksów TOC-TIC i identyfikacji nowych składników, receptor prebiałkowy TOC159 został zmodyfikowany N-końcowy przez dodanie znacznika tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP), w wyniku czego powstaje TAP-TOC159. Znacznik TAP jest przeznaczony do dwóch sekwencyjnych etapów oczyszczania powinowactwa (stąd "powinowactwo tandemowe"). Znacznik TAP stosowany w tych badaniach składa się z N-końcowej domeny wiążącej IgG pochodzącej z białka A Staphylococcus aureus (ProtA), po której następuje peptyd wiążący kalmodulinę (CBP). Pomiędzy tymi dwoma znacznikami powinowactwa uwzględniono miejsce rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Dlatego proteaza TEV może być stosowana do delikatnej elucji kompleksów zawierających TOC159 po związaniu się z kulkami IgG. W przedstawionym tutaj protokole pominięto drugi etap oczyszczania z powinowactwem do kalmoduliny. Protokół oczyszczania rozpoczyna się od przygotowania i rozpuszczenia całkowitych błon komórkowych. Po poddaniu działaniu detergentu, rozpuszczone białka błonowe są inkubowane z kulkami IgG w celu immunoizolacji kompleksów zawierających TAP-TOC159. Po związaniu i intensywnym płukaniu kompleksy zawierające TAP-TOC159 są rozszczepiane i uwalniane z kulek IgG za pomocą proteazy TEV, za pomocą której usuwana jest domena wiążąca IgG S. aureus. Western blot wyizolowanych kompleksów zawierających TOC159 może być wykorzystany do potwierdzenia obecności znanych lub podejrzewanych białek TOC i TIC. Co ważniejsze, kompleksy zawierające TOC159 zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji nowych składników kompleksów TOC i TIC za pomocą spektrometrii mas. Protokół, który prezentujemy, potencjalnie pozwala na efektywną izolację dowolnego kompleksu białkowego związanego z błoną, który można wykorzystać do identyfikacji nieznanych jeszcze składników za pomocą spektrometrii mas.

Opisano tutaj protokół oczyszczania kompleksu białek koperty chloroplastów z etykietą TAP z transgenicznych roślin A. thaliana. Jak pokazano na Rysunku 1A, do izolacji tego kompleksu wykorzystano rośliny eksponujące konstrukt 35S:NTAP-TOC159, natomiast rośliny eksponujące konstrukt 35S:NTAP posłużyły jako kontrola. Rysunek 1B przedstawia szczegółowe etapy oczyszczania kompleksów białkowych TAP-TOC159, po których zastosowano spektrometrię mas w celu identyfikacji białek oddziałujących. Analiza immunoblotingowa (Rysunek 2, prawa strona) potwierdza, że wyizolowane TAP-TOC159 oddziałuje z białkami TOC75 i TOC33 kompleksu TOC. Kinaza zewnętrznej błony chloroplastu KOC1, znana z fosforylacji TOC159, również została współizolowana z kompleksem TAP-TOC159 (Rysunek 2B, prawa strona). Obecność TIC10 wykazuje, że wyizolowany kompleks TAP-TOC159 zawiera również komponenty kompleksu TIC. Przeciwciało FBN1A skierowane przeciwko białku plastoglubul, niezwiązanemu z importem białek, nie rozpoznało kompleksu TAP-TOC159, co wskazuje na brak zanieczyszczeń. W kontroli negatywnej immunoprecypitowane białko NTAP nie współizolowało się z żadnym z białek TOC-TIC (Rysunek 2, lewa strona), co potwierdza specyficzność oczyszczania TAP-TOC159.
<img alt="Metoda oczyszczania białek, cięcie TEV, schemat wiązania powinowactwa, analiza spektrometryczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Schemat konstruktów i procedury oczyszczania powinowactwa. (A). Konstrukt 35S:NTAP-TOC159, kodujący NTAP-TOC159, był stabilnie ekspresowany w Arabidopsis thaliana. Rośliny kontrolne ujemne eksprimowały konstrukt 35S:NTAP, kodujący sam znacznik TAP. (B). Wieloetapowy protokół oczyszczania powinowactwem składa się z izolacji i solubilizacji błon, immunopuryfikacji przy użyciu agarozy z IgG, przemyć, cięcia proteazą TEV oraz elucji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik analizy immunoblotowania, prążki białkowe z markerami TOC159 i TIC10, drabinka wielkości w kDa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58532/58532fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Tandemowa puryfikacja powinowactwem białka TOC159. Oczyszczono białko TOC159 z N-terminalną znaczniką TAP z linii NTAP-TOC15:ppi2 Arabidopsis rośliny oraz białko TAP oczyszczone z roślin TAP:WT wykorzystano jako kontrolę negatywną. Ekstrakty białek całkowitych (T), solubilizowane białka błonowe = frakcja załadowana (L), frakcja nieprzepuszczona (FT), pierwsza i ostatnia frakcja przemywania (W1 i W6) oraz 10% eluatu TEV analizowano metodą Western blotting. Membranę inkubowano z przeciwciałami przeciwko TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC3 (AT1G0280), KOC1 (AT4G3250), TIC10 (AT1G06950) oraz FBN1A (AT4G04020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58532/58532fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tabela buforów</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor sprzęgający</td>
			<td>NaHCO₃3 
			Dostosować pH do wartości 8,5, regulując pH za pomocą 0,1 M Na2CO3</td>
			<td>10 mM 
			 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor blokujący</td>
			<td>Tris–HCl 
			Dostosować pH do wartości 8 za pomocą HCl.</td>
			<td>10 mM 
			 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor PBS</td>
			<td>Na2HPO4 
			KH2PO4 
			NaCl 
			KCl 
			Dostosować pH do wartości 7,3 za pomocą HCl.</td>
			<td>4,3 mM 
			1,4 mM 
			137 
			2.7 
			 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor sprzęgający NaCl</td>
			<td>Bufor sprzęgający 
			NaCl</td>
			<td>  
			1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do rozcierania 2X</td>
			<td>Tris-HCl, pH 7,5 skorygowane HCl. 
			NaCl 
			NaF 
			PMSF 
			Koktajl inhibitorów proteaz roślinnych</td>
			<td>10 mM 
			20 mM 
			5 mM 
			1 mM 
			0.20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X roztwór do solubilizacji</td>
			<td>Glicerol 
			Triton-X10</td>
			<td>40% 
			3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor A</td>
			<td>  
			bufor do rozcierania 2X 
			bufor do rozcierania 1X 
			4X roztwór solubilizujący</td>
			<td>10 ml 
			50 ml 
			25 ml 
			25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor do elucji TEV</td>
			<td>Tris-HCl, pH 8 z HCl 
			EDTA, pH 8 z HCl 
			NaCl 
			Glicerol 
			Triton-X10 
			DTT</td>
			<td>50 mM 
			0,5 mM 
			10 mM 
			10% 
			0.75% 
			1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x bufor do nakładania próbek w elektroforezie SDS-PAGE</td>
			<td>Tris-HCl pH 6,8 z HCl 
			SDS 
			Glicerol 
			Błękit bromofenolowy 
			DTT</td>
			<td>0,1 M 
			4% 
			20% 
			0.20% 
			0,2 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Składy buforów.

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chloroplastów, na przykład dotyczące składu maszyn do importu białek chloroplastowych. Jest niezbędny do zazieleniania i fotosyntezy, a tym samym do produkcji żywności na naszej planecie. Maszyna molekularna składa się z dwóch oddzielnych kompleksów w zewnętrznym i wewnętrznym członku chloroplastu zwanych TOC i TIC, ale skład nie jest w pełni znany.Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczanie kompleksu Arabidopsis TOC/TIC można przeprowadzić w jednoetapowej metodzie oczyszczania, oczyszczaniu TAP-TOC. Jest to specyficzna i skuteczna metoda. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowi w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ nie są zaznajomieni z izolacją frakcji błonowych chloroplastów, detergentem, solubilizacją lub oczyszczaniem powinowactwa.Po przygotowaniu roślin Arabidopsis zmiel 10 gramów trzytygodniowych sadzonek w ciekłym azocie, używając zimnego moździerza i tłuczka z piaskiem. Dodaj 20 mililitrów zimnego buforu do mielenia do zmielonych tkanek. Dobrze wymieszaj i pozwól mieszaninie rozmrozić się na lodzie.Następnie namocz dwie warstwy materiału do szybkiej filtracji za pomocą bufora do mielenia. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy materiału filtracyjnego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Odwirować filtrat o ciśnieniu 1 500 g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut i przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Powtórzyć wirowanie jeszcze raz w tych samych warunkach. Przenieś supernatant do zimnej probówki ultrawirówki o pojemności 38,50 mililitra i uzupełnij do 35 mililitrów zimnym buforem do mielenia. Za pomocą ultrawirówki odwirować próbkę w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.Za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego ponownie zawieś zielone granulki w buforze do mielenia. Odwirować w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę i wyrzucić supernatant. Użyj szklanego homogenizatora teflonowego, aby ponownie zawiesić zielony granulat w 18,75 mililitrach jednego bufora do mielenia.Następnie dodaj kolejne 9,375 mililitra jednego x bufora mielącego. Dodaj 9,375 mililitra czterech x roztworu solubilizacyjnego, aby doprowadzić końcową objętość do 37,5 mililitra i inkubować na obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie użyj ultrawirówki, aby odwirować próbkę w temperaturze 100 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.Przenieść supernatant zawierający rozpuszczone membrany do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Po przygotowaniu żywicy agarozowej IGG przenieś wcześniej umytą żywicę agarozową IGG do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 37,5 mililitra rozpuszczonych membran. Inkubować przez noc na obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia osadź żywicę agarozową IGG w temperaturze 100 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Czy żywica agarozowa IGG w 37,5 mililitrach buforu A i inkubować na obracającej się wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Kontynuować sedymentację i mycie żywicy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś żywicę agarozową IGG do kolumny wirowej o pojemności 500 mikrolitrów z filtrem 35 mikronów. Przemyć kulki dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu elucyjnego TEV w celu zrównoważenia.Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu elucyjnego TEV zawierającego 10 mikrolitrów proteazy TEV. Inkubować kolumnę wirową z kulkami w termomikserze w temperaturze 16 stopni Celsjusza i 350 obr./min przez dwie godziny. Następnie otwórz kolumnę wirującą i umieść ją w nowej, czystej tubie o pojemności 1,5 mililitra.Wiruj tę probówkę z prędkością 100 razy g i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zebrać eluat. W tym badaniu oczyszczony jest oczyszczony kompleks białkowy otoczki chloroplastowej znakowany TAP z transgenicznych roślin A. thaliana. Analiza immunoblot potwierdza, że izolat TAP-TOC159 oddziałuje z TOC75 i TOC33 kompleksu TOC.Kinaza błony zewnętrznej chloroplastów, KOC1, o której wiadomo, że fosforyluje TOC159, jest również współizolowana. Obecność TIC110 ujawnia, że wyizolowany kompleks TAP-TOC159 zawiera również składniki kompleksu TIC. Przeciwciało FBN1A nie rozpoznało kompleksu TAP-TOC159, co wskazuje na brak zanieczyszczeń.W kontroli ujemnej immunoprecypitowane białko NTAP nie izolowało się jednocześnie z żadnym z białek TOC, TIC i potwierdza swoistość oczyszczania TAP-TOC159. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat importu białek chloroplastowych, może być potencjalnie zastosowana do każdego innego kompleksu w systemie butelek Arabidopsis thaliana. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak western blot lub spektrometria mas, aby wykazać obecność znanych składników lub zidentyfikować nowe składniki kompleksów TOC i TIC.Technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie importu białek chloroplastowych w celu zbadania funkcji nowych składników kompleksów TOC i TIC.

affinity-purification-chloroplast-translocon-protein-complexes-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Drosophila słynie z potężnej manipulacji genetycznej, ale nie z przydatności do dogłębnej analizy biochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy procedurę opartą na TAP, która ma na celu identyfikację oddziałujących partnerów dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu muchy. Procedura ta może potencjalnie prowadzić do powstania nowych kierunków badań.

Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP)

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Opisujemy metodę generowania indukowalnych stabilnych linii komórkowych oznaczonych znacznikami lokalizacji i powinowactwa (LAP) do badania funkcji białek, czasoprzestrzennej lokalizacji subkomórkowej i sieci interakcji białko-białko.

Indukowalne, stabilne linie komórkowe znakowane na LAP do badania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj metodę oczyszczania kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP w Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia identyfikację nowych partnerów interakcyjnych poprzez spektrometrię masową.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Przeglądaj więcej filmów