Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP
1 listopada 2018
Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chloroplastów, na przykład dotyczące składu maszyn do importu białek chloroplastowych. Jest niezbędny do zazieleniania i fotosyntezy, a tym samym do produkcji żywności na naszej planecie. Maszyna molekularna składa się z dwóch oddzielnych kompleksów w zewnętrznym i wewnętrznym członku chloroplastu zwanych TOC i TIC, ale skład nie jest w pełni znany.
Główną zaletą tej techniki jest to, że oczyszczanie kompleksu Arabidopsis TOC/TIC można przeprowadzić w jednoetapowej metodzie oczyszczania, oczyszczaniu TAP-TOC. Jest to specyficzna i skuteczna metoda. Ogólnie rzecz biorąc, naukowcy nowi w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ nie są zaznajomieni z izolacją frakcji błonowych chloroplastów, detergentem, solubilizacją lub oczyszczaniem powinowactwa.
Po przygotowaniu roślin Arabidopsis zmiel 10 gramów trzytygodniowych sadzonek w ciekłym azocie, używając zimnego moździerza i tłuczka z piaskiem. Dodaj 20 mililitrów zimnego buforu do mielenia do zmielonych tkanek. Dobrze wymieszaj i pozwól mieszaninie rozmrozić się na lodzie.
Następnie namocz dwie warstwy materiału do szybkiej filtracji za pomocą bufora do mielenia. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy materiału filtracyjnego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Odwirować filtrat o ciśnieniu 1 500 g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut i przenieść supernatant do świeżej, wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.
Powtórzyć wirowanie jeszcze raz w tych samych warunkach. Przenieś supernatant do zimnej probówki ultrawirówki o pojemności 38,50 mililitra i uzupełnij do 35 mililitrów zimnym buforem do mielenia. Za pomocą ultrawirówki odwirować próbkę w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.
Za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego ponownie zawieś zielone granulki w buforze do mielenia. Odwirować w temperaturze 100 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę i wyrzucić supernatant. Użyj szklanego homogenizatora teflonowego, aby ponownie zawiesić zielony granulat w 18,75 mililitrach jednego bufora do mielenia.
Następnie dodaj kolejne 9,375 mililitra jednego x bufora mielącego. Dodaj 9,375 mililitra czterech x roztworu solubilizacyjnego, aby doprowadzić końcową objętość do 37,5 mililitra i inkubować na obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie użyj ultrawirówki, aby odwirować próbkę w temperaturze 100 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.
Przenieść supernatant zawierający rozpuszczone membrany do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Po przygotowaniu żywicy agarozowej IGG przenieś wcześniej umytą żywicę agarozową IGG do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 37,5 mililitra rozpuszczonych membran. Inkubować przez noc na obracającym się wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia osadź żywicę agarozową IGG w temperaturze 100 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Czy żywica agarozowa IGG w 37,5 mililitrach buforu A i inkubować na obracającej się wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Kontynuować sedymentację i mycie żywicy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś żywicę agarozową IGG do kolumny wirowej o pojemności 500 mikrolitrów z filtrem 35 mikronów. Przemyć kulki dwukrotnie 300 mikrolitrami buforu elucyjnego TEV w celu zrównoważenia.
Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu elucyjnego TEV zawierającego 10 mikrolitrów proteazy TEV. Inkubować kolumnę wirową z kulkami w termomikserze w temperaturze 16 stopni Celsjusza i 350 obr./min przez dwie godziny. Następnie otwórz kolumnę wirującą i umieść ją w nowej, czystej tubie o pojemności 1,5 mililitra.
Wiruj tę probówkę z prędkością 100 razy g i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zebrać eluat. W tym badaniu oczyszczony jest oczyszczony kompleks białkowy otoczki chloroplastowej znakowany TAP z transgenicznych roślin A. thaliana. Analiza immunoblot potwierdza, że izolat TAP-TOC159 oddziałuje z TOC75 i TOC33 kompleksu TOC.
Kinaza błony zewnętrznej chloroplastów, KOC1, o której wiadomo, że fosforyluje TOC159, jest również współizolowana. Obecność TIC110 ujawnia, że wyizolowany kompleks TAP-TOC159 zawiera również składniki kompleksu TIC. Przeciwciało FBN1A nie rozpoznało kompleksu TAP-TOC159, co wskazuje na brak zanieczyszczeń.
W kontroli ujemnej immunoprecypitowane białko NTAP nie izolowało się jednocześnie z żadnym z białek TOC, TIC i potwierdza swoistość oczyszczania TAP-TOC159. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat importu białek chloroplastowych, może być potencjalnie zastosowana do każdego innego kompleksu w systemie butelek Arabidopsis thaliana. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak western blot lub spektrometria mas, aby wykazać obecność znanych składników lub zidentyfikować nowe składniki kompleksów TOC i TIC.
Technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie importu białek chloroplastowych w celu zbadania funkcji nowych składników kompleksów TOC i TIC.
Przegląd
W tym artykule przedstawiono jednokrokowe protokoły afinitetowej izolacji dla oczyszczania kompleksów importujących białka do chloroplastów (kompleks TOC-TIC) z wykorzystaniem znacznika TAP-tag. Ta metoda może identyfikować nowe związki partnerów za pomocą spektrometrii masowej i jest kluczowa dla zrozumienia funkcji chloroplastów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia chloroplastów
- Oczyszczanie białek
- Spektrometria masowa
Tło
- Maszyneria importująca białka do chloroplastów jest niezbędna dla fotosyntezy i produkcji żywności.
- Kompleksy TOC i TIC są zaangażowane w import białek, ale ich pełny skład nie jest dobrze poznany.
- Obecne metody izolacji tych kompleksów mogą być złożone i czasochłonne.
- Celem tego badania jest uproszczenie procesu oczyszczania.
Cel badania
- Opracowanie prostego protokołu oczyszczania kompleksu TOC-TIC.
- Umożliwienie identyfikacji nowych składników zaangażowanych w import białek do chloroplastów.
- Dostarczenie metody, która może być zastosowana do innych kompleksów białkowych w Arabidopsis thaliana.
Wykorzystane metody
- Przygotowanie siewek Arabidopsis i mielenie w ciekłym azocie.
- Sekwencyjna wirowanie w celu wyizolowania błon chloroplastów.
- Oczyszczanie afinityjne z wykorzystaniem żywicy IGG agarose.
- Analiza immunoblotu w celu potwierdzenia obecności specyficznych białek.
Główne wyniki
- Kompleks TAP-TOC159 został pomyślnie oczyszczony i wykazano, że oddziałuje z TOC75 i TOC33.
- Ko-izolacja TIC110 wskazuje na obecność komponentów TIC w oczyszczonym kompleksie.
- Metoda wykazała swoistość, ponieważ negatywne kontrole nie wykazały ko-izolacji z białkami TOC i TIC.
- Ta technika umożliwia dalszą eksplorację mechanizmów importu białek do chloroplastów.
Wnioski
- Metoda oczyszczania z wykorzystaniem znacznika TAP-tag jest efektywna i specyficzna dla izolacji kompleksów białkowych chloroplastów.
- To podejście może wzmóc badania nad systemem importu białek do chloroplastów.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do identyfikacji nowych składników kompleksów TOC i TIC.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
