Name: Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę tworzenia i wzorcowania hydrożeli światłem do trójwymiarowych hodowli komórkowych. Technika ta umożliwia kontrolowane inkapsulowanie komórek w syntetycznych macierzach ekstracelularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez programy Delaware COBRE w zakresie odkrywania leków i zaawansowanych biomateriałów, finansowane przez Nagrody Rozwoju Instytucjonalnego od National Institute of Generals Medical Sciences w National Institutes of Health (odpowiednio P20GM104316 i P30 GM110758-01), Pew Charitable Trusts (00026178), National Science Foundation Career Award (DMR-1253906), Burroughs Wellcome Fund (1006787), oraz program National Science Foundation IGERT SBE2 na University of Delaware (stypendium dla L. Sawickiego). Autorzy dziękują Delaware Biotechnology Institute BioImaging Center na Uniwersytecie Delaware za szkolenie i dostęp do mikroskopii konfokalnej, pani Katherine Wiley za pomoc podczas sesji wideo, panu Matthew Rehmannowi za hojne dostarczenie hMSC wyizolowanych ze szpiku kostnego, prof. Christopherowi J. Kloxinowi i panu Stephenowi Ma za hojne dostarczenie fotomasek oraz prof. Wilfredowi Chenowi za korzystanie z automatycznego czytnika płytek.

<ol><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+-+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+in+Materials+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry in Materials Science.</a> Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).</li>
<li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+An+indispensable+tool+to+create+multifaceted+cell+culture+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Lett%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds.</a> ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).</li>
<li>Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+control+of+the+alkyne-azide+cycloaddition+by+photoinitiated+Cu%28II%29+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction.</a> Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+-+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).</li>
<li>Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+forming+hydrogels+via+catalyst-free+and+bioorthogonal+%26%2334%3Btetrazole-Alkene%26%2334%3B+photo-click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal &#34;tetrazole-Alkene&#34; photo-click chemistry.</a> Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).</li>
<li>Burdick, J. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+from+static+to+dynamic+complexity+in+hydrogel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design.</a> Nat Commun. 3, 1269(2012).</li>
<li>Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+dynamic+soft+materials+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture.</a> Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).</li>
<li>Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+well-defined+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+prepared+by+thiol-ene+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Polym+Sci+Part+A+Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry.</a> J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+extracellular+matrix+mimic+via+thiol-norbornene+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization.</a> Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).</li>
<li>Roberts, J. J., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+photopolymerizable+thiol-ene+PEG+and+acrylate-based+PEG+hydrogels+for+cartilage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development.</a> Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-norbornene+photoclick+hydrogels+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications.</a> J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+thiol-ene+photoclick+hydrogels+using+facile+techniques+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications.</a> Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).</li>
<li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable%2C+photoadaptable+hydrogels+via+radical-mediated+disulfide+fragmentation+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction.</a> Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+incorporating+RGD+adhesive+peptide+in+polyethylene+glycol+diacrylate+hydrogel+on+osteogenesis+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells.</a> Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).</li>
<li>Wacker, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+migration+on+RGD-peptide-containing+PEG+hydrogels+in+the+presence+of+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate.</a> Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+well-defined+peptide-hydrogel+spacing+and+concentration%3A+impact+on+epithelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior.</a> Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).</li>
<li>Qiong Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+biodegradable+polyethylene+glycol%2F+RGD+peptide+hybrid+hydrogels+for+in+vitro+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stern+cellsa%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa.</a> Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J Vis Exp. (32), e1590(2009).</li>
<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks+Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Society%22%5BJournal%5D)">Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks.</a> Society. 6 (1), 386-391 (2005).</li>
<li>Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+gels+based+on+%28hydroxypropyl%29+cellulose+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+%28Guildf%29%22%5BJournal%5D)">Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate.</a> Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+of+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Scaffolding+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds.</a> Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).</li>
<li>Mosiewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+cell+manipulation+through+enzymatic+hydrogel+photopatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning.</a> Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).</li>
<li>Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+cytocompatibility+of+six+cell+lines+with+photoinitiators+used+for+polymerizing+hydrogels+and+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation.</a> Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).</li>
<li>Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNimmo%2C+CM+%22Diels+-+Alder+Click+Cross-Linked+Hyaluronic+Acid+Hydrogels+for+Tissue+Engineering%22">Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering</a>. , 824-830 (2011).</li>
<li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically+tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+rates+and+mechanisms+for+radical%2C+photoinitated+addition+of+thiols+to+alkynes%2C+and+implications+for+thiol-yne+photopolymerizations+and+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions.</a> Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Wylie, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li>
<li>Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+growth+factors+on+solid+supports+for+the+modulation+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).</li>
<li>Hudalla, G. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+that+regulate+growth+factor+activity+via+bioinspired+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions.</a> Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).</li>
<li>Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiona tutaj procedura demonstruje techniki fotoenkapsulacji komórek w hydrożelach utworzonych przez chemię tiolowo-pianową, a następnie fotomodelowania żeli za pomocą wskazówek biochemicznych. Wykorzystanie światła do początkowego formowania hydrożeli pozwala na jednorodne mieszanie i zawieszenie komórek w roztworze polimerowym przed polimeryzacją. Szybka polimeryzacja "blokuje" żel w kształcie zdefiniowanej formy i zamyka zawieszone komórki w sieci hydrożelowej. Żele mogą być również formowane w wiele różnych kształtów (np. szkiełka podstawowe lub końcówki strzykawek) w zależności od pożądanego końcowego zastosowania. Na przykład komórki zamknięte w kapsułkach do hodowli 3D w hydrożelach przymocowanych do szkiełek podstawowych są szczególnie przydatne w zastosowaniach obrazowania, ponieważ tłumienie światła jest ograniczone w cienkiej próbce. Formy strzykawkowe mogą być używane do szybkiej kapsułkowania komórek, co pozwala na przygotowanie większej liczby próbek w krótkim czasie (w porównaniu ze szkiełkami szklanymi), które można wykorzystać do eksperymentów wymagających dużej liczby komórek, takich jak cytometria przepływowa lub qPCR. Następnie żele te mogą być wzorowane na sygnałach biochemicznych, aby wywołać pożądane reakcje komórkowe, takie jak różnicowanie lub inwazja. 30,31
Testy żywotności i aktywności metabolicznej wskazują na przeżycie komórek w systemie materialnym i przedstawionych warunkach wzorcowania. Należy zauważyć, że aktywność metaboliczną monitorowano do 3 dnia w niedegradowalnych żelach (wiązanie peptydowe RGKGRK) w celu oceny początkowego wpływu polimeryzacji i warunków modelowania na funkcję komórki. Ponadto test integralności błony (barwienie żywy/martwy/cytotoksyczność) hMSC po 1 i 6 dniach od enkapsulacji w żelach zawierających degradowalny peptyd (GPQGIWGQ) potwierdza, że komórki pozostają żywotne i rozprzestrzeniają się po 1 tygodniu w hodowli. Żywotność dodatkowych linii komórkowych została zgłoszona dla warunków fotowzorca32 podobnych do tych stosowanych tutaj i może być oceniona dla opisanego systemu hydrożelowego za pomocą barwienia żywych/martwych i testów aktywności metabolicznej. Chociaż nie zaobserwowaliśmy problemów z żywotnością komórek przy użyciu tego systemu materiałów i powiązanych procedur (4.2 i 4.3), niektóre typy komórek mogą być wrażliwe na ekspozycję na wolne rodniki i/lub światło. W takim przypadku użytkownicy mogą rozważyć użycie systemów materiałów nieinicjowanych fotoinicjowo, takich jak azydkowo-alkinowe,12 FXIII,31 lub chemie tworzenia hydrożelu na bazie Diels Alder. 33 Rozdział 33
Przedstawiono również łatwe techniki wykrywania i ilościowego określania wzorców biochemicznych sygnałów w żelach (3.1 i 3.2). Test Ellmana jest szczególnie interesujący, ponieważ odczynniki są dostępne na rynku i nie są wymagane żadne dodatkowe etapy przetwarzania syntetycznego ani droższe odczynniki (np. peptyd znakowany fluorescencyjnie). Test Ellmana może być wykorzystany do precyzyjnego określenia modyfikacji wolnych tioli za pomocą wskazówek biochemicznych w różnych warunkach fotowzorcowania, a także do szybkiej wizualizacji wzorów. W celu ilościowego określenia inkorporacji peptydów, stężenie tiolowej grupy funkcyjnej przed i po modelowaniu, jako ilościowa miara inkorporacji peptydów, jest bezpośrednio oceniane za pomocą testu Ellmana. Podczas gdy ten rodzaj kwantyfikacji można przeprowadzić za pomocą peptydów znakowanych fluorescencyjnie,34 kwantyfikacja oparta na obrazowaniu wymaga bardziej czasochłonnych etapów obsługi i analizy (np. syntezy peptydu znakowanego fluorescencyjnie i wygenerowania krzywej kalibracyjnej w celu powiązania fluorescencji ze stężeniem peptydu za pomocą analizy obrazu). W celu obrazowania inkorporacji peptydów, odczynnik Ellmana może być bezpośrednio nałożony na próbki i natychmiast zobrazowany. Chociaż technika ta jest ograniczona do płaszczyzn x i y do wizualizacji wzorców, może być stosowana jako prosta, rutynowa metoda określania, czy matryce zawierające wolne grupy tiolowe zostały wzorzyste. Ważne jest, aby pamiętać, że test Ellmana nie jest uważany za cytozgodny, więc chociaż może być używany do obserwacji i ilościowego określania fotowzorców, nie można tego zrobić w obecności komórek. W przypadku obrazowania wzorców w trzech wymiarach i w obecności komórek, koniugacja peptydów fluorescencyjnych w matrycach hydrożelowych pozostaje potężnym i szeroko stosowanym podejściem. Rozdzielczość wzorów można ocenić w płaszczyznach x, y i z za pomocą mikroskopii konfokalnej, a metoda ta jest cytokompatybilna, dzięki czemu można zidentyfikować komórki w regionach wzorzystych lub niewzorzystych. Podsumowując, test Ellmana i techniki oparte na obrazowaniu są uzupełniającymi się narzędziami dla badaczy do oceny zarówno ilościowej, jak i jakościowej fotowzorców sygnałów biochemicznych w systemie materiałowym.
Photoclick, czyli szerzej fotoinicjowane, chemie do tworzenia i modyfikacji hydrożeli w obecności komórek są liczne. Przedstawione tutaj techniki formowania, enkapsulacji i modelowania nie ograniczają się do opisanego systemu materiałów i mogą być stosowane do alternatywnych substancji chemicznych opartych na świetle, takich jak tiol-alkin,35 azydo-alkin,4 i inne chemikalia tiol--enu (np. tiol-norbornen),10,13, a także z różnymi fotoinicjatorami, takimi jak Irgacure 2959, Eozyna Y i kamforchinon. Należy pamiętać, że użytkownicy mogą być zmuszeni do dostosowania parametrów procedury (np. czasów inkubacji, czasów polimeryzacji, gęstości komórek), aby zapewnić warunki pozostające cytokompatybilne dla tych innych systemów. Ponieważ proces modelowania wymaga dyfuzji peptydu (peptydów) zmodyfikowanego alokiem do hydrożelu (2.2.3-2.2.5), proces ten może okazać się najbardziej przydatny do dodawania ugrupowań wiążących integryny (np. peptydów lub fragmentów białek macierzy zewnątrzkomórkowej) do hydrożelu, gdzie przyłączenie liganda do sieci jest wymagane do wytworzenia sił trakcyjnych przez komórkę i pełnej aktywacji integryny. 36 Należy zauważyć, że w przypadku biomolekuł, które mogą być podobnie aktywne w roztworze lub po unieruchomieniu (np. czynniki wzrostu lub cytokiny), etap inkubacji dyfuzji ugrupowań (~ 1 godzina) do hydrożelu może prowadzić do zdarzeń sygnalizacyjnych, które zawiły wyniki wzorcowania. Ustalono inne metody immobilizacji czynników wzrostu lub miejscowej sekwestracji w celu ich modelowania. 37-39 Rozdział 37-39Dodatkowo rozdzielczość wzoru jest podyktowana kontrolą nad ekspozycją na światło. W tym przypadku fotomaski umożliwiają tworzenie wzorów przez głębokość żelu oraz w płaszczyznach x i y; Jednak większą kontrolę przestrzenną nad wzorcowaniem sygnałów biochemicznych w żelach można osiągnąć za pomocą alternatywnych metod napromieniania, takich jak użycie dwufotonowego mikroskopu konfokalnego do generowania wzorów w płaszczyznach X, Y i Z. 34,40 Wreszcie, ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy system materiałowy wykorzystywany w tej procedurze jest tylko początkowo modyfikowany za pomocą wskazówek biochemicznych, ortogonalne chemie fotokliknięć mogą być stosowane w celu umożliwienia zmian właściwości matrycy w czasie. 12 Przedstawione tu procedury i techniki dodają różnorodności do obecnych podejść do tworzenia syntetycznych matryc o dobrze zdefiniowanych i kontrolowanych przestrzennie właściwościach. W szczególności komercyjna dostępność odczynników i materiałów stosowanych w tej procedurze będzie przydatna dla szerokiego grona badaczy zainteresowanych wykorzystaniem biomateriałów na bazie hydrożelu do zastosowań w kontrolowanych hodowlach komórkowych.

Kliknij chemia jest coraz częściej wykorzystywana w projektowaniu materiałów do licznych zastosowań biomedycznych, w tym dostarczania leków, inżynierii tkankowej i kontrolowanych hodowli komórkowych, dzięki ich selektywnym, wydajnym i często cytokompatybilnym reaktywnościom. 1-3 Chemia Photoclick, która wykorzystuje światło do wywoływania lub inicjowania reakcji (np. azydek-alkin,4 tiol-en,5 i tetrazol-alken6) są szczególnie interesujące dla tworzenia lub modyfikacji biomateriałów. Szybkie tempo w łagodnych warunkach i kontrola czasu i miejsca ich zachodzenia za pomocą światła sprawiają, że reakcje te dobrze nadają się do kierowanej przez użytkownika kontroli właściwości biomateriałów w obecności komórek. 7,8 W szczególności tiolowo-enerowe metody chemiczne typu photoclick wykorzystano do wytworzenia biomateriałów na bazie hydrożelu o solidnych właściwościach mechanicznych5,9 oraz do enkapsulacji wielu różnych typów komórek, w tym między innymi ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC), fibroblastów, chondrocytów i komórek trzustki, które dają nadzieję na hodowlę i dostarczanie komórek. 10,11 Co więcej, te chemikalia zostały wykorzystane do przestrzennego wzorcowania sygnałów biochemicznych w celu naśladowania kluczowych aspektów natywnych mikrośrodowisk komórkowych i ułatwiania odpowiednich interakcji komórka-macierz, w tym adhezji, różnicowania i inwazji. 3,12
Do budowy hydrożeli tiolowo-enowych ze światłem, peptydy zawierające cysteiny (tiol) są zwykle reagowane z polimerami funkcjonalizowanymi akrylanami lub norbornenami ("ene") w celu szybkiej, fotoinicjowanej polimeryzacji w warunkach cytokompatybilnych. 13 Rozszerzając ten zestaw narzędzi, staraliśmy się ustalić metody tworzenia hydrożelu z nowymi, wszechstronnymi i dostępnymi blokami budulcowymi, które wymagały minimalnego przetwarzania syntetycznego lub były dostępne na rynku w celu ich szerokiego zastosowania jako syntetyczne matryce zewnątrzkomórkowe. 14 W szczególności peptydy zmodyfikowano lizynami chronionymi alliloksykarbonylem (Alloc): jeden dla wiszących grup wiążących integryny w celu promowania adhezji komórek [K(alloc)GWGRGDS = Pep1Alloc] lub dwa dla niedegradowalnych lub degradowalnych przez komórki usieciowań [K(alloc)RGKGRKGK(alloc)G lub KK(alloc)GGPQGIWGQGK(alloc)K = Pep2Alloc, odpowiednio]. Dzięki tym sekwencjom stworzono warunki do szybkiej reakcji (1-5 min) z czteroramiennym poli(glikolem etylenowo-etylowym) modyfikowanym tiolem (PEG4SH) przy użyciu cytozgodnych dawek światła UV o dużej długości fali (10 mW/cm2 przy 365 nm) i fotoinicjatora fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP). Otrzymane hydrożele były stabilne w warunkach hodowli komórkowej przez wiele tygodni. Aby umożliwić degradację i przebudowę sterowaną komórkami, enzymatycznie rozszczepialny peptyd został włączony do wiązań krzyżowych żelu (tj. GPQGIWGQ),15 a modelowa komórka pierwotna, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC), pozostały wysoce żywotne po enkapsulacji i podczas hodowli w tych matrycach. Co więcej, peptydy zostały przestrzennie ukształtowane w tych materiałach, a hMSC pozostają żywotne i metabolicznie aktywne w warunkach fotowzorcowania. Alternatywne sekwencje peptydowe wisiorka, nie pokazane tutaj (np. IKVAV, YIGSR, GFOGER itp.), mogą być również włączone do matryc w celu zbadania dodatkowych interakcji komórek z otaczającym mikrośrodowiskiem. Wyniki te są obiecujące dla zastosowania tych materiałów na bazie hydrożelu do trójwymiarowej (3D) hodowli i dostarczania komórek w celu badania i kierowania interakcjami komórka-macierz dla różnych typów komórek.
Tutaj przedstawiono metody fotoenkapsulacji komórek, a następnie fotowzorce biochemiczne w proponowanym systemie hydrożelowym (Rysunek 1). Przedstawiono również techniki obserwacji i ilościowego oznaczania tych fotowzorców: w szczególności i) ilościowe i jakościowe zastosowanie testu Ellmana do określenia modyfikacji wolnych tioli w substratach wzorcowych oraz ii) uzupełniające jakościowe zastosowanie peptydów fluorescencyjnych (AF488Pep1Alloc) do obserwacji tych wzorów w trzech wymiarach. Ponadto przedstawiono testy mające na celu określenie żywotności (barwienie żywe/martwe/cytotoksyczne) i aktywności metabolicznej (MTS; 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium), aby użytkownicy mogli określić cytokompatybilność warunków fotoenkapsulacji i fotowzorcowania dla różnych linii komórkowych w matrycach hydrożelowych. Podczas gdy protokół został zademonstrowany dla łatwego systemu hydrożelowego photoclick opartego na świetle, techniki te mogą być stosowane do wielu innych radykalnie inicjowanych systemów hydrożelowych do fotoenkapsulacji i fotomodelowania w obecności komórek.

<table><tbody><tr><td>Niestandardowe peptydy</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td><td>peptydy mogą być również syntetyzowane za pomocą standardowych technik SPPS z materiałami od dostawców, w tym ChemImpex i ChemPep.</td></tr><tr><td>4-ramienny PEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Wymieniony w kategorii Wieloramienne homofunkcyjne PEG-i. PEG4SH może być również syntetyzowany, jak wspomniano wcześniej.</td></tr><tr><td>Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian</td><td>litu Colorado Roztwory fotopolimerowe</td><td>Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylofonylofosfonian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470</td><td>Uwaga, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Chlorek 2,4,6-trimetylobenzoilu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>682519</td><td>Uwaga, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Bromek litu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-butanon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>Kolba, okrągłodenny, 100&nbsp; ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml Lejek filtracyjny, Buchner, Medium Frit</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>W razie potrzeby można użyć bibuły filtracyjnej wewnątrz zwykłego szklanego lejka.</td></tr><tr><td>Mieszadła magnetyczne</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td><td></td></tr> <tr><td>Mieszadło magnetyczne i płyta grzejna</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td><td></td></tr> <tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td><td></td></tr> <tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr> Sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Wybierz odpowiednią pożywkę i trypsynę w zależności od typu komórki.</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td> <td>rozmiary 1,5 lub 2 ml, sterylne.</td></tr><tr><td>Strzykawka BD z końcówkami poślizgowymi (Luer) (bez igły)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>Podany tutaj numer produktu dotyczy strzykawki 1 ml (16H), Dostępne są różne rozmiary (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Fisherfinest Premium Plain Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Kauczuk silikonowy o wysokiej czystości, grubość 0,010 cala, arkusz 6 "x 8", twardość 55A (uszczelka)</td> <td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, oryginalny</td><td>Amazon</td><td>800002243</td><td>Można kupić od innych dostawców.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td> <td>----</td><td>Photomask Division, różne projekty mogą być drukowane zgodnie z życzeniem.</td></tr><tr><td>DTNB; Odczynnik Ellmana; 5,5-dithio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki/Certyfikowany ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Kwas ortofosforowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat chlorowodorku cysteiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY zestaw żywotności/cytotoksyczności, do komórek ssaków</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Wodny test roztworu</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td> różni <td>dostawcy</td> <td>----</td> <td>Zdolna do prędkości 90-110 x g.</td></tr><tr><td>Czytnik płytek wielodołkowych</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td> <td>Możliwość odczytu absorbancji przy 405 nm w płytce 96-dołkowej.</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny lub konfokalny</td><td>Różni dostawcy</td> <td>----</td> <td>Do wizualizacji wzorów peptydowych i komórek w hydrożelach.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>Alternatywne systemy świetlne mogą być stosowane do polimeryzacji hydrożeli.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zeiss Zen Lite</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>Dostępne w zeiss.com; kompatybilne z obrazami wykonanymi za pomocą mikroskopów Zeiss</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td>----<td>Dostępne pod adresem imagej.nih.gov; Dotyczy ogólnej analizy obrazu</td></tr></tbody></table>

tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Kliknij chemia została zbadana pod kątem wykorzystania w licznych zastosowaniach biomateriałów, w tym w dostarczaniu leków, inżynierii tkankowej i hodowli komórek. W szczególności reakcje kliknięcia za pośrednictwem światła, takie jak fotoinicjowane reakcje tiolowo-enowe i tiolowo-ynowe, zapewniają czasoprzestrzenną kontrolę nad właściwościami materiału i umożliwiają projektowanie systemów o wysokim stopniu kontroli właściwości kierowanej przez użytkownika. Wytwarzanie i modyfikacja biomateriałów na bazie hydrożelu z wykorzystaniem precyzji zapewnianej przez światło i wszechstronności oferowanej przez te tiolowo-X chemikalia fotoklikowe cieszą się rosnącym zainteresowaniem, szczególnie w przypadku hodowli komórek w dobrze zdefiniowanych, biomimetycznych mikrośrodowiskach. W tym miejscu opisujemy metody fotoenkapsulacji komórek i późniejszego fotowzorcowania sygnałów biochemicznych w matrycach hydrożelowych przy użyciu wszechstronnych i modułowych bloków budulcowych polimeryzowanych w reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. W szczególności przedstawiono podejście do konstruowania hydrożeli z funkcjonalizowanych alliloksykarbonylem (Alloc) wiązań peptydowych i ugrupowań peptydowych wisiorków oraz funkcjonalizowanego tiolem poli(glikolu etylenowego) (PEG), które szybko polimeryzują w obecności fotoinicjatora acylofosfinianu litu i cytokompatybilnych dawek światła ultrafioletowego (UV) o dużej długości fali. Opisano proste techniki wizualizacji fotowzorców i ilościowego określania stężenia dodanych peptydów. Ponadto opracowano metody kapsułkowania komórek, w szczególności ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, oraz określania ich żywotności i aktywności. Podczas gdy tworzenie i początkowy wzór hydrożeli tiolowo-allokowych jest pokazany tutaj, techniki te mogą być szeroko stosowane do wielu innych systemów materiałowych inicjowanych światłem i rodnikami (np. tiol-norbornen, tiol-akrylan w celu wytworzenia wzorzystych substratów.

Układ i procedura fotoenkapsulacji komórek, a następnie fotopatterningu żeli zawierających enkapsulowane komórki, przedstawiono na Rysunku 1, natomiast przykład przygotowania roztworów zapasowych do utworzenia żelu o stężeniu 10% wag. podano w Tabeli 1. Na podstawie Tabeli 1 oblicza się ilość monomerów (PEG4SH, Pep2Alloc, ±Pep1Alloc) i fotoinicjatora (LAP) niezbędnych do polimeryzacji hydrożeli. Na podstawie tych obliczeń przygotowuje się roztwory zapasowe PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc oraz LAP, które są mieszane z Pep1Alloc lub bez niego, odpowiednio w celu formowania i fotopatterningu żeli (Rysunek 1A). Następnie komórki są zbierane z płytek, przeliczane i wirowane w odpowiednich ilościach w celu enkapsulacji (Rysunek 1B). Osad komórkowy jest resuspendowany w roztworze żelotwórczym (peptyd/polimer/LAP w PBS), a mieszaniny komórki/monomeru przenosi się do form szklanych lub strzykawkowych. Komórki zostają zamknięte w hydrożelu po naświetleniu (1-5 minut 10 mW/cm2 przy 365 nm) (Rysunek 1C). W celu fotopatterningu (Rysunek 1D) żele moczy się w roztworze Pep1Alloc i LAP przez okres od 30 min do 1 h i 30 min, co umożliwia dyfuzję peptydu i inicjatora do spolimeryzowanej macierzy. Te nasycone peptydami żele przykrywa się fotomaskami z pożądanymi wzorami i poddaje drugiej dawce światła (1 min), aby sprzęgnąć peptydy z wolnymi grupami tiolowymi w macierzy. Wiszące łączniki są powiązane kowalencyjnie z żelem tylko w obszarach naświetlonych, co ułatwia odpowiednie oddziaływania komórka-macierz i naśladuje kluczowe właściwości mechaniczne i biochemiczne naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania funkcji i losów komórek in vitro.
Metoda Ellmana zapewnia prosty i niedrogi sposób ilościowego określenia stopnia modyfikacji żelu oraz wbudowania peptydów w podłożach z fotowzorami. Żele z wzorem i bez wzoru (tj. żele z modyfikacją peptydową lub bez niej) są namaczane w buforze reakcyjnym Ellmana po polimeryzacji. Następnie standardy cysteiny oraz żele namoczone w buforze umieszcza się w płytkach 48-dołkowych i inkubuje z odczynnikiem Ellmana (Rysunek 2A, lewa strona). Po 1 godzinie i 30 minutach aliquoty próbek przenosi się do poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej i rejestruje absorbancję przy 405 nm. Na podstawie standardów cysteiny wykreśla się krzywą kalibracyjną (Rysunek 2A, prawa strona) (absorbancja względem stężenia, dopasowanie liniowe), a ilość wolnych tioli w żelach można wyznaczyć na podstawie ich czynnika rozcieńczenia. Stężenia wolnych tioli dla różnych warunków polimeryzacji i fotowzorowania żelu o zawartości 10% wag. przedstawiono na Rysunku 2B. Żele polimeryzowane przez 1 lub 5 min bez Pep1Alloc (słupki niebieskie, I = 1 min i II = 5 min) wykazują statystycznie podobne stężenia wolnych tioli, co wskazuje na szybki przebieg reakcji i zakończenie żelowania w ciągu 1 min (test t dwustronny, p &gt;0,05). Zatem dodatkowa ekspozycja na światło (2-5 minut) nie prowadzi do dalszej konwersji grup funkcyjnych. Żele polimeryzowane przez 1 min bez Pep1Alloc namaczano w roztworze Pep1Alloc (3 mg/ml) i LAP (2,2 mM) przez 30 i 90 min (słupki zielone, II = 30 min i IV = 90 min), a następnie poddano drugiej dawce światła przez 1 min. Spadek ilości wolnych tioli (60-80% w stosunku do warunków 1 min) wskazuje na efektywną modyfikację żeli bocznymi sygnałami w tych warunkach. W przypadku chęci uzyskania wyższego stopnia modyfikacji można zastosować większe stężenia roztworu Pep1Alloc, ponieważ dostępność Pep1Alloc do wolnych tioli w bardziej rozcieńczonych roztworach peptydów może ograniczać konwersję; na przykład ustalono, że stężenia do 20 mg/ml Pep1Alloc zapewniają konwersję wolnych tioli na poziomie &gt;90%.
W sposób unikalny, wzory peptydów naniesionych na hydrożel mogą być szybko obrazowane za pomocą odczynnika Ellmana (Rysunek 3A, poniżej 5 min). Jednakże wizualizacja wzoru zanika z czasem (powyżej 5 min) ze względu na dyfuzję żółtego dianionu TNB2- przez żel. Aby poprawić rozdzielczość obrazowania i obserwować wzory w trzech wymiarach (płaszczyzny x, y i z) oraz w obecności komórek, można zastosować dodatkowo peptydy fluorescencyjne (AF48Pep1Alloc). Na Rysunku 3B przedstawiono projekcje x, y i z stosów obrazów wykonanych za pomocą mikroskopu konfokalnego, co demonstruje rozdzielczość wzoru (skala µm).
Około (94 ± 2) % oraz (94 ± 1) % hMSC zamkniętych wewnątrz degradowalnych żeli (Pep2Alloc = GPQG↓WGQ) pozostaje żywych (zielone ciała komórek) odpowiednio 1 i 6 dni po enkapsulacji, przy czym zaobserwowano niewielką liczbę martwych komórek (czerwone jądra) (Rysunek 4A). Co więcej, rozprzestrzenianie się hMSC zaobserwowano 6 dni po enkapsulacji (Rysunek 4A, wstawka), co wskazuje, że komórki mogą przebudowywać i oddziaływać z tymi matrycami degradowalnymi przez MMP, zmodyfikowanymi RGDS wiążącym integryny. Testy aktywności metabolicznej przeprowadzone na komórkach zamkniętych w żelach niedegradowalnych (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 i 3 dni po enkapsulacji (Rysunek 4B) stanowią drugi pomiar żywotności komórek i wykazują, że komórki pozostają aktywne dla różnych badanych warunków fotoenkapsulacji i fotopatrandningu w teście Ellmana (Rysunek 2B). W szczególności nie stwierdzono istotnej różnicy w aktywności metabolicznej między inkubacjami przez 30 min i 90 min z Pep1Alloc+LAP (warunki III i IV) a początkową enkapsulacją (warunki I i II), co wskazuje, że procedura jest odpowiednia do zastosowań fotopatrandningu w obecności zamkniętych komórek (obustronny test t, p &gt; 0,05).
<img alt="Schemat procesu tworzenia hydrożelu; fotoinicjator LAP; enkapsulacja Pep1Alloc; wzorcowanie żelu." src="/files/ftp_upload/54462/54462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ do enkapsulacji komórek w hydrożelach i następującego po niej fotopatterningu z wykorzystaniem sygnałów biochemicznych. (A) Przygotowano i zmieszano roztwory zapasowe makromerów i fotoinicjatora (PEG4SH = szkielet, Pep2Alloc = czynnik sieciujący, Pep1Alloc = wisząca grupa adhezyjna (RGDS), LAP = fotoinicjator). (B) Komórki są zbierane do enkapsulacji. (CKomórki miesza się z roztworami makromerów bez lub z peptydami wiążącymi integryny (odpowiednio PEG4SH/Pep2Alloc/LAP lub PEG4SH/Pep2Alloc/Pep1Alloc/LAP), a następnie enkapsuluje poprzez ekspozycję na światło. (DŻele zawierające nadmiar grup tiolowych w momencie tworzenia żelu (tutaj: PEG4SH/Pep2Alloc/LAP, utworzone z nadmiarem 2 mM grup tiolowych) można wzorować pod kątem sygnałów biochemicznych poprzez późniejsze dodanie peptydów zfunkcjonalizowanych pojedynczą grupą alloc (Pep1Alloc, np., RGDS, IKVAV, itp.) w celu promowania adhezji komórek w określonych obszarach żelu. Tutaj przedstawiono wzorowanie żeli za pomocą znakowanego fluorescencyjnie RGDS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę ilustrację w powiększeniu, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat płytki 48-dołkowej, krzywa kalibracyjna oraz wykres słupkowy stężeń ilustrujące analizę tioli." src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Konfiguracja i wyniki ilościowego testu Ellmana w celu oceny modyfikacji wzorcowanych hydrożeli. (AŻele i wzorce cysteiny inkubuje się w płytkach 48-dołkowych z odczynnikiem Ellmana. Wykreśla się liniową krzywą wzorcową w celu oznaczenia stężenia cysteiny w próbkach żelu.B) Nadmiar wolnych grup tiolowych jest wbudowywany w hydrożele podczas formowania żelu i zużywany podczas wzorowania za pomocą zawieszonego peptydStoppingu z grupą alloc (I = 1 min polimeryzacji; II = 5 min polimeryzacji; III = 30 min inkubacji z Pep1Alloc; IV = 90 min inkubacji z Pep1Alloc; w obu przypadkach III i IV polimeryzowano i wzorowano światłem przez 1 min). Przedstawione dane ilustrują średnią (n = 3), a słupki błędów wskazują błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Metoda chromatograficzna z mikroskopią fluorescencyjną i poklatkową, od 1 do 10 min, analiza emisji." src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza metodą Ellmana oraz obrazy fluorescencyjne w celu wizualizacji fotowzorowanych hydrożeli. (A) Odczynnik Ellmana może być wykorzystany do szybkiego wykrywania wzorów (linii) w płaszczyznach x i y (kolor żółty = obszar bez wzoru, pasek skali = 1 mm). (B) Do obserwacji wzorców w płaszczyznach x, y i z można wykorzystać peptydy fluorescencyjne (kolor zielony = obszar wzorcowy; 200 µm pasek skali; 10-krotny obiektyw imersyjny w wodzie; Ex/Em 48/525 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna hodowli komórkowych oraz wykres słupkowy absorbancji, demonstrujące wzrost i absorbancję." src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Żywotność i aktywność metaboliczna komórek wewnątrz niebiodegradowalnych fotowzorowanych hydrożeli. (APrzykład stosu obrazów z mikroskopu konfokalnego (projekcja z; obiektyw zanurzeniowy 10X) żywych (zielone; Ex/Em 48/525 nm) i martwych hMSC (czerwone; Ex/Em 543/580 nm) enkapsulowanych w hydrożelach 24 h po enkapsulacji (Pasek skali = 200 µm). Komórki rozprzestrzeniły się w tych hydrożelach 6 dni po enkapsulacji (obrazek wstawkowy, pasek skali = 50 µm). (B) Komórki są metabolicznie aktywne 1 i 3 dni (odpowiednio słupki ciemne i jasne) po enkapsulacji dla różnych warunków polimeryzacji (I = 1 min polimeryzacji; II = 5 min polimeryzacji) i wzorcowania (III = 30 min inkubacji z Pep1Alloc; IV = 90 min inkubacji z Pep1Alloc; w obu przypadkach polimeryzacja i wzorcowanie światłem trwały 1 min). Przedstawione dane obrazują średnią (n = 3), a słupki błędów wskazują błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela przygotowania hydrożelu z danymi dla PEG4SH i Pep2Alloc; masy cząsteczkowe i stężenia." src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Przykład konfiguracji do obliczania objętości roztworów zapasowych w celu przygotowania hydrożeli. Komórki w arkuszu zaznaczone na niebiesko wskazują parametry definiowane przez użytkownika; pozostałe wartości są obliczane na podstawie tych ustawień. Końcowe objętości dla każdego roztworu roboczego niezbędnego do przygotowania żelu zaznaczono na pomarańczowo. Białe komórki zawierają formuły służące do obliczania objętości końcowych na podstawie parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Należy pamiętać, że stężenie 2,2 mM LAP odpowiada wartości 0,067% wagowo.

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest formowanie, wzorowanie i enkapsulacja komórek w syntetycznych macierzach pozakomórkowych opartych na polimerach. Metodę tę można wykorzystać do rozstrzygnięcia kluczowych kwestii biologicznych związanych z identyfikacją sygnałów pozakomórkowych, które regulują odpowiedzi komórkowe w heterogenicznych mikrośrodowiskach. Główną zaletą tej techniki jest wytworzenie stabilnej macierzy syntetycznej do enkapsulacji i hodowli komórek przy użyciu dostępnych materiałów oraz protokołów.Metodę tę można wykorzystać do kontrolowanej hodowli komórkowej oraz do badania odpowiedzi komórek in vitro. Można ją zastosować w innych systemach, w tym w dostarczaniu leków i inżynierii tkankowej. Należy przygotować materiały do tworzenia hydrożelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Do końca wypełpotentego cieczą światłowodu należy przymocować soczewkę kolimującą, aby zapewnić względnie równomierną intensywność światła we wszystkich próbkach. Należy dostosować odległość światłowodu od próbek, aby uzyskać rozmiar plamki światła pokrywający badane próbki. W celu przygotowania hydrożeli bez wzorów, należy sporządzić grube hydrożele formowane w końcówkach strzykawek, pipetując od 10 do 20 µL roztworu prekursora żelu do końcówki sterylnej, odciętej strzykawki.Przygotuj jeden żel na strzykawkę, tak aby jego grubość wynosiła w przybliżeniu od 0.5 do 1.5 milimetrów, w zależności od objętości i średnicy strzykawki. Przygotuj cienkie hydrożele w formach z szkiełek przedmiotowych, umieszczając gumową uszczelkę wokół krawędzi niepowlekanego szkiełka. Następnie nanieś pipetą od pięciu do 10 µL roztworu prekursora żelu na niepowlekane szkiełko przedmiotowe.Następnie umieść szkiełko podstawowe pokryte powłoką antyadhezyjną na powierzchni roztworu żelu. Przymocuj szkiełka za pomocą małych klipsów biurowych w celu ich stabilizacji. Ustaw natężenie lampy tak, aby uzyskać 10 mW/cm² na powierzchni żelu w przypadku form z końcówek strzykawki lub form ze szkiełek podstawowych.Użycie radiometru do pomiaru natężenia. Następnie należy umieścić formy pod lampą. Naświetlać od jednej do pięciu minut, aby zapewnić całkowitą polimeryzację żeli.W przypadku żeli o wyższej zawartości tereftalanu glikolu polietylenowego należy zastosować krótszy czas polimeryzacji, a w przypadku żeli o niższej zawartości czas dłuższy, aby uzyskać w pełni spolimeryzowane hydrożele o modułach mieszczących się w zakresie tkanek miękkich. Żele z form z końcówek strzykawek należy umieścić w sterylnej, niepowlekanej płytce 48-dołkowej, a szkiełka przedmiotowe w sterylnym naczyniu.Aby przygotować hydrożele wzorcowane, należy sporządzić roztwór prekursora zgodnie z opisem w protokole tekstowym i energicznie pipetować roztwór, aby zapewnić jego równomierne wymieszanie. Następnie należy pokryć wcześniej uformowane żele roztworem fotoinicjatora z peptydem penton w fosforanie litu i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Po inkubacji należy usunąć nadmiar roztworu.Jeśli żele są formowane w końcówce strzykawki, należy użyć szpatułki, aby ostrożnie przenieść je z płytki 48-dołkowej na sterylną szkiełko przedmiotowe w celu wytworzenia wzoru. Maskę fotolitograficzną z pożądanym wzorem należy umieścić bezpośrednio na żelach uformowanych w strzykawce i na szkiełku. Należy upewnić się, że wydrukowana część maski dotyka żelu, aby zapewnić optymalną wierność odwzorowania wzoru.Umieść próbki pod lampą i naświetlaj przez jedną minutę. Po wykonaniu wzoru umieść żele formowane w strzykawce w sterylnej płytce 48-dołkowej, która nie była traktowana do hodowli tkanek. Żele formowane na szkiełkach przedmiotowych, które przylegają do szkła, umieść w sterylnej szalce.Przepłukać trzykrotnie przez 15 minut pożywką hodowlaną lub odpowiednim buforem, w zależności od planowanych eksperymentów. Aby przeprowadzić detekcję i kwantyfikację wolnych tioli w fotowzorowanych hydrożelach, najpierw przygotować roztwory i wykonać obliczenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Formować cienkie hydrożele do wzorowania w sposób opisany wcześniej.W szczególności należy przygotować żele z nadmiarem wolnych grup tiolowych, a połowę tych próbek wzorować peptydem pentonowym, używając przezrozytego szkiełka nakrywkowego, aby w pełni naświetlić cały żel. Wzorowane i niewzorowane żele należy umieścić w dołkach płytki 48-dołkowej. Płukać przez 15 minut, trzykrotnie, przy użyciu buforu do reakcji Ellmana, aby umożliwić dyfuzję produktów końcowych reakcji z żelu oraz zajście równowagowego pęcznienia.Do żeli po płukaniu dodaj dodatkowy bufor reakcyjny Ellmana w taki sposób, aby objętość napęczniałego żelu wraz z buforem reakcyjnym stanowiła wielokrotność 20 microliters. Na przykład, jeśli przewidywana objętość napęczniałego żelu wynosi 15 microliters, dodaj pięć microliters buforu reakcyjnego. a jeśli przewidywana objętość napęczniałego żelu wynosi 30 microliters, dodaj 10 microliters buforu reakcyjnego.Pipetuj standardy sistyny do poszczególnych dołków płytki 48-dołkowej w wielokrotnościach 20 µL, w zależności od objętości użytej w poprzednim kroku. Na przykład, jeśli w poprzednim kroku objętość spęcznionego żelu wraz z dodatkowym buforem reakcyjnym wynosiła 40 µL, dodaj 40 µL każdego standardu do poszczególnych pustych dołków.Następnie należy rozcieńczyć odczynnik Ellmana oraz bufor reakcyjny. Dodaj rozcieńczony odczynnik Ellmana do dołków zawierających standardy i próbki. W przypadku próbek o objętości 20 µL, dodaj 183,6 µL roztworu do każdego dołka.Inkubować lub umieścić na wytrząsarce przez jedną godzinę i trzydzieści minut, aż do momentu, gdy kolor roztworu będzie odpowiadał kolorowi żeli w ocenie wizualnej, aby zapewnić wystarczającą dyfuzję żółtego dianionu 2-nitro-5-tiobenzoidenowego, który powstaje w wyniku reakcji odczynnika Ellmana z wolnymi grupami tiolowymi z żelu. Pobrać 100 µL roztworu z próbek oraz wzorców i przenieść do dołków płytki 96-dołkowej. Odczytać absorbancję przy 405 nm za pomocą czytnika płytek.Aby zwizualizować wzory fotochemiczne, należy usunąć nadmiar buforu reakcyjnego, delikatnie ocierając krawędzie hydrożelu chusteczką. Odpipetować odczynnik Ellmana bezpośrednio na powierzchnię żelu. Natychmiast wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 10x lub mikroskopu stereoskopowego z kamerą kolorową.Zebrać komórki i przygotować je do enkapsulacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Bezpośrednio po odessaniu PBS, zawiesić osad komórkowy w roztworze prekursorowym do końcowego stężenia 5000 komórek na µL. Pozostawić odpowiednie stężenie wolnych grup tiolowych dla późniejszej reakcji z peptydem pentonu.W przypadku chęci zastosowania fotolitografii: uformować, spolimeryzować i wzorować hydrożele w sposób opisany wcześniej. Po wykonaniu wzoru przepłukać żele trzy razy po 10 minut w pożywce wzrostowej, aby usunąć niezareagowane substancje oraz nadmiar fotoinicjatora z fosforanu litu.Inkubować żele w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego dla dalszych analiz. Uzupełniać pożywkę co 48 godzin lub zgodnie z wymaganiami danej aplikacji. Aby określić żywotność enkapsulowanych komórek, należy najpierw usunąć pożywkę wzrostową z żeli i płukać je trzykrotnie przez 15 minut w PBS, aby umożliwić dyfuzję pożywki z żeli.Do 1 mL sterylnego PBS dodać 2 µL rozmrożonego 2 mM etydinium homodimeru-1 oraz 0,5 µL rozmrożonego 4 mM roztworu azotku wapnia (calcium AN). Wymieszać na wirówce typu vortex, aby zapewnić całkowite połączenie składników. Do każdej formy z żelem w płytce 48-dołkowej dodać 300 µL gotowego roztworu lub ilość wystarczającą do pokrycia powierzchni żelu na szkiełku przedmiotowym w sterylnym naczyniu.Następnie inkubować przez 45 minut. Odessać nadmiar roztworu i wypłukać żele, aby usunąć nadmiar barwnika. Wykonać obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopu konfokalnego.Lub na mikroskopie epifluorescencyjnym z powiększeniem 10x, przy wzbudzeniu 488 nanometer i emisji 525 nanometer. Stężenie wolnych grup tiolowych w hydrożelach nieuformowanych i uformowanych w wzory, wyznaczone za pomocą odczynnika Ellmana, wykazało, że hydrożele polimeryzowane początkowo przez jedną minutę oraz przez pięć minut mają statystycznie podobne stężenia wolnych grup tiolowych, co wskazuje na szybką reakcję i całkowitą żelację w ciągu jednej minuty.Kolejne wzorowanie masowe żeli inkubowanych z peptydami pentonowymi przez 30 minut oraz przez jedną godzinę i 30 minut wykazało od 60 do 80 procent redukcji stężenia wolnych grup tiolowych, co wskazuje na efektywną modyfikację nadmiaru tioli. Wzory fotolitograficzne, utworzone poprzez naświetlanie próbek osłoniętych maskami (przedstawionymi tutaj jako linie), można obserwować w dwóch wymiarach przy zastosowaniu odczynnika Ellmana. Alternatywnie, można je obserwować w trzech wymiarach poprzez włączenie peptydów fluorescencyjnych i przeprowadzenie późniejszego obrazowania.Dorosłe ludzkie komórki macierzyste zamknięte w hydrożelach poddano barwieniu na żywotność oraz hydrotoksyczność, a następnie zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Żywe komórki bez uszkodzeń błony są znakowane na zielono, co wskazuje na przeżycie komórek jeden dzień po enkapsulacji.Komórki zaczynają rozprzestrzeniać się w macierzy sześć dni po enkapsulacji, co pokazano na powiększeniu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie sterylności i ostrożności w obchodzeniu się z próbkami, aby zapobiec uszkodzeniu komórek po enkapsulacji w wyniku wprowadzenia zanieczyszczeń lub działania sił ścinających.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak cytometria przepływowa z immunobarwieniem oraz analiza ekspresji genów, aby zbadać funkcję i los komórek w odpowiedzi na środowisko pozakomórkowe. Technika ta otwiera przed badaczami z dziedzin biologii, bioinżynierii i medycyny drogę do badania erozji obszarów tkankowych lub progresji chorób w syntetycznych macierzach pozakomórkowych z kontrolowanymi, zdefiniowanymi przez użytkownika właściwościami, co służy opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak enkapsulować komórki oraz jak wzorować miękkie macierze na potrzeby kontrolowanych badań kultur komórkowych.

light-mediated-formation-patterning-hydrogels-for-cell-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Różne metody manipulowania trójwymiarową architekturą w hydrożelach na bazie białek są tutaj oceniane pod kątem właściwości materiałów. Sieci makroporowate są funkcjonalizowane peptydem adhezyjnym, a ich wykonalność w hodowli komórkowej jest oceniana przy użyciu dwóch różnych modelowych linii komórkowych.

Łatwa manipulacja architekturą w hydrożelach na bazie białek do zastosowań w hodowlach komórkowych

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Poznaj metodę tworzenia i wzorcowania hydrożeli światłem do trójwymiarowych hodowli komórkowych. Technika ta umożliwia kontrolowane inkapsulowanie komórek w syntetycznych macierzach ekstracelularnych.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Przeglądaj więcej filmów