Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest tworzenie, modelowanie i hermetyzowanie komórek w matrycach zewnątrzkomórkowych na bazie syntetycznego polimeru. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na krytyczne pytania biologiczne związane z identyfikacją dodatkowych sygnałów komórkowych, które regulują reakcje komórek w heterogenicznych mikrośrodowiskach. Główną zaletą tej techniki jest to, że generowana jest wytrzymała syntetyczna matryca do enkapsulacji komórek i hodowli przy użyciu protokołów i dostępnych materiałów.

Metoda ta może być stosowana do kontrolowanych hodowli komórkowych i do badania odpowiedzi komórek in vitro. Może być stosowany w innych systemach, w tym w dostarczaniu leków i inżynierii tkankowej. Przygotować materiały do tworzenia hydrożelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przymocuj soczewkę kolimacyjną do końca światłowodu wypełnionego cieczą, aby zapewnić względnie równomierne natężenie światła we wszystkich próbkach. Dostosuj odległość światłowodu od próbek, aby uzyskać rozmiar plamki, który pokryje interesujące próbki. Aby wytworzyć hydrożele bez wzoru, przygotuj gęste hydrożele uformowane w końcówkach strzykawek, pipetując od 10 do 20 mikrolitrów roztworu prekursora żelu do końcówki sterylnie wyciętej strzykawki.

Przygotuj pojedynczy żel na strzykawkę, aby miał grubość około 0,5 do 1,5 milimetra, w zależności od objętości i średnicy strzykawki. Przygotuj cienkie hydrożele w szklanych foremkach do szkiełek, umieszczając gumową uszczelkę wokół krawędzi niepowlekanego szkiełka podstawowego. Następnie odpipetować od pięciu do 10 mikrolitrów żelowego roztworu prekursora na niepowlekane szkiełko podstawowe.

I umieść szkiełko pokryte antyadhezyjnym klejem na roztworze żelu. Zabezpiecz szkiełka małymi klipsami do segregatorów, aby je ustabilizować. Ustaw intensywność lampy tak, aby osiągnąć 10 miliwatów na centymetr kwadratowy na powierzchni żelu dla form do końcówek strzykawek lub szklanych form do szkiełek.

Używanie radiometru do wykrywania intensywności. I umieść foremki pod lampą. Stosuj światło przez jedną do pięciu minut, aby umożliwić całkowitą polimeryzację żeli.

Krótszy czas polimeryzacji należy stosować w przypadku żeli o wyższej zawartości politereftalanu glikolu polietylenowego. Oraz dłuższy czas w przypadku żeli o mniejszej zawartości do wytworzenia w pełni spolimeryzowanych hydrożeli z modułami w zakresie tkanek miękkich. Umieść żele z formy końcówki strzykawki na sterylnej, niepoddanej obróbce płytce 48-dołkowej i umieść szklane szkiełka w sterylnym naczyniu.

Aby przygotować wzorzyste hydrożele, należy przygotować roztwór prekursora zgodnie z opisem w protokole tekstowym i energicznie pipetować roztwór, aby zapewnić równomierne wymieszanie roztworu. Następnie przykryj wstępnie uformowane żele peptydem pentonowym w roztworze fotoinicjatora fosforanu litu i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji usunąć nadmiar roztworu.

Jeśli żele są formowane w końcówce strzykawki, użyj szpatułki, aby ostrożnie przenieść z płytki 48-dołkowej na sterylne szkiełko podstawowe w celu wykonania wzoru. Umieść maskę fotograficzną z pożądanym wzorem bezpośrednio na strzykawce i żelach formowanych ze szkła. Upewnij się, że wydrukowana część maski dotyka żelu, aby zapewnić optymalną wierność wzoru.

Umieścić próbki pod lampą i poddawać je promieniowaniu przez jedną minutę. Po utworzeniu wzoru umieść żele formowane strzykawką na sterylnej 48-dołkowej płytce niepoddanej hodowli tkankowej. Umieść żele formowane ze szkła szkiełkowego, które są przyklejone do szkiełek szkiełkowych, w sterylnym naczyniu.

Przepłukać trzy razy po 15 minut pożywką lub odpowiednim buforem w oparciu o zaplanowane eksperymenty. Aby przygotować się do wykrywania i oznaczania ilościowego wolnych tioli w hydrożelach fotowzorzystych, należy najpierw przygotować roztwory i wykonać obliczenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uformuj cienkie hydrożele do modelowania jak poprzednio.

W szczególności należy przygotować żele z nadmiarem wolnych tioli i pokryć połowę tych próbek peptydem pentonowym za pomocą przezroczystego szkiełka nakrywkowego, aby w pełni naświetlić cały żel światłem. Wzorzyste i niewzorzyste żele umieścić w studzienkach na płytce 48-dołkowej. Płukać przez 15 minut, trzykrotnie buforem reakcyjnym Ellmana, aby umożliwić dyfuzję przereagowanych form końcowych z żelu i wystąpienie pęcznienia równowagowego.

Dodać dodatkowy bufor reakcyjny Ellmana do żeli do płukania, tak aby spęczniejąca objętość żelu z buforem reakcyjnym była wielokrotnością 20 mikrolitrów. Na przykład, jeśli przewidywana objętość spuchniętego żelu wynosi 15 mikrolitrów, dodaj pięć mikrolitrów buforu reakcyjnego. A jeśli przewidywana objętość spuchniętego żelu wynosi 30 mikrolitrów, dodaj 10 mikrolitrów buforu reakcyjnego.

Odpipetować wzorce sykstynowe do pojedynczych studzienek na płytce 48-dołkowej w wielokrotności 20 mikrolitrów. W zależności od objętości użytej w poprzednim kroku. Na przykład, jeśli poprzedni krok miał spęczniejącą objętość żelu plus dodatkowy bufor reakcyjny równy 40 mikrolitrów, dodaj 40 mikrolitrów każdego wzorca do poszczególnych pustych studzienek.

Następnie rozcieńczyć odczynnik Ellmana i bufor reakcyjny. Dodać rozcieńczony odczynnik Ellmana do studzienek zawierających wzorce i próbki. W przypadku próbek o objętości 20 mikrolitrów dodaj 183,6 mikrolitrów roztworu do każdej studzienki.

Inkubować lub umieszczać na wytrząsarce przez godzinę i trzydzieści minut, lub do momentu, gdy kolor roztworu będzie odpowiadał kolorowi żeli w drodze oględzin, aby zapewnić wystarczającą dyfuzję żółtego dianionu 2-nitro-5-tiobenzoesowego, który powstaje w wyniku reakcji odczynnika Ellmana z wolnymi tiolami z żelu. Pobrać 100 mikrolitrów roztworu z próbek i wzorców i umieścić w studzienkach z 96-dołkową płytką. Odczytaj chłonność przy 405 nanometrach na czytniku płytkowym.

Aby uwidocznić wzory fotograficzne, usuń nadmiar bufora reakcyjnego, delikatnie przecierając krawędzie hydrożelu chusteczką. Odczynnik Ellmana należy odpipetować bezpośrednio na powierzchnię żelu. Natychmiastowy obraz na mikroskopie świetlnym 10x lub na mikroskopie stereoskopowym z kolorową kamerą.

Zbierz komórki i przygotuj je do enkapsulacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Natychmiast po zasysaniu PBS zawiesić granulowane komórki w roztworze prekursora do końcowego stężenia pięciu tysięcy komórek na mikrolitr. Pozostawić odpowiednie stężenie wolnych tioli do późniejszej reakcji z peptydem pentonowym.

Jeśli pożądane jest wykonanie wzoru fotograficznego. Formuj, polimeryzuj i modeluj hydrożele jak poprzednio. Płukać żele przez 10 minut, trzy razy, w pożywce wzrostowej po ułożeniu wzoru, aby usunąć nieprzereagowane gatunki i nadmiar fotoinicjatora fosforanu litu.

Inkubuj żele w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 do pożądanego punktu czasowego do dalszej analizy. Uzupełniaj podłoże co 48 godzin lub w zależności od aplikacji. Aby określić żywotność zamkniętych w kapsułkach komórek, najpierw usuń pożywkę wzrostową z żeli i płucz przez 15 minut, trzy razy, PBS, aby umożliwić dyfuzję pożywki z żeli.

Dodaj dwa mikrolitry rozmrożonego dwumilimolowego homodimeru etydyny-1 i 0,5 mikrolitra rozmrożonych czterech milimolowych roztworów AN wapnia do jednego mililitra sterylnego PBS. Wiruj, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Dodać 300 mikrolitrów stałego roztworu do każdego żelu formy strzykawkowej w 48 płytkach dołkowych lub tyle, aby pokryć powierzchnię żelu na szkiełku podstawowym w sterylnym naczyniu.

I inkubować przez 45 minut. Usuń nadmiar stojącego roztworu i spłucz, aby usunąć nadmiar barwnika z żeli. Zobrazuj komórki pod mikroskopem konfokalnym.

Lub na mikroskopie epifluorescencyjnym o możliwości 10x. I wzbudzenie 488 nanometrów i emisja 525 nanometrów. Stężenie wolnego tiolu w hydrożelach bez wzoru i wzoru określone ilościowo za pomocą Ellmana wykazało, że hydrożele początkowo polimeryzujące przez jedną minutę i przez pięć minut mają statystycznie podobne stężenia wolnego tiolu, co wskazuje na szybką reakcję i całkowite żelowanie w ciągu jednej minuty.

Późniejsze masowe modelowanie żeli inkubowanych z peptydami pentonowymi przez 30 minut oraz przez godzinę i 30 minut powoduje zmniejszenie stężenia wolnego tiolu o 60 do 80 procent, co wskazuje na skuteczną modyfikację nadmiaru tiolu. Wzory fotograficzne powstające przez prześwitywanie światłem przez próbki pokryte maskami, wydrukowane tutaj liniami, można obserwować w dwóch wymiarach przy zastosowaniu odczynnika Ellmana. Lub w trzech wymiarach z włączeniem peptydów fluorescencyjnych w późniejszym obrazowaniu.

Dorosłe ludzkie komórki macierzyste zamknięte w hyrożelach poddano działaniu barwników żywotności i hydrotoksyczności. I zobrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Żywe komórki bez uszkodzenia błony są oznaczone na zielono i wskazują na przeżycie komórek jeden dzień po enkapsulacji.

Komórki zaczynają rozprzestrzeniać się w macierzy sześć dni po enkapsulacji. Jak pokazano na obrazie wstawki. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu sterylnych i ostrożnych procedur obchodzenia się z nimi, aby zapobiec uszkodzeniu komórek po enkapsulacji poprzez wprowadzenie zanieczyszczeń lub mechanicznego prześwitu.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak cytometria przepływowa barwienia immunologicznego i ekspresja genów, w celu zbadania funkcji i losu komórki w odpowiedzi na środowisko pozakomórkowe. Technika ta toruje drogę naukowcom z dziedziny biologii, bioinżynierii i medycyny do badania erozji regionów tkanek lub progresji choroby w syntetycznych matrycach zewnątrzkomórkowych z kontrolą właściwości zdefiniowanych przez użytkownika, w kierunku opracowania nowych strategii leczenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kapsułkować komórki i tworzyć miękkie matryce do kontrolowanych badań nad kulturami komórkowymi.