Name: Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę wzorowania białek na hydrożelach PEG przy użyciu fotopolimeryzacji do badań odpowiedzi komórkowych. Technika ta umożliwia naśladowanie sygnałów in vivo w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było głównie wspierane przez granty z American Heart Association Scientist Development Grant (12SDG12050083 dla G.D.), National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 dla G.D.) oraz National Science Foundation (CBET-1263455 i CBET-1350240 dla G.D.).

1. Przygotowanie materiałów do syntezy hydrożelu
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe PEGDA, fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) i fibronektyny w sterylnych warunkach i na podstawie obliczeń (Tabela 1A).
	<ol>
		<li>Odważyć i rozpuścić związki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Zazwyczaj należy utrzymywać stężenie roztworu roboczego PEGDA w zakresie od 50 do 200 mg/ml (5-20% wagowo-objętościowo). Odpipetować roztwór PEGDA przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji. 
		UWAGA: Roztwory PEGDA należy przechowywać przykryte folią, aby chronić je przed światłem. Przygotuj świeży roztwór PEGDA (zalecany) do każdego eksperymentu.</li>
		<li>Odtworzyć białko fibronektyny w proszku zgodnie z zaleceniami producenta. Roztwór podstawowy fibronektyny należy utrzymywać w stężeniu 1 mg/ml, podzielić na 60–100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Przed użyciem rozmrozić podwielokrotności w temperaturze 4 °C przez kilka godzin lub przez noc. Jeśli białko nie jest jeszcze dostarczane w sterylnych warunkach, do sterylizacji należy użyć filtra strzykawkowego 0,22 μm. 
		UWAGA: Fibronektyna służy do przyłączania komórek. Inne białka ECM mogą być podstawione.</li>
		<li>Odważyć LAP dla roztworu podstawowego i rozpuścić go w PBS; typowe stężenie podstawowe wynosi 25 mg/ml. Wykonaj sonizację, jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy z rozpuszczeniem. Przepuść roztwór przez filtr 0,22 μm w celu sterylizacji. Przykryj LAP foliowym opakowaniem i przechowuj w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy. 
		UWAGA: LAP jest fotoinicjatorem używanym do fotochemii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj sterylne szklane formy do szkiełek do tworzenia hydrożelu.
	<ol>
		<li>Autoklawuj arkusz poliestru; jeden jest potrzebny do każdej formy żelowej. Namocz dwa szkiełka podstawowe i trzy plastikowe przekładki (o grubości 0,5 mm) dla każdej formy żelowej w 70% etanolu przez co najmniej 2 godziny, ale generalnie pozwól im namoczyć się przez noc. Namocz pięć spinaczy do każdego żelu w 70% etanolu na 10 minut przed użyciem.</li>
		<li>Umieść szkiełka podstawowe, przekładki i spinki do segregatora na małym autoklawizowanym arkuszu w kapturze do hodowli komórkowych, aby pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka godzin.</li>
		<li>Przygotuj formy hydrożelowe, umieszczając plastikowe przekładki wokół krawędzi szkiełka. Umieść drugie szklane szkiełko na górze. Przymocuj przekładki szczelnie obok siebie za pomocą klipsów do segregatorów, po dwa z każdego dłuższego boku i jeden na górze. 
		UWAGA: Jeśli nie zostanie prawidłowo zmontowany, roztwór żelu wycieknie.</li>
		<li>Przed użyciem wysterylizuj powierzchnię formy za pomocą okapu do hodowli komórkowych ze światłem UV przez 30 minut. W połowie odwróć formę, aby odsłonić obie powierzchnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Modyfikowanie białek za pomocą wolnego tiolu
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe, korzystając z obliczeń z arkusza kalkulacyjnego do przekształcania aminy w tiol na białkach (tabela 1A).
	<ol>
		<li>Aby utworzyć bufor reakcyjny, dostosuj PBS do pH 8 i dodaj 5 mM EDTA. Pipetowany bufor reakcyjny do filtra strzykawkowego 0,22 μm w celu sterylizacji. 
		UWAGA: EDTA jest ważny, ponieważ chroni tiole przed tworzeniem wiązań dwusiarczkowych. Grupy tiolowe muszą pozostać w swojej zredukowanej formie, aby zaszła reakcja.</li>
		<li>Odważyć 2-iminotiolan (odczynnik Trauta) i rozpuścić go w buforze reakcyjnym do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml (14 mM). Przepuść roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy. 
		UWAGA: 2-iminotiolan to cząsteczka, która reaguje z wolnymi aminami wystawionymi na działanie rozpuszczalnika na białka i przekształca je w wolne tiole.</li>
		<li>Rozpuść białko w buforze reakcyjnym w stężeniu od 0,1 do 1 mg/ml. O ile nie jest to wcześniej sterylne, pipetuj ten roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm w celu sterylizacji. 
		UWAGA: Białko to jest sygnałem biochemicznym, który zostanie wzorowany na powierzchni hydrożelu. Ponadto, chociaż stężenia białka mogą się różnić, wyższe stężenia są idealne dla silniejszych wzorców białkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Białko należy przereagować z 2-iminotiolanem, mieszając ze sobą oba roztwory podstawowe; użyć Tabeli 1B w celu obliczenia prawidłowego stosunku objętości. Zazwyczaj stosuje się stosunek molowy 2-iminotiolanu do białka 8:1. 
	UWAGA: W przypadku większych białek lub bardziej rozcieńczonych stężeń należy użyć wyższego stosunku molowego 2-iminotiolanu. Zapoznaj się z protokołem producenta15.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj odsalającej mikrokolumny wirowej, aby usunąć tiolowany produkt białkowy z pozostałych reagentów, postępując zgodnie z protokołem producenta16. 
	UWAGA: Limit wykluczenia tej żywicy wynosi 5 KDa.</li>
	<li>Użyj testu Ellmana, aby ilościowo zmierzyć liczbę wolnych tioli na białko. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla testu17.</li>
</ol>
3. Tworzenie hydrożelu
<ol>
	<li>Stworzyć roztwór prekursora żelu na podstawie wartości obliczonych z tabeli 1C. Wymieszaj ze sobą objętości PEGDA, fibronektyny i LAP. Energicznie pipetować roztwór, aby uzyskać jednorodny roztwór, ale unikać tworzenia pęcherzyków. Roztwór należy chronić przed światłem.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować roztwór prekursora żelu między dwoma szklanymi szkiełkami formy żelowej. Zazwyczaj do formy dodaje się objętość od 800 do 1,000 μl. Wystaw roztwór żelu w formie na działanie światła UV (długość fali: 365 nm, moc: 3-4 mW/cm2) przez 1-2 minuty, aby powstał hydrożel. 
	UWAGA: Nie wystawiaj hydrożelu na długotrwałe działanie promieniowania UV, ponieważ ograniczy to możliwości modelowania białek powierzchniowych.</li>
	<li>Zdejmij spinki do segregatora i delikatnie zdejmij górne szkiełko, wywierając przeciwny nacisk na dwie boczne przekładki.</li>
	<li>Użyj odpowiedniej wielkości stempla do biopsji, aby wyciąć próbki hydrożelu. Z prostokąta żelu należy wyciąć wiele hydrożeli, które posłużą jako kontrpróby i próbki kontrolne.</li>
</ol>
4. Pomiary sztywności hydrożelu
<ol>
	<li>Wykraść hydrożele za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 8 mm, aby uzyskać reometr z równoległą płytką 8 mm. Załadować jedną próbkę hydrożelu do reometru (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Obniż równoległą geometrię płytki o średnicy 8 mm, aż zetknie się z powierzchnią żelu. W przypadku próbki hydrożelu o grubości 0,5 mm należy zachować odstęp 0,5 mm.</li>
	<li>Wykonuj przemiatanie w czasie przez 5 minut przy 0,1% odkształceniu, częstotliwości 0,1 Hz i 37 °C. Uśrednij wartości G' przy każdym przemiataniu. Uruchom niezależne hydrożele dla powtórzeń każdej kompozycji. 
	UWAGA: Wartości G' powinny być stabilne we wszystkich punktach czasowych; Jeśli tak nie jest, należy wykonać przemiatanie procentowe odkształcenia i częstotliwości, aby wybrać odpowiednie wartości<klasa SUP="Xref">14.</li>
</ol>
5. Wzorce białek
<ol>
	<li>Przygotuj żądany wzór fotomaski za pomocą programu do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Wydrukuj fotomaskę na przezroczystym arkuszu za pomocą drukarki o wysokiej rozdzielczości. Namocz fotomaskę w 70% etanolu na 10 minut przed użyciem. Przed użyciem pozostaw fotomaskę do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodać tiolowany roztwór białka przygotowany w kroku 2 do powierzchni hydrożelu w celu nadania wzoru powierzchniowego. Odpipetować 1-2 μl/cm2 tiolowanego roztworu białka na powierzchnię każdego żelu do wycinania. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować objętość białka; Dodać tylko tyle, aby równomiernie pokryć całą powierzchnię próbki hydrożelu.</li>
	<li>Ostrożnie umieść fotomaskę na powierzchni hydrożelu. Nie pozwól, aby pęcherzyki powietrza znalazły się między fotomaską a powierzchnią hydrożelu. Delikatnie dociśnij maskę, aby usunąć wszelkie tworzące się bąbelki.</li>
	<li>Wystaw hydrożel na drugą rundę światła UV (długość fali: 365 nm, moc: 3-4 mW/cm2) przez 30-60 s. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wystawić wzór na działanie wystarczającej ilości światła UV, aby stworzyć silny wzór bez powodowania utraty funkcji białka.</li>
	<li>Przemyj hydrożele PBS, aby usunąć nieprzereagowane gatunki i umieść każdy hydrożel w płytce studzienki. Zachowaj ostrożność podczas umieszczania żeli w każdej studzience; Upewnij się, że wzorzysta powierzchnia jest skierowana do góry. Umyć żele w PBS w temperaturze 4 °C; żele są stabilne przez co najmniej dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
6. Przygotowanie hydrożeli do wysiewu komórek
<ol>
	<li>Przed wysiewem inkubować żele w podłożu podstawowym przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) należy użyć pożywki EGM-2 bez czynników wzrostu. Zminimalizuj objętość pożywki dodawanej do każdej studzienki, aby zapobiec unoszeniu się hydrożelu. W przypadku płytki 48-dołkowej należy użyć pożywki o objętości 250 μl.</li>
	<li>Wiruj płytkę o masie 300 x g przez 3 minuty, aby upewnić się, że hydrożele znajdują się na dnie studzienki i nie unoszą się na wodzie. Zrób to bezpośrednio przed wysiewem komórek.</li>
</ol>
7. Wysiewanie komórek na hydrożelach
<ol>
	<li>Stosuj standardowe sterylne procedury hodowli komórek ssaków do wysiewu komórek i procedur eksperymentalnych. Usunąć HUVEC z kolb do hodowli tkankowych przy użyciu standardowych protokołów odrywania komórek. Umyć naczynie do hodowli tkankowej sterylnym PBS i inkubować z trypsyną przez 3-5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zawiesinę komórek trypsynizowanych ugasić nadmiarem pożywki komórkowej lub roztworem neutralizatora trypsyny.</li>
	<li>Odwirowywać zawiesinę komórkową w wirówce o sile 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad komórkowy.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w podstawowym EGM-2 bez czynników wzrostu. Użyj hemocytometru do zliczania komórek.</li>
	<li>Dodaj 75 000 komórek/cm2 do każdej powierzchni hydrożelu, pipetując powoli do środka każdej studzienki, aby nie naruszyć żeli. Umieścić płytkę studzienkową w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Przez kilka dni okresowo wyjmuj naczynie do obserwacji.</li>
</ol>
8. Ocena bioaktywności
<ol>
	<li>Hodowla E. coli przez noc w zawiesinie w bulionie LB w zawiesinie orbitalnej w temperaturze 37 °C i 200 obr./min. Odwirować kulturę E. coli, zdekantować i rozpuść osad komórkowy w minimalnej objętości PBS. Odważyć lizozym i rozpuścić w roztworze podstawowym w stężeniu 1 mg/ml.</li>
	<li>Odpipetować niewielką objętość (25 μl) roztworu podstawowego lizozymu do probówek do mikrowirówek. Dodaj różne poziomy fotoinicjatora LAP (0-12 mM) i wystaw próbki na działanie 1 minuty światła UV. W oddzielnej grupie dodaj taką samą ilość LAP (2 mM) do roztworu lizozymu i wystaw próbki na działanie różnych czasów świecenia promieniami UV (0-4 min). Uwzględnij powtórzenia dla każdego zabiegu.</li>
	<li>Dodać równą objętość stężonego roztworu E. coli do każdej próbki lizozymu, aby uzyskać końcowe stężenie białka lizozymu wynoszące 0,5 mg/ml. Mieszaninę roztworów inkubować przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Daje to czas funkcjonalnemu lizozymowi na lizę ściany komórkowej bakterii i uwolnienie białek do roztworu.</li>
	<li>Do kontroli pozytywnej należy użyć lizozymu niepoddanego działaniu substancji inkubowanego z E. coli; należy uznać to za pomiar w 100% bioaktywny. Roztwór lizozymu inkubowany z samym PBS należy stosować jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Odwiruj próbki, aby usunąć resztki komórek i zachować supernatant. Uruchom test Bradforda, aby określić ilościowo całkowite stężenie białka w supernatancie w celu zmierzenia ilości lizatu bakteryjnego.</li>
	<li>Uruchom test Bradforda zgodnie z protokołem producenta18. Obliczyć krotną zmianę stężenia białka w porównaniu z kontrolą ujemną.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-effects+of+matrix+low+elasticity+and+aligned+topography+on+stem+cell+neurogenic+differentiation+and+rapid+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth.</a> Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).</li>
<li>Evans, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+affects+early+differentiation+events+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells.</a> Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).</li>
<li>Ye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+and+Nanoscale+Spatial+Organization+of+Cell-Adhesive+Ligands+Direct+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate.</a> Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).</li>
<li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+tethered+TGF-beta1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li>
<li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+moieties+tethered+into+PEG+networks+induce+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).</li>
<li>Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+of+chemotropic+factors+from+immobilized+patterns+to+guide+axonal+growth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).</li>
<li>Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).</li>
<li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+hydrogels+with+immobilized+ephrinA1+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li>
<li>McCall, J. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+photopolymerizations+provide+a+facile+method+to+encapsulate+proteins+and+maintain+their+bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).</li>
<li>Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rheological+characterization+of+hydrogels+for+tissue+engineering+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).</li>
<li>Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf">https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf</a> (2017).</li>
<li>Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia metodę tworzenia bioaktywnych wzorców białek do zastosowań biologicznych. Istnieje kilka modyfikacji, które można wprowadzić, aby dostosować ten protokół do różnych eksperymentów. Po pierwsze, wymagania dotyczące przyłączenia komórek będą się różnić dla różnych typów komórek. Jeśli początkowo zaobserwuje się słabe przyleganie komórek do żeli, zaleca się zwiększenie stężenia białka ECM w roztworze prekursorowym. Zamiast fibronektyny można stosować inne białka ECM, w tym różne rodzaje kolagenu, lamini...

Istnieje wiele bodźców, które wpływają na zachowanie komórki. Ogólnie rzecz biorąc, typowe techniki hodowli komórek opierają się na rozpuszczalnych czynnikach w celu wywołania odpowiedzi komórkowych; Podejście to ma jednak swoje ograniczenia. Metody te nie są w stanie dokładnie przedstawić wszystkich motywów sygnalizacyjnych powszechnie występujących in vivo. Takie mechanizmy sygnalizacyjne obejmują sekwestrowane czynniki wzrostu, sygnalizację komórka-komórka i przestrzennie specyficzne sygnały biochemiczne. Co więcej, sztywność podłoża może odgrywać ważną rolę w zachowaniu komórek i różnicowaniu komórek macierzystych i nie jest łatwo manipulować przy użyciu typowych praktyk hodowli komórek1,2. Podejścia oparte na biomateriałach oferują nową platformę do rozpoczęcia badań nad tymi mechanizmami sygnalizacyjnymi. W szczególności hydrożele są doskonałymi kandydatami do dostrajania sztywności podłoża3,4, immobilizując białka i peptydy5,6, oraz tworząc przestrzennie specyficzne wzorce7,8.
Hydrożele są powszechnie używane jako rusztowania w inżynierii tkankowej ze względu na ich biofizyczne i biochemiczne podobieństwa z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)9,10. Naturalne polimery są często wybierane na rusztowania, ponieważ są biokompatybilne i znajdują się w wielu tkankach organizmu. Ograniczeniem stosowania naturalnych polimerów jako substratów jest to, że brakuje w nich łatwych do manipulowania ugrupowań chemicznych do biokoniugacji. Z drugiej strony, syntetyczne hydrożele, takie jak PEG, są doskonałymi platformami dla ukierunkowanych chemii11,12. Ponadto hydrożele PEG nie wywołują odpowiedzi komórkowej i dlatego są wykorzystywane jako obojętne szkielety do tworzenia bioaktywnych rusztowań.
Do tworzenia bioaktywnych hydrożeli stosuje się zarówno fotopolimeryzację, jak i reakcje chemiczne tiolowo-enowe. Te fotoreakcje wymagają fotoinicjatora i źródła światła UV. Kiedy fotoinicjatory są wprowadzane do światła UV, wiązania pękają, tworząc rodniki. Te rodniki są niezbędne do zainicjowania reakcji, ale mogą negatywnie wpływać na bioaktywność białka12,13. Dlatego tak ważna jest optymalizacja czasu ekspozycji na fotoinicjator i promieniowanie UV w celu utrzymania bioaktywności białek.
W tej metodzie, hydrożele są syntetyzowane poprzez fotopolimeryzację wzrostu łańcucha akrylanowo-akrylowego. Monomery PEG-diakrylanu (PEGDA) reagują ze sobą, tworząc rozgałęzione sieci polimerowe odpowiedzialne za strukturę hydrożelu. Stężenie monomerów PEGDA w roztworze prekursora żelu będzie kontrolować sztywność podłoża. Ze względu na mały rozmiar porów hydrożelu, białka ECM, takie jak fibronektyna, mogą być łatwo włączone do hydrożelu w celu przyłączenia komórek. Wreszcie, hydrożele te mogą być modelowane powierzchniowo za pomocą bioaktywnych peptydów lub białek za pomocą reakcji chemicznych tiol-en. W tym przypadku nieprzereagowane wolne akrylany w systemie hydrożelowym będą reagować z wolnymi tiolami znajdującymi się na białku lub peptydzie pod wpływem światła UV. Po unieruchomieniu białek lub peptydów na powierzchni hydrożelu, hydrożel może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni bez utraty bioaktywności. Zapewnia to wygodę, elastyczne planowanie eksperymentów i możliwość współpracy między laboratoriami. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta pozwala na biomechaniczną i przestrzenną kontrolę biochemiczną, niezależną od siebie, co daje możliwość wpływania na zachowanie komórek.

<table><tbody><tr><td>PEG-diakrylan (PEGDA)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-3400</td><td>Może być również syntetyzowany lub kupowany za pośrednictwem innych sprzedawców. Można stosować różne masy cząsteczkowe.</td></tr><tr><td>Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian litu (LAP)</td><td></td><td></td><td>Syntetyzowany w laboratorium</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>Można stosować inne białka przyczepu komórkowego, takie jak laminina, matrigel</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Photomask FineLine Imaging</td><td>n/a</td><td>Niestandardowe wydruki na przezroczystych arkuszach o wysokiej rozdzielczości DPI.</td></tr><tr><td>Spinacze do segregatorów</td><td>Różni dostawcy Kompaktowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>źródło światła UV (365nm)</td> <td>UVP</td><td>UVP-21</td><td>Można stosować inne źródła światła UV, wymagana jest kalibracja mocy.</td></tr><tr><td>2-iminotiolan (Pierce Traut' s odczynnik)</td><td>Thermo Sci.</td><td>26101</td><td></td></tr><tr><td>Ellman' s Odczynnik: DTNB; 5,5-ditio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy)</td><td>Thermo Sci.</td><td>22582</td><td></td></tr><tr><td>ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)W eksperymentach</td><td></td> wykorzystano <td>liczbę pasaży</td>Lonza <td></td> między 6-10</tr><tr><td>EGM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC31-56, CC-3162</td><td>EGM-2 bez czynników wzrostu. Do utrzymania komórek użyto pełnej pożywki EGM-2</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna EDTA</td><td>Life Tech</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Neutralizator trypsyny</td><td>Life Tech</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Różne Venders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Sci. Jasna linia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m filtr</td><td>Cell Treat</td><td>229743</td><td></td></tr><tr><td>1mL Szklana strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Sci.</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Przekładki plastikowe</td><td>Różne Sprzedawcy</td><td></td><td>Grubość 0,5 mm</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>BICCA</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-shield</td><td>Bio-shield</td><td>19-150-0010</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradford&nbsp;</td>Żywica odsalająca <td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Sephadex G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>95016-754</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny Microspin</td><td>Thermo Sci.</td><td></td><td></td>PI69725</tr><tr><td>AR-G2 rehometer</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Istnieje wiele bodźców biologicznych, które mogą wpływać na zachowanie komórek i różnicowanie komórek macierzystych. Ogólne podejścia do hodowli komórkowych opierają się na rozpuszczalnych czynnikach w pożywce w celu kontrolowania zachowania komórki. Jednak rozpuszczalne dodatki nie mogą naśladować pewnych motywów sygnalizacyjnych, takich jak czynniki wzrostu związane z macierzą, sygnalizacja komórka-komórka i przestrzenne sygnały biochemiczne, które mają powszechny wpływ na komórki. Ponadto właściwości biofizyczne matrycy, takie jak sztywność substratu, odgrywają ważną rolę w losie komórki, którym nie jest łatwo manipulować przy użyciu konwencjonalnych praktyk hodowli komórek. W tej metodzie opisujemy prosty protokół dostarczania wzorzystych bioaktywnych białek na syntetycznych hydrożelach z glikolu polietylenowego (PEG) przy użyciu fotochemii. Platforma ta pozwala na niezależną kontrolę sztywności podłoża i przestrzennych wskazówek biochemicznych. Hydrożele te mogą osiągać szeroki zakres fizjologicznie istotnych wartości sztywności. Dodatkowo, powierzchnie tych hydrożeli mogą być fotowzorcowane za pomocą bioaktywnych peptydów lub białek poprzez reakcje chemiczne tiol-en. Metody te zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania funkcji białka po unieruchomieniu powierzchni. Jest to wszechstronny protokół, który można zastosować do dowolnego białka lub peptydu w celu stworzenia różnorodnych wzorów. Wreszcie, komórki wysiane na powierzchni tych bioaktywnych hydrożeli mogą być monitorowane w czasie, ponieważ reagują na sygnały specyficzne przestrzennie.

Protokół tworzenia aktywnych biologicznie wzorów na powierzchni hydrożeli PEG przedstawiono na Rysunku 1. Opracowano arkusz kalkulacyjny do obliczenia objętości i stężenia każdego roztworu zapasowego (Tabela 1A). Białka przeznaczone do unieruchomienia na powierzchni hydrożelu są modyfikowane 2-iminotiolanem (Rysunek 1B). Reakcja ta jest przeprowadzana z użyciem objętości podanych w Tabeli...

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest stworzenie unieruchomionych, bioaktywnych, przestrzennych wzorów białkowych, które mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi komórkowych. Metoda ta pozwala na odtworzenie sygnałów in-vivo z wykorzystaniem strategii biomateriałowych. Technika ta umożliwia dokładne naśladowanie określonych motywów sygnałowych, których nie można uzyskać za pomocą standardowych metod hodowli, takich jak sekwencyjne czynniki wzrostu, sygnalizacja międzykomórkowa oraz specyficzne przestrzennie bodźce biochemiczne.Niniejszy protokół ma istotne znaczenie w odniesieniu do istniejących metod, ponieważ zapewnia uproszczony sposób regulacji sztywności podłoża i wzorowania białek. Chociaż metoda ta może przyczynić się do rozwoju technologii inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, może być również stosowana do badania innych układów, takich jak rozwój tkanek i los komórek macierzystych. Na początek, w warunkach sterylnych, należy przygotować roztwory zapasowe głównego składnika hydrożelu, polietylenoglikolu diakrylanu, fotoinicjatora, fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu oraz białka ECM, fibronektyny, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Każdy roztwór należy poddać sterylizacji przez filtrowanie za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,22 micron przed użyciem lub przechowywaniem poszczególnych alikwotów. Następnie roztwór PEG-DA należy owinąć folią, aby chronić go przed światłem. Roztwór stokowy fotoinicjatora należy owinąć folią w celu ochrony przed światłem, a przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze cztery degree celsius przez maksymalnie kilka miesięcy.Jeśli roztwór zapasowy fibronektyny jest zamrożony, należy pozwolić sterylnej alikwocie odtajać na lodzie przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie należy wysterylizować w autoklawie jedną arkusz poliestrowy dla każdej formy do żelu. Następnie dwie szkiełka przedmiotowe i trzy plastikowe dystansery dla każdej formy do żelu należy namoczyć w 70% etanolu przez co najmniej dwie godziny.Dodatkowo należy namoczyć pięć żabkami biurowymi dla każdej formy do żelu w 70% etanolu przez 10 minut. Położyć szkiełka przedmiotowe, dystansery i żabki na małej tacce do autoklawowania w komorze do hodowli komórek, aby wyschły na powietrzu przez kilka godzin. Następnie przygotować formy do hydrożelu, umieszczając plastikowe dystansery o grubości 0,5 mm wokół krawędzi szkiełka przedmiotowego.Umieść drugie szkiełko podstawowe na górze, a następnie mocno zabezpiecz dystanse obok siebie za pomocą klipsów biurowych. Na koniec wysterylizuj powierzchnię formy, umieszczając ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza i włączając lampę UV na 30 minut przed użyciem. W połowie procesu sterylizacji odwróć formę, aby upewnić się, że obie powierzchnie zostały naświetlone.Przygotuj roztwory prekursorów żelu zgodnie z opisem w tabeli 1 towarzyszącego protokołu tekstowego. Następnie wymieszaj odpowiednie objętości PEG-DA, fibronektyny i fotoinicjatora w celu utworzenia hydrożelu. Pipetuj roztwór energicznie, aby zapewnić jego jednorodność, unikając jednocześnie powstawania pęcherzyków powietrza.Ostrożnie nanieś pipetą roztwór prekursora żelu pomiędzy dwie szklane płytki formy żelowej. Następnie umieść formę pod światłem UV i naświetlaj przez jedną lub dwie minuty, aby utworzyć hydrożel. Po żelowaniu zdejmij zaciski sprężynowe i delikatnie usuń górną szklaną płytkę, wywierając przeciwstawny nacisk na dwa boczne dystansery.Następnie, używająctreka do biopsji o odpowiedniej średnicy, należy wyciąć próbki hydrożelu. Wycięte powinno zostać kilka hydrożeli z prostokątnego żelu, aby służyły one jako powtórzenia i próbki kontrolne. Maskę światłoczułą należy wysterylizować, mocząc ją w 70% ethanol przez 10 minut.Następnie należy pozostawić maskę fotograficzną do wyschnięcia w dygestorium do hodowli komórkowych. W kolejnym kroku nanieść pipetą od 1 do 2 µL na centymetr kwadratowy roztworu białka z grupami tiolowymi na powierzchnię każdego wyciętego hydrożelu w celu wzorowania powierzchni. Ważne jest, aby równomiernie rozprowadzić roztwór białka na powierzchni hydrożelu, aby zapewnić jednorodną immobilizację białek.Ostrożnie umieść maskę fotograficzną na powierzchni hydrożelu. Delikatnie naciśnij maskę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które powstały między maską a powierzchnią hydrożelu. Następnie umieść hydrożel pod światłem UV i poddaj go drugiej serii naświetlania promieniami UV przez 30 do 60 sekund.Przemyj hydrożele roztworem PBS, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane substancje, a następnie umieść każdy hydrożel w płytce wielodotykowej tak, aby powierzchnia z wzorem była skierowana do góry. Następnie mocz żele w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Odlej PBS z otworów, po czym dodaj 250 µL podstawowego medium EGM2 do każdego otworu i inkubuj żele przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C.Podczas inkubacji przeprowadź trawienie trypsyną płytki z niemal zrastającymi się HUVEC, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, stosując standardowe techniki. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową i ostrożnie usuń nadsącz. Przesuś osad komórkowy w podstawowej pożywce EGM2 bez dodatnych czynników wzrostu, a następnie nanieś część zawiesiny komórkowej do hemocytometru.Policz komórki, aby określić ich stężenie. Następnie odwiruj płytkę zawierającą hydrożele z prędkością 300 x G przez trzy minuty, aby upewnić się, że hydrożele znajdują się na dnie studni i nie unoszą się. Jest krytyczne, aby hydrożele nie pływały w obrębie studni.Pływające hydrożele ograniczą sukces w wysiewaniu komórek i spowodują problemy z obrazowaniem hydrożeli. Powoli nanieś pipetą 75 000 komórek na cm² na środek powierzchni każdego hydrożelu, aby nie zakłócić struktury żeli. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.Przez kilka dni okresowo wyjmuj naczynie, aby obserwować migrację komórek w odpowiedzi na wzór białkowy. Wymieniaj 50% pożywki co dwa do trzech dni. Podczas formowania hydrożeli można zastosować różne stężenia prekursora PEG-diakrylanu, aby uzyskać pożądaną sztywność podłoża.Przedstawiony tutaj roztwór 20% PEG-DA odpowiada sztywności przekraczającej 100 kilopascals. Ważne jest również uwzględnienie zarówno stężenia fotoinicjatora, jak i czasu ekspozycji na UV, ponieważ zwiększenie którejkolwiek z tych zmiennych zmniejszy bioaktywność przyłączonych cząsteczek, reprezentowaną tutaj przez bioaktywność lizosomów. Minimalizacja ekspozycji na UV podczas formowania hydrożelu jest kluczowa dla zachowania wolnych grup funkcyjnych akrylanu dla późniejszych reakcji immobilizacji białek.Hydrożele wystawione na działanie światła UV przez więcej niż dwie minuty nie są w stanie utworzyć unieruchomionych wzorów białkowych zaznaczonych na czerwono. Ponadto, wraz ze zwiększeniem ekspozycji na UV wzoru białkowego, więcej białek reaguje z powierzchnią. Po prawidłowym przygotowaniu, na tych wzorzystych podłożach hydrożelowych można hodować komórki w celu manipulowania ich zachowaniem.W tym przypadku komórki śródbłonka zostały równomiernie wysiane na powierzchni hydrożeli z PEG o wzorcu VEGF. Dwa dni po wysianiu zaobserwowano migrację komórek śródbłonka w kierunku obszarów hydrożelu, w których znajdował się unieruchomiony VEGF. Po opanowaniu tego protokołu badacze mogą wykorzystać go do unieruchomienia dowolnego białka lub peptydy w celu badania nowych platform bioaktywnych dla systemów komórkowych in vitro.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby dążyć do zminimalizowania stężenia inicjatora fotoinicjacji oraz czasu ekspozycji na promieniowanie UV, aby zachować aktywność biologiczną unieruchomionych cząsteczek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób nanoszenia wzorów z białek i peptydów aktywnych biologicznie na hydrożele PEG, równomiernego wysiewania komórek na hydrożele oraz obserwowania następującej po tym reakcji komórkowej.

patterning-bioactive-proteins-or-peptides-on-hydrogel-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Opisujemy protokół modyfikacji powinowactwa komórek powierzchni rusztowania w środowisku wodnym. Metoda wykorzystuje fotokatalizę dwutlenku tytanu do rozkładu filmu organicznego w obszarze napromieniowanym światłem. Pokazujemy, że można go wykorzystać do tworzenia mikrodomen białek rusztowań, zarówno ex situ, jak i in situ.

Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO2

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Poznaj metodę wzorowania białek na hydrożelach PEG przy użyciu fotopolimeryzacji do badań odpowiedzi komórkowych. Technika ta umożliwia naśladowanie sygnałów in vivo w inżynierii tkankowej.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Przeglądaj więcej filmów