Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Ogólnym celem tej metodologii jest stworzenie unieruchomionych bioaktywnych wzorców białek przestrzennych, które można wykorzystać do badania odpowiedzi komórkowych. Metoda ta pozwala na rekapitulację sygnałów in vivo przy użyciu strategii biomateriałowych. Technika ta pozwala na dokładne naśladowanie pewnych motywów sygnalizacyjnych, których nie można osiągnąć przy użyciu standardowych metod hodowli, takich jak sekwencyjne czynniki wzrostu, sygnalizacja komórkowa, sygnalizacja komórkowa i przestrzenne specyficzne sygnały biochemiczne.

Protokół ten jest istotny dla istniejących metod, ponieważ zapewnia uproszczoną metodę dostosowywania sztywności podłoża i wzorca białka. Chociaż metoda ta może przyczynić się do rozwoju technologii inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, może być również stosowana do badania innych systemów, takich jak rozwój tkanek i los komórek macierzystych. Na początek przygotuj roztwory podstawowe dla głównego składnika hydrożelowego, dikrylanu glikolu polietylenowego, fotoinicjatora, fenylo-2, 4, 6-trimetylobenzoilofosfinianu litu i białka ECM, fibronektyny, w sterylnych warunkach, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Filtruj wysterylizuj każdy roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,22 mikrona przed użyciem lub przechowywaniem poszczególnych porcji. Następnie owiń roztwór PEG-DA folią, aby zabezpieczyć go przed światłem. Zawiń roztwór podstawowy inicjatora fotograficznego w folię, aby chronić go przed światłem, a przygotowany roztwór przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do kilku miesięcy.

Jeśli roztwór podstawowy fibronektyny jest zamrożony, pozwól sterylnej podwielokrotności rozmrozić się na lodzie przez kilka godzin lub w czterech stopniach Celsjusza przez noc. Zacznij od autoklawowania jednego arkusza poliestru dla każdej formy żelowej. Następnie namocz dwa szklane szkiełka w trzech plastikowych przekładkach dla każdej formy żelowej w 70% etanolu przez co najmniej dwie godziny.

Dodatkowo namocz pięć spinaczy do segregatora dla każdej formy żelowej w 70% etanolu przez 10 minut. Umieść szkiełka podstawowe, przekładki i spinki do segregatora na małym arkuszu autoklawu w kapturze do hodowli komórkowych, aby pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka godzin. Następnie przygotuj foremki hydrożelowe, umieszczając plastikowe przekładki o grubości 0,5 milimetra wokół krawędzi szklanego szkiełka.

Umieść drugi szklany szkiełko na górze, a następnie mocno przymocuj przekładki obok siebie za pomocą spinaczy do segregatorów. Na koniec wysterylizuj powierzchnię formy, umieszczając ją w okapie i włączając światło UV na 30 minut przed użyciem. W połowie procesu sterylizacji odwróć formę, aby była bardziej podatna na odsłonięcie obu powierzchni.

Sporządzić roztwory prekursorów żelu zgodnie z opisem w tabeli pierwszej dołączonego protokołu tekstowego. Następnie wymieszaj ze sobą objętości PEG-DA, fibronektyny i fotoinicjatora, aby uzyskać hydrożel. Energicznie pipetować roztwór, aby uzyskać jednorodny roztwór, ale unikać tworzenia pęcherzyków.

Ostrożnie odpipetować roztwór prekursora żelu między dwoma szklanymi szkiełkami formy żelowej. Następnie umieść formę w świetle UV i wystaw ją na jedną do dwóch minut, aby powstał hydrożel. Po zżelowaniu zdejmij klipsy do segregatora i delikatnie zdejmij górne szkiełko, wywierając przeciwny nacisk na dwie boczne przekładki.

Następnie, za pomocą odpowiedniej wielkości stempla do biopsji, wyciąć próbki hydrożelu. Z prostokąta żelu należy wyciąć wiele hydrożeli, które posłużą jako kontrpróby i próbki kontrolne. Wysterylizuj maskę fotograficzną, mocząc ją w 70% etanolu przez 10 minut.

Następnie pozostaw maskę fotograficzną do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych. Następnie odpipetuj od jednego do dwóch mikrolitrów na centymetr kwadratowy tiolowanego roztworu białka do powierzchni każdego wyciętego hydrożelu w celu narysowania wzoru powierzchniowego. Ważne jest, aby równomiernie rozprowadzić roztwór białkowy na powierzchni hydrożelu, aby zapewnić równomierne unieruchomienie białka.

Ostrożnie umieść fotomaskę na powierzchni hydrożelu. Delikatnie dociśnij maskę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które tworzą się między maską a powierzchnią hydrożelu. Następnie umieść hydrożel pod światłem UV i wystaw go na drugą rundę światła UV przez 30 do 60 sekund.

Przemyć hydrożele PBS, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane gatunki i umieścić każdy hydrożel w płytce studzienki tak, aby powierzchnia wzoru była skierowana do góry. Następnie umyj żele przez noc w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usuń PBS ze studzienek, a następnie dodaj 250 mikrolitrów podstawowego EGM2 do każdej studzienki i inkubuj żele przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Podczas inkubacji trypsyna trawi płytkę z prawie zlewającymi się HUVEC do zawiesiny jednokomórkowej przy użyciu standardowych technik. Następnie odwirować zawiesinę komórek i ostrożnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy i podstawowy EGM2 bez dodatku czynników wzrostu i dodać część zawiesiny komórek do hemocytometru.

Policz komórki, aby określić stężenie. Następnie odwirowywać płytkę zawierającą hydrożele o sile 300 x G przez trzy minuty, aby upewnić się, że hydrożele znajdują się na dnie studzienki i nie unoszą się na wodzie. Bardzo ważne jest, aby hydrożele nie unosiły się w studniach.

Pływające hydrożele ograniczą sukces w wysiewaniu komórek i spowodują problemy z obrazowaniem hydrożelu. Powoli odpipetować 75 000 komórek na centymetr do kwadratu na środku każdej powierzchni hydrożelu, aby nie naruszyć żeli. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przez kilka dni okresowo wyjmuj naczynie, aby obserwować migrację komórek w odpowiedzi na wzór białka. Wymieniaj 50% nośników co dwa do trzech dni. Podczas formowania hydrożeli można stosować różne stężenia prekursorów PEG-diakrylanu w celu uzyskania pożądanej sztywności podłoża.

Pokazane tutaj rozwiązanie 20% PEG-DA koreluje ze sztywnością ponad 100 kilopaskalów. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę zarówno stężenie fotoinicjatora, jak i czas ekspozycji na promieniowanie UV, ponieważ wzrost którejkolwiek z tych zmiennych zmniejszy bioaktywność przyłączonych cząsteczek, reprezentowaną tutaj przez bioaktywność lizosomu. Minimalizacja ekspozycji na promieniowanie UV podczas tworzenia hydrożelu ma kluczowe znaczenie dla utrzymania wolnych grup funkcyjnych akrylanów dla kolejnych reakcji immobilizacji białek.

Hydrożele wystawione na działanie światła UV dłużej niż dwie minuty nie są w stanie wytworzyć unieruchomionych wzorów białkowych pokazanych na czerwono. Dodatkowo, wraz ze wzrostem ekspozycji na promieniowanie UV na wzór białka, więcej białek reaguje na powierzchnię. Po prawidłowym przygotowaniu komórki można hodować na tych wzorzystych podłożach hydrożelowych, aby manipulować ich zachowaniem.

W tym przypadku komórki śródbłonka zostały równomiernie wysiane na powierzchnię hydrożeli PEG o wzorze VEGF. Dwa dni po wysiewie zaobserwowano, że komórki śródbłonka migrują w kierunku obszarów przestrzennych hydrożelu, który zawierał unieruchomiony VEGF. Po opracowaniu tego protokołu naukowcy mogą go wykorzystać do unieruchomienia dowolnego białka lub peptydu w celu zbadania nowych platform bioaktywnych dla systemów komórkowych in vitro.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zminimalizowaniu stężenia fotoinicjatora i czasu ekspozycji na promieniowanie UV, aby utrzymać bioaktywność unieruchomionych cząsteczek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wzór bioaktywnych białek i peptydów na hydrożelach PEG, komórki nasienne równomiernie na hydrożelach i obserwować wynikającą z tego odpowiedź komórkową.