Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest stworzenie unieruchomionych, bioaktywnych, przestrzennych wzorów białkowych, które mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi komórkowych. Metoda ta pozwala na odtworzenie sygnałów in-vivo z wykorzystaniem strategii biomateriałowych. Technika ta umożliwia dokładne naśladowanie określonych motywów sygnałowych, których nie można uzyskać za pomocą standardowych metod hodowli, takich jak sekwencyjne czynniki wzrostu, sygnalizacja międzykomórkowa oraz specyficzne przestrzennie bodźce biochemiczne.

Niniejszy protokół ma istotne znaczenie w odniesieniu do istniejących metod, ponieważ zapewnia uproszczony sposób regulacji sztywności podłoża i wzorowania białek. Chociaż metoda ta może przyczynić się do rozwoju technologii inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, może być również stosowana do badania innych układów, takich jak rozwój tkanek i los komórek macierzystych. Na początek, w warunkach sterylnych, należy przygotować roztwory zapasowe głównego składnika hydrożelu, polietylenoglikolu diakrylanu, fotoinicjatora, fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu oraz białka ECM, fibronektyny, zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.

Każdy roztwór należy poddać sterylizacji przez filtrowanie za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,22 micron przed użyciem lub przechowywaniem poszczególnych alikwotów. Następnie roztwór PEG-DA należy owinąć folią, aby chronić go przed światłem. Roztwór stokowy fotoinicjatora należy owinąć folią w celu ochrony przed światłem, a przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze cztery degree celsius przez maksymalnie kilka miesięcy.

Jeśli roztwór zapasowy fibronektyny jest zamrożony, należy pozwolić sterylnej alikwocie odtajać na lodzie przez kilka godzin lub w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie należy wysterylizować w autoklawie jedną arkusz poliestrowy dla każdej formy do żelu. Następnie dwie szkiełka przedmiotowe i trzy plastikowe dystansery dla każdej formy do żelu należy namoczyć w 70% etanolu przez co najmniej dwie godziny.

Dodatkowo należy namoczyć pięć żabkami biurowymi dla każdej formy do żelu w 70% etanolu przez 10 minut. Położyć szkiełka przedmiotowe, dystansery i żabki na małej tacce do autoklawowania w komorze do hodowli komórek, aby wyschły na powietrzu przez kilka godzin. Następnie przygotować formy do hydrożelu, umieszczając plastikowe dystansery o grubości 0,5 mm wokół krawędzi szkiełka przedmiotowego.

Umieść drugie szkiełko podstawowe na górze, a następnie mocno zabezpiecz dystanse obok siebie za pomocą klipsów biurowych. Na koniec wysterylizuj powierzchnię formy, umieszczając ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza i włączając lampę UV na 30 minut przed użyciem. W połowie procesu sterylizacji odwróć formę, aby upewnić się, że obie powierzchnie zostały naświetlone.

Przygotuj roztwory prekursorów żelu zgodnie z opisem w tabeli 1 towarzyszącego protokołu tekstowego. Następnie wymieszaj odpowiednie objętości PEG-DA, fibronektyny i fotoinicjatora w celu utworzenia hydrożelu. Pipetuj roztwór energicznie, aby zapewnić jego jednorodność, unikając jednocześnie powstawania pęcherzyków powietrza.

Ostrożnie nanieś pipetą roztwór prekursora żelu pomiędzy dwie szklane płytki formy żelowej. Następnie umieść formę pod światłem UV i naświetlaj przez jedną lub dwie minuty, aby utworzyć hydrożel. Po żelowaniu zdejmij zaciski sprężynowe i delikatnie usuń górną szklaną płytkę, wywierając przeciwstawny nacisk na dwa boczne dystansery.

Następnie, używająctreka do biopsji o odpowiedniej średnicy, należy wyciąć próbki hydrożelu. Wycięte powinno zostać kilka hydrożeli z prostokątnego żelu, aby służyły one jako powtórzenia i próbki kontrolne. Maskę światłoczułą należy wysterylizować, mocząc ją w 70% ethanol przez 10 minut.

Następnie należy pozostawić maskę fotograficzną do wyschnięcia w dygestorium do hodowli komórkowych. W kolejnym kroku nanieść pipetą od 1 do 2 µL na centymetr kwadratowy roztworu białka z grupami tiolowymi na powierzchnię każdego wyciętego hydrożelu w celu wzorowania powierzchni. Ważne jest, aby równomiernie rozprowadzić roztwór białka na powierzchni hydrożelu, aby zapewnić jednorodną immobilizację białek.

Ostrożnie umieść maskę fotograficzną na powierzchni hydrożelu. Delikatnie naciśnij maskę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które powstały między maską a powierzchnią hydrożelu. Następnie umieść hydrożel pod światłem UV i poddaj go drugiej serii naświetlania promieniami UV przez 30 do 60 sekund.

Przemyj hydrożele roztworem PBS, aby usunąć wszelkie nieprzereagowane substancje, a następnie umieść każdy hydrożel w płytce wielodotykowej tak, aby powierzchnia z wzorem była skierowana do góry. Następnie mocz żele w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Odlej PBS z otworów, po czym dodaj 250 µL podstawowego medium EGM2 do każdego otworu i inkubuj żele przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C.

Podczas inkubacji przeprowadź trawienie trypsyną płytki z niemal zrastającymi się HUVEC, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, stosując standardowe techniki. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową i ostrożnie usuń nadsącz. Przesuś osad komórkowy w podstawowej pożywce EGM2 bez dodatnych czynników wzrostu, a następnie nanieś część zawiesiny komórkowej do hemocytometru.

Policz komórki, aby określić ich stężenie. Następnie odwiruj płytkę zawierającą hydrożele z prędkością 300 x G przez trzy minuty, aby upewnić się, że hydrożele znajdują się na dnie studni i nie unoszą się. Jest krytyczne, aby hydrożele nie pływały w obrębie studni.

Pływające hydrożele ograniczą sukces w wysiewaniu komórek i spowodują problemy z obrazowaniem hydrożeli. Powoli nanieś pipetą 75 000 komórek na cm² na środek powierzchni każdego hydrożelu, aby nie zakłócić struktury żeli. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.

Przez kilka dni okresowo wyjmuj naczynie, aby obserwować migrację komórek w odpowiedzi na wzór białkowy. Wymieniaj 50% pożywki co dwa do trzech dni. Podczas formowania hydrożeli można zastosować różne stężenia prekursora PEG-diakrylanu, aby uzyskać pożądaną sztywność podłoża.

Przedstawiony tutaj roztwór 20% PEG-DA odpowiada sztywności przekraczającej 100 kilopascals. Ważne jest również uwzględnienie zarówno stężenia fotoinicjatora, jak i czasu ekspozycji na UV, ponieważ zwiększenie którejkolwiek z tych zmiennych zmniejszy bioaktywność przyłączonych cząsteczek, reprezentowaną tutaj przez bioaktywność lizosomów. Minimalizacja ekspozycji na UV podczas formowania hydrożelu jest kluczowa dla zachowania wolnych grup funkcyjnych akrylanu dla późniejszych reakcji immobilizacji białek.

Hydrożele wystawione na działanie światła UV przez więcej niż dwie minuty nie są w stanie utworzyć unieruchomionych wzorów białkowych zaznaczonych na czerwono. Ponadto, wraz ze zwiększeniem ekspozycji na UV wzoru białkowego, więcej białek reaguje z powierzchnią. Po prawidłowym przygotowaniu, na tych wzorzystych podłożach hydrożelowych można hodować komórki w celu manipulowania ich zachowaniem.

W tym przypadku komórki śródbłonka zostały równomiernie wysiane na powierzchni hydrożeli z PEG o wzorcu VEGF. Dwa dni po wysianiu zaobserwowano migrację komórek śródbłonka w kierunku obszarów hydrożelu, w których znajdował się unieruchomiony VEGF. Po opanowaniu tego protokołu badacze mogą wykorzystać go do unieruchomienia dowolnego białka lub peptydy w celu badania nowych platform bioaktywnych dla systemów komórkowych in vitro.

Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby dążyć do zminimalizowania stężenia inicjatora fotoinicjacji oraz czasu ekspozycji na promieniowanie UV, aby zachować aktywność biologiczną unieruchomionych cząsteczek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób nanoszenia wzorów z białek i peptydów aktywnych biologicznie na hydrożele PEG, równomiernego wysiewania komórek na hydrożele oraz obserwowania następującej po tym reakcji komórkowej.