Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Ogólnym celem tej procedury jest ocena postępującego upośledzenia neurologicznego u myszy z przewlekłymi chorobami demielinizacyjnymi. Osiągamy to, oferując rekomendacje parametrów testowych odpowiednich do badania długotrwałej niepełnosprawności neurologicznej w modelu wirusa Theilers postępującego stwardnienia rozsianego, przy użyciu testu Rotarod. Procedura ta stanowi punkt odniesienia, na podstawie którego można ocenić znaczenie modelu mysiego dla postępującej demielinizacji i jego przydatność do testowania terapii mających na celu leczenie postępujących schorzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane.

Przewagą tego zoptymalizowanego testu nad tradycyjnym wizualnym systemem punktacji jest to, że generuje on obiektywną zmienną do ilościowego określenia długoterminowego wpływu terapii i procedur eksperymentalnych na funkcje motoryczne. Tę procedurę zademonstruje Darlene Royce, technik z laboratorium neuroimmunologii w Dartmouth. Aby ocenić wyjściową równowagę, koordynację i kontrolę motoryczną, należy rozpocząć protokół adaptacyjny na pięć dni przed zakażeniem TMEV, najpierw pozwalając myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut.

Podczas gdy myszy się aklimatyzują, ustaw Rotarod z parametrami treningowymi minus pięć DPI. Następnie chwyć mysz za ogon i umieść ją na pręcie skierowanym tyłem do operatora. Jeśli mysz upadnie lub podskoczy, umieść ją z powrotem na swoim pasie na Rotarodzie, aż wszystkie myszy znajdą się na swoim miejscu.

Po załadowaniu wszystkich czterech myszy naciśnij przycisk Enter, aby rozpocząć eksperyment. Upewnij się, że timery uruchamiają się automatycznie i obserwuj obroty na minutę wyświetlane dla każdego pasa. Następnie, gdy każde zwierzę spada z pręta, zapisz prędkość pręta w momencie upadku, a także czas, w którym zwierzę pozostawało na pręcie.

Po tym, jak wszystkie myszy upadną, użyj chusteczki, aby usunąć wszelkie kał i mocz z pręta, ponieważ obecność moczu i materiału kałowego może wpływać na zdolność myszy do prawidłowego chwytania pręta. Po trzyminutowym odpoczynku daj myszom drugą, a następnie trzecią próbę, w której maksymalny czas pojedynczej próby wynosi 240 sekund. Wykonaj w sumie trzy próby w ciągu każdego dnia testowego.

Na koniec zwróć myszy do ich domowej klatki. W dniach ujemnych cztery, ujemnie trzy, ujemnie dwa i ujemnie jeden PI, ustaw Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu treningowego i powtórz eksperyment Rotarod. Zacznij od przeniesienia klatek zawierających od czterech do sześciu tygodni samic myszy SJL ze stojaka do wygodnej przestrzeni roboczej.

Użyj dziurkaczy do uszu do oznaczania myszy, aby umożliwić indywidualną ocenę choroby klinicznej i histologicznej. Następnie narysuj 30 mikrolitrów materiału infekującego TMEV w PBS do igły strzykawki insulinowej o rozmiarze 29. Przygotuj aparat do znieczulenia, zapewniając obecność odpowiedniej ilości tlenu i izofluranu na czas trwania zabiegu.

Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i uszczelnij górę. Po kilku minutach wyjmij zwierzę z komory i przetestuj mysz, ściskając podkładkę pod stopę, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Następnie oczyść miejsce wstrzyknięcia 70% alkoholem izopropylowym i wstrzyknij 30 mikrolitrów materiału infekującego TMEV do prawej półkuli mózgowej za pomocą wstrzyknięcia z wolnej ręki.

Na koniec przywróć mysz do klatki trzymania, gdy będzie w pełni czujna i mobilna. W siódmym dniu po zakażeniu należy ustawić Rotarod z odpowiednimi parametrami eksperymentalnymi i powtórzyć całe ćwiczenie treningowe Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu eksperymentalnego. Po trzecim badaniu każdego dnia należy zważyć każdą mysz i zanotować masę ciała w karcie danych.

Testuj myszy dwa razy w tygodniu przez następne sześć tygodni w ten sam sposób. Po sześciu tygodniach testuj myszy raz w tygodniu za pomocą tego samego protokołu eksperymentalnego przez średnio 150 dni eksperymentalnych. Następnie przeanalizuj surowe dane i wyraź je jako neurologiczny wskaźnik funkcjonalny lub NFI.

Aby określić indywidualną wartość NFI, oblicz wyjściowy próg wydajności każdej myszy jako średnią wszystkich czasów działania od 15 do 45 dni po zakażeniu. Aby umożliwić ocenę sprawności motorycznej w wyniku postępującej demielinizacji i wykluczyć wszelkie deficyty przyczyniające się do wczesnego zapalenia mózgu. Następnie oblicz wartość NFI jako średnią trzech ostatnich średnich czasów działania podzieloną przez podstawowy próg wydajności myszy.

Na koniec należy obliczyć skorygowany NFI, dzieląc wartość NFI przez średnią wartość NFI uzyskaną przez grupę pozorowaną leczoną w tym konkretnym dniu. Rysunek ten pokazuje, że myszy zakażone TMEV wykazują znacznie zwiększone deficyty neurologiczne w czasie w porównaniu z myszami kontrolnymi. Przewlekłe zakażenie dwoma różnymi szczepami TMEV negatywnie wpłynęło na czas pracy myszy.

Obie grupy myszy zakażonych TMEV miały znacznie niższe wartości NFI niż myszy pozorowane. Co więcej, nie było różnicy między progresją niepełnosprawności u myszy zakażonych szczepem BeAn i u myszy zakażonych szczepem DA we wszystkich punktach czasowych. Po tej procedurze można zastosować tradycyjne metody oceny wizualnej, takie jak test odruchu prostującego, w celu szybkiej oceny ogólnego stanu zdrowia myszy.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się stwardnieniem rozsianym i chorobami neurodegeneracyjnymi do testowania skuteczności terapii i innych interwencji w opóźnianiu postępującej niepełnosprawności. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić długoterminową postępującą niepełnosprawność u myszy. Procedura ta jest przydatna nie tylko w wykrywaniu postępującej niepełnosprawności neurologicznej w modelu wirusa Theilera, ale jest również przydatna w odkrywaniu upośledzeń w innych mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.