Name: Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test Rotarod do oceny postępującej niepełnosprawności neurologicznej u myszy zakażonych wirusem TMEV. Ta metoda zapewnia obiektywną kwantyfikację funkcji motorycznych w modelu stwardnienia rozsianego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują personelowi Centrum Medycyny Porównawczej i Badań (CCMR) w Dartmouth za fachową opiekę nad myszami wykorzystywanymi do tych badań. Autorzy dziękują również Emily Clough za jej doskonałe wsparcie administracyjne.

Wszystkie prace ze zwierzętami wykorzystują protokoły sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Geisel School of Medicine w Dartmouth.
1. Model myszy
<ol>
	<li>Indukcja choroby demielinizacyjnej wywołanej TMEV
	<ol>
		<li>Przenieś klatki zawierające 4- do 6-tygodniowe samice myszy SJL/JHan ze stojaka do wygodnego miejsca pracy. Oznacz myszy (np. kolczykiem lub dziurkaczem w uchu), aby umożliwić indywidualną ocenę choroby klinicznej i histologicznej.</li>
		<li>Pobrać 30 μl materiału infekującego TMEV (2 x 106 jednostek tworzących płytkę nazębną; PFU) w PBS do strzykawki insulinowej i igły o rozmiarze 29G.</li>
		<li>Przygotuj aparat do znieczulenia gazem: sprawdź system, aby upewnić się, że na czas trwania zabiegu jest odpowiednia ilość tlenu i izofluranu.</li>
		<li>Włączyć przepływomierz na 1 l/min. Umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej i uszczelnić górę. Włącz waporyzator na 3,5% i monitoruj zwierzę aż do leżenia.</li>
		<li>Wyjmij zwierzę z komory i przetestuj mysz, ściskając podnóżek, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Brak reakcji na silne uszczypnięcie świadczy o odpowiednim znieczuleniu.</li>
		<li>Oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% alkoholem izopropylowym.</li>
		<li>Wstrzyknąć 30 μl materiału infekującego TMEV do prawej półkuli mózgowej za pomocą wstrzyknięcia z wolnej ręki (ryc. 1). Miejsce wstrzyknięcia znajduje się mniej więcej w połowie drogi między linią oka a linią ucha i tuż poza linią środkową.</li>
		<li>Przywróć mysz do klatki trzymania, gdy jest w pełni czujna i mobilna (zwykle 3-5 minut).</li>
		<li>Myszy należy poddać eutanazji przez wykrwawienie lub perfuzję serca od 3 do 6 miesięcy po zakażeniu TMEV, w zależności od szybkości rozwoju choroby.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza Rotarod
<ol>
	<li>Aparat Rotarod
	<ol>
		<li>Przetestuj myszy przed zakażeniem TMEV, aby zapoznać je z maszyną i ocenić ich normalną równowagę wyjściową, koordynację i kontrolę motoryczną.</li>
		<li>Rozpocznij protokół adaptacyjny w ciągu -5 dni po infekcji (dpi; tj. 5 dni przed zakażeniem TMEV).</li>
		<li>Pozwól myszom zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed badaniem Rotarod, aby umożliwić im dostosowanie się do środowiska.</li>
		<li>Upewnij się, że zarówno jednostka Rotarod, jak i komputer są podłączone i połączone ze sobą (Rysunek 2).</li>
		<li>Wstępnie ustaw Rotarod z parametrami protokołu treningowego -5 dpi, jak opisano w Tabeli 1.</li>
		<li>Zapisz plik roboczy z datą i danymi identyfikacyjnymi.</li>
		<li>Przenieś klatkę zawierającą drużynę, która ma zostać przetestowana, ze stojaka na stół przylegający do Rotarodu. Myszy są zwykle testowane w oddziałach po 4 osoby.</li>
		<li>Podnieś mysz za ogon i połóż ją na pręcie, odwróconą tyłem do operatora. Powtórz od drugiej do czwartej myszy. Jeśli mysz upadnie lub podskoczy, umieść ją z powrotem na swoim pasie na Rotarodzie, aż wszystkie myszy znajdą się na swoich pozycjach. Zignoruj, jeśli jakiekolwiek myszy odwrócą się twarzą do operatora.</li>
		<li>Po załadowaniu wszystkich myszy naciśnij przycisk "Enter", aby rozpocząć eksperyment. Obserwuj, jak timery uruchamiają się automatycznie, a obroty na minutę (obr./min) są wyświetlane dla każdego toru.
		<ol>
			<li>Gdy każde zwierzę spada z pręta, zapisuj prędkość pręta w momencie upadku, a także czas, w którym zwierzę pozostawało na pręcie. Pręt będzie się obracał, dopóki ostatnie zwierzę nie spadnie z zespołu pręta.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po tym, jak wszystkie myszy upadną, użyj chusteczki, aby usunąć kał i mocz z pręta. Obecność moczu i kału może wpływać na zdolność myszy do chwytania pręta.
		<ol>
			<li>Po 3-minutowym odpoczynku daj myszom drugą, a następnie trzecią próbę. Maksymalny czas pojedynczej próby wynosi 240 sek. Wykonaj łącznie 3 badania kliniczne w ciągu każdego dnia testowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść myszy z powrotem w klatce domowej i z powrotem do stojaka. Pod koniec sesji eksperymentalnej wyczyść Rotarod wodą z mydłem, aby usunąć cały kał z maszyny.</li>
		<li>Wytrzyj płytkę podstawy do czysta etanolem 70%. Spryskaj całą maszynę dwutlenkiem chloru w celu dezynfekcji.</li>
		<li>W dniach - 4, - 3, - 2 i - 1 pi, należy wstępnie ustawić Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu treningowego, jak opisano w Tabeli 1, i powtórzyć kroki od 2.1.2 do 2.1.12.</li>
		<li>Po uzyskaniu podstawowych miar należy zainfekować myszy TMEV. Zezwól na 6-dniowy okres odzyskiwania liczby pi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Protokół</td>
			<td rowspan="2">Dzień testowy</td>
			<td rowspan="2">Częstotliwość</td>
			<td rowspan="2">Prędkość początkowa (obr./min)</td>
			<td rowspan="2">Maksymalna prędkość (rpm)</td>
			<td>przyspieszenie</td>
			<td>Prób</td>
			<td>Informatyka (ITI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(obr./min/sek)</td>
			<td>(N x s)</td>
			<td>(min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Trening</td>
			<td>- 5 d.p.i</td>
			<td>1/dzień</td>
			<td>1</td>
			<td>12</td>
			<td>01/03</td>
			<td>Czas trwania: 3x240 sekund</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 4 d.p.i</td>
			<td>1/dzień</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
			<td>01/03</td>
			<td>Czas trwania: 3x240 sekund</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 3 d.p.i</td>
			<td>1/dzień</td>
			<td>1</td>
			<td>14</td>
			<td>01/03</td>
			<td>Czas trwania: 3x240 sekund</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- 2; - 1 d.p.i</td>
			<td>1/dzień</td>
			<td>5</td>
			<td>Rozdział 40</td>
			<td>01/03</td>
			<td>Czas trwania: 3x240 sekund</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Eksperymentalny</td>
			<td>Od +7 do +50 s.p.i</td>
			<td>2/tydzień</td>
			<td>5</td>
			<td>Rozdział 40</td>
			<td>05/30</td>
			<td>Czas trwania: 3x240 sekund</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Od +51 do +150 s.p.i</td>
			<td>1/tydzień</td>
			<td>5</td>
			<td>Rozdział 40</td>
			<td>05/30</td>
			<td>Czas trwania: 3x240 sekund</td>
			<td>3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry Rotarod w protokołach treningowych i eksperymentalnych.
<ol start="2">
	<li>Protokół Eksperymentalny Rotarod
	<ol>
		<li>Na +7 dpi wstępnie ustaw Rotarod z odpowiednimi parametrami protokołu eksperymentalnego, jak opisano w Tabeli 1. Powtórz kroki od 2.1.2 do 2.1.10.</li>
		<li>Pod koniec próby #3 zważ każdą mysz i zanotuj masę ciała na karcie danych. Wyczyść i zdezynfekuj Rotarod zgodnie z krokami 2.1.11 i 2.1.12.</li>
		<li>Testuj myszy dwa razy w tygodniu przez kolejne 6 tygodni, jak opisano powyżej. Po 6 tygodniach (w których myszy prawdopodobnie osiągnęły fazę plateau)8,9 testuj myszy raz w tygodniu według tego samego protokołu eksperymentalnego. Sam protokół badania trwa średnio 150 dni, w zależności od konkretnego przebiegu choroby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neurologiczny Indeks Funkcjonalny
	<ol>
		<li>Wyeksportuj surowe dane do pliku arkusza kalkulacyjnego i przeanalizuj wyniki.</li>
		<li>Wyrazić dane jako czas pracy (rysunek 3A): jest to normalny czas pracy powiększony o pasywny czas obrotu pomniejszony o czas opóźnienia obrotu (tabela 2)10. Obliczyć średni czas trwania trzech prób w ciągu dnia.</li>
		<li>Wyraź dane jako neurologiczny indeks funkcjonalny (NFI; Rysunek 3B).
		<ol>
			<li>Oblicz podstawowy próg wydajności każdej myszy z osobna. Podstawowy próg osiągów wyznacza się jako średnią wszystkich czasów pracy od dnia + 15 do + 45 pi6,7.</li>
			<li>Oblicz NFI jako średnią trzech ostatnich średnich czasów działania podzieloną przez podstawowy próg wydajności tej konkretnej myszy6,7,<br />
			UWAGA: Jeśli testowane czasy działania myszy w dniu + 72, + 76 i + 79 pi wynoszą 55 sekund, 45 sekund i 50 sekund, a czas odniesienia dla tej samej myszy wynosił 135 sekund, NFI dla tej myszy w rozdzielczości +79 dpi wyniesie [(45+50+55)/3]/135 lub 0,37.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyraż dane jako skorygowany NFI (adjNFI; Rysunek 3C): korygować dane NFI o wartość populacji dla pojedynczego eksperymentu.
		<ol>
			<li>Oblicza się adjNFI, dzieląc wartość NFI przez średnią NFI uzyskaną przez grupę pozorowaną w tym konkretnym dniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>termin</td>
			<td>definicja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normalny czas pracy</td>
			<td>Całkowity czas, w którym mysz aktywnie biega na obracającym się pręcie, tj. opóźnienie do spadku.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasywny czas obrotu</td>
			<td>Czas, przez jaki mysz pozostawała na pręcie w trybie pasywnego obracania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas opóźnienia obrotu</td>
			<td>Czas, przez jaki mysz pozostaje na pręcie w trybie pasywnego obrotu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasywny tryb rotacji</td>
			<td>Gdy mysz chwyta pręt i obraca się bez konieczności poruszania się.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Łączny czas trwania sesji</td>
			<td>Łączny czas, przez jaki mysz pozostaje na obracającym się pręcie podczas sesji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wydajność wyjściowa</td>
			<td>Sprawność silnika przed uszkodzeniem oceniana w celu określenia minimalnego progu wydajności.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wskaźnik funkcji neurologicznych (NFI)</td>
			<td>Indeks kliniczny, który porównuje wydajność motoryczną każdej myszy, tj. czas pracy, w dowolnym momencie z jej szczytową wydajnością.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skorygowany wskaźnik funkcji neurologicznych (adjNFI)</td>
			<td>Gdy proces normalizacji jest stosowany w celu skorygowania danych NFI o wartość populacji dla pojedynczego eksperymentu. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wartość populacji</td>
			<td>Średnia wartość NFI uzyskana przez grupę leczoną pozorem w określonym dniu.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Definicje parametrów Rotarod przyjęte do ilościowego określenia upośledzenia neurologicznego.

<ol><li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+an+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
<li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPachner%2C+AR+%22A+Primer+of+Neuroimmunological+Disease%22">A Primer of Neuroimmunological Disease</a>. , Springer. New York. (2012).</li>
<li>Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetic+susceptibility+to+ethanol+intoxication+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetic susceptibility to ethanol intoxication in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2917-2922 (2003).</li>
<li>McGavern, D. B., Zoecklein, L., Drescher, K. M., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurologic+deficits+in+a+chronic+progressive+murine+model+of+CNS+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic progressive murine model of CNS demyelination.</a> Exp Neurol. 158, 171-181 (1999).</li>
<li>Zoecklein, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+demyelinating+disease+induced+by+the+Daniel%27s+strain+and+BeAn+strain+of+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of demyelinating disease induced by the Daniel's strain and BeAn strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus.</a> Brain Pathol. 13, 291-308 (2003).</li>
<li>Gilli, F., Li, L., Campbell, S. J., Anthony, D. C., Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+B-cell+depletion+in+the+Theiler%27s+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of B-cell depletion in the Theiler's model of multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 359, 40-47 (2015).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+FTY720+in+the+Theiler%27s+virus+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of FTY720 in the Theiler's virus model of multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 308, 41-48 (2011).</li>
<li>Homanics, G. E., Quinlan, J. J., Firestone, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+and+behavioral+responses+of+inbred+C57BL%2F6J+and+strain+129%2FSvJ+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Be%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic and behavioral responses of inbred C57BL/6J and strain 129/SvJ mouse lines.</a> Pharmacol Biochem Be. 63, 21-26 (1999).</li>
<li>Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+post-stroke+behavior+in+mouse+models+of+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cerebr+Blood+F+Met%22%5BJournal%5D)">Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia.</a> J Cerebr Blood F Met. 33, 330-338 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Columbus+Instruments+Rotamex-5+Manual%22">Columbus Instruments Rotamex-5 Manual</a>. , 1-33 (2005).</li>
<li>Dunham, N. W., Miya, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+a+simple+apparatus+for+detecting+neurological+deficit+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Pharm+Ass%22%5BJournal%5D)">A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice.</a> J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).</li>
<li>Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+approach+identifies+new+pathways+associated+with+demyelination+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).</li>
<li>Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nociception%2C+sex+and+peripheral+nerve+innervation+in+the+TMEV+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Analysis of nociception, sex and peripheral nerve innervation in the TMEV animal model of multiple sclerosis.</a> Pain. 136, 293-304 (2008).</li>
<li>Pirko, I., Johnson, A. J., Lohrey, A. K., Chen, Y., Ying, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+gray+matter+T2+hypointensity+correlates+with+disability+in+a+murine+model+of+MS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Deep gray matter T2 hypointensity correlates with disability in a murine model of MS.</a> J Neurol Sci. 282, 34-38 (2009).</li>
<li>Oleszak, E. L., Chang, J. R., Friedman, H., Katsetos, C. D., Platsoucas, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection%3A+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection: a model for multiple sclerosis.</a> Clin Microbiol Rev. 17, 174-207 (2004).</li>
<li>McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+multiple+sclerosis%3A+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+Theiler%27s+virus-induced+demyelinating+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease.</a> Methods Mol Biol. 900, Clifton, N.J. 381-401 (2012).</li>
<li>International Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screens. , Available from:
 Rotarod. https://www.mousephenotype.org/impress/protocol/158/12 (2016).</li>
<li>Bohlen, M., Cameron, A., Metten, P., Crabbe, J. C., Wahlsten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+rotational+acceleration+for+the+rotarod+test+of+rodent+motor+coordination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Calibration of rotational acceleration for the rotarod test of rodent motor coordination.</a> J Neurosci Methods. 178, 10-14 (2009).</li>
<li>Hopkins, M. E., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+effects+of+exercise+on+fear+conditioning%3A+the+influence+of+time+of+day%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day.</a> Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo pewnych ograniczeń, test wydajności Rotarod stanowi ważne narzędzie do oceny funkcji motorycznych i dysfunkcji w TMEV-IDD, a także wpływu interwencji farmakologicznych na postęp niepełnosprawności u myszy.
Test Rotarod został po raz pierwszy opisany w 1957 roku jako narzędzie do pomiaru deficytów neurologicznych u gryzoni1. Gryzonie muszą chodzić na obracającym się pręcie, ze zwiększającą się prędkością obrotową i starać się unikać upadku na ziemię. Opóźnienie do upadku jest ...

Mysi wirus zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) to neurotropowy jednoniciowy wirus RNA, który uporczywie infekuje mysi ośrodkowy układ nerwowy (OUN). U wrażliwych myszy zakażenie TMEV powoduje przewlekłą chorobę demielinizacyjną o podłożu immunologicznym, znaną jako choroba demielinizacyjna indukowana przez TMEV (TMEV-IDD). Eksperymentalne zakażenie myszy przebiega podobnie jak w postępujących postaciach stwardnienia rozsianego (SM). TMEV-IDD charakteryzuje się dwiema odrębnymi fazami: fazą ostrą i fazą przewlekłą. Ostra faza to łagodne, zwykle subkliniczne zapalenie mózgu1,2. Druga, przewlekła faza, rozpoczynająca się około miesiąca po zakażeniu, polega na powoli postępującej niepełnosprawności charakteryzującej się demielinizacją, stanem zapalnym i uszkodzeniem aksonów1,2. Osłabienie obserwowane u myszy wiąże się ze spastycznością, a czasami z silnymi skurczami tonicznymi.
Ponieważ obecnie nie ma leków łagodzących postępującą niepełnosprawność u pacjentów, badacze są szczególnie zainteresowani TMEV-IDD, który stanowi optymalny model zwierzęcy do monitorowania wpływu leków modyfikujących przebieg choroby. Jednak zarówno u myszy, jak i u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, monitorowanie postępu niepełnosprawności wymaga ciągłej obserwacji klinicznej przez dłuższy czas. U myszy długoterminowe monitorowanie postępu niepełnosprawności można przeprowadzić za pomocą testu wydajności Rotarod.
Test wydajności Rotarod to standardowy test behawioralny, który ocenia funkcje motoryczne, takie jak koordynacja, równowaga i zmęczenie u gryzoni. Myszy muszą utrzymywać równowagę na obracającym się pręcie, który obraca się pod ciągłym przyspieszeniem; Rejestrowane jest opóźnienie czasowe do upadku z tego pręta. Zwierzęta z dysfunkcją neurologiczną nie są w stanie utrzymać się na obracającym się pręcie tak długo, jak grupy kontrolne, i zwykle odpadają, gdy prędkość obrotowa przekracza ich zdolność motoryczną. Im większe upośledzenie neurologiczne mają zwierzęta, tym szybciej spadną z pręta i tym krótsze jest opóźnienie czasowe.
Przewaga testu Rotarod nad tradycyjnymi wizualnymi systemami punktacji polega na tym, że generuje on obiektywną, mierzalną zmienną - opóźnienie czasowe - która ostatecznie może być wykorzystana do analiz statystycznych w celu ilościowego określenia efektów terapii i procedur eksperymentalnych3.
W Laboratorium Neuroimmunologii (LONI) w Dartmouth, myszy są poddawane protokołowi adaptacyjnemu, gdzie są testowane przed zakażeniem TMEV w celu zapoznania ich z maszyną i oceny ich normalnej "wyjściowej" równowagi, koordynacji i kontroli motorycznej4,5. Po ustaleniu linii bazowej i zakażeniu myszy TMEV są one testowane raz lub dwa razy w tygodniu przez okres kilku miesięcy. Właściwy protokół badania trwa średnio 150 dni, co pozwala na ocenę spadku równowagi, koordynacji i kontroli motorycznej w całym przebiegu choroby demielinizacyjnej.
Do tej pory w Dartmouth przetestowano kilkaset myszy TMEV-IDD i myszy leczonych pozorowanym pod kątem dysfunkcji neurologicznych. Myszy te otrzymały różne terapie immunomodulujące, ale żaden środek farmakologiczny nie okazał się skuteczny w łagodzeniu progresji niepełnosprawności6,7. Niniejszy artykuł i związany z nim protokół opisują, jak scharakteryzować postępujące upośledzenie neurologiczne wykazywane przez myszy TMEV-IDD. W szczególności protokół zawiera zalecenia dotyczące określonych parametrów testowych, które uważa się za ogólnie odpowiednie do badania niepełnosprawności neurologicznej u myszy TMEV-IDD za pomocą testu Rotarod. Procedura ta stanowi punkt odniesienia, w stosunku do którego można ocenić (1) znaczenie tego modelu myszy dla postępującego stwardnienia rozsianego oraz (2) jego przydatność do testowania terapii mających na celu leczenie postępujących schorzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane. Oczywiście, test wydajności Rotarod oraz obecnie zoptymalizowane parametry i protokół testowy są przydatne nie tylko w wykrywaniu postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu TMEV-IDD, ale są również przydatne w odkrywaniu upośledzeń w innych indukowanych przez wirusy i/lub genetycznych mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td>Myszy SJL/JCrHsd w wieku od 4 do 6 tygodni</td><td>Envigo</td><td>#052</td><td></td></tr><tr><td>Zapas</td><td></td><td></td><td></td>wirusa TMEV</tr><tr><td>Waporyzator izofluranu</td><td>Aparat Harvard</td><td>#340471</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe U- 100 29 g x 0,5 cc</td><td>BD</td><td>#328203</td><td></td></tr><tr><td>Rotamex-5 4-pasmowy pręt Rota-Rod dla myszy z RS-232 i oprogramowaniem</td><td>Columbus Instruments</td><td>#0890M</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Po zakażeniu śródmózgowym wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV), u podatnych myszy SJL rozwija się przewlekła, postępująca choroba demielinizacyjna, z cechami klinicznymi podobnymi do postępujących postaci stwardnienia rozsianego (MS). Myszy wykazują postępującą niepełnosprawność z utratą funkcji motorycznych i czuciowych, co można ocenić za pomocą wielu aparatów i protokołów. Wśród nich test wydajności Rotarod jest bardzo powszechnym testem behawioralnym, którego zaletą jest to, że zapewnia obiektywne pomiary, ale często stosuje się go przy założeniu, że jest prosty i prosty. W przeciwieństwie do wizualnych systemów punktacji stosowanych w niektórych modelach stwardnienia rozsianego, które są wysoce subiektywne, test Rotarod generuje obiektywną, mierzalną, ciągłą zmienną (tj. długość czasu), co pozwala na niemal idealną zgodność między oceniającymi. Niezawodność międzylaboratoryjną można jednak osiągnąć tylko wtedy, gdy różne parametry testowe zostaną powtórzone. W tym manuskrypcie zalecenia dotyczące konkretnych parametrów testowych, takich jak rozmiar, prędkość i przyspieszenie pręta; ilość czasu szkolenia zwierząt; i przetwarzania danych, są prezentowane na potrzeby testu Rotarod.

Celem tego reprezentatywnego eksperymentu było porównanie deficytów neurologicznych wywołanych przez szczep Daniels (DA) oraz szczep BeAn wirusa TMEV. Na potrzeby niniejszego badania grupę 32 samic myszy szczepu SJL zainfekowano dokranialnie TMEV, albo szczepem DA (n = 16), albo szczepem BeAn (n = 16), a następnie monitorowano w czasie ich objawy kliniczne. Dodatkowa grupa 20 myszy została poddana zabiegowi pozorowanemu (tj. dokranialnie wstrzyknięto roztwór soli fizjologicznej) ...

Zoptymalizowany protokół testowy jest przedstawiony w tym artykule dla testu wydajności Rotarod, używanego do pomiaru postępującej niepełnosprawności neurologicznej u myszy zakażonych TMEV.

Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena postępującego upośledzenia neurologicznego u myszy z przewlekłymi chorobami demielinizacyjnymi. Osiągamy to poprzez przedstawienie zaleceń dotyczących parametrów testowych odpowiednich do badania długotrwałej niepełnosprawności neurologicznej w modelu postępującej stwardnienia rozsianego wywołanego wirusem Theilera, z wykorzystaniem testu Rotarod. Procedura ta stanowi punkt odniesienia do oceny zasadności zastosowania modelu mysiego w badaniu postępującej demielinizacji oraz jego przydatności do testowania terapii ukierunkowanych na leczenie postępujących schorzeń neurologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane.Przewagą tego zoptymalizowanego testu nad tradycyjnym systemem oceny wizualnej jest to, że generuje on obiektywną zmienną pozwalającą na ilościowe określenie długoterminowego wpływu terapii i procedur eksperymentalnych na funkcje motoryczne. Procedurę tę zaprezentuje Darlene Royce, technik z laboratorium neuroimmunologii w Dartmouth. Aby ocenić wyjściową koordynację równowagi i kontrolę motoryczną, należy rozpocząć protokół adaptacyjny na pięć dni przed infekcją TMEV, pozwalając myszom na aklimatyzację w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut.Podczas gdy myszy aklimatyzują się, należy wstępnie zaprogramować Rotarod, ustawiając parametry treningowe na minus pięć DPI. Następnie należy chwycić mysz za ogon i umieścić ją na pręcie, tyłem do operatora. Jeśli mysz spadnie lub zeskoczy, należy ją umieścić z powrotem w jej torze na Rotarodzie, aż wszystkie myszy znajdą się na swoich pozycjach.Po umieszczeniu wszystkich czterech myszy, naciśnij przycisk enter, aby rozpocząć eksperyment. Upewnij się, że pomiary czasu rozpoczęły się automatycznie i obserwuj liczbę obrotów na minutę wyświetlaną dla każdego toru. Następnie, w momencie spadnięcia każdego zwierzęcia z pręta, zanotuj prędkość pręta w chwili upadku oraz czas, przez który zwierzę utrzymywało się na pręcie.Po spadnięciu wszystkich myszy należy za pomocą chusteczki usunąć z pręta wszelkie grudki kału oraz mocz, ponieważ obecność moczu i materiału kałowego może wpływać na zdolność myszy do prawidłowego chwytania pręta. Po trzech minutach odpoczynku przeprowadza się drugą, a następnie trzecią próbę, w której maksymalny czas pojedynczej próby wynosi 240 sekund. W każdym dniu testowania należy przeprowadzić łącznie trzy próby.Na koniec należy przenieść myszy z powrotem do ich klatki domowej. W dniach minus cztery, minus trzy, minus dwa i minus jeden przed indukcją (PI), należy zaprogramować Rotarod zgodnie z odpowiednimi parametrami protokołu treningowego i powtórzyć eksperyment na Rotarodzie. Należy rozpocząć od przeniesienia klatek z samicami myszy SJL w wieku od czterech do sześciu tygodni ze stojaka do wygodnej przestrzeni roboczej.Użyj dziurkacza do uszu, aby oznakować myszy, co umożliwi indywidualną ocenę zmian klinicznych i histologicznych. Następnie nabierz 30 µL roztworu zakaźnego TMEV w PBS do igły strzykawki insulinowej o rozmiarze 29 G. Przygotuj aparat do znieczulenia gazowego, upewniając się, że dostępna jest wystarczająca ilość tlenu i izofluranu na cały czas trwania procedury.Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i szczelnie zamknij górną pokrywę. Po kilku minutach wyjmij zwierzę z komory i sprawdź stopień znieczulenia myszy, uciskając opuszkę stopy, aby upewnić się, że znieczulenie jest wystarczające. Następnie oczyść miejsce wstrzyknięcia 70% isopropyl alcohol i wstrzyknij 30 µL zawiesiny zakaźnej TMEV do prawej półkuli mózgu metodą wstrzykiwania wolnoręcznego.Na koniec, gdy mysz będzie w pełni przytomna i mobilna, należy przenieść ją z powrotem do klatki hodowlanej. Siódmego dnia po infekcji należy zaprogramować Rotarod z odpowiednimi parametrami eksperymentalnymi i powtórzyć pełny cykl treningowy na Rotarod zgodnie z odpowiednimi parametrami protokołu eksperymentalnego. Po trzeciej próbie każdego dnia należy zważyć każdą mysz i zapisać masę ciała w arkuszu danych.Przez następne sześć tygodni testuj myszy dwa razy w tygodniu w ten sam sposób. Po sześciu tygodniach testuj myszy raz w tygodniu, stosując ten sam protokół eksperymentalny, przez średnio 150 dni eksperymentalnych. Następnie przeanalizuj surowe dane i wyraź je jako wskaźnik funkcji neurologicznych, lub NFI.Aby określić indywidualną wartość NFI, należy obliczyć bazowy próg wydajności każdej myszy jako średnią wszystkich czasów biegu od 15. do 45. dnia po infekcji. Pozwala to na ocenę sprawności motorycznej w wyniku postępującej demielinizacji i wykluczenie ewentualnych deficytów wynikających z wczesnego zapalenia mózgu. Następnie należy obliczyć wartość NFI jako średnią z trzech ostatnich średnich czasów biegu podzieloną przez bazowy próg wydajności danej myszy.Na koniec oblicz skorygowany NFI, dzieląc wartość NFI przez średnią wartość NFI uzyskaną w grupie poddanej zabiegowi pozorowanemu (sham) w danym dniu. Rysunek ten pokazuje, że u myszy zakażonych TMEV występuje znaczący wzrost deficytów neurologicznych w czasie w porównaniu z myszami kontrolnymi. Przewlekła infekcja dwoma różnymi szczepami TMEV negatywnie wpłynęła na czasy biegu myszy.Obie grupy myszy zainfekowanych TMEV wykazywały znacznie niższe wartości NFI niż myszy z grupy kontrolnej (sham). Co więcej, we wszystkich punktach czasowych nie stwierdzono różnic w progresji niepełnosprawności między myszami zainfekowanymi szczepem BeAn a tymi zainfekowanymi szczepem DA. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować tradycyjne metody oceny wizualnej, takie jak test odruchu prostowania, w celu szybkiej oceny ogólnego stanu zdrowia myszy.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie stwardnienia rozsianego i chorób neurodegeneracyjnych do testowania skuteczności terapii i innych interwencji w opóźnianiu postępującej niepełnosprawności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać długotrwałą postępującą niepełnosprawność u myszy. Procedura ta jest przydatna nie tylko w wykrywaniu postępującej niepełnosprawności neurologicznej w modelu wirusa Theiler, ale również w ujawnianiu zaburzeń w innych modelach mysich chorób neurodegeneracyjnych.

measuring-progressive-neurological-disability-mouse-model-multiple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono protokoły dla dwóch uznanych zadań koordynacji ruchowej: rotarod z przyspieszeniem oraz poprzecznej belki, a także dwóch testów opracowanych niedawno w Oxfordzie: prętów statycznych i równoległych drążków. Testy te pozwalają wykryć zaburzenia motoryczne, które mogą być istotne same w sobie, a także mogą stanowić zmienne w badaniach nad innymi obszarami zachowania.

Pomiar koordynacji ruchowej u myszy

Model mysi stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) poddano badaniu klinicznemu i behawioralnemu. Jako warunek wstępny dla towarzyszącej analizy immunohistologicznej szczegółowo przedstawiono przygotowanie rdzenia kręgowego.

Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Precyzyjny pomiar neurologicznego i neuropsychologicznego upośledzenia i niepełnosprawności w stwardnieniu rozsianym jest wyzwaniem. Przedstawiamy szczegóły metodologiczne dotyczące nowego testu, Testu Wydajności Stwardnienia Rozsianego (MSPT). To nowe podejście do celu, jakim jest kwantyfikacja niepełnosprawności związanej ze stwardnieniem rozsianym, stanowi platformę komputerową do precyzyjnego i wiarygodnego pomiaru ciężkości stwardnienia rozsianego.

Test wydajności stwardnienia rozsianego (MSPT): narzędzie do oceny niepełnosprawności oparte na iPadzie

Ten protokół wideo opisuje czułą, niezawodną i szybką metodę oceny deficytów nerwowo-mięśniowych w transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego.

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Analiza chodu kinematycznego w płaszczyźnie strzałkowej dostarcza bardzo precyzyjnych informacji o tym, jak wykonywany jest ruch. Opisujemy zastosowanie tych technik do identyfikacji deficytów chodu u myszy poddanych demielinizacji o podłożu autoimmunologicznym. Metody te mogą być również wykorzystane do scharakteryzowania deficytów chodu dla innych modeli myszy z upośledzoną lokomocją.

Analiza kinematyczna chodu w płaszczyźnie strzałkowej u myszy C57BL/6 poddanych eksperymentalnemu autoimmunologicznemu zapaleniu mózgu i rdzenia wywołanemu MOG35-55

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Dostarczono eksperymentalny potok do ilościowego opisu wzorca lokomotorycznego swobodnie chodzących myszy za pomocą zestawu narzędzi MouseWalker (MW), począwszy od wstępnych nagrań wideo i śledzenia, a skończywszy na analizie po kwantyfikacji. W celu wykazania użyteczności systemu MW wykorzystano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy.

Wykorzystanie MouseWalker do ilościowego określenia dysfunkcji lokomotorycznej w mysim modelu urazu rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Ten artykuł przedstawia protokół realizacji wysoce translacyjnej i niezależnie sprawdzonej koncepcji mysiej jednostki uderzenia (mSU) u myszy o dużym skoku. Zapewnia również ustandaryzowany protokół wykonywania ogniskowej eksperymentalnej skali udaru u myszy, która ocenia deficyty ogniskowe udaru wykryte nawet długotrwale.

Protokół jednostki udaru myszy ze standaryzowaną punktacją neurologiczną do translacyjnych badań udarów myszy

Poznaj zoptymalizowany test Rotarod do oceny postępującej niepełnosprawności neurologicznej u myszy zakażonych wirusem TMEV. Ta metoda zapewnia obiektywną kwantyfikację funkcji motorycznych w modelu stwardnienia rozsianego.

Pomiar postępującej niepełnosprawności neurologicznej w mysim modelu stwardnienia rozsianego

Przeglądaj więcej filmów