Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Uwalnianie pułapek zewnątrzkomórkowych przez neutrofile i inne komórki odpornościowe jest ważne dla odporności wrodzonej, ale także silnie związane z patologiami zapalnymi. Bardzo niewiele wiadomo na temat tego procesu w makrofagach, chociaż komórki te odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi zapalnej. Protokół ten zapewnia pierwotny ludzki model in vitro pułapki zewnątrzkomórkowej makrofagów lub uwalniania mastu.

Stanowi on dla nas model do badania potencjalnego fizjologicznego wzrostu tej struktury in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki z tego protokołu są komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z preparatów ludzkiego kożuchowca. Nie jest wymagany etap przygotowania do różnicowania monocytów w makrofagi, co kontrastuje z innymi liniami komórkowymi monocytów, takimi jak linia komórkowa THP-1.

Protokół ten można łatwo dostosować do innych komórek odpornościowych, w tym izolowanych neutrofili i mikrogleju. Pułapki zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez makrofagi są bardzo delikatne, dlatego należy zachować ostrożność między krokami, aby zachować integralność zabarwionych pułapek. W sterylnych warunkach przygotuj pożywkę gruntującą M1, dodając do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640 interferon gamma do stężenia 20 nanogramów na mililitr i lipopolisacharyd do stężenia jednego mikrograma na mililitr.

Przygotować pożywkę gruntującą M2, dodając interleukinę 4 do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640 do stężenia 20 nanogramów na mililitr. W sterylnych warunkach odessać pożywkę z dołków z nasionami i kulturą tkankową zawierających HMDM. Ostrożnie dodaj do każdej studzienki jeden mililitr sterylnego PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza.

Usuń bufor PBS i umyj go jeszcze dwa razy. Dodaj jeden mililitr pożywki gruntującej M1 lub M2 do każdej studzienki zawierającej HMDM. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym.

W sterylnych warunkach przygotuj pożywki hodowlane zawierające różne stymulatory uwalniania MET do kompletnej pożywki RPMI-1640. Do eksperymentów ze stymulacją kwasu podchlorawego przygotuj 200 mikromolowy kwas podchlorawy w probówce Falcona z HBSS, która została wstępnie podgrzana do 37 stopni Celsjusza. Po zabiegu polaryzacji odessać pożywkę komórkową z każdej studzienki i ostrożnie umyć komórki trzykrotnie mililitrowymi porcjami sterylnego PBS do stymulacji PMA, TNF alfa i interleukiny 8 lub HBSS do stymulacji kwasem podchlorawym.

Po usunięciu PBS w ostatnim etapie mycia, dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki zawierającej PMA, TNF alfa lub interleukinę 8. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym przez sześć godzin w przypadku stymulacji TNF alfa i 24 godziny w przypadku stymulacji PMA lub interleukiny 8. W przypadku eksperymentów z kwasem podchlorawym, po usunięciu HBSS w ostatnim etapie mycia, dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego kwasu podchlorawego.

Następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym. Następnie ostrożnie odessać supernatant komórek i umyć komórki trzykrotnie mililitrowymi porcjami HBSS. Po usunięciu HBSS z ostatniego etapu mycia, dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640.

Następnie inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym. Przygotuj zielony barwnik SYTOX w HBSS o stężeniu 40 mikromolowym. Bezpośrednio dodaj 25 mikrolitrów barwnika do każdej studzienki zawierającej HMDM.

Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności. Następnie umieść HMDM w studzienkach do hodowli tkankowych na stoliku mikroskopowym odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania. Włącz fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum działania, źródło światła jasnego pola i odwrócony mikroskop zainstalowany z kolorową kamerą cyfrową o wysokiej rozdzielczości.

Obróć koło filtra do pozycji numer dwa dla zielonej fluorescencji ze wzbudzeniem na 504 nanometrach i wymiarach na 523 nanometrach. Korzystając z obiektywu 5X, ustaw ostrość obrazu za pomocą zgrubnej ostrości, a następnie pokrętła precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry. Przełącz mikroskop w tryb aparatu.

Uruchom skojarzone oprogramowanie. Kliknij przycisk Odtwórz, aby wyświetlić podgląd obrazu i wyreguluj pokrętło precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry w oknie podglądu oprogramowania. Kliknij przycisk Przechwyć.

W oprogramowaniu kliknij Plik. Zapisz jako wymagany typ pliku obrazu. W mikroskopie obróć koło filtra do pozycji numer pięć w celu obrazowania w jasnym polu i powtórz procedury przechwytywania, aby uzyskać odpowiedni obraz w jasnym polu.

Pokazano tu obrazy w jasnym polu pokazujące zmiany morfologiczne HMDM w odpowiedzi na bodźce. Makrofagi spolaryzowane M1 z eksperymentów z HMDM wystawione na działanie interferonu gamma i lipopolisacharydu wykazały wydłużony i wrzecionowaty kształt komórki. Dla porównania, morfologia makrofagów spolaryzowanych M2 po ekspozycji HMDM na interleukinę 4 przez 48 godzin była zazwyczaj okrągła i płaska.

Zdolność zróżnicowanych fenotypów HMDM do uwalniania MET została uwidoczniona za pomocą obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek za pomocą SYTOX green. Kontrola uzyskana z każdego fenotypu HMDM inkubowanego przez 24 godziny przy braku jakichkolwiek bodźców prozapalnych wykazała bardzo ograniczone zabarwienie na zielono. Dodatnie barwienie dla METs, pokazane jako zielone smugi, osiągnięto po ekspozycji M1-HMDM na kwas podchlorawy, PMA, interleukinę 8 lub TNF alfa.

Obecność niektórych zielonych zabarwień widocznych w komórkach odzwierciedla utratę integralności błony, która może wynikać ze śmierci komórki, która jest niezależna od uwolnienia pułapki zewnątrzkomórkowej. Eksperymenty przeprowadzone na M2-HMDM wystawionych na działanie interleukiny 4 nie wykazały uwalniania DNA z komórek, na co wskazuje brak nici lub pasm zewnątrzkomórkowego DNA. Stwierdzono jednak pewien wychwyt komórkowy zielonego barwnika fluorescencyjnego z kwasem podchlorawym i TNF alfa.

Ważne jest, aby unikać bezpośredniego jasnego światła, które może prześwietlić plamy przed obrazowaniem. Zewnątrzkomórkowe DNA można określić ilościowo za pomocą analizy qPCR na jądrowym i mitochondrialnym DNA obecnym w supernatancie komórki. Dalsza charakterystyka struktury mastucji i jej roli w przewlekłym zapaleniu za pomocą HMDM może być bardziej istotna klinicznie w porównaniu z innymi unieśmiertelnionymi magazynami makrofagów linii komórkowych.