Name: Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę stymulacji i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów. Technika wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do badania odpowiedzi zapalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) oraz Novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ potwierdza również otrzymanie australijskiej nagrody podyplomowej przyznanej przez Uniwersytet w Sydney. Chcielibyśmy podziękować Panu Patowi Pisansarakit i Pani Morgan Jones za pomoc w izolacji monocytów i hodowli tkankowej.

HMDM zostali odizolowani od preparatów do kożucha ludzkiego dostarczanych przez bank krwi z aprobatą etyczną Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney.
1. Kultura HMDM
<ol>
	<li>Wyizolować monocyty z preparatów kożuchy przygotowanych z krwi obwodowej zdrowych dawców ludzkich przy użyciu dostępnego na rynku preparatu do izolacji limfocytów, a następnie przeprowadzić przeciwprądową elutriację odśrodkową19,20.</li>
	<li>Potwierdź obecność monocytów poprzez cytoprzędzenie i barwienie zmodyfikowanym barwnikiem Giemsa do charakterystyki monocytów19.</li>
	<li>W sterylnych warunkach dostosuj gęstość monocytów do 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki RPMI-1640 bez surowicy. Dodać 1 ml tej zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 12-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Hodowla w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 2 godziny w celu ułatwienia przylegania do płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>W sterylnych warunkach usuń pożywkę komórkową i zastąp ją kompletną pożywką hodowlaną RPMI-1640 zawierającą 10% (v/v) zebranej ludzkiej surowicy i 20 mM L-glutaminy.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym przez 8 dni, zmieniając pożywkę co 2 dni.</li>
</ol>
2. Polaryzacja HMDM
<ol>
	<li>W sterylnych warunkach przygotować pożywkę gruntującą M1, dodając γ interferonu (IFNγ; 20 ng/ml) i lipopolisacharyd (LPS; 1 μg/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Przygotować pożywkę kondycyjną M2, dodając interleukinę 4 (IL-4; 20 ng/ml) do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640.</li>
	<li>W sterylnych warunkach należy odsysać pożywkę z dołków na płytki do hodowli tkankowych, które zawierają HMDM, które zostały wysiane i wyhodowane zgodnie z opisem w sekcji 1.</li>
	<li>Ostrożnie umyć studzienki zawierające komórki 3x sterylnym PBS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), używając 1 ml porcji PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki gruntującej M1 lub M2 do każdej studzienki zawierającej HMDM (w zależności od tego, która z nich jest odpowiednia dla eksperymentu).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.</li>
</ol>
3. Stymulacja HMDM w celu wywołania uwolnienia MET
<ol>
	<li>W sterylnych warunkach przygotuj pożywki hodowlane zawierające różne stymulatory uwalniania MET (w zależności od tego, który jest odpowiedni dla eksperymentu) do kompletnych pożywek RPMI-1640: PMA (25 nM), ludzki rekombinowany TNFα (25 ng / ml) lub ludzka rekombinowana IL-8 (50 ng / ml).</li>
	<li>W przypadku eksperymentów ze stymulacją HOCl należy przygotować HOCl (200 μM) w HBSS (wstępnie podgrzanym do 37 °C), bezpośrednio przed dodaniem do komórek. Upewnij się, że HOCl nie jest przygotowany w kompletnym nośniku komórkowym. 
	nuta: Stężenie roztworu podstawowego HOCl określa się ilościowo, mierząc absorbancję UV roztworu przy 292 nm i pH = 116 i stosując współczynnik ekstynkcji 350 M-1 cm-1 21.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu polaryzacji opisanej w sekcji 2, należy odessać pożywkę komórkową z każdej studzienki i ostrożnie przemyć komórki 3x podwielokrotnościami po 1 ml jałowego PBS (dla PMA, TNFα i IL-8) lub HBSS (dla HOCl), które zostały wstępnie podgrzane do 37 °C.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z PMA, TNFα lub IL-8: dodać 1 ml kompletnej pożywki zawierającej PMA, TNFα lub IL-8 po usunięciu PBS w końcowym etapie mycia.</li>
	<li>W przypadku doświadczeń z TNFα inkubować komórki przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym. W przypadku doświadczeń z PMA i IL-8 inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.</li>
	<li>W przypadku eksperymentów z HOCl dodaj 1 ml HOCl do HBSS po usunięciu HBSS w końcowym etapie mycia. Następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.
	<ol>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant komórek i przemyć komórki 3x 1 ml porcji HBSS, jak opisano w kroku 3.3.</li>
		<li>Po wyjęciu HBSS z ostatniego etapu mycia, dodaj 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640. Następnie inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 w inkubatorze komórkowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wizualizacja MET w żywej hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przygotować zielony barwnik SYTOX w HBSS o stężeniu 40 μM.</li>
	<li>Pod koniec zabiegów opisanych w sekcji 3 w celu wywołania uwalniania MET, należy bezpośrednio dodać 25 μl z 40 μM barwnika do każdej studzienki zawierającej HMDM.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut w ciemności.</li>
	<li>Umieścić HMDM w studzienkach do hodowli tkankowych na stoliku mikroskopu odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania.</li>
	<li>Zabiegi mikroskopowe
	<ol>
		<li>Włącz fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum działania, źródło światła jasnego pola i mikroskop odwrócony zainstalowany z kolorową kamerą cyfrową o wysokiej rozdzielczości (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Obrócić koło filtra do pozycji "numer 2" dla zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 504 nm, emisja = 523 nm) do obrazowania próbek barwionych na zielono zawartych w studzienkach do hodowli tkankowych.</li>
		<li>Korzystając z obiektywu 5x, ustaw ostrość obrazu za pomocą zgrubnej ostrości, a następnie pokręteł precyzyjnego ustawiania ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry, gdy będzie oglądany przez okular mikroskopu.</li>
		<li>Przełącz mikroskop w tryb aparatu.</li>
		<li>Uruchom skojarzone oprogramowanie.</li>
		<li>Wybierz kartę Przechwytywanie w oprogramowaniu.</li>
		<li>Kliknij przycisk Odtwórz, aby wyświetlić podgląd obrazu i wyreguluj pokrętło precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry w oknie podglądu oprogramowania.</li>
		<li>Kliknij przycisk Przechwyć. 
		nuta: Przechwycony obraz zostanie automatycznie wyświetlony w dołączonym oprogramowaniu.</li>
		<li>W oprogramowaniu kliknij Plik | Zapisz jako wymagany typ pliku obrazu.</li>
		<li>W mikroskopie obróć koło filtra do pozycji "numer 5" do obrazowania w jasnym polu i powtórz kroki 4.5.2–4.5.9, aby uzyskać odpowiedni obraz w jasnym polu.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.5.2–4.5.10 w razie potrzeby w celu późniejszego uzyskania obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639(2009).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Keshari, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+induced+neutrophil+extracellular+traps+formation%3A+implication+for+the+inflammatory+disease+condition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition.</a> PLoS One. 7 (10), 48111(2012).</li>
<li>Rayner, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hypochlorous+acid+%28HOCl%29+and+other+inflammatory+mediators+in+the+induction+of+macrophage+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traps+and+hyperinflammation+-+new+ways+that+neutrophils+promote+or+hinder+survival%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival.</a> British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+reduces+vascular+damage+and+modulates+innate+immune+responses+in+murine+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis.</a> Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).</li>
<li>Megens, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+luminal+neutrophil+extracellular+traps+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).</li>
<li>Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Footprints+of+neutrophil+extracellular+traps+as+predictors+of+cardiovascular+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).</li>
<li>Goldmann, O., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+world+of+extracellular+traps%3A+not+only+neutrophils+but+much+more%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more.</a> Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>Pertiwi, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+derived+from+macrophages%2C+mast+cells%2C+eosinophils+and+neutrophils+are+generated+in+a+time-dependent+manner+during+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis.</a> Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).</li>
<li>Okubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+extracellular+trap+formation+promoted+by+platelet+activation+is+a+key+mediator+of+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).</li>
<li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+NET+or+not+to+NET%3Acurrent+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li>
<li>Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Extracellular+Traps%3A+A+Scoping+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review.</a> Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668(2010).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+low-density+lipoprotein+results+in+the+time-dependent+accumulation+of+cholesteryl+esters+and+apolipoprotein+B-100+protein+in+primary+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages.</a> FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).</li>
<li>Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophage-mediated+oxidation+of+low-density+lipoprotein+is+delayed+and+independant+of+superoxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production.</a> Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).</li>
<li>Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acid+ionization+constant+of+HOCl+from+5+%C2%B0C+to+35+%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phyical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C.</a> Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).</li>
<li>Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pivotal+role+for+NF-kappaB+in+the+macrophage+inflammatory+response+to+the+myeloperoxidase+oxidant+hypothiocyanous+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).</li>
<li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Generowanie i wizualizacja powstawania MET przy użyciu zróżnicowanych M1 HMDM stanowi nowy model in vitro, który może być przydatny do badania potencjalnej patologicznej roli tych struktur makrofagów, szczególnie w przewlekłych stanach zapalnych. Zapewnia solidny protokół stymulacji pierwotnych ludzkich makrofagów do uwalniania MET, który może być również wykorzystany w powiązanych badaniach z ludzkimi liniami komórkowymi monocytów lub mysich makrofagów. Pomyślne wdrożenie tego protokołu do stymulacji tworzenia MET przez...

Uwolnienie ET z neutrofili zostało po raz pierwszy zidentyfikowane jako wrodzona odpowiedź immunologiczna wywołana przez infekcję bakteryjną1. Składają się ze szkieletu DNA, z którym związane są różne ziarniste białka o właściwościach przeciwbakteryjnych, w tym elastaza neutrofilowa i mieloperoksydaza2. Podstawową rolą neutrofili ET (NET) jest wychwytywanie patogenów i ułatwianie ich eliminacji3. Jednak oprócz ochronnej roli ET w obronie immunologicznej, coraz więcej badań odkrywa również rolę w patogenezie chorób, szczególnie podczas rozwoju chorób wywołanych stanem zapalnym (tj. reumatoidalne zapalenie stawów i miażdżyca4). Uwalnianie ET może być wywołane przez różne cytokiny prozapalne, w tym interleukinę 8 (IL-8) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα)5,6, a zlokalizowane nagromadzenie ET może zwiększyć uszkodzenie tkanek i wywołać reakcję prozapalną7. Na przykład, istoty pozaziemskie są zaangażowane jako odgrywające przyczynową rolę w rozwoju miażdżycy8, promując zakrzepicę9 i przewidując ryzyko sercowo-naczyniowe10.
Teraz uznaje się, że oprócz neutrofili, inne komórki odpornościowe (np. komórki tuczne, eozynofile i makrofagi) mogą również uwalniać ET po ekspozycji na stymulację mikrobiologiczną lub prozapalną11,12. Może to być szczególnie istotne w przypadku makrofagów, biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w rozwoju, regulacji i rozwiązywaniu przewlekłych chorób zapalnych. Dlatego ważne jest, aby lepiej zrozumieć potencjalny związek między uwalnianiem ET z makrofagów a rozwojem chorób związanych ze stanem zapalnym. Ostatnie badania wykazały obecność MET i NET w nienaruszonych ludzkich blaszkach miażdżycowych i zorganizowanych skrzeplinach13. Podobnie, MET są zaangażowane w prowadzenie do uszkodzenia nerek poprzez regulację reakcji zapalnych14. Jednak w przeciwieństwie do neutrofili istnieją ograniczone dane na temat mechanizmów powstawania MET z makrofagów. Ostatnie badania z wykorzystaniem ludzkich modeli powstawania MET in vitro pokazują pewne różnice w szlakach zaangażowanych w każdy typ komórki (tj. w odniesieniu do braku cytrulinacji histonów z makrofagami)6. Jednak niektóre wykazały, że uwolnienie NET może również wystąpić przy braku cytrulinacji histonów15.
Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie prostej i bezpośredniej metody oceny uwalniania MET w klinicznie istotnym modelu makrofagów. Istnieje wiele różnych modeli komórek makrofagów in vitro, które zostały wykorzystane do badania MET (tj. linii komórkowej ludzkich monocytów THP-1 i różnych linii komórek mysich makrofagów)16. Istnieją pewne ograniczenia związane z tymi modelami. Na przykład różnicowanie monocytów THP-1 do makrofagów zwykle wymaga etapu primingu, takiego jak dodanie octanu mirystynianu forbolu (PMA), który sam aktywuje szlaki zależne od kinazy białkowej C (PKC). Wiadomo, że ten proces wyzwala uwalnianie ET 4 i powoduje niskie podstawowe uwalnianie MET z komórek THP-1. Inne badania wykazały pewne różnice w bioaktywności i reakcjach zapalnych wywoływanych przez makrofagi in vivo w porównaniu z komórkami THP-1 traktowanymi PMA17.
Podobnie, zachowanie i reakcje zapalne różnych linii komórkowych podobnych do mysich makrofagów nie reprezentują w pełni spektrum odpowiedzi pierwotnych makrofagów ludzkich18. Dlatego, w celu zbadania tworzenia makrofagów ET w warunkach klinicznych, uważa się, że pierwotne makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów (HMDM) są bardziej odpowiednim modelem niż monocytowe lub mysie linie komórkowe podobne do makrofagów.
ET uwalnianie z HMDM spolaryzowanych M1 zostało wykazane po ekspozycji tych komórek na szereg różnych bodźców zapalnych, w tym oksydacyjny kwas podchlorawy pochodzący z mieloperoksydazy, PMA, TNFα i IL-86. Opisano tutaj protokół polaryzacji HMDM do fenotypu M1 i wizualizacji późniejszego uwolnienia MET po ekspozycji na te bodźce zapalne. PMA jest stosowany jako bodziec uwalniania MET, aby ułatwić porównania z poprzednimi badaniami, w których wykorzystano neutrofile. Co ważne, HOCl, IL-8 i TNFα są również wykorzystywane do stymulowania uwalniania MET, które uważa się za lepsze modele środowiska zapalnego in vivo. Mikroskopowa metoda wizualizacji uwalniania ET polega na barwieniu zewnątrzkomórkowego DNA w żywych kulturach komórkowych przy użyciu SYTOX green, nieprzepuszczalnego fluorescencyjnego zielonego barwnika kwasem nukleinowym, który został z powodzeniem zastosowany w poprzednich badaniach neutrofili. Metoda ta pozwala na szybką i jakościową ocenę uwalniania istot pozaziemskich, ale nie jest odpowiednia jako samodzielna metoda do ilościowego określania zakresu uwolnienia istot pozaziem. Alternatywna metodologia powinna być stosowana, jeżeli wymagana jest kwantyfikacja w celu porównania zakresu uwalniania ET wynikającego z różnych warunków leczenia lub interwencji.

<table><tbody><tr><td>Fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum 120Q</td><td>EXFO Photonic Solutions, Toronto, Kanada</td><td></td><td>Seria x-cite</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Płytka wielodołkowa (12 dołków)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3336</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Różnicowy zestaw barwników Quik (zmodyfikowany Giemsa)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>24606</td><td>Charakterystyka monocytów</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14025050</td><td>Do etapów mycia i leczenia HOCl</td></tr><tr><td>Kwas podchlorawy (HOCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Do stymulacji MET</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PMC4031</td><td>Do gruntowania M1</td></tr><tr><td>Interleukina 4</td><td>Nauki zintegrowane</td><td>rhil-4</td><td>Do gruntowania M2</td></tr><tr><td>Interleukina 8</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-943</td><td>Do stymulacji MET</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59202C</td><td>Dodawany do pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych Lipopolisacharyd</td><td>Nauki zintegrowane</td><td>tlrl-eblps Do</td><td>gruntowania M1</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield PoC AS</td><td>1114544</td><td>Do izolacji monocytów</td></tr><tr><td>Olympus IX71 odwrócony mikroskop</td><td>Olympus, Tokio, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octan (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Do stymulacji MET</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>Do etapów mycia</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>SYTOX zielony</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>Dla MET wizulaizacja</td></tr><tr><td>TH4-200 źródło światła jasnego pola</td><td>Olimp, Tokio, Japonia</td><td></td><td>seria x-cite</td></tr><tr><td>Czynnik martwicy nowotworu alfa</td><td>Lonza</td><td>300-01A-50</td><td>Do stymulacji MET</td></tr></tbody></table>

stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Uwalnianie pułapek zewnątrzkomórkowych (ET) przez neutrofile zostało zidentyfikowane jako czynnik przyczyniający się do rozwoju chorób związanych z przewlekłym stanem zapalnym. Neutrofile ET (NET) składają się z siatki DNA, białek histonowych i różnych białek ziarnistych (tj. mieloperoksydazy, elastazy i katepsyny G). Inne komórki odpornościowe, w tym makrofagi, mogą również wytwarzać ET; jednak w jakim stopniu dzieje się to in vivo i czy pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów (MET) odgrywają rolę w mechanizmach patologicznych, nie zostało szczegółowo zbadane. Aby lepiej zrozumieć rolę MET w patologiach zapalnych, opracowano protokół wizualizacji uwalniania MET z pierwotnych ludzkich makrofagów in vitro, który można również wykorzystać w eksperymentach immunofluorescencyjnych. Pozwala to na dalszą charakterystykę tych struktur i porównanie ich z istotami pozaziem uwalnianymi z neutrofili. Ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów (HMDM) wytwarzają MET po ekspozycji na różne bodźce zapalne po różnicowaniu do fenotypu prozapalnego M1. Uwalnianie MET można uwidocznić za pomocą mikroskopii przy użyciu zielonego fluorescencyjnego barwnika kwasem nukleinowym, który jest nieprzepuszczalny dla żywych komórek (np. zielony SYTOX). Stosowanie świeżo wyizolowanych pierwotnych makrofagów, takich jak HMDM, jest korzystne w modelowaniu zdarzeń zapalnych in vivo, które są istotne dla potencjalnych zastosowań klinicznych. Protokół ten może być również wykorzystany do badania uwalniania MET z ludzkich linii komórkowych monocytów (np. THP-1) po różnicowaniu do makrofagów z octanem mirystynianu forbolu lub innych linii komórkowych makrofagów (np. mysich komórek podobnych do makrofagów J774A.1).

Obrazy w polu jasnym przedstawiające zmiany morfologiczne HMDM w odpowiedzi na bodźce różnicowania komórkowego pokazano na Rysunku 1. Makrofagi spolaryzowane do fenotypu M1 z eksperymentów z HMDM poddanymi działaniu IFNγ i LPS wykazywały wydłużony, wrzecionowaty kształt komórek, co zaznaczono czarnymi strzałkami na Rysunku 1 (środkowy panel). Dla porównania, morfologia makrofagów spolaryzowanych do fenotypu M2 po ekspozycji HMDM na IL-4 przez 48 h była typowo ok...

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Uwalnianie pułapek zewnątrzkomórkowych przez neutrofile i inne komórki odpornościowe jest ważne dla odporności wrodzonej, ale także silnie związane z patologiami zapalnymi. Bardzo niewiele wiadomo na temat tego procesu w makrofagach, chociaż komórki te odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi zapalnej. Protokół ten zapewnia pierwotny ludzki model in vitro pułapki zewnątrzkomórkowej makrofagów lub uwalniania mastu.Stanowi on dla nas model do badania potencjalnego fizjologicznego wzrostu tej struktury in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki z tego protokołu są komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z preparatów ludzkiego kożuchowca. Nie jest wymagany etap przygotowania do różnicowania monocytów w makrofagi, co kontrastuje z innymi liniami komórkowymi monocytów, takimi jak linia komórkowa THP-1.Protokół ten można łatwo dostosować do innych komórek odpornościowych, w tym izolowanych neutrofili i mikrogleju. Pułapki zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez makrofagi są bardzo delikatne, dlatego należy zachować ostrożność między krokami, aby zachować integralność zabarwionych pułapek. W sterylnych warunkach przygotuj pożywkę gruntującą M1, dodając do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640 interferon gamma do stężenia 20 nanogramów na mililitr i lipopolisacharyd do stężenia jednego mikrograma na mililitr.Przygotować pożywkę gruntującą M2, dodając interleukinę 4 do kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640 do stężenia 20 nanogramów na mililitr. W sterylnych warunkach odessać pożywkę z dołków z nasionami i kulturą tkankową zawierających HMDM. Ostrożnie dodaj do każdej studzienki jeden mililitr sterylnego PBS podgrzanego do 37 stopni Celsjusza.Usuń bufor PBS i umyj go jeszcze dwa razy. Dodaj jeden mililitr pożywki gruntującej M1 lub M2 do każdej studzienki zawierającej HMDM. Inkubować komórki przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym.W sterylnych warunkach przygotuj pożywki hodowlane zawierające różne stymulatory uwalniania MET do kompletnej pożywki RPMI-1640. Do eksperymentów ze stymulacją kwasu podchlorawego przygotuj 200 mikromolowy kwas podchlorawy w probówce Falcona z HBSS, która została wstępnie podgrzana do 37 stopni Celsjusza. Po zabiegu polaryzacji odessać pożywkę komórkową z każdej studzienki i ostrożnie umyć komórki trzykrotnie mililitrowymi porcjami sterylnego PBS do stymulacji PMA, TNF alfa i interleukiny 8 lub HBSS do stymulacji kwasem podchlorawym.Po usunięciu PBS w ostatnim etapie mycia, dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki zawierającej PMA, TNF alfa lub interleukinę 8. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym przez sześć godzin w przypadku stymulacji TNF alfa i 24 godziny w przypadku stymulacji PMA lub interleukiny 8. W przypadku eksperymentów z kwasem podchlorawym, po usunięciu HBSS w ostatnim etapie mycia, dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego kwasu podchlorawego.Następnie inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym. Następnie ostrożnie odessać supernatant komórek i umyć komórki trzykrotnie mililitrowymi porcjami HBSS. Po usunięciu HBSS z ostatniego etapu mycia, dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki hodowlanej RPMI-1640.Następnie inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla w inkubatorze komórkowym. Przygotuj zielony barwnik SYTOX w HBSS o stężeniu 40 mikromolowym. Bezpośrednio dodaj 25 mikrolitrów barwnika do każdej studzienki zawierającej HMDM.Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności. Następnie umieść HMDM w studzienkach do hodowli tkankowych na stoliku mikroskopowym odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania. Włącz fluorescencyjne źródło światła o szerokim spektrum działania, źródło światła jasnego pola i odwrócony mikroskop zainstalowany z kolorową kamerą cyfrową o wysokiej rozdzielczości.Obróć koło filtra do pozycji numer dwa dla zielonej fluorescencji ze wzbudzeniem na 504 nanometrach i wymiarach na 523 nanometrach. Korzystając z obiektywu 5X, ustaw ostrość obrazu za pomocą zgrubnej ostrości, a następnie pokrętła precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry. Przełącz mikroskop w tryb aparatu.Uruchom skojarzone oprogramowanie. Kliknij przycisk Odtwórz, aby wyświetlić podgląd obrazu i wyreguluj pokrętło precyzyjnej ostrości na mikroskopie, aż obraz będzie ostry, wyraźny i ostry w oknie podglądu oprogramowania. Kliknij przycisk Przechwyć.W oprogramowaniu kliknij Plik. Zapisz jako wymagany typ pliku obrazu. W mikroskopie obróć koło filtra do pozycji numer pięć w celu obrazowania w jasnym polu i powtórz procedury przechwytywania, aby uzyskać odpowiedni obraz w jasnym polu.Pokazano tu obrazy w jasnym polu pokazujące zmiany morfologiczne HMDM w odpowiedzi na bodźce. Makrofagi spolaryzowane M1 z eksperymentów z HMDM wystawione na działanie interferonu gamma i lipopolisacharydu wykazały wydłużony i wrzecionowaty kształt komórki. Dla porównania, morfologia makrofagów spolaryzowanych M2 po ekspozycji HMDM na interleukinę 4 przez 48 godzin była zazwyczaj okrągła i płaska.Zdolność zróżnicowanych fenotypów HMDM do uwalniania MET została uwidoczniona za pomocą obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek za pomocą SYTOX green. Kontrola uzyskana z każdego fenotypu HMDM inkubowanego przez 24 godziny przy braku jakichkolwiek bodźców prozapalnych wykazała bardzo ograniczone zabarwienie na zielono. Dodatnie barwienie dla METs, pokazane jako zielone smugi, osiągnięto po ekspozycji M1-HMDM na kwas podchlorawy, PMA, interleukinę 8 lub TNF alfa.Obecność niektórych zielonych zabarwień widocznych w komórkach odzwierciedla utratę integralności błony, która może wynikać ze śmierci komórki, która jest niezależna od uwolnienia pułapki zewnątrzkomórkowej. Eksperymenty przeprowadzone na M2-HMDM wystawionych na działanie interleukiny 4 nie wykazały uwalniania DNA z komórek, na co wskazuje brak nici lub pasm zewnątrzkomórkowego DNA. Stwierdzono jednak pewien wychwyt komórkowy zielonego barwnika fluorescencyjnego z kwasem podchlorawym i TNF alfa.Ważne jest, aby unikać bezpośredniego jasnego światła, które może prześwietlić plamy przed obrazowaniem. Zewnątrzkomórkowe DNA można określić ilościowo za pomocą analizy qPCR na jądrowym i mitochondrialnym DNA obecnym w supernatancie komórki. Dalsza charakterystyka struktury mastucji i jej roli w przewlekłym zapaleniu za pomocą HMDM może być bardziej istotna klinicznie w porównaniu z innymi unieśmiertelnionymi magazynami makrofagów linii komórkowych.

in-vitro-stimulation-visualization-extracellular-trap-release

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

W tym filmie opisujemy protokół do immunologicznego barwienia i wizualizacji opartej na mikroskopii konfokalnej pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w tkance płucnej myszy. Makrofagi rezydujące w tkankach charakteryzują się ekspresją specyficznego dla makrofagów markera glikoproteiny powierzchniowej F4 / 80, podczas gdy MET są wizualizowane przez znakowanie markerów MET metaloproteinazy macierzy 9, cytrulinowanego histonu H3 i chromatyny zewnątrzkomórkowej.

Charakterystyka pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów w próbkach tkanki płucnej myszy

Ten film pokazuje aktywację białek kaspazy u ludzkich makrofagów za pomocą białek reporterowych dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Prodomeny kaspazy-1 są połączone z niefluorescencyjnymi fragmentami białek Wenus, które są rekrutowane do kompleksów inflamasomowych. Bliskość inflamasomów indukuje ponowne fałdowanie i fluorescencję fragmentów Wenus, potwierdzając aktywację kaspazy w makrofagach.

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów, MET, w makrofagach oskrzelowo-pęcherzykowych z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych w makrofagach z ludzkich płynów płucnych oskrzelowo-pęcherzykowych

Ten film demonstruje in vitro stymulację makrofagów zewnątrzkomórkowych pułapek (MET) u ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów przy użyciu różnych bodźców zapalnych, takich jak TNF-alfa, PMA i HOCL. Film przedstawia również metodę barwienia barwnikiem SYTOX MET w celu wizualizacji.

Stymulacja in vitro i wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów to nowo opisana jednostka. W tym artykule skoncentrujemy się na metodach mikroskopii konfokalnej i sposobie ich wizualizacji in vitro i in vivo na próbkach płuc.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Poznaj metodę stymulacji i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów. Technika wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do badania odpowiedzi zapalnej.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów (Wideo) | JoVE Journal

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Przeglądaj więcej filmów