Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i określenie częstotliwości występowania stromul za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek w liściach, a także wizualizacja stromul in vitro z wykorzystaniem chloroplastów wyizolowanych z liści. Metody eksperymentalne te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki roślinnej i badań nad chloroplastami poprzez odkrycie sposobu funkcjonowania stromul. Główną zaletą tych technik jest to, że dostarczają one powtarzalnych i wiarygodnych danych, nawet w odniesieniu do tych wysoce dynamicznych struktur chloroplastów.

Pomysł na badanie izolacji chloroplastów pojawił się, ponieważ niektóre badania sugerowały, że formowanie się stromul wymaga obecności struktur cytozolowych, takich jak cytoszkielet. Zdecydowaliśmy się zatem na homogenizację komórek, aby sprawdzić, czy stromule nadal mogą powstawać. Aby przygotować próbki liści, należy za pomocą bardzo ostrego ostrza do golenia wyciąć niewielki fragment liścia Nicotiana benthamiana.

Bezpośrednio po wycięciu sekcji liścia należy zanurzyć ją w strzykawce o pojemności 5 ml wypełnionej wodą. Następnie należy usunąć powietrze ze strzykawki i wytworzyć próżnię, zakrywając palcem wylot strzykawki przed cofnięciem tłoka. Należy delikatnie zwolnić tłok, aby uniknąć uszkodzenia sekcji liścia.

Następnie powtórzyć usuwanie powietrza dwa lub trzy razy, aż do momentu całkowitego usunięcia pęcherzyków i uzyskania ciemnozielonego koloru liścia. Nanieść kroplę wody na szkiełko podstawowe, a następnie umieścić na niej przekrój liścia. Na wierzch liścia dodać kolejną kroplę wody i przykryć całość szkiełkiem nakrywkowym.

Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe, aż zostaną one usunięte. Przy użyciu światła przechodzącego i obiektywu 20x ustaw ostrość na pole widzenia w pobliżu centrum przekroju liścia, wizualizując jednocześnie wiele chloroplastów. Zapisz obraz w świetle przechodzącym, aby w razie potrzeby móc później rozróżnić typy komórek.

Następnie przełącz na oświetlenie laserowe z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji dla stosowanego fluoroforu i zapisz kolejny obraz. W oprogramowaniu mikroskopu wybierz kanał GFP, a następnie kliknij, aby ustawić aperturę pinhole na jedną jednostkę Airy. Wybierz skanowanie laserowe, aby rozpocząć wizualizację próbki, a następnie kliknij kanał GFP oraz wzmocnienie detektora (gain), aby zminimalizować moc lasera przy jednoczesnym zachowaniu wyraźnej wizualizacji stromul.

Następnie przygotuj eksperyment Z-stack, który pozwoli zebrać serię obrazów przez epidermę liścia w polu widzenia. Dostosuj prędkość skanowania i rozdzielczość obrazu w razie potrzeby, aby upewnić się, że Z-stack zostanie zebrany szybko. Następnie zapisz Z-stack do późniejszej analizy.

Używając programu ImageJ, połącz stos Z w jeden obraz, stosując w oprogramowaniu metodę maksymalnej intensywności. Następnie zidentyfikuj i ręcznie policz wszystkie chloroplasty na obrazie. Dla każdego chloroplastu określ wizualnie, czy w połączonym obrazie stosu Z widoczne są jeden lub więcej stromul wychodzących z chloroplastu.

Aby wyizolować nienaruszone chloroplasty, należy przygotować zimny bufor ekstrakcyjny z następujących odczynników. Następnie, za pomocą NaOH i HCl, należy dostosować pH do wartości 6,9 i schłodzić bufor przed użyciem. Należy przygotować bufor izolacyjny i dostosować jego pH do wartości 7,6.

Jeśli liście nie wykazują ekspresji genetycznie kodowanego stromofluoroforu, należy przygotować roztwór diacetylofluoresceiny karboksylowej (CFDA). Aby wyizolować chloroplasty, należy pobrać około 5 do 10 g liści z kilku roślin i krótko opłukać je w zimnej wodzie. Następnie liście należy bezzwłocznie przenieść do 50 ml zimnego buforu ekstrakcyjnego.

Używając blendera i wykonując kilka krótkich impulsów, zmiel liście, a następnie przefiltruj mieszaninę przez dwie do trzech warstw gazy, aby usunąć pozostałości liści. Podziel ekstrakt chloroplastów do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 milliliter i wiruj przez jedną minutę przy 750 x g. Odrzuć nadsącz i użyj 10 milliters buforu izolacyjnego, aby zawiesić zielone chloroplasty.

Następnie ponownie odwiruj próbkę przez jedną minutę przy 750 x g, odlej nadsącz i użyj buforu izolacyjnego, aby zawiesić chloroplasty do końcowej objętości pięciu mililitrów. Jeśli chloroplasts pochodzą z roślin transgenicznych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, przenieś 20 µL chloroplastów na szkiełko i nałóż szkiełko nakrywkowe. Następnie przeprowadź badanie mikroskopowe.

Aby zbarwić chloroplasty z roślin, które nie wykazują ekspresji białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, należy dodać 5 µL stoku CFDA o stężeniu 50 mM do 5 mL chloroplastów w buforze izolacyjnym. Po inkubacji chloroplastów przez 5 minut należy przenieść niewielką alikwot na szkiełko, nałożyć szkiełko nakrywkowe i przeprowadzić obserwacje mikroskopowe. Na koniec, aby uwidocznić wiele chloroplastów jednocześnie, należy użyć zestawu filtrów FITC lub GFP oraz obiektywu 20x.

Lub obiektyw o większym powiększeniu, aby zwizualizować pojedynczy, wyizolowany chloroplast. Przedstawiono tutaj złączony stos obrazów pokazujący częstotliwość występowania GFP w szparkach w liściach młodych siewek N.Benthamiana. Na tym panelu obraz został odsycony i odwrócony, tak aby stroma była czarna.

Chloroplasty zaklasyfikowano jako nieposiadające stromul lub posiadające co najmniej jedną stromulę. spośród 87 zwizualizowanych chloroplastów epidermy 33 posiadały stromule, co daje częstotliwość 37,9 procent w tym liściu. Wykres ten przedstawia analizę ponad 23 000 chloroplastów i kilkuset komórek z pojedynczego liścia pochodzącego z 21 różnych roślin.

Średnia częstotliwość występowania stromul w ciągu dnia wynosiła 20,8 ± 1,8%, natomiast średnia częstotliwość nocna wynosiła 12,8 ± 0,9%, co wskazuje na istotnie wyższą częstotliwość w ciągu dnia, co potwierdzono testem t Welcha. Na tej rycinie przedstawiono stromule chloroplastów obserwowane in vitro po izolacji z N.benthamiana eksponującej GFP skierowane do plastydów, lub po zastosowaniu CFDA do barwienia chloroplastów z N.benthamiana lub Spinachia oleracea. Podczas obrazowania stromul w żywych komórkach ważne jest, aby pracować szybko i manipulować tkanką roślinną w możliwie najmniejszym stopniu.

Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak wyciszanie genów lub traktowanie chemiczne, aby odkryć dodatkowe czynniki molekularne lub szlaki zaangażowane w powstawanie i funkcję stromuli. Technika ta była stosowana przez badaczy biologii komórki roślinnej oraz odporności roślin w celu zbadania roli stromuli w komórkowych szlakach sygnalizacyjnych i odpowiedziach roślin na patogeny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak obliczyć częstotliwość występowania stromuli w liściu oraz jak obserwować stromule w wyizolowanych chloroplastach.

Należy pamiętać, że lasery oraz napięcie elektryczne zasilające skaningowy elektronowy mikroskop konfokalny mogą być niezwykle niebezpieczne, dlatego ważne jest zrozumienie wymagań systemowych dotyczących użytkowania tego urządzenia.