Name: Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metody wizualizacji częstotliwości stromul w chloroplastach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej. Protokoły te pozwalają na niezawodne badanie dynamiki struktur plastydowych w komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.O.B. i A.M.R. byli wspierani przez stypendia przeddoktoranckie z National Science Foundation.

UWAGA: W tym protokole skupiliśmy się na ocenie częstości występowania stromuli w naskórku liści N. benthamiana. Wygenerowano kilka stabilnych linii transgenicznych, które można wykorzystać do tego celu, w tym 35SPRO:FNRtp:EGFP13 i NRIP1:Cerulean6. Obie te linie wykazują silną ekspresję fluoroforów w zrębie chloroplastów liści uprawianych w szerokim zakresie warunków. Alternatywnie, fluorofory ukierunkowane na chloroplasty mogą ulegać przejściowej ekspresji w N. benthamiana przy użyciu przemian Agrobacterium 13. Jest to mniej idealne rozwiązanie niż w przypadku linii transgenicznych, ponieważ nacieki Agrobacterium indukują pewne podstawowe reakcje obronne u N. benthamiana, a interakcje z Agrobacterium mogą zmieniać częstotliwość zrębu w liściu14, potencjalnie komplikując interpretację wyników. Wreszcie, aby uwidocznić powstawanie zrębu in vitro, chloroplasty można wyekstrahować z dowolnego gatunku roślin, używając genetycznie kodowanych fluoroforów lub barwnika fluorescencyjnego, jak opisano w sekcji 5 poniżej. 9,15
UWAGA: Szczegółowe metody uprawy roślin zostały już wcześniej opisane. 16 Krótko mówiąc, uprawiaj rośliny N. benthamiana w 4-calowych doniczkach wypełnionych dowolną profesjonalną mieszanką gleby, która zapewnia dobry drenaż. Przykryj sadzonki przezroczystą plastikową kopułą na pierwsze 10-14 dni, aby zapewnić wilgotne środowisko do kiełkowania. Dodaj dowolną standardową mieszankę nawozów zgodnie z instrukcjami producenta do 14-dniowych roślin. Uprawiaj rośliny w białym świetle, używając natężenia światła ~100 μmol fotonów m-2 sec-1. Podlewaj rośliny regularnie.
1. Przygotowanie próbek liści do wizualizacji
UWAGA: Zranienie wpływa na dynamikę stromuli8, dlatego przygotowanie tkanek powinno być przeprowadzone bezpośrednio przed wizualizacją zrębów za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Idealnie byłoby, gdyby próbka została uwidoczniona w ciągu 15 minut po usunięciu z rośliny.
<ol>
	<li>Wytnij niewielką część liścia za pomocą bardzo ostrej żyletki. Zawsze używaj tego samego obszaru liścia, aby uzyskać spójność, i upewnij się, że wizualizujesz tę samą powierzchnię (adaksjalną lub abaksjalną) we wszystkich eksperymentach.</li>
	<li>Natychmiast po przecięciu części liścia zanurzyć część liścia w strzykawce bezigłowej o pojemności 5 ml wypełnionej wodą, usunąć powietrze ze strzykawki i zastosować podciśnienie, zakrywając otwór strzykawki palcem i pociągając za tłok.
	<ol>
		<li>Delikatnie zwolnić tłok, aby uniknąć uszkodzenia części skrzydła. Powtórz to dwa lub trzy razy lub do momentu, gdy większość powietrza zostanie usunięta, a liść wydaje się być ciemnozielony. 
		UWAGA: Ten krok usuwa powietrze z liścia, które może zakłócać dokładną wizualizację zrębów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj kroplę wody do zjeżdżalni i umieść na niej część liścia. Następnie dodaj kolejną kroplę wody na wierzch liścia i umieść szkiełko nakrywkowe na liściu. Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe, aż zostaną usunięte. Szkiełko jest teraz gotowe do mikroskopii i powinno zostać natychmiast zobrazowane.</li>
</ol>
2. Wizualizacja stromułów za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>W przypadku światła przechodzącego skup się na polu widzenia w pobliżu środka sekcji liścia (z dala od komórek uszkodzonych przez żyletkę). Użyj obiektywu 20X, aby można było jednocześnie uwidocznić wiele chloroplastów. Zapisz obraz ze światłem przechodzącym, aby w razie potrzeby można było później rozróżnić typy komórek.</li>
	<li>Przełącz źródło oświetlenia na laser z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji dla używanego fluoroforu. Na przykład wzbudzić GFP za pomocą lasera o długości fali 488 nm i zbierać emisje o długości fali od 500 nm do 525 nm.
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wybierz kanał GFP i kliknij, aby wyregulować otwór otworkowy na 1 jednostkę Airy. Wybierz skanowanie laserowe, aby rozpocząć wizualizację próbki, a następnie kliknij kanał GFP, aby dostosować intensywność lasera i wzmocnienie detektora, aby zminimalizować moc lasera, jednocześnie wyraźnie wizualizując zręby. Po ustaleniu tych ustawień utrzymuj je tak spójne, jak to możliwe we wszystkich eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj eksperyment z-stack, który zbierze serię obrazów przez naskórek liści w polu widzenia.
	<ol>
		<li>W przypadku stosu z należy uwzględnić wszystkie chloroplasty naskórka w polu widzenia, aby uniknąć odchylenia (na przykład, jeśli chloroplasty w pobliżu powierzchni liścia mają więcej zrębów w testowanych warunkach).</li>
		<li>Wykonuj zdjęcia w maksymalnym możliwym interwale, który będzie obejmował wszystkie stromule, ale zminimalizuje czas wymagany do wykonania stosu z. Na przykład, jeśli 1 jednostka Airy'ego odpowiada ostrej sekcji konfokalnej o głębokości 2 μm, robienie zdjęcia co 2 μm jest prawdopodobnie idealne. 
		UWAGA: Naskórek liści jest nierówną powierzchnią, więc całkowita głębokość stosu Z będzie się różnić w zależności od próbki; Większość stosów Z wymaga 10-20 obrazów, ale może zawierać więcej.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj szybkość skanowania i rozdzielczość obrazu, aby upewnić się, że stos z jest zbierany szybko (zwykle w ciągu 5-10 minut, jeśli to możliwe). Zapisz stos z do późniejszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Określ częstotliwość zrębu za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu. W przypadku tego protokołu zalecamy użycie ImageJ, który jest publicznie dostępny w National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), lub popularnej aktualizacji ImageJ, Fidżi (http://fiji.sc/Fiji).</li>
	<li>Połącz stos z w jeden obraz, korzystając z projekcji maksymalnej intensywności w oprogramowaniu.</li>
	<li>Zidentyfikuj i ręcznie policz wszystkie chloroplasty na obrazie.</li>
	<li>Dla każdego chloroplastu wizualnie określ, czy na scalonym obrazie stosu z chloroplastem widoczna jest jedna lub więcej stromuł. Przykłady można znaleźć na rysunku 1. 
	UWAGA: Ponieważ biologiczne funkcje zrębułek nie są znane, każde cienkie, wypełnione zrębem, rurkowe przedłużenie z chloroplastu można uznać za "stromulę", niezależnie od długości. Zgodnie z ogólną zasadą, wypełnione zrębem przedłużenie z chloroplastu jest zrębem, jeśli ma średnicę mniejszą niż około 1 μm na większości swojej długości7. Upewnij się, że jedna osoba analizuje wszystkie obrazy, aby kontrolować subiektywne różnice w określaniu, czy chloroplast ma zręb, czy nie. Drugi badacz powinien niezależnie zweryfikować częstość występowania stromuli, aby jeszcze bardziej zredukować subiektywne odchylenia.</li>
</ol>
4. Projekt eksperymentalny i pobieranie próbek
UWAGA: Częstotliwość stromuli jest bardzo zmienna między liśćmi, ale kilka raportów sugeruje, że występuje niewielka różnica w częstotliwości stromuli w obrębie pojedynczego liścia9,17.
<ol>
	<li>Oblicz częstotliwość zrębu liści na podstawie pojedynczego pola widzenia jednego liścia. Wyrzuć liść i potraktuj go jako niezależną próbkę. Nie należy traktować oddzielnych pól widzenia z jednego liścia jako niezależnych próbek. 
	UWAGA: Nie ma silnego konsensusu co do tego, jak najlepiej mierzyć zmiany w aktywności zrębów i dopóki funkcja zrębułów nie zostanie jaśniej zdefiniowana, naukowcy powinni nadal być kreatywni w ilościowym określaniu dynamiki stromuli. Dla porównania w literaturze należy jednak stosować wspólne standardy sprawozdawczości oprócz bardziej kreatywnych podejść. Jako minimum zawsze podawaj częstotliwość chloroplastów, które mają jeden lub więcej zrębów.</li>
	<li>Określ częstotliwość chloroplastów, które mają zręby w polu view. Użyj ImageJ, aby zidentyfikować wszystkie chloroplasty w polu widzenia. Następnie dla każdego chloroplastu określ, czy chloroplast utworzył co najmniej jeden zręb. Podaj częstość występowania zrębu jako procent chloroplastów ze stromulą. 
	UWAGA: Niektórzy badacze przekształcają procent, na przykład za pomocą transformacji arcsinus, przed podaniem częstości zrębów; Chociaż jest to opcja do analizy statystycznej, sinus łuku o częstości Stromula nie jest wartością intuicyjną i nie musi być podawany w głównym tekście lub rysunkach badania.
	<ol>
		<li>Alternatywnym podejściem jest policzenie całkowitej liczby zrębów i podzielenie jej przez całkowitą liczbę chloroplastów. 
		UWAGA: W większości przypadków da to podobne wyniki jak podejście 4.2; Może jednak przeszacować częstość występowania zrębów, jeśli pojedynczy chloroplast utworzył wiele zrębów. Na przykład w przykładzie pokazanym poniżej reprezentatywnych wyników kilka chloroplastów ma dwa lub więcej zrębów, co zwiększa liczbę zstromień na chloroplast do 40/87 (w porównaniu z częstością zrębułów wynoszącą 33/87).</li>
		<li>Alternatywnie, określ długość zrębu zamiast częstotliwości zrębu. Długość można zmierzyć w ImageJ, śledząc zręb za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego. 
		UWAGA: Ponieważ biologiczna rola zrębów pozostaje nieznana, nie jest jasne, czy długość zrębu wpływa na ich funkcję. Należy podać znaczące różnice w długości zrębu, jeśli są one obserwowane, ale należy również podać częstość występowania zrębu (jak opisano w ppkt 4.2). 
		UWAGA: Częstotliwość występowania stromuli może być bardzo zmienna między różnymi liśćmi w tych samych warunkach wzrostu. Dlatego, chociaż określenie częstości występowania zrębułów może być czasochłonne, eksperymenty powinny być starannie zaprojektowane, aby obejmowały duże próby. Korzystając z zestawów danych z naszego laboratorium, ustaliliśmy, że wielkość próby co najmniej 16 roślin dla każdego zabiegu jest zwykle wystarczająco silna, aby określić, czy istnieje statystycznie istotna różnica co najmniej 1,5-krotnej zmiany częstości zrębu między dwoma warunkami (przy standardowych α = 0,05 i β = 0,80).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza statystyczna wyników.
	<ol>
		<li>Aby porównać średnią częstość występowania zrębu w dwóch zabiegach, należy użyć testu t Welcha (znanego również jako heteroskedastyczny test t lub test t przy założeniu nierównej wariancji). 
		UWAGA: Ten test nie jest tak skuteczny jak konwencjonalny test t Studenta, ale test t Welcha jest korzystny, ponieważ nie zakłada, że wariancja w rozkładzie częstości zrębu jest podobna między zabiegami. 
		UWAGA: Ponieważ częstość występowania zrębułów jest "proporcją", przewiduje się, że ich rozkład próbkowania będzie dwumianowy, a nie normalny, co teoretycznie może zniekształcić analizę statystyczną, jeśli wielkość próbki jest bardzo niska lub jeśli częstotliwość zrębułek jest bardzo niska (bliska 0%) lub bardzo wysoka (bliska 100%). W niektórych raportach stosowano transformacje arcus sinus przed analizą statystyczną, która ma na celu przekształcenie rozkładu dwumianowego w rozkład normalny, a tym samym spełnienie standardowych wymagań testu t Studenta lub ANOVA. W praktyce jednak transformacje arcusine mają niewielki lub żaden wpływ na analizę statystyczną i dlatego nie są zalecane. Zamiast tego powtórz eksperymenty, aby zwiększyć wielkość próby, co zwiększy moc statystyczną i zmniejszy błędy w interpretacji danych.</li>
		<li>Niezależnie od zastosowanego podejścia statystycznego należy pamiętać o dokładnym raportowaniu strategii pobierania próbek, wielkości próby, testu statystycznego i wartości p dla każdego eksperymentu. 
		UWAGA: Podobnie jak w przypadku innych dziedzin biologii, wartość p mniejsza niż 0,05 może być uważana za "statystycznie istotną", chociaż badacze z pewnością powinni podać dokładną uzyskaną wartość p. Jeśli p jest nieco powyżej 0,05, zwiększenie wielkości próby za pomocą dwóch lub trzech eksperymentów może pomóc w wyjaśnieniu, czy zaobserwowana różnica jest odtwarzalna i statystycznie istotna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja nienaruszonych chloroplastów w celu wizualizacji dynamiki zrębu
UWAGA: Do izolowania chloroplastów z liści użyto kilku metod, w tym nieco innego protokołu w niedawnym badaniu nad powstawaniem zrębu in vitro15. Protokół opisany poniżej wykorzystuje stosunkowo prostą metodę, która nie daje biochemicznie czystych próbek chloroplastów, ale zamiast tego izoluje dużą ilość nienaruszonych, zdrowych chloroplastów9,18.
<ol>
	<li>Przygotować bufor do ekstrakcji na zimno: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitolu, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl2 i 1,0 mM MnCl2. Dostosuj pH do 6,9 za pomocą NaOH i HCl i wstaw do lodówki przed użyciem. 
	UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne, stosowanie zimnych i trzymanie próbek na lodzie, jeśli to możliwe, pozwoli uzyskać wyższy odsetek nienaruszonych chloroplastów.</li>
	<li>Przygotuj bufor izolacyjny: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitolu, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl2, 1,0 mM MgCl2, 10 mM KCl i 1,0 mM NaCl. Dostosuj pH do 7,6 za pomocą NaOH i HCl i wstaw do lodówki przed użyciem.</li>
	<li>Jeśli na liściach nie występuje genetycznie kodowany fluorofor zrębu, należy przygotować roztwór dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA): 50 mM roztwór podstawowy CFDA w dimetylosulfotlenku (DMSO) (2,3 mg CFDA na 1,0 ml DMSO). 
	UWAGA: Dokładne stężenie nie jest krytyczne. Utrzymuj akcje CFDA w niepewności przez cały czas. Przechowywać małe porcje 50 mM CFDA w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Aby wyizolować chloroplasty, usuń ~5-10 g liści z kilku roślin i krótko spłucz w zimnej wodzie. Natychmiast przenieść do 50 ml zimnego buforu ekstrakcyjnego. Zmiel liście za pomocą blendera z kilkoma krótkimi impulsami. Przefiltruj przez dwie lub trzy warstwy gazy, aby usunąć resztki liści, podziel wyekstrahowane chloroplasty na dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml i wiruj przez 1 minutę przy 750 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić zielone chloroplasty w 10 ml buforze izolacyjnym. Ponownie odwirować przez 1 minutę przy 750 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić chloroplasty w buforze izolacyjnym, aby doprowadzić końcową objętość do 5 ml.</li>
	<li>Przenieść 20 μl chloroplastów na szkiełko podstawowe, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i rozpocząć mikroskopię. 
	UWAGA: Chloroplasty z roślin transgenicznych wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy są teraz gotowe do wizualizacji za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Barwnik chloroplastów z roślin, które nie wykazują ekspresji białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, aby uwidocznić zręby.
	<ol>
		<li>Dodać 5 μl 50 mM bulionu CFDA do 5 ml chloroplastów zawieszonych w buforze izolacyjnym. Doprowadzić końcowe stężenie do 50 μM.</li>
		<li>Pozostawić chloroplasty do inkubacji przez 5 minut, a następnie przenieść małą porcję (~50 μl) na szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i rozpocząć mikroskopię.</li>
		<li>Użyj zestawu filtrów FITC lub GFP. Użyj obiektywu 20X, aby zwizualizować wiele chloroplastów jednocześnie, lub wyższego obiektywu, aby zwizualizować pojedynczy izolowany chloroplast. 
		UWAGA: CFDA będzie fluoryzować wewnątrz zrębu nienaruszonych chloroplastów.</li>
		<li>W przypadku silnej fluorescencji tła należy ponownie przemyć chloroplasty w 10 ml buforu izolacyjnego po 5 minutach inkubacji z CFDA, odwirować przez 1 minutę przy 750 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 5 ml buforze izolacyjnym</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Koussevitzky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+chloroplasts+converge+to+regulate+nuclear+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression.</a> Science. 316 (5825), 715-719 (2007).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+Organelle-nucleus+cross-talk+regulates+plant+intercellular+communication+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).</li>
<li>Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+states+of+plastids+and+mitochondria+differentially+regulate+intercellular+transport+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata.</a> Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).</li>
<li>Nomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-mediated+activation+of+plant+immune+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis.</a> Nat. Commun. 3, 926(2012).</li>
<li>Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncharacterized+apocarotenoid-derived+signal+generated+in+%CE%B6-carotene+desaturase+mutants+regulates+leaf+development+and+the+expression+of+chloroplast+and+nuclear+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).</li>
<li>Caplan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+stromules+runction+during+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Chloroplast stromules runction during innate immunity.</a> Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).</li>
<li>Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromules%3A+recent+insights+into+a+long+neglected+feature+of+plastid+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).</li>
<li>Gray, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+stromules+are+induced+by+stress+treatments+acting+through+abscisic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid.</a> Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).</li>
<li>Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplasts+extend+stromules+independently+and+in+response+to+internal+redox+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).</li>
<li>Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis+gene-promoter+fusions+in+leaf+epidermal+cells+of+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants.</a> Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).</li>
<li>Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+and+loss+of+photosynthetic+membranes+during+plastid+differentiation+in+the+shoot+apex+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).</li>
<li>Chiang, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+GATA+transcription+factors+GNC+and+CGA1+reveals+their+key+role+in+chloroplast+development%2C+growth%2C+and+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).</li>
<li>Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+stromule+branching+coincides+with+contiguous+endoplasmic+reticulum+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).</li>
<li>Erickson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-derived+cytokinin+influences+plastid+morphology+and+starch+accumulation+in+Nicotiana+benthamiana+during+transient+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 127(2014).</li>
<li>Ho, J., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+stromules+in+vitro+from+chloroplasts+isolated+from+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana.</a> PLoS One. 11 (2), e0146489(2016).</li>
<li>Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunkard%2C+JO+%22Method.+Mol.+Biol%22">Method. Mol. Biol</a>. , 185-198 (2015).</li>
<li>Schattat, M. H., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+stromule+formation+by+extracellular+sucrose+and+glucose+in+epidermal+leaf+tissue+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 11, 115(2011).</li>
<li>Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoly%2C+D+%22Method.+Mol.+Biol%22">Method. Mol. Biol</a>. 684, 321-325 (2011).</li>
<li>Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromule+formation+is+dependent+upon+plastid+size%2C+plastid+differentiation+status+and+the+density+of+plastids+within+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell.</a> Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas badania zrębów należy wziąć pod uwagę trzy ważne czynniki: (i) manipulacja tkanką roślinną musi być ograniczona do absolutnego minimum, (ii) system doświadczalny musi być spójny oraz (iii) strategie pobierania próbek muszą być starannie zaplanowane, aby zapewnić analizę solidnych, powtarzalnych danych.
Zręble są niezwykle dynamiczne: mogą się szybko wysuwać i chować na oczach obserwatora pod mikroskopem. Co więcej, częstotliwość zrębułek różni się znacznie w odpowiedzi na szeroki zakre...

Chloroplasty to dynamiczne organelle w komórkach roślinnych odpowiedzialne za fotosyntezę i wiele innych procesów metabolicznych. Szlaki sygnałowe z chloroplastu wywierają również znaczący wpływ na fizjologię i rozwój roślin, koordynując reakcje roślin na stres środowiskowy, patogeny, a nawet kształt liści1-6. Ostatnio biolodzy zainteresowali się słabo poznanym aspektem struktury chloroplastów: stromulami, bardzo cienkimi kanalikami wypełnionymi zrębem, które rozciągają się od powierzchni chloroplastu7.
Biologiczne funkcje stromuli pozostają nieznane, chociaż wiadomo, że częstotliwość stromuli zmienia się w odpowiedzi na bodźce środowiskowe7-9, a stromule mogą być zdolne do przekazywania cząsteczek sygnałowych między organellami6. Wszystkie rodzaje plastydów (nie tylko zielone, fotosyntetyczne chloroplasty, ale także przezroczyste leukoplasty, amyloplasty wypełnione skrobią i pigmentowane chromoplasty, by wymienić tylko kilka rodzajów plastydów) tworzą stromule, a zręble znajdują się we wszystkich gatunkach roślin lądowych, które zostały do tej pory zbadane. Zręby mogą się dynamicznie wysuwać i chować, pojawiając się lub znikając w ciągu kilku sekund lub mogą pozostawać względnie nieruchome przez długi czas. Jedną z głównych przeszkód stojących przed biologami stromuli jest to, że zręby są często badane przy użyciu dramatycznie różnych metod, tkanek i gatunków, co utrudnia porównania w literaturze dotyczącej biologii stromuli. Idąc dalej, standardowe praktyki i dokładne opisy systemów eksperymentalnych stosowanych do badania zrębów będą miały kluczowe znaczenie dla odkrycia funkcji tych wszechobecnych cech morfologii chloroplastów.
Tutaj opisujemy metody wizualizacji powstawania zrębu w chloroplastach naskórka liści Nicotiana benthamiana. W mezofilu chloroplasty są gęsto upakowane w duże, trójwymiarowe komórki, co utrudnia dokładną i szybką wizualizację zrębułek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Natomiast komórki naskórka są stosunkowo płaskie, zawierają mniej chloroplastów i znajdują się na powierzchni liścia, co pozwala na łatwą i szybką wizualizację zrębów. N. benthamiana jest idealnym systemem modelowym do tych eksperymentów, ponieważ, w przeciwieństwie do wielu gatunków roślin, wszystkie komórki w naskórku N. benthamiana wytwarzają chloroplasty10. W naskórku większości roślin, w tym Arabidopsis thaliana, tylko komórki ochronne aparatów szparkowych mają chloroplasty, podczas gdy inne komórki naskórka mają "leukoplasty", plastydy, które są przezroczyste, stosunkowo amorficzne i niefotosyntetyczne9,11,12. Tak więc, podczas gdy pojedyncze pole widzenia naskórka A. thaliana może pokazywać tylko garstkę chloroplastów w parze komórek ochronnych, pole widzenia naskórka N. benthamiana będzie obejmowało dziesiątki, a nawet setki chloroplastów. Wszystkie opisane tutaj metody można jednak zmodyfikować w celu zbadania innych pytań w biologii stromuli; na przykład zastosowaliśmy to samo podejście do badania zrębów leukoplastów A. thaliana9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Model: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Dioctan karboksyfluoresceiny (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&nbsp;</td><td>Model: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>fiji.sc</td> Oprogramowanie typu open <td></td><td>source do analizy obrazów biologicznych</td></tr></tbody></table>

wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromule, czyli "kanaliki wypełnione zrębem", to wąskie, rurkowate przedłużenia od powierzchni chloroplastu, które są powszechnie obserwowane w komórkach roślinnych, ale których funkcje pozostają tajemnicze. Wraz z rosnącym zainteresowaniem rolą chloroplastów w koordynowaniu reakcji roślin na stres, w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie zrębami i ich związkiem z dynamiką sygnalizacji chloroplastów, do czego przyczyniły się postępy w mikroskopii fluorescencyjnej i fluoroforach białkowych, które pozwalają na szybką i dokładną wizualizację dynamiki zrębu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły do oznaczania częstości występowania zrębu w chloroplastach naskórka Nicotiana benthamiana, doskonałego systemu modelowego do badania biologii zrębu chloroplastów. Udostępniamy również metody wizualizacji zrębów chloroplastów in vitro poprzez ekstrakcję chloroplastów z liści. Na koniec przedstawiamy strategie pobierania próbek i podejścia statystyczne do analizy różnic w częstości występowania zrębułów w odpowiedzi na bodźce, takie jak stres środowiskowy, zabiegi chemiczne lub wyciszanie genów. Naukowcy mogą wykorzystać te protokoły jako punkt wyjścia do opracowania nowych metod innowacyjnych eksperymentów w celu zbadania, w jaki sposób i dlaczego chloroplasty tworzą zręble.

Niniejszy protokół został zastosowany do wizualizacji częstotliwości występowania stromul w dzień i w nocy w kotyledonach młodych siewek N. benthamiana. Przekroje z serii z-stack zostały połączone w jeden obraz (Rycina 1A). W celach wizualnych obraz ten został następnie odbarwiony i odwrócony, tak aby stroma była widoczna jako czarna (Rycina 1B). Chloroplasty oznaczono albo jako pozbawione stromul (zielona gwiazdka), albo jako posiadając...

Opisane są protokoły badania dynamiki zrębów chloroplastowych, kanalików wypełnionych zrębem, które rozciągają się od powierzchni chloroplastów.

Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i określenie częstotliwości występowania stromul za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek w liściach, a także wizualizacja stromul in vitro z wykorzystaniem chloroplastów wyizolowanych z liści. Metody eksperymentalne te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki roślinnej i badań nad chloroplastami poprzez odkrycie sposobu funkcjonowania stromul. Główną zaletą tych technik jest to, że dostarczają one powtarzalnych i wiarygodnych danych, nawet w odniesieniu do tych wysoce dynamicznych struktur chloroplastów.Pomysł na badanie izolacji chloroplastów pojawił się, ponieważ niektóre badania sugerowały, że formowanie się stromul wymaga obecności struktur cytozolowych, takich jak cytoszkielet. Zdecydowaliśmy się zatem na homogenizację komórek, aby sprawdzić, czy stromule nadal mogą powstawać. Aby przygotować próbki liści, należy za pomocą bardzo ostrego ostrza do golenia wyciąć niewielki fragment liścia Nicotiana benthamiana.Bezpośrednio po wycięciu sekcji liścia należy zanurzyć ją w strzykawce o pojemności 5 ml wypełnionej wodą. Następnie należy usunąć powietrze ze strzykawki i wytworzyć próżnię, zakrywając palcem wylot strzykawki przed cofnięciem tłoka. Należy delikatnie zwolnić tłok, aby uniknąć uszkodzenia sekcji liścia.Następnie powtórzyć usuwanie powietrza dwa lub trzy razy, aż do momentu całkowitego usunięcia pęcherzyków i uzyskania ciemnozielonego koloru liścia. Nanieść kroplę wody na szkiełko podstawowe, a następnie umieścić na niej przekrój liścia. Na wierzch liścia dodać kolejną kroplę wody i przykryć całość szkiełkiem nakrywkowym.Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe, aż zostaną one usunięte. Przy użyciu światła przechodzącego i obiektywu 20x ustaw ostrość na pole widzenia w pobliżu centrum przekroju liścia, wizualizując jednocześnie wiele chloroplastów. Zapisz obraz w świetle przechodzącym, aby w razie potrzeby móc później rozróżnić typy komórek.Następnie przełącz na oświetlenie laserowe z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji dla stosowanego fluoroforu i zapisz kolejny obraz. W oprogramowaniu mikroskopu wybierz kanał GFP, a następnie kliknij, aby ustawić aperturę pinhole na jedną jednostkę Airy. Wybierz skanowanie laserowe, aby rozpocząć wizualizację próbki, a następnie kliknij kanał GFP oraz wzmocnienie detektora (gain), aby zminimalizować moc lasera przy jednoczesnym zachowaniu wyraźnej wizualizacji stromul.Następnie przygotuj eksperyment Z-stack, który pozwoli zebrać serię obrazów przez epidermę liścia w polu widzenia. Dostosuj prędkość skanowania i rozdzielczość obrazu w razie potrzeby, aby upewnić się, że Z-stack zostanie zebrany szybko. Następnie zapisz Z-stack do późniejszej analizy.Używając programu ImageJ, połącz stos Z w jeden obraz, stosując w oprogramowaniu metodę maksymalnej intensywności. Następnie zidentyfikuj i ręcznie policz wszystkie chloroplasty na obrazie. Dla każdego chloroplastu określ wizualnie, czy w połączonym obrazie stosu Z widoczne są jeden lub więcej stromul wychodzących z chloroplastu.Aby wyizolować nienaruszone chloroplasty, należy przygotować zimny bufor ekstrakcyjny z następujących odczynników. Następnie, za pomocą NaOH i HCl, należy dostosować pH do wartości 6,9 i schłodzić bufor przed użyciem. Należy przygotować bufor izolacyjny i dostosować jego pH do wartości 7,6.Jeśli liście nie wykazują ekspresji genetycznie kodowanego stromofluoroforu, należy przygotować roztwór diacetylofluoresceiny karboksylowej (CFDA). Aby wyizolować chloroplasty, należy pobrać około 5 do 10 g liści z kilku roślin i krótko opłukać je w zimnej wodzie. Następnie liście należy bezzwłocznie przenieść do 50 ml zimnego buforu ekstrakcyjnego.Używając blendera i wykonując kilka krótkich impulsów, zmiel liście, a następnie przefiltruj mieszaninę przez dwie do trzech warstw gazy, aby usunąć pozostałości liści. Podziel ekstrakt chloroplastów do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 milliliter i wiruj przez jedną minutę przy 750 x g. Odrzuć nadsącz i użyj 10 milliters buforu izolacyjnego, aby zawiesić zielone chloroplasty.Następnie ponownie odwiruj próbkę przez jedną minutę przy 750 x g, odlej nadsącz i użyj buforu izolacyjnego, aby zawiesić chloroplasty do końcowej objętości pięciu mililitrów. Jeśli chloroplasts pochodzą z roślin transgenicznych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, przenieś 20 µL chloroplastów na szkiełko i nałóż szkiełko nakrywkowe. Następnie przeprowadź badanie mikroskopowe.Aby zbarwić chloroplasty z roślin, które nie wykazują ekspresji białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, należy dodać 5 µL stoku CFDA o stężeniu 50 mM do 5 mL chloroplastów w buforze izolacyjnym. Po inkubacji chloroplastów przez 5 minut należy przenieść niewielką alikwot na szkiełko, nałożyć szkiełko nakrywkowe i przeprowadzić obserwacje mikroskopowe. Na koniec, aby uwidocznić wiele chloroplastów jednocześnie, należy użyć zestawu filtrów FITC lub GFP oraz obiektywu 20x.Lub obiektyw o większym powiększeniu, aby zwizualizować pojedynczy, wyizolowany chloroplast. Przedstawiono tutaj złączony stos obrazów pokazujący częstotliwość występowania GFP w szparkach w liściach młodych siewek N.Benthamiana. Na tym panelu obraz został odsycony i odwrócony, tak aby stroma była czarna.Chloroplasty zaklasyfikowano jako nieposiadające stromul lub posiadające co najmniej jedną stromulę. spośród 87 zwizualizowanych chloroplastów epidermy 33 posiadały stromule, co daje częstotliwość 37,9 procent w tym liściu. Wykres ten przedstawia analizę ponad 23 000 chloroplastów i kilkuset komórek z pojedynczego liścia pochodzącego z 21 różnych roślin.Średnia częstotliwość występowania stromul w ciągu dnia wynosiła 20,8 ± 1,8%, natomiast średnia częstotliwość nocna wynosiła 12,8 ± 0,9%, co wskazuje na istotnie wyższą częstotliwość w ciągu dnia, co potwierdzono testem t Welcha. Na tej rycinie przedstawiono stromule chloroplastów obserwowane in vitro po izolacji z N.benthamiana eksponującej GFP skierowane do plastydów, lub po zastosowaniu CFDA do barwienia chloroplastów z N.benthamiana lub Spinachia oleracea. Podczas obrazowania stromul w żywych komórkach ważne jest, aby pracować szybko i manipulować tkanką roślinną w możliwie najmniejszym stopniu.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak wyciszanie genów lub traktowanie chemiczne, aby odkryć dodatkowe czynniki molekularne lub szlaki zaangażowane w powstawanie i funkcję stromuli. Technika ta była stosowana przez badaczy biologii komórki roślinnej oraz odporności roślin w celu zbadania roli stromuli w komórkowych szlakach sygnalizacyjnych i odpowiedziach roślin na patogeny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak obliczyć częstotliwość występowania stromuli w liściu oraz jak obserwować stromule w wyizolowanych chloroplastach.Należy pamiętać, że lasery oraz napięcie elektryczne zasilające skaningowy elektronowy mikroskop konfokalny mogą być niezwykle niebezpieczne, dlatego ważne jest zrozumienie wymagań systemowych dotyczących użytkowania tego urządzenia.

visualizing-stromule-frequency-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Źródło: Schlimpert, S. i in. Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życia bakterii Streptomyces venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji kiełkowania, wzrostu strzępek i zarodnikowania w czasie rzeczywistym.

Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe cyklu życiowego Streptomyces venezuelae

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.

Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Poznaj metody wizualizacji częstotliwości stromul w chloroplastach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej. Protokoły te pozwalają na niezawodne badanie dynamiki struktur plastydowych w komórkach roślinnych.

Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów