Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i określenie częstości występowania zrębu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek w liściach oraz wizualizacja zrębów in vitro przy użyciu chloroplastu wyekstrahowanego z liści. Te eksperymentalne metody mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii komórek roślinnych i badaniach nad chloroplastami, odkrywając, jak działają zręble. Główną zaletą tych technik jest to, że dostarczają one powtarzalnych i solidnych danych, nawet w przypadku tych wysoce dynamicznych struktur chloroplastowych.

Wpadliśmy na pomysł badania izolacji chloroplastów, ponieważ niektóre badania sugerowały, że tworzenie się zrębu wymaga powstania struktur cytozolowych, takich jak cytoszkielet. Zdecydowaliśmy się więc zmieszać komórkę i sprawdzić, czy zręby mogą się jeszcze tworzyć. Aby przygotować próbki liści, zacznij od użycia bardzo ostrej żyletki, aby przeciąć niewielką część liścia Nicotiana benthamiana.

Natychmiast po przecięciu części liścia zanurz ją w pięciomililitrowej strzykawce wypełnionej wodą. Następnie usunąć powietrze ze strzykawki i zastosować podciśnienie, zakrywając palcem otwór strzykawki, przed pociągnięciem tłoka. Delikatnie zwolnić tłok, aby uniknąć uszkodzenia części skrzydła.

Następnie powtórz usuwanie powietrza dwa lub trzy razy lub do momentu, gdy powietrze zostanie usunięte, a liść wydaje się być ciemnozielony. Dodaj kroplę wody do zjeżdżalni i umieść sekcję liścia na kropli. Następnie dodaj kolejną kroplę wody na wierzch liścia i dodaj szkiełko nakrywkowe.

Jeśli są jakieś pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w szkiełko nakrywkowe, aż zostaną usunięte. Przy świetle przechodzącym i obiektywie 20x skup się na polu widzenia w pobliżu środka sekcji liścia, wizualizując jednocześnie wiele chloroplastów. Zapisz obraz ze światłem przechodzącym, aby w razie potrzeby można było później rozróżnić typy komórek.

Następnie przełącz się na oświetlenie laserowe z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji dla używanego fluoroforu i zapisz kolejny obraz. Korzystając z oprogramowania mikroskopu, wybierz kanał GFP i kliknij, aby wyregulować otwór otworkowy na jedną przewiewną jednostkę. Wybierz skanowanie laserowe, aby rozpocząć wizualizację próbki, a następnie kliknij kanał GFP i wzmocnienie detektora, aby zminimalizować moc lasera, jednocześnie wyraźnie wizualizując zręby.

Następnie przygotuj eksperyment ze stosem Z, który zbierze serię obrazów przez naskórek liści w polu widzenia. W razie potrzeby dostosuj szybkość skanowania i rozdzielczość obrazu, aby mieć pewność, że stos Z zostanie szybko zebrany. Następnie zapisz stos Z do późniejszej analizy.

Używając obrazu J, połącz stos Z w jeden obraz, używając maksymalnej intensywności w oprogramowaniu. Następnie zidentyfikuj i ręcznie policz wszystkie chloroplasty na obrazie. Dla każdego chloroplastu wizualnie określ, czy na scalonym obrazie stosu Z widoczny jest co najmniej jeden lub więcej zrębów wystających z chloroplastu.

Aby wyekstrahować nienaruszone chloroplasty, należy przygotować bufor do ekstrakcji na zimno przy użyciu następujących odczynników. Następnie za pomocą NaOH i HCl dostosuj pH do 6,9 i wstaw do lodówki przed użyciem. Przygotować bufor izolacyjny i dostosować pH do 7,6.

Jeśli na liściach nie ma ekspresji genetycznie kodowanego stromofluoroforu, przygotuj dioctan karboksyfluoresceiny lub roztwór CFDA. Aby wyizolować chloroplasty, usuń około 5 do 10 gramów liści z kilku roślin i krótko spłucz w zimnej wodzie. Następnie natychmiast przenieś liście do 50 mililitrów bufora do ekstrakcji na zimno.

Za pomocą blendera z kilkoma krótkimi impulsami zmiel liście, a następnie przefiltruj mieszaninę przez dwie do trzech warstw gazy serowej, aby usunąć resztki liści. Podziel wyekstrahowany chloroplast na dwie 50-mililitrowe probówki wirówkowe i wiruj przez jedną minutę przy 750 x g. Wyrzuć supernatant i użyj 10 mililitrów buforu izolacyjnego do ponownego zawieszenia zielonych chloroplastów.

Następnie ponownie odwirować przez jedną minutę przy 750 x g, odrzucić supernatant i użyć buforu izolacyjnego do ponownego zawieszenia chloroplastów do końcowej objętości pięciu mililitrów. Jeśli chloroplasty pochodzą z roślin transgenicznych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, przenieś 20 mikrolitrów chloroplastów na szkiełko podstawowe i dodaj szkiełko nakrywkowe. Następnie przeprowadź mikroskopię.

Aby zabarwić chloroplasty z roślin, które nie wykazują ekspresji białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na plastydy, dodaj pięć mikrolitrów 50-milimolowego zapasu CFDA do pięciu mililitrów chloroplastów w buforze izolacyjnym. Po pozostawieniu chloroplastów do inkubacji przez pięć minut, przenieś małą porcję na szkiełko, dodaj szkiełko nakrywkowe i przeprowadź mikroskopię. Na koniec użyj zestawu filtrów FITC lub GFP i obiektywu 20x, aby jednocześnie wizualizować wiele chloroplastów.

Lub wyższy cel, aby uwidocznić pojedynczy izolowany chloroplast. Pokazano tutaj połączony stos pokazujący częstość występowania stomuli GFP w kodoledencji młodych siewek N.Bentamiana. W tym panelu obraz został zdesaturowany i odwrócony, tak że zrąb wydaje się.

Chloroplasty zostały oznaczone jako nieposiadające zrębów lub mające co najmniej jeden zręb. Spośród 87 uwidocznionych chloroplastów naskórka, 33 mają zręby, co daje częstotliwość 37,9 procent w tym liściu. Ten wykres przedstawia analizę ponad 23 000 chloroplastów i kilkuset komórek z jednego liścia z 21 różnych roślin.

Średnia częstotliwość stromuli w ciągu dnia wynosiła 20,8 plus minus 1,8 procent, a średnia częstotliwość stromuli w nocy wynosiła 12,8 plus minus 0,9 procent, co wskazuje na znacznie wyższą częstotliwość w ciągu dnia, jak określono za pomocą testu T Welcha. Na tym rysunku zaobserwowano zręby chloroplastów in vitro po wyizolowaniu z N. benthamiana wykazującego ekspresję GFP ukierunkowanego na plastyd lub po użyciu CFDA do barwienia chloroplastów z N. benthamiana lub Spinachia oleracea. Podczas obrazowania żywych komórek zrębu ważne jest, aby pracować szybko i jak najmniej manipulować tkanką roślinną.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak wyciszanie genów lub zabiegi chemiczne, w celu odkrycia dodatkowych graczy molekularnych lub szlaków zaangażowanych w tworzenie i funkcję zrębu. Technika ta została wykorzystana przez naukowców zajmujących się biologią komórek roślinnych i odpornością roślin do badania roli zrębów w komórkowych szlakach sygnałowych i reakcjach roślin na patogeny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obliczyć częstotliwość zrębu w liściu i jak obserwować zręby w wyekstrahowanych chloroplastach.

Pamiętaj też, że lasery i napięcie elektryczne zasilające skaningowy mikroskop elektronowy mogą być niezwykle niebezpieczne i ważne jest, aby zrozumieć wymagania systemowe dotyczące korzystania z tego sprzętu.