Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie żywych komórek poprzez wzrost i podział za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby można było zbadać wpływ historii komórkowej i pochodzenia na rozwój komórkowy bakterii. Osiąga się to poprzez najpierw przeniesienie komórek z płynnej pożywki o stosunkowo wysokich stężeniach składników odżywczych do płynnej pożywki głodowej. Następnie mikroskopijne szkiełko, na którym komórki bakteryjne wyrosną na mikrokolonię.

Przygotowuje się monowarstwę. Następnie nagrywany jest film z poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Na koniec film jest przetwarzany, a dane są analizowane.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują rozwój pojedynczej komórki bakteryjnej za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak cytometria przepływowa i standardowa mikroskopia, jest to, że umożliwia monitorowanie dynamiki białek, zachowania komórek i rozwoju pojedynczych komórek w czasie, wykazując, że procedura będzie w stożku, doktorant z mojego laboratorium Aby przygotować komórki inokulowane od minus 80 stopni Celsjusza, zapasy w 10 mililitrach mikroskopii poklatkowej lub pożywki TLM w sterylnych kolbach do wytrząsania, w razie potrzeby uzupełnionych antybiotykami, hodować komórki przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 225 obr./min w sterylnej kolbie do wytrząsania następnego ranka, aby splądrować komórki od 1 do 10 w Prewarm, chemicznie zdefiniowanym pożywce lub CDM bez antybiotyków, hodować najsubtelniejsze komórki pszczół do połowy fazy wykładniczej, co trwa około czterech godzin. Zmierzyć absorbancję kultury przy 600 nanometrach i rozcieńczyć komórki do około 600 0,035.

Korzystanie z CDM. Ta średnica zewnętrzna zapewnia, że pojedyncze komórki z odpowiednimi odstępami między komórkami są dostrzegane na szkiełku mikroskopowym do mikroskopii poklatkowej. Jedna godzina przed tym, jak komórki osiągną średni wzrost wykładniczy.

Przygotuj szkiełko mikroskopowe, czyszcząc dwa szkiełka 70% etanolem i wodą. Zdejmij jedną z plastikowych osłon z ramki genetycznej, uważając, aby nie spowodować demontażu plastikowej osłony po drugiej stronie ramki. Przymocuj ramkę genu na środku jednego ze szklanych szkiełek, najpierw przyklejając ją z jednej strony, a następnie prowadząc resztę paznokciem.

Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić 150 miligramów niskotopliwych arosów o wysokiej rozdzielczości. W 10 mililitrach CDM upewnij się, że aros jest całkowicie rozpuszczony, aby zapobiec fluorescencji tła. Odpipetować 500 mikrolitrów ciepłego agro CDM do środka ramki genowej, upewniając się, że cały obszar, w tym granice, jest w pełni pokryty.

Działa szybko, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu aros. Umieść drugie szklane szkiełko na ramce genowej wypełnionej Aros CDM, starając się uniknąć pęcherzyków powietrza. Umieść kanapkę w pozycji poziomej w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 45 minut, aby agros wystarczająco zastygł.

Gdy aros dokładnie zastygnie, zsuń z górnej szklanki. Za pomocą żyletki wytnij paski agro o szerokości około pięciu milimetrów, na których będą rosły bakterie. Na szkiełko można użyć maksymalnie trzech pasków, oddzielonych od siebie odstępami około czterech milimetrów po każdej stronie.

Przestrzenie te zapewnią powietrze, które jest niezbędne do wzrostu Blu. Ostrożnie zdejmij drugą i ostatnią plastikową osłonę z ramki genu, aby odsłonić lepką stronę. Załaduj pojedyncze komórki w około 2,5 mikrolitra płynu na stałe podłoże, zaczynając od góry podkładki agros, nie dotykając jej.

Za pomocą końcówki pipety pozwól medium równomiernie się rozprowadzić, przechylając szkiełko w górę i w dół. Umieść czystą osłonę mikroskopu na ramce genu, aby całkowicie przymocować szkiełko nakrywkowe. Użyj paznokcia, aby wywrzeć nacisk Więc po załadowaniu komórek.

Bardzo ważne jest, aby poczekać, aż płyn wyschnie wystarczająco długo, aby nie doszło do powstania komórek pływających i wzrostu w wielu warstwach. Jeśli jednak komórki będą suszone zbyt długo, będą miały problemy z wyrośnięciem na monowarstwę mikro cholonu. Tak więc czas potrzebny do wyschnięcia szkiełek zależy od eksperymentu i nie można go zmierzyć.

Aby zapobiec problemom z autofokusem w pierwszych godzinach eksperymentu poklatkowego, należy rozgrzać szkiełko przez godzinę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby przygotować się do mikroskopii poklatkowej. Rozgrzej komorę środowiskową przez co najmniej dwie godziny. Przed rozpoczęciem eksperymentu wybierz odpowiednie filtry obiektywu i lustro dichroiczne zgodnie z konfiguracją eksperymentu.

W przypadku długich eksperymentów upewnij się, że filtr UV jest umieszczony między źródłem światła a próbką. Ponadto, jeśli to możliwe, zablokuj część światła wzbudzającego za pomocą filtrów o neutralnej gęstości, aby zminimalizować ekspozycję. Zaprogramuj eksperyment zgodnie z konkretną konfiguracją eksperymentalną.

Rozsądnie jest określić ilość światła wymaganą dla określonych konstrukcji, a także ustawienia automatycznego ustawiania ostrości dla innych mikroskopów poklatkowych lub bakterii przed właściwym eksperymentem. Krótsze czasy naświetlania i niższy poziom światła wzbudzającego zminimalizują bielenie i fototoksyczność Użyj światła skopowego do funkcji automatycznego ustawiania ostrości. Na koniec umieść przygotowane szkiełko w wstępnie podgrzanej komorze środowiskowej mikroskopu i monitoruj wzrost pojedynczych komórek w monowarstwie mikrokolonii w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Udany eksperyment z fluorescencją poklatkową pozwoli na wytworzenie monowarstwy mikrokolonii całkowicie zlokalizowanej w polu widzenia. Pod koniec eksperymentu w tym filmie po lewej stronie znajduje się jasne pole i widać fluorescencję. Po prawej.

Oto przykład mikrokolonii B Subtles, w której niektóre komórki rosły jedna na drugiej, co utrudniało dokładne prześledzenie ich historii, a także prawidłowy pomiar poziomu fluorescencji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie przygotować mikroskopijną próbkę do mikroskopii poklatkowej i jak wykonać poklatkową mikroskopię fluorescencyjną. Eksperymentuj z komórkami BACE.