Name: Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek bakteryjnych Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. Ta technika umożliwia badanie dynamiki białek i zachowań komórkowych na poziomie pojedynczych komórek w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w grupie JWV są wspierane przez stypendium EU Marie-Curie Reintegration Fellowship, grant Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), grant Horizon (ZonMW) oraz stypendium VENI (NWO-ALW). Grupa OPK jest wspierana przez kilka grantów STW (NWO), granty SYSMO1 (IGdeJ) i SYSMO2, grant ESF Eurocores SynBio (SynMod) oraz przez Kluyver Center for Genomics of Industrial Fermentation i Top Institute for Food and Nutrition.

<ol><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li>
<li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li>
<li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li>
<li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li>
<li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li>
<li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li>
<li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li>
<li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li>
<li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSICIC%3A+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li>
<li>Montero, L. lopis P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li>
<li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types%3A+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li>
<li>Hoskins, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li>
<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

Brak declared konfliktów interesów.

W przeciwieństwie do wielu innych technik analizy pojedynczych komórek, opisana tutaj metoda mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse może być wykorzystana do śledzenia historii konkretnej komórki w odniesieniu do jej przodków, zachowania oraz zdarzeń podziału. W połączeniu z fluorescencyjnie znakowanymi promotorami docelowymi lub białkami, można w czasie rzeczywistym śledzić aktywację specyficznych szlaków rozwojowych, a także monitorować lokalizację i dynamikę białek podczas rozwoju bakterii.
Jak wskazano powyżej, badania koncentrujące się na różnych gatunkach bakterii można przeprowadzić poprzez dostosowanie warunków hodowli do wymagań konkretnej bakterii. Jedynymi napotkanymi przez nas ograniczeniami były warunki wzrostu oraz wielkość próbki. Ze względu na szczelne środowisko, warunków pożywki nie można zmieniać w trakcie eksperymentu. Ponadto, w ramach jednego doświadczenia można efektywnie monitorować maksymalnie cztery szczepy. 
Biorąc pod uwagę kilka krytycznych etapów, opisana tutaj metoda analizy pojedynczych komórek może zostać z łatwością zastosowana przy użyciu dowolnego mikroskopu automatycznego. Poniżej przedstawiono przegląd tych krytycznych etapów. Szczegółowe informacje znajdują się w tekście głównym. Przygotowanie ogólne: Zaleca się sprawdzenie ustawień autofokusu wymaganych dla konkretnej bakterii przed rozpoczęciem eksperymentu. Podobnie, jeśli to możliwe, należy wcześniej określić przybliżone optymalne ustawienia dla wizualizacji fluorescencji. Ponadto przestrzeganie przygotowanego harmonogramu pomaga w odpowiednim przygotowaniu wszystkich materiałów (podgrzanie komory mikroskopu, zaprogramowanie ustawień mikroskopu, przygotowanie szkiełka na godzinę przed osiągnięciem przez komórki pożądanej fazy wzrostu, patrz Ryc. 1). Wzrost B. subtilis w TLM i CDM: TLM i CDM są chemicznie zdefiniowanymi mediami głodzeniowymi, w których B. subtilis rośnie powoli. Czas hodowli komórek w tych mediach może wymagać przedłużenia w zależności od konkretnego szczepu. Wolny wzrost zapobiega nakładaniu się komórek na siebie. Przygotowanie próbki do mikroskopu: Należy zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza między ramką genu, szkiełkiem przedmiotowym a szkiełkiem nakrywką, aby uniknąć nadmiernego wysychania medium na bazie agarozy. To samo dotyczy styku medium ze szkiełkiem nakrywką. Kluczowe jest dopuszczenie do wystarczającego wyschnięcia komórek, aby zapobiec ich przemieszczaniu się i/lub wzrostowi wielowarstwowemu. Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse: Podgrzanie szkiełka oraz komory środowiskowej jest kluczowe dla uniknięcia poważnych problemów z autofokusem. Komórki należy wybierać w środku podkładki agarowej, ponieważ mają one największą szansę pozostać w polu widzenia i w ostrości podczas eksperymentu (pod warunkiem, że próbka została wystarczająco wysuszona). Maksymalna liczba 10 lokalizacji na eksperyment wciąż pozwala na prawidłowe działanie. Po wybraniu pierwszej interesującej komórki należy używać oprogramowania wyłącznie do regulacji ostrości (szczegóły w tekście). W ciągu pierwszych godzin eksperymentu należy w odstępach 30 min sprawdzać, czy komórki nadal znajdują się w ostrości. Analiza: Przed przystąpieniem do rozszerzonych procedur analitycznych ważne jest sprawdzenie, czy tło medium ma podobne wartości w kanałach fluorescencji. Małe cząsteczki kurzu, składniki medium, zabrudzone soczewki lub maleńkie grudki agarozy mogą przyczyniać się do lokalnego zwiększenia fluorescencji, co utrudnia lub uniemożliwia analizę filmu. Rozwiązywanie problemów: Jeśli komórki rosną jedna na drugiej, może to wskazywać na zbyt wczesne nałożenie szkiełka nakrywki lub na to, że medium nie nadaje się do wzrostu monowarstw mikrokolonii. Jeśli interesujące komórki stale obumierają przedwcześnie, podczas gdy inne komórki na szkiełku dzielą się prawidłowo, należy sprawdzić, czy filtr UV został ustawiony w odpowiedniej pozycji. Podczas długich eksperymentów pomocne może być również skrócenie czasu ekspozycji lub zmniejszenie natężenia światła.

<table><tbody><tr><td>Ramka odczytu genu</td><td>ABgene Limited</td><td>AB-0578</td><td>1,7 x 2,8 cm</td></tr><tr><td>agaroza niskotopliwa o wysokiej rozdzielczości</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td></td></tr><tr><td>duże szkiełko nakrywkowe</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>opcjonalnie barwnik błonowy, np. FM&lt;sup&gt;&lt;/sup&gt; 5-95</td><td>Invitrogen</td><td>T23360</td><td>dostępne są również inne barwniki membranowe: &lt;a href=&quot;# Arkusz danych produktu

## Sonda TaqMan Gene Expression Assay (Human GAPDH)

**Katalog nr:** mp34653

Sondy TaqMan Gene Expression Assay umożliwiają szybką, dokładną i powtarzalną analizę poziomu ekspresji genów w próbkach RNA za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Każdy zestaw zawiera zoptymalizowane pary starterów oraz specyficzną sondę TaqMan, które zostały zaprojektowane i zweryfikowane pod kątem wydajności i specyficzności dla konkretnego genu.

### Opis produktu
Sonda TaqMan Gene Expression Assay (Human GAPDH) jest przeznaczona do pomiaru poziomu ekspresji genu GAPDH u ludzi. Zestawy te są dostarczane w formie gotowych mieszanek liofilizowanych, co zapewnia spójność wyników między różnymi seriami i laboratoriami.

### Skład zestawu
Każda probówka zawiera:
* Startery (Forward i Reverse)
* Sondę TaqMan

### Zalecane zastosowania
* Analiza ekspresji genów
* Profilowanie transkrypcyjne
* Kwantyfikacja mRNA

### Protokół stosowania

#### 1. Przygotowanie próbek
Wyczerpuj standardowe procedury izolacji RNA i syntezy cDNA. Zaleca się stosowanie wysokiej jakości cDNA w celu zapewnienia optymalnej wydajności amplifikacji.

#### 2. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
Do przeprowadzenia reakcji qPCR należy użyć odpowiedniego master mixu do qPCR (np. TaqMan Fast Advanced Master Mix). 

Przykładowy skład reakcji dla jednej próbki:
* Master Mix (2X): 10 µL
* Sonda TaqMan Gene Expression Assay (20X): 5 µL
* Kwadrat cDNA (rozcieńczony): 5 µL
* Woda wolna od nukleaz: Ilość potrzebna do uzyskania końcowej objętości 20 µL

#### 3. Warunki termiczne
Zaleca się stosowanie następującego cyklu termicznego (dla systemów Fast):
* Aktywacja polimerazy: 95°C przez 20 sekund
* Cykle PCR (40 cykli):
 * Denaturacja: 95°C przez 1 sekundę
 * Przymieście i wydłużanie: 60°C przez 20 sekund (odczyt fluorescencji w tej fazie)

### Interpretacja wyników
Ilość mRNA w próbce można obliczyć, wykorzystując metodę $\Delta\Delta\text{Ct}$ lub standardową krzywą kalibracyjną. Gen GAPDH jest często stosowany jako gen referencyjny (housekeeping gene) do normalizacji danych ekspresji innych genów.

### Przechowywanie i stabilność
* Przechowywać w temperaturze -20°C.
* Unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

### Uwagi
Produkt jest przeznaczony wyłącznie do zastosowań w badaniach naukowych. Nie jest przeznaczony do diagnostyki in vivo lub in vitro.&quot;&gt;**Sonda TaqMan Gene Expression Assay**

**Przegląd**
Sondy TaqMan Gene Expression Assay umożliwiają precyzyjną i czułą analizę ilościową ekspresji genów w próbkach RNA za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR). Każdy zestaw zawiera specyficzną parę starterów oraz sondę fluorescencyjną, które zostały zoptymalizowane pod kątem wydajności i specyficzności w celu zapewnienia dokładnego pomiaru poziomu mRNA konkretnego genu.

**Zasada działania**
Sondy TaqMan wykorzystują mechanizm transferu energii w rezonansie (FRET). Sonda składa się z oligonukleotydu z przyłączonym do jednego końca fluoroforem (reporterem), a do drugiego wygaszaczem (quencherem). Dopóki sonda pozostaje nienaruszona, wygaszacz hamuje sygnał fluorescencyjny reportera. Podczas fazy wydłużania PCR, polimeraza DNA z aktywnością egzonukleazy 5' $\rightarrow$ 3' degraduje sondę, co powoduje oddzielenie reportera od wygaszacza i emisję sygnału fluorescencyjnego proporcjonalnego do ilości syntetyzowanego produktu PCR.

**Zalety**
* **Wysoka specyficzność:** Zastosowanie zarówno starterów, jak i sondy, zapewnia podwójną weryfikację sekwencji docelowej.
* **Kwantyfikacja w czasie rzeczywistym:** Pozwala na monitorowanie amplifikacji w każdym cyklu.
* **Zoptymalizowane parametry:** Każdy assay jest testowany pod kątem wydajności i specyficzności.
* **Kompatybilność:** Możliwość pracy z wieloma systemami qPCR i różnymi barwnikami fluorescencyjnymi.

**Zalecany protokół**

**1. Przygotowanie cDNA**
Przed przeprowadzeniem qPCR należy przekształcić wyizolowane RNA w cDNA za pomocą odwrotnej transkrypcji (RT). Zaleca się stosanie wysokiej jakości zestawów do syntezy cDNA, aby zapewnić reprezentatywność próbki.

**2. Warunki reakcji qPCR**
Sondy TaqMan Gene Expression Assay są zoptymalizowane do pracy z standardowymi mieszankami Master Mix do qPCR zawierającymi polimerazę DNA i dNTP.

Typowy program termiczny:
* **Denaturacja wstępna:** 95°C przez 2–10 minut.
* **Cykle (40 cykli):**
 * Denaturacja: 95°C przez 15 sekund.
 * Przyłączanie i wydłużanie: 60°C przez 1 minutę.

**3. Analiza danych**
Po zakończeniu reakcji qPCR należy przeanalizować krzywe amplifikacji i wyznaczyć wartość Ct (cykl progowy). Do względnej kwantyfikacji ekspresji genów zaleca się metodę $\Delta\Delta$Ct z wykorzystaniem genu referencyjnego (tzw. genu housekeeping), aby znormalizować ilość cDNA w każdej próbce.

**Przechowywanie i stabilność**
Przechowywać w temperaturze -20°C. Unikać częstych cykli zamrażania i rozmrażania poprzez przygotowanie aliquotów.

**Uwagi**
* Zawsze stosuj odpowiednie środki ostrożności przy pracy z materiałami biologicznymi.
* Przechowuj wszystkie odczynniki w temperaturze 4°C podczas przygotowywania reakcji.&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mikroskop do obrazowania poklatkowego z komorą inkubacyjną</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td>szczegółowe informacje na temat naszego urządzenia znajdują się w odpowiednich sekcjach</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek bacillus subtilis i streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy coraz bardziej uświadamiają sobie, że średnie dane uzyskane z eksperymentów opartych na populacjach drobnoustrojów nie są reprezentatywne dla zachowania, stanu lub fenotypu pojedynczych komórek. W związku z tym nowym spostrzeżeniem liczba badań nad pojedynczymi komórkami stale rośnie (nowsze przeglądy literatury zob. 1,2,3). Jednak wiele stosowanych technik analizy pojedynczych komórek nie pozwala na monitorowanie rozwoju i zachowania jednej, konkretnej komórki w czasie (np. cytometria przepływowa lub standardowa mikroskopia).
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy opis metody mikroskopowej wykorzystanej w kilku niedawnych badaniach 4, 5, 6, 7, która umożliwia śledzenie i rejestrowanie (fluorescencji) pojedynczych komórek bakterii Bacillus subtilis oraz Streptococcus pneumoniae podczas wzrostu i podziałów przez wiele pokoleń. Powstające w ten sposób filmy mogą służyć do konstruowania drzew filogenetycznych poprzez odtwarzanie historii pojedynczej komórki w populacji wywodzącej się od jednego wspólnego przodka. Ta metoda mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse może być wykorzystana nie tylko do badania wzrostu, podziału i różnicowania pojedynczych komórek, ale także do analizy wpływu historii i pochodzenia komórki na określone zachowania komórkowe. Ponadto mikroskopia time-lapse idealnie nadaje się do badania dynamiki ekspresji genów oraz lokalizacji białek podczas cyklu komórkowego bakterii. Metoda ta wyjaśnia, jak przygotować komórki bakteryjne i przygotować szkiełko mikroskopowe, aby umożliwić rozwój pojedynczych komórek w mikrokolonię. W skrócie, pojedyncze komórki nanosi się na powierzchnię półstałą, składającą się z pożywki wzrostowej uzupełnionej agarozą, na której rosną i dzielą się pod mikroskopem fluorescencyjnym w komorze środowiskowej z kontrolą temperatury. Obrazy są rejestrowane w określonych odstępach czasu, a następnie analizowane przy użyciu oprogramowania o otwartym kodzie źródłowym ImageJ.

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy coraz bardziej zdawali sobie sprawę, że średnie dane uzyskane z eksperymentów opartych na populacjach drobnoustrojów nie są ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie żywych komórek podczas ich wzrostu i podziału przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, aby można było zbadać wpływ historii i pochodzenia komórek na rozwój komórkowy bakterii. Osiąga się to poprzez najpierw przeniesienie komórek z medium ciekłego o stosunkowo wysokim stężeniu składników odżywczych do ciekłego medium głodzeniowego. Następnie przygotowuje się szkiełko przedmiotowe, na którym komórki bakteryjne wyrosną w mikrokolonię.Przygotowano monowarstwę. Następnie zarejestrowano film z mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse. Na koniec film został poddany obróbce, a dane zostały przeanalizowane.Ostatecznie można uzyskać wyniki obrazujące rozwój pojedynczej komórki bakteryjnej za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa i standardowa mikroskopia, jest możliwość monitorowania dynamiki białek, zachowania komórkowego oraz rozwoju pojedynczych komórek w czasie; procedurę tę zademonstruje Cone, doktorant z mojego laboratorium. Aby przygotować B. subtilis, zaszczep komórki z banków przechowywanych w -80 °C w 10 ml pożywki do mikroskopii poklatkowej (TLM) w sterylnych kolbach z wytrząsaniem, uzupełnionej w razie potrzeby o antybiotyki; hoduj komórki przez noc w 30 °C przy 225 RPM w sterylnej kolbie z wytrząsaniem. Następnego ranka rozcieńcz komórki w stosunku od 1:10 w podgrzanym do odpowiedniej temperatury, chemicznie zdefiniowanym medium (CDM) bez antybiotyków; hoduj komórki B. subtilis do średniej fazy wykładniczej, co zajmuje około czterech godzin. Zmierz absorbancję kultury przy 600 nm i rozcieńcz komórki do przybliżonej wartości a600 wynoszącej 0,035.Z zastosowaniem CDM. Taka wartość OD zapewnia, że pojedyncze komórki z odpowiednimi odstępami między sobą zostaną naniesione na szkiełko mikroskopowe do obrazowania time-lapse. Na jedną godzinę przed osiągnięciem przez komórki środkowej fazy wzrostu wykładniczego.Przygotuj preparat, oczyszczając dwa szkiełka przedmiotowe 70% ethanol i wodą. Zdejmij jedną z plastikowych osłonek z ramki do genów, uważając, aby nie spowodować odłączenia osłony po drugiej stronie ramki. Przymocuj ramkę do genów na środku jednego ze szkiełek, przyklejając najpierw jedną krawędź, a następnie dociskając pozostałą część paznokciem.Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić 150 mg wysokorozdzielczego agarozy o niskiej temperaturze topnienia. W 10 mL CDM upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona, aby zapobiec fluorescencji tła. Pipetuj 500 µL ciepłej agarozy w CDM na środek ramki genu, upewniając się, że cały obszar, w tym krawędzie, jest w pełni pokryty.Należy pracować szybko, aby zapobiec nadmiernemu wysychaniu agarozy. Drugie szkiełko przedmiotowe należy położyć na ramce genowej wypełnionej Aros CDM, starając się uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Tak przygotowaną kanapkę należy umieścić w pozycji poziomej w temperaturze 4°C na 45 minut, aby agaroza wystarczająco stężała.Po ostrożnym zastygnięciu agaru, zsuń górną szybkę. Za pomocą żyletki wytnij paski agaru o szerokości około 5 mm, na których będą rosły bakterie. Na jednym szkiełku można umieścić maksymalnie trzy paski, zachowując odstępy około 4 mm z każdej strony.Przestrzenie te zapewnią dopływ powietrza, który jest niezbędny do wzrostu Blu. Ostrożnie zdejmij drugą i ostatnią plastikową osłonę z ramki genowej, aby odsłonić lepką stronę. Nanieś pojedyncze komórki w około 2,5 µL cieczy na podłoże stałe, zaczynając od górnej części podkładki agros, nie dotykając jej.Za pomocą końcówki pipety rozprowadź równomiernie medium, przechylając szkiełko przedmiotowe w górę i w dół. Na ramkę genu nałóż czyste szkiełko nakrywkę, aby całkowicie ją przylepić. Po naniesieniu komórek dociśnij szkiełko paznokciem.Kluczowe jest odczekanie wystarczająco długo, aż ciecz wyschnie, aby uniknąć przemieszczania się komórek i ich wzrostu w wielu warstwach. Jednakże, jeśli komórki będą suszone zbyt długo, mogą wystąpić problemy z ich wzrostem w monowarstwę mikrocholonów. Zatem czas wymagany do wysuszenia preparatów zależy od eksperymentu i nie może zostać precyzyjnie określony.W związku z tym należy oczywiście wypracować odpowiednie wyczucie. Aby zapobiec problemom z autofokusem w pierwszych godzinach eksperymentu time-lapse, przed przystąpieniem do mikroskopii time-lapse należy podgrzać preparat przez jedną godzinę w temperaturze 30 °C. Komorę środowiskową należy podgrzewać przez co najmniej dwie godziny. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dobrać odpowiedni obiektyw, filtry i lustro dichroiczne, zgodnie z konfiguracją eksperymentalną.W przypadku długich eksperymentów należy upewnić się, że między źródłem światła a próbką umieszczono filtr UV. Ponadto, jeśli to możliwe, należy zablokować część światła wzbudzenia za pomocą filtrów neutralnych, aby zminimalizować ekspozycję. Zaprogramuj eksperyment zgodnie z konkretną konfiguracją doświadczalną.Zaleca się, aby przed właściwym eksperymentem określić ilość światła wymaganą dla konkretnych konstruktów, a także ustawienia autofokusa dla innych mikroskopów do lapse-time lub bakterii. Krótsze czasy naświetlania i niższe poziomy światła wzbudzenia zminimalizują blaknięcie oraz fototoksyczność. Do funkcji autofokusa należy używać światła mikroskopowego. Na koniec należy umieścić przygotowany preparat w wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej mikroskopu i monitorować wzrost pojedynczych komórek w monowarstwę mikrokolonii w temperaturze 30 °C.Pomyślnie przeprowadzony eksperyment z fluorescencją w trybie time-lapse pozwoli na uzyskanie monowarstwy mikrokolonii znajdującej się w całości w polu widzenia. Na końcu eksperymentu przedstawionego w tym filmie, po lewej stronie widoczny jest obraz w jasnym polu, a po prawej obraz fluorescencji.Oto przykład mikrokolonii B Subtles, w której niektóre komórki narosły na sobie, co utrudnia dokładne prześledzenie ich historii oraz prawidłowy pomiar poziomów fluorescencji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak skutecznie przygotować próbkę mikroskopową do mikroskopii time-lapse oraz jak przeprowadzić fluorescencyjną mikroskopię time-lapse. Eksperyment z komórkami BACE.

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii time-lapse

Aby zbadać zachowanie roju Myxococcus xanthus, opracowaliśmy protokół mikrokinematografii poklatkowej, który można modyfikować dla różnych analiz. Wykorzystuje on standardowe warunki hodowli dostosowane do mikroskopii i zapewnia powtarzalne wyniki dzięki zastosowaniu niedrogich, wielorazowych uszczelek silikonowych. Metodę tę wykorzystaliśmy do ilościowego określenia wielokomórkowego chemotaksy.

Nagrywanie zachowań wielokomórkowych w biofilmach Myxococcus xanthus przy użyciu mikrocynematografii poklatkowej

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Źródło: Schlimpert, S. i in. Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życia bakterii Streptomyces venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji kiełkowania, wzrostu strzępek i zarodnikowania w czasie rzeczywistym.

Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe cyklu życiowego Streptomyces venezuelae

Źródło: Makowski, Ł., i in. Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życia bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne Bdellovibrio bacteriovorus polującego na unieruchomionej E. coli pod agarozową poduszką, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym replikacji wewnątrzkomórkowej i uwalniania potomstwa do badania drapieżnictwa bakteryjnego i interakcji...

Obrazowanie czasowe z żywymi komórkami drapieżnictwa bakterioworu Bdellovibrio na E. coli

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Prezentowany tutaj jest protokół, który opisuje monitorowanie pełnego cyklu życia drapieżnej bakterii Bdellovibrio bacteriovorus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w połączeniu z podkładką agarozową i naczyniami do obrazowania komórek.

Obrazowanie żywymi komórkami cyklu życiowego bakteryjnego drapieżnika Bdellovibrio bacteriovorus przy użyciu poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek bakteryjnych Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae przy użyciu zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej poklatkowej. Ta technika umożliwia badanie dynamiki białek i zachowań komórkowych na poziomie pojedynczych komórek w czasie.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Przeglądaj więcej filmów