Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej
28 lipca 2011
Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie żywych komórek podczas ich wzrostu i podziału przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, aby można było zbadać wpływ historii i pochodzenia komórek na rozwój komórkowy bakterii. Osiąga się to poprzez najpierw przeniesienie komórek z medium ciekłego o stosunkowo wysokim stężeniu składników odżywczych do ciekłego medium głodzeniowego. Następnie przygotowuje się szkiełko przedmiotowe, na którym komórki bakteryjne wyrosną w mikrokolonię.
Przygotowano monowarstwę. Następnie zarejestrowano film z mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse. Na koniec film został poddany obróbce, a dane zostały przeanalizowane.
Ostatecznie można uzyskać wyniki obrazujące rozwój pojedynczej komórki bakteryjnej za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa i standardowa mikroskopia, jest możliwość monitorowania dynamiki białek, zachowania komórkowego oraz rozwoju pojedynczych komórek w czasie; procedurę tę zademonstruje Cone, doktorant z mojego laboratorium. Aby przygotować B. subtilis, zaszczep komórki z banków przechowywanych w -80 °C w 10 ml pożywki do mikroskopii poklatkowej (TLM) w sterylnych kolbach z wytrząsaniem, uzupełnionej w razie potrzeby o antybiotyki; hoduj komórki przez noc w 30 °C przy 225 RPM w sterylnej kolbie z wytrząsaniem. Następnego ranka rozcieńcz komórki w stosunku od 1:10 w podgrzanym do odpowiedniej temperatury, chemicznie zdefiniowanym medium (CDM) bez antybiotyków; hoduj komórki B. subtilis do średniej fazy wykładniczej, co zajmuje około czterech godzin. Zmierz absorbancję kultury przy 600 nm i rozcieńcz komórki do przybliżonej wartości a600 wynoszącej 0,035.
Z zastosowaniem CDM. Taka wartość OD zapewnia, że pojedyncze komórki z odpowiednimi odstępami między sobą zostaną naniesione na szkiełko mikroskopowe do obrazowania time-lapse. Na jedną godzinę przed osiągnięciem przez komórki środkowej fazy wzrostu wykładniczego.
Przygotuj preparat, oczyszczając dwa szkiełka przedmiotowe 70% ethanol i wodą. Zdejmij jedną z plastikowych osłonek z ramki do genów, uważając, aby nie spowodować odłączenia osłony po drugiej stronie ramki. Przymocuj ramkę do genów na środku jednego ze szkiełek, przyklejając najpierw jedną krawędź, a następnie dociskając pozostałą część paznokciem.
Użyj kuchenki mikrofalowej, aby rozpuścić 150 mg wysokorozdzielczego agarozy o niskiej temperaturze topnienia. W 10 mL CDM upewnij się, że agaroza jest całkowicie rozpuszczona, aby zapobiec fluorescencji tła. Pipetuj 500 µL ciepłej agarozy w CDM na środek ramki genu, upewniając się, że cały obszar, w tym krawędzie, jest w pełni pokryty.
Należy pracować szybko, aby zapobiec nadmiernemu wysychaniu agarozy. Drugie szkiełko przedmiotowe należy położyć na ramce genowej wypełnionej Aros CDM, starając się uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Tak przygotowaną kanapkę należy umieścić w pozycji poziomej w temperaturze 4°C na 45 minut, aby agaroza wystarczająco stężała.
Po ostrożnym zastygnięciu agaru, zsuń górną szybkę. Za pomocą żyletki wytnij paski agaru o szerokości około 5 mm, na których będą rosły bakterie. Na jednym szkiełku można umieścić maksymalnie trzy paski, zachowując odstępy około 4 mm z każdej strony.
Przestrzenie te zapewnią dopływ powietrza, który jest niezbędny do wzrostu Blu. Ostrożnie zdejmij drugą i ostatnią plastikową osłonę z ramki genowej, aby odsłonić lepką stronę. Nanieś pojedyncze komórki w około 2,5 µL cieczy na podłoże stałe, zaczynając od górnej części podkładki agros, nie dotykając jej.
Za pomocą końcówki pipety rozprowadź równomiernie medium, przechylając szkiełko przedmiotowe w górę i w dół. Na ramkę genu nałóż czyste szkiełko nakrywkę, aby całkowicie ją przylepić. Po naniesieniu komórek dociśnij szkiełko paznokciem.
Kluczowe jest odczekanie wystarczająco długo, aż ciecz wyschnie, aby uniknąć przemieszczania się komórek i ich wzrostu w wielu warstwach. Jednakże, jeśli komórki będą suszone zbyt długo, mogą wystąpić problemy z ich wzrostem w monowarstwę mikrocholonów. Zatem czas wymagany do wysuszenia preparatów zależy od eksperymentu i nie może zostać precyzyjnie określony.
W związku z tym należy oczywiście wypracować odpowiednie wyczucie. Aby zapobiec problemom z autofokusem w pierwszych godzinach eksperymentu time-lapse, przed przystąpieniem do mikroskopii time-lapse należy podgrzać preparat przez jedną godzinę w temperaturze 30 °C. Komorę środowiskową należy podgrzewać przez co najmniej dwie godziny. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dobrać odpowiedni obiektyw, filtry i lustro dichroiczne, zgodnie z konfiguracją eksperymentalną.
W przypadku długich eksperymentów należy upewnić się, że między źródłem światła a próbką umieszczono filtr UV. Ponadto, jeśli to możliwe, należy zablokować część światła wzbudzenia za pomocą filtrów neutralnych, aby zminimalizować ekspozycję. Zaprogramuj eksperyment zgodnie z konkretną konfiguracją doświadczalną.
Zaleca się, aby przed właściwym eksperymentem określić ilość światła wymaganą dla konkretnych konstruktów, a także ustawienia autofokusa dla innych mikroskopów do lapse-time lub bakterii. Krótsze czasy naświetlania i niższe poziomy światła wzbudzenia zminimalizują blaknięcie oraz fototoksyczność. Do funkcji autofokusa należy używać światła mikroskopowego. Na koniec należy umieścić przygotowany preparat w wstępnie ogrzanej komorze środowiskowej mikroskopu i monitorować wzrost pojedynczych komórek w monowarstwę mikrokolonii w temperaturze 30 °C.
Pomyślnie przeprowadzony eksperyment z fluorescencją w trybie time-lapse pozwoli na uzyskanie monowarstwy mikrokolonii znajdującej się w całości w polu widzenia. Na końcu eksperymentu przedstawionego w tym filmie, po lewej stronie widoczny jest obraz w jasnym polu, a po prawej obraz fluorescencji.
Oto przykład mikrokolonii B Subtles, w której niektóre komórki narosły na sobie, co utrudnia dokładne prześledzenie ich historii oraz prawidłowy pomiar poziomów fluorescencji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak skutecznie przygotować próbkę mikroskopową do mikroskopii time-lapse oraz jak przeprowadzić fluorescencyjną mikroskopię time-lapse. Eksperyment z komórkami BACE.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę monitorowania zachowania pojedynczych komórek bakteryjnych w czasie z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse. Zawiera on szczegółowe wytyczne dotyczące przygotowania próbek oraz analizy uzyskanych obrazów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Mikroskopia fluorescencyjna
Wprowadzenie
- Zrozumienie zachowania komórek bakteryjnych jest kluczowe dla wielu badań biologicznych.
- Mikroskopia poklatkowa umożliwia obserwację dynamiki żywych komórek.
- Metoda ta pozwala uzyskać wgląd w wpływ historii komórki na jej rozwój.
- Tradycyjne metody mogą nie uchwycić niuansów zachowania pojedynczych komórek.
Cel badania
- W celu wizualizacji żywych komórek bakteryjnych podczas wzrostu i podziału.
- W celu analizy wpływu warunków odżywczych na rozwój komórkowy.
- W celu pogłębienia wiedzy na temat dynamiki białek i zachowania komórek.
Zastosowane metody
- Przenieś komórki do pożywki głodowej, aby zainicjować wzrost.
- Przygotuj szkiełko mikroskopowe do wzrostu bakterii.
- Nagraj filmy z fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej.
- Przeanalizuj zarejestrowane dane, aby zaobserwować rozwój komórek.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie pojedynczych komórek bakteryjnych w czasie.
- Obserwacja powstawania i rozwoju mikrokolonii.
- Wnioski dotyczące dynamiki ekspresji białek w pojedynczych komórkach.
- Wykazanie zalet mikroskopii poklatkowej w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
Wnioski
- Protokół ten w skuteczny sposób umożliwia badanie zachowania pojedynczych komórek bakterii.
- Mikroskopia poklatkowa jest potężnym narzędziem analizy komórkowej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu analizy innej dynamiki bakteryjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Monitorowanie zachowania pojedynczych komórek bakterii umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka przy walidacji celów przeciwdrobnoustrojowych poprzez ujawnienie heterogeniczności w zakresie wzrostu, podziału i ekspresji białek. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków poprzez łączenie historii komórkowej z wynikami fenotypowymi, co pozwala na optymalizację portfela projektów w rozwoju antybiotyków. Mikroskopia poklatkowa zapewnia ciągłość translacyjną od screeningu mechanistycznego po ocenę w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez śledzenie odpowiedzi poszczególnych komórek na zmiany w dostępie do składników odżywczych oraz perturbacje genetyczne w czasie.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki białek i zachowania komórkowego w pojedynczych komórkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez korelację pochodzenia komórkowego ze stabilnością fenotypową w kolejnych generacjach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania związków poprzez uzyskanie powtarzalnej formacji mikrokolonii na podkładkach agarozowych.
- Wyniki ilościowe: Generuje rozdzielone w czasie dane fluorescencyjne i w jasnym polu, umożliwiając pomiar tempa wzrostu, czasu podziału oraz lokalizacji białek.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w różnych gatunkach bakterii (B. subtilis, S. pneumoniae) w celu standaryzowanej oceny celów przeciwdrobnoustrojowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Modelowanie zachowania patogenów u gatunków istotnych klinicznie, takich jak S. pneumoniae, w celu dostarczenia danych do badań nad mechanizmem działania środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Zgodność z translacyjnymi biomarkerami: Powiązanie dynamiki białek w pojedynczych komórkach z fenotypami na poziomie populacyjnym, co wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o biomarkery.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w modelach przedklinicznych poprzez walidację efektów celowanych w rozdzielczości pojedynczej komórki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta pozycjonuje obrazowanie poklatkowe pojedynczych komórek pomiędzy walidacją celu a optymalizacją wiodących związków, umożliwiając weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego przed przesiewaniem związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację wpływu dynamiki ekspresji genów na zachowanie komórek podczas wzrostu i podziału.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy mikrokolonie o ustandaryzowanych odstępach i strukturze monowarstwy, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe zmienne zależne, w tym intensywność fluorescencji, czas podziału oraz śledzenie linii komórkowych do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy obserwacje pojedynczych komórek z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie zachowań zależnych od pochodzenia w systemach patogenów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość ponownego wykorzystania mikroskopii do międzyprojektowej oceny celów przeciwdrobnoustrojowych w modelach bakterii Gram-dodatnich.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki białek w pojedynczych komórkach oraz heterogeniczności behawioralnej.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane przygotowanie preparatów oraz kontrola warunków środowiskowych zapewniają powtarzalność pomiędzy laboratoriami i seriami eksperymentalnymi.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go dzięki redukcji ryzyka związanego z celami na podstawie spójności odpowiedzi w pojedynczych komórkach, a nie średnich populacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Skorygowana pod kątem ryzyka priorytetyzacja kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe z wykorzystaniem danych fenotypowych z rozdzielczością linii komórkowych, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich wynikających z maskowania populacyjnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu technik hodowli drobnoustrojów, mikroskopii fluorescencyjnej oraz oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ.
- Metoda jest zależna od komór środowiskowych z kontrolą temperatury, filtrów neutralnych oraz ochrony przed promieniowaniem UV podczas długotrwałego obrazowania.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja przygotowania preparatów, stężenia agarozy oraz protokołów nakładania komórek w celu zapewnienia spójności międzylaboratoryjnej.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują optymalizację grubości agarozy oraz składu składników odżywczych dla różnych gatunków bakterii i szybkości ich wzrostu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko fototoksyczności podczas przedłużonego obrazowania oraz trudności w śledzeniu komórek rosnących w formacjach wielowarstwowych.
