Name: Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach MCF7 przy użyciu mikroskopii konfokalnej i oprogramowania ImageJ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Nauki w ramach grantu nr 2014/14/M/NZ1/00437.

1. Kroki przygotowawcze
<ol>
	<li>Wysiew komórek w celu uzyskania konfluentnych monowarstw
	<ol>
		<li>Przed wysiewem pokryć dołki szkiełka z 4 komorami kolagenem I (lub innym wybranym komponentem ECM). W przypadku pokrywania kolagenem I należy postępować zgodnie z protokołem komercyjnym: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html przy stężeniu 8 μg/cm2.</li>
		<li>Wysiać 400 000 komórek do jednego dołka szkiełka z 4 komorami.</li>
		<li>Hodować komórki przez 24 h (lub dłużej, w zależności od punktów końcowych eksperymentu) przed barwieniem, w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2. Krok ten pozwala na dojrzewanie kontaktów międzykomórkowych i formowanie się monowarstw.</li>
		<li>Użyć odwróconego mikroskopu optycznego, aby zweryfikować konfluencję (wymagane jest około 90%) oraz ogólny stan monowarstw. Nie kontynuować procedury, jeśli komórki pływają lub wykazują oznaki stresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne 
	UWAGA: Komórki można barwić zgodnie z wybranym protokołem. W niniejszym przypadku immunofluorescencję przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem4.
	<ol>
		<li>Do analizy adhezji ogniskowej należy zbarwić komórki wybranym białkiem adhezji ogniskowej (w tym protokole paksylliną). Do analizy kształtu komórek należy zastosować barwienie wybranym białkiem połączeń międzykomórkowych (w tym protokole białkiem desmosomalnym plakoglobiną).</li>
		<li>W procedurze należy stosować 0,5 mL określonych roztworów, chyba że wskazano inaczej.</li>
		<li>Utrwalić komórki w 4% formaldehydzie w PBS przez 30 min na lodzie.</li>
		<li>Inkubować z 0,1 M chlorkiem amonu (w PBS) przez 10 min w celu wygaszenia autofluorescencji.</li>
		<li>Dodać 0,5% Triton X-100 (w PBS) na 30 min (permeabilizacja).</li>
		<li>Blokować 5% mlekiem (lub 1% BSA) w TBS-T przez 1 h.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4 °C przez noc (anty-paksyllina: królik, 1:250, anty-plakoglobina: królik, 1:400).</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym przez 30 min (Alexa Fluor 594 koza anty-królik, 1:500, 1:500).</li>
		<li>Barwić 300 nM DAPI przez 1-5 min, chroniąc przed światłem. 
		UWAGA: Opcjonalnie można przeprowadzić dodatkowe barwienie aktyny koniugatami fluorescencyjnymi falloidyny (stężenie 1:400); falloidynę należy dodać w tym samym kroku co przeciwciało wtórne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne
	<ol>
		<li>Wykonać obrazy pojedynczych przekrojów Z przy użyciu mikroskopu konfokalnego (np. Zeiss LSM800). 
		UWAGA: Opcjonalne barwienie aktyny może pomóc w ocenie właściwej płaszczyzny ogniskowania. Barwienie aktyny kortykalnej występuje w regionie apikalnym, natomiast włókna stresowe aktyny znajdują się w regionie bazalnym, blisko podłoża, co zilustrowano na Rysunku 1.</li>
		<li>Obrazowanie adhezji ogniskowej
		<ol>
			<li>Do analizy adhezji ogniskowej wybrać przekroje Z z regionu bazalnego, blisko podłoża.</li>
			<li>Użyć obiektywu o najwyższej dostępnej aperturze numerycznej (preferowane 63x N.A.: 1.4). 
			UWAGA: Kształt adhezji ogniskowej (FA) jest bardzo specyficzny i łatwo rozpoznawalny. Dlatego zaleca się rozpoczęcie skanowania od płaszczyzny ogniskowania poniżej komórek, a następnie powolne skanowanie w ich kierunku, aż FA będą wyraźnie widoczne. Analiza obrazu będzie dokładniejsza przy mniejszych polach widzenia, które mają tendencję do większej jednorodności, ale wiąże się to z obliczeniem mniejszej liczby komórek w jednym polu widzenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obrazowanie kontaktów międzykomórkowych
		<ol>
			<li>Użyć obiektywu 40x lub 63x.</li>
			<li>Wybrać kanały dla barwienia jąder oraz barwienia preferowanego białka połączeń.</li>
			<li>Do analizy kształtu komórek wybrać przekroje Z z regionu apikalnego monowarstw.</li>
			<li>Wykonać zdjęcia dla co najmniej 3 różnych pól widzenia (200-400 komórek).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza obrazu
UWAGA: Dostarczone makra działają optymalnie w wersji ImageJ 1.50f lub nowszej. Należy ich używać wyłącznie do kwantyfikacji obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu i bez pikseli niedonasyconych lub przesyconych. Opisane metody obejmują kroki wymagające ręcznej regulacji parametrów. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie analizy w ciemno/ściepionego eksperymentu. Do szyfrowania nazw plików obrazów można użyć wtyczek ImageJ, takich jak „Blind Analysis Tool” (dostępny pod adresem: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools).
<ol>
	<li>Analiza adhezji ogniskowej 
	UWAGA: Zalecanymi plikami wejściowymi dla następujących metod są: obrazy FA przedstawione w 8-bitowej skali szarości zapisane w formacie .tiff.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz za pomocą programu ImageJ.</li>
		<li>Ustaw skalę obrazu na piksele (Analiza | Ustawienie skali; Usunąć skalę i sprawdzić Globalny opcja).</li>
		<li>W opcjach pomiaru uwzględnij nazwę pliku oraz obszar ROI (Analizuj | Ustaw pomiary…); sprawdź Obszar i Etykieta wyświetlania opcje</li>
		<li>Odejmij tło (Proces | Odejmowanie tła; zestaw Promień toczącej się kulki parametr na 50 pikseli; sprawdź Przesuwna paraboloida opcja). W przypadku obrazów RGB w pseudokolorach: rozdziel kanały RGB, pozostaw otwarty kanał z FA, zamknij pozostałe kanały (Obraz | Kolor | Rozdzielenie kanałów).</li>
		<li>Wyznacz pole powierzchni najmniejszego obszaru zainteresowania (ROI). Używając zaznaczenia swobodnego lub wielokąta, obrysuj pojedynczą, najmniejszą adhezję ogniskową i zmierz jej powierzchnię (Analiza | Pomiar). Powtórz ten krok dla różnych obszarów zainteresowania (ROI; FA) z kilku losowo wybranych obrazów (łącznie 20 ROI). Oblicz i zapisz średnią z uzyskanych wyników. 
		UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko podczas pierwszej analizy danego zestawu obrazów (konkretna linia komórkowa, szkiełka pokryte określonymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, inne warunki hodowli).</li>
		<li>Konwertuj obraz na binarny stosując jedną z następujących metod:
		<ol>
			<li>Ustaw globalny próg (Obraz | Dopasuj | Próg; sprawdź Domyślny, B&amp;W i Ciemne tło opcje, ręczne dostosowanie progu lub jego automatyczne ustawienie).</li>
			<li>Ustaw lokalny próg (Obraz | Dopasuj | Auto Local Threshold…; zbiór Metoda do Phansalkara i sprawdź Białe obiekty na czarnym tle opcja. Następnie odwróć obraz (Edytuj | Odwróć).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zmierz liczbę i powierzchnię obszarów ROI. Wybierz Analiza | Analiza cząsteksprawdź Jednostki pikseli, Wyświetl wyniki, Wyczyść wyniki i Podsumuj opcjeustawić Parametr rozmiarujako dolną granicę przyjmij średnią z najmniejszych obszarów ROI z kroku 2.1.5. Górną granicę można ustawić na poziomie 25% typowej powierzchni komórki.</li>
		<li>Przenieś dane (obejmujące odpowiednio: nazwę obrazu, liczbę FA, całkowitą i średnią powierzchnię FA; Przekrój, Liczba, Powierzchnia całkowita, Średnia wielkość) z Streszczenie okno wybranego programu do zarządzania danymi.</li>
		<li>Wyznacz liczbę komórek na obraz poprzez policzenie jąder zabarwionych DAPI. Liczenie można przeprowadzić ręcznie (Wtyczki | Analiza | Licznik komórek) lub zgodnie z dostępnymi protokołami, takimi jak: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.</li>
		<li>Alternatywnie, aby ułatwić zliczanie adhezji ogniskowych (FAs), należy użyć załączonego makra ImageJ (FAs.ijm).
		<ol>
			<li>Przenieś plik .ijm z makrem do folderu plugins lub macros znajdującego się w katalogach plików źródłowych ImageJ.</li>
			<li>Wyznacz obszar najmniejszego ROI, zgodnie z opisem w kroku 2.1.4.</li>
			<li>Otwórz plik makra (Wtyczki | Makra | Edytuj...).</li>
			<li>Przed uruchomieniem makra należy ustawić wartości trzech zmiennych: wartość wypełnienia dla pole_najmniejszego_obszaru_zainteresowania z liczbą uzyskaną w kroku 2.1.4. Ustaw typ_progu wartość do instrukcja lub automatyczny.</li>
			<li>Zapisz zmiany (makro powinno być gotowe do użycia).</li>
			<li>Uruchom makro z panelu ImageJ lub przypisz do niego skrót klawiszowy. Makro rozpoczyna się od standardowego otwórz okno dialogowe. Wybierz obraz do przetworzenia. 
			UWAGA: W przypadku ręcznej regulacji progu wymagane będzie ręczne potwierdzenie wartości progu (należy unikać akceptowania zmian za pomocą Zastosuj przycisk włączania Próg okno dialogowe, użycie Wymagane działanie okno dialogowe użytkownika). Wyniki uzyskane przy użyciu makra są takie same, jak opisano w kroku 2.1.8 (zawarte w Streszczenie okno dialogowe). Dodatkowo, w przypadku ręcznej regulacji progu Dolny poziom progowy jest przedstawione w Dziennik okno dialogowe, ponieważ wartość ta pozwala na odtworzenie uzyskanych wyników w przyszłości, jeśli będzie to konieczne. Rysunki uzupełniające S1 i S2 zostały uwzględnione jako zbiór danych treningowych dla makra FAs.ijm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza kształtu komórek
	<ol>
		<li>Podręcznik
		<ol>
			<li>Otwórz obraz w programie ImageJ lub innym oprogramowaniu do przetwarzania obrazów o podobnym zestawie funkcji (dalsze instrukcje odnoszą się do programu ImageJ). Wybierz parametry do pomiaru z menu Analiza | Ustawienia pomiarów i tykanie Deskryptory kształtu w pojawiającym się oknie.</li>
			<li>Ręcznie wyznacz granice komórek, znakowane wybranymi białkami połączeń, przy użyciu Zaznaczenia ręczne ikona. Wybrane parametry są automatycznie obliczane dla każdej komórki. Po obrysowaniu każdej komórki należy zapisać wyniki, klikając Edytuj | Wybór | Dodaj do menedżeraNależy liczyć wyłącznie komórki kompletne, w całości widoczne i o nieprzerwanych granicach.</li>
			<li>Po obrysowaniu wszystkich komórek w polu widzenia należy przeprowadzić pomiar, zaznaczając wszystkie numery pojawiające się w lewym polu okna ROI Manager (odpowiadające komórkom), a następnie klikając Pomiar Wyniki pojawiają się w Wyniki pole i można je przenieść do wybranego arkusza kalkulacyjnego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zautomatyzowany 
		UWAGA: Aby ułatwić kwantyfikację deskryptorów kształtu komórek (CSI, współczynnik kształtu, okrągłość, zwartość), do niniejszego artykułu dołączono przygotowane makro ImageJ (CSI.ijm). Makro to opiera się głównie na wtyczce ImageJ o nazwie MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5Makro wykonuje następujące kroki: 1) rozszerzenie każdej krawędzi obrazu o 10 czarnych pikseli [MorpholibJ]; 2) serie dylatacji i erozji – filtr morfologiczny [MorpholibJ]; 3) generowanie obrazu binarnego granic komórek poprzez segmentację morfologiczną [MorpholibJ]; 4) dylatacja granic komórek; 5) inwersja wartości pikseli; 6) generowanie zaznaczeń oraz pomiar pola powierzchni i obwodu komórek na obrazie; oraz 7) zapisanie obrazu z obrysowanymi komórkami oraz zaznaczeń ROI ImageJ w nowym pliku.
		<ol>
			<li>Przenieś plik .ijm z makrem do folderu plugins lub macros znajdującego się w folderach plików źródłowych ImageJ. Uruchom makro z panelu ImageJ lub utwórz do niego skrót.</li>
			<li>Przed kwantyfikacją nowego zestawu danych należy określić wartości dla najmniejszych i największych obszarów zainteresowania. Obrysować (za pomocą zaznaczenia swobodnego lub wielokąta) kilka (3–10) przykładów najmniejszych i największych komórek na obrazie, a następnie zmierzyć ich pole powierzchni (Analiza | Pomiar).</li>
			<li>Alternatywnie należy uruchomić makro z ustawieniami domyślnymi (dolna granica rozmiaru ustawiona na 0, a górna na nieskończoność), odczekać do zakończenia działania makra, a następnie wybrać Ustawienie granic rozmiaru komórek opcja. Pomierz powierzchnię najmniejszych i największych komórek, klikając na ich etykiety, a następnie naciśnij Pomiar w menedżerze ROI programu ImageJ. Ustaw wartość najmniejsza komórka i największa komórka zmiennych. Zapisz zmiany, zamknij wszystkie okna dialogowe makra i uruchom makro ponownie. 
			UWAGA: Makro można stosować bez definiowania granic rozmiaru ROI, jednak nie jest to zalecane, ponieważ znacząco zwiększa to ryzyko pomiaru nieodpowiednich fragmentów komórek lub skupisk komórkowych.</li>
			<li>Uruchom makro za pomocą standardu Otwórz okno dialogowe. Wybierz obraz do przetworzenia (skala szarości).</li>
			<li>Przeanalizuj wyniki. Wynik dostarczony przez makro składa się z: tabeli wyników (etykieta komórki, etykieta obrazu, pole powierzchni komórki [piksele2], obwód komórki [piksele2], kolistość [CSI], stosunek boków, okrągłość, zwartość), obraz z obrysowanymi komórkami i listą zaznaczonych obszarów ROI (która zostanie również zapisana w nowym pliku w Wyniki podfolder). Tabela z wynikami zostanie automatycznie skopiowana do schowka użytkownika. 
			UWAGA: Rysunki uzupełniające S3 i S4 zostały uwzględnione jako zbiór danych treningowych dla makra CSI.ijm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie
<ol>
	<li>Ilościowe oznaczanie FA
	<ol>
		<li>Oblicz średnią liczbę FA oraz średni rozmiar FA na komórkę/jądro. 
		UWAGA: W przypadku niektórych linii komórkowych możliwe jest osobne zliczanie FA w poszczególnych komórkach. Dla linii komórkowych o silnych kontaktach międzykomórkowych, które rosną w formie monowarstw, takich jak MCF7, liczbę i rozmiar FA na komórkę można obliczyć, dzieląc wartości uzyskane z zliczania FA przez liczbę jąder w całym obrazie.</li>
		<li>Oceń istotność statystyczną potencjalnych różnic między populacjami (grupami eksperymentalnymi). W zależności od rozkładu i wariancji danych, do porównania dwóch różnych grup zastosuj test t Studenta (rozkład normalny) lub nieparametryczny test U (Mann-Whitneya). Do porównania wielu grup zastosuj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) lub test Kruskala-Wallisa w połączeniu z odpowiednimi testami post-hoc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza kształtu komórek
	<ol>
		<li>Obliczanie deskryptorów kształtu
		<ol>
			<li>Analiza manualna: Oblicz indeks kształtu komórki (CSI, nazywany również kolistością lub kształtem komórki) w wybranym arkuszu kalkulacyjnym dla każdej mierzonej komórki na podstawie odpowiedniej powierzchni i obwodu, korzystając ze wzoru: 
			<img alt="Wzór na CSI: CSI = 4π × powierzchnia/(obwód)², schemat wzoru, obliczanie indeksu kolistości." src="/files/ftp_upload/61461/61461equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
			UWAGA: CSI przyjmuje wartości od 1 (okrągły) do 0 (wydłużony). Przykłady różnych kształtów komórek (o tej samej powierzchni) i ich odpowiadające wartości CSI przedstawiono na Rysunku 2. W analizie zautomatyzowanej wartości deskryptorów kształtu (wymienione i zdefiniowane poniżej) są obliczane automatycznie i pojawiają się w oknie wyników: 
			(1) CSI = 4π*powierzchnia/(obwód)2 
			(2) AR = oś większa/oś mniejsza 
			(3) Roundness = 4*powierzchnia/π*(oś większa)2 
			(4) Solidity = powierzchnia/powierzchnia wypukła</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Histogramy rozkładu kształtu komórek
		<ol>
			<li>Przedstaw rozkład kształtu komórek w formie histogramu kolistości (CSI). Zaklasyfikuj komórki według ich wartości CSI (obliczonej dla minimum 200–400 komórek) do jednego z dziesięciu równych przedziałów (zakres: 0-1, szerokość słupka: 0,1). Histogram wyświetla liczbę komórek w każdej kategorii. 
			UWAGA: Histogram pokazujący rozkład kształtu typowej warstwy komórek MCF7 wykazuje szczyt w okolicach 0,7-0,8 CSI. Jeśli kształt komórek jest zaburzony przez jakiś czynnik (na przykład leczenie paklitakselem, które powoduje zatrzymanie w fazie G2/M i w konsekwencji więcej komórek jest okrągłych), powinno to być odzwierciedlone na histogramie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykresy rozkładu kumulatywnego
		<ol>
			<li>Porównaj kumulatywne rozkłady CSI dla każdej linii komórkowej, ponieważ jest to najlepszy sposób na ocenę statystycznie istotnych różnic w zmianach kształtu komórek (lub wszelkich innych zmianach w rozkładzie). Można to na przykład zastosować do śledzenia zmieniającego się rozkładu FA.</li>
			<li>Oblicz funkcję rozkładu kumulatywnego (CDF), aby porównać rozkłady. CDF przypisuje dla danej wartości CSI (naniesionej na oś X) procent (lub względną liczbę), dla którego wszystkie wartości są mniejsze lub równe tej wartości CSI (naniesionej na oś Y). Zatem, w miarę wzrostu wartości CSI, rośnie również procent zbioru wartości, które są mniejsze lub równe tej wartości. CDF można obliczyć za pomocą wybranego oprogramowania statystycznego lub manualnie.</li>
			<li>Do analizy statystycznej zastosuj nieparametryczny test Kołmogorowa-Smirnowa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Search+Results%22%5BJournal%5D)">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006(2016).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).</li>
<li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li>
<li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP%2C+a+bisphenol+A+analog%2C+as+a+novel+AR+down-regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoLibJ%3A+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li>
<li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAX1+impact+on+collective+cell+migration%2C+cell+adhesion%2C+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li>
<li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+analysis+of+cell%2C+nucleus+and+focal+adhesion+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201(2018).</li>
<li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics%2C+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707(2016).</li>
<li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li>
<li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li>
<li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Adhezja komórka-komórka i komórka-substrat stanowią nieodłączne atrybuty komórek nabłonkowych i odgrywają kluczową rolę w morfogenezie i embriogenezie tkanek. W tkankach dorosłych prawidłowa regulacja właściwości mechanicznych warstwy komórkowej ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy i zapobiegania reakcjom patologicznym, takim jak progresja guza i przerzuty. Wielkość i liczba zrostów ogniskowych zależy od siły adhezji komórka-substrat, podczas gdy kształt komórki zależy od sił kurczliwych i jest związany ze sta...

Monowarstwy komórek nabłonkowych działają jak zbiorowość, w której adhezja komórka-komórka i komórka-substrat, a także siły skurczu i napięcia reprezentują ważne parametry, a ich właściwa równowaga przyczynia się do ogólnej integralności jednostki1,2,3. W związku z tym ocena tych parametrów stanowi sposób na ustalenie aktualnego stanu warstwy komórkowej.
Dwie opisane tutaj metody reprezentują dwuwymiarową analizę zlewających się monowarstw przylegających komórek nabłonkowych (w tym przypadku linii komórkowej raka piersi MCF7). Analiza jest wykonywana przy użyciu obrazów konfokalnych (pojedynczych warstw Z) z różnych obszarów na osi Z; obszar podstawowy w pobliżu podłoża do pomiarów adhezji ogniskowej (FA) i obszar wierzchołkowy do pomiarów kształtu komórki. Przedstawione metody są stosunkowo proste i wymagają standardowych technik laboratoryjnych oraz oprogramowania typu open source. Mikroskopia konfokalna jest wystarczająca dla tego protokołu, więc można ją wykonać bez stosowania bardziej specjalistycznej mikroskopii TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). W związku z tym protokół może zostać wdrożony w stosunkowo standardowych warunkach laboratoryjnych. Chociaż dokładność metod jest ograniczona, mogą one rozróżnić podstawowe różnice w adhezji ogniskowej i kształcie komórki.
Obie opisane tutaj metody składają się ze standardowych procedur eksperymentalnych, takich jak hodowla komórek, barwienie immunologiczne, obrazowanie konfokalne i analiza obrazu wykonywane za pomocą ImageJ. Można jednak użyć dowolnego oprogramowania do przetwarzania obrazu z odpowiednimi funkcjami. Przedstawione metody pozwalają śledzić i porównywać zmiany wywołane leczeniem farmakologicznym lub minimalną modyfikacją genetyczną. Uzyskiwanie określonych wartości nie jest zalecane ze względu na ograniczoną precyzję tych metod. Dołączono dwa zautomatyzowane makra, aby ułatwić pomiary wielu obrazów.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32740</td><td>kozia anty-króliczka, 1:500</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen ze skóry cielęcej</td><td>Sigma</td><td>C9791-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:10000 (zapas 1 mg/ml w H2O), kwas nukleinowy barwienie</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glukoza, pirogronian</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-136</td><td></td></tr><tr><td>Złącze plakoglobina</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2309S</td><td>królik, 1:400</td></tr><tr><td>Szafa laminarna klasy 2</td><td>Alpina</td><td></td><td>standardowe wyposażenie</td></tr><tr><td>Linia komórkowa oparta na MCF7HAX1KD</td><td>Linia komórkowa założona w Narodowym Instytucie Onkologii w Warszawie, opisana w Balcerak i wsp., 2019</td><td></td><td>MCF7 linia komórkowa zHAX1knockdown</td></tr><tr><td>Linia komórkowa MCF7 (KONTROLA)</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td>nabłonek, przylegająca linia komórkowa raka piersi</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Olympus CK2</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paxillin</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>królik, 1:250, Y113</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>koniugatat falloidyny-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>1:400 (zapas 5 mg / ml w DMSO), znakowanie aktyny</td></tr><tr><td>PTX</td><td>Sigma</td><td>T7402-1MG</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash; NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash; Podstawa Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss LSM800</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek mcf7

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

Przedstawione tutaj metody określają ilościowo niektóre parametry zlewającej się przylegającej monowarstwy komórek z wielu odpowiednio wybarwionych obrazów konfokalnych: adhezja do podłoża jako funkcja liczby i wielkości zrostów ogniskowych oraz kształt komórki, charakteryzowany przez indeks kształtu komórki i inne deskryptory kształtu. Zrosty ogniskowe uwidoczniono za pomocą barwienia paksyliną, a granice komórka-komórka oznaczono połączeniem plakoglobiny i aktyny. Metody hodowli komórkowej i barwienia były standardowe; obrazy reprezentują pojedyncze płaszczyzny ogniskowe; Analizę obrazu przeprowadzono przy użyciu publicznie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Przedstawione protokoły służą do ilościowego określenia liczby i wielkości zrostów ogniskowych oraz różnic w rozkładzie kształtu komórki w monowarstwach, ale można je ponownie wykorzystać do ilościowego określenia wielkości i kształtu dowolnej innej odrębnej struktury komórkowej, która może być barwiona (np. mitochondria lub jądra). Ocena tych parametrów jest ważna w charakterystyce sił dynamicznych w przylegającej warstwie komórkowej, w tym adhezji komórek i kurczliwości aktomiozyny, które wpływają na kształt komórki.

Analiza adhezji ogniskowych 
Wcześniej wykazano, że wyciszenie genu HAX1 wpływa na adhezje ogniskowe6. Komórki hodowano przez 48 h na powierzchni powlekanej kolagenem typu I. Obrazy kontrolnych komórek MCF7 oraz komórek MCF7 z wyciszonym genem HAX1 (HAX1 KD) z trzech niezależnych eksperymentów, barwionych na białko adhezji ogniskowej paxillin, uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego (obraz z jednej płaszczyzny ogniskowej/przekroju Z z regionu bazal...

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

Protokół ten umożliwia ilościowe określenie obszaru, obwodu i kształtu struktury wewnątrzkomórkowej na podstawie jej dwuwymiarowego obrazu. Technika ta jest szybka i łatwa, wymaga jedynie standardowych ustawień laboratoryjnych i mikroskopu konfokalnego oraz wykorzystuje oprogramowanie typu open source. Zabieg zademonstruje Anna Balcerak, doktorantka z mojego laboratorium.Zacznij od wysiewu cztery razy od 10 do piątej komórki w 0,5 mililitra pożywki hodowlanej na dołek w czterodołkowym szkiełku kolagenowym z jedną pokrytą komorą na 24-godzinną hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu stopniach dwutlenku węgla. Następnego ranka użyj optycznego mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność co najmniej 90% zlewającej się monowarstwy i użyj mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy z pojedynczym plasterkiem Z. Aby przeprowadzić analizę przyczepności ogniskowej, otwórz obrazy w ImageJ i wybierz opcję Analizuj, Ustaw skalę, Usuń skalę i Globalnie, aby ustawić skalę obrazu w pikselach.Aby uwzględnić nazwę pliku i obszar obszaru zainteresowania w opcjach pomiaru, kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź opcje obszaru i wyświetlaj etykietę. Aby odjąć tło, wybierz proces i odejmij tło. Ustaw promień toczącej się piłki na 50 pikseli i sprawdź paraboloidę przesuwu.Aby określić obszar najmniejszego obszaru zainteresowania, obrysuj najmniejszą pojedynczą przyczepność ogniskową i kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby zmierzyć obszar. Po wybraniu i zmierzeniu co najmniej 20 obszarów zainteresowania należy obliczyć i zapisać średnią uzyskanych wyników. Ustaw górną granicę na 25% typowego obszaru komórki.Aby nadać obrazowi plik binarny, kliknij pozycję obraz, dostosuj i próg, a następnie zaznacz domyślne, czarno-białe i ciemne tło. Aby zmierzyć liczbę i obszary obszarów zainteresowania, wybierz opcję Analizuj i analizuj cząstki oraz sprawdzaj jednostki pikseli, wyświetlaj wyniki, wyczyść wyniki i podsumuj. Przenieś dane dotyczące średniego rozmiaru wycinka, liczby i obszaru całkowitego z okna podsumowania do wybranego programu do zarządzania danymi.Aby określić ilościowo przyczepność ogniskową, otwórz makro ImageJ adhezji ogniskowej i wprowadź obszar najmniejszego obszaru zainteresowania jako obszar najmniejszego obszaru zainteresowania. Ustaw wartość typu progu na ręczny lub automatyczny i zapisz zmiany. Następnie wywołaj makro z ImageJ i wybierz obraz do przetworzenia.W celu ręcznej analizy kształtu komórki należy otworzyć obraz w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazu i wybrać parametry, które mają być mierzone. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie wyznaczyć granice komórek zgodnie z wybranymi białkami połączeniowymi. Wybrane parametry zostaną automatycznie obliczone dla każdej komórki.Po obrysowaniu wszystkich komórek wybierz pozycję edytuj, zaznacz i dodaj do menedżera. Należy zaznaczać tylko kompletne, w pełni widoczne komórki z nieprzerwanymi obramowaniami. Aby dokonać pomiaru, zaznacz wszystkie liczby pojawiające się w lewym polu menedżera obszaru zainteresowania i kliknij przycisk Zmierz.Wyniki pojawią się w polu wyników i będzie można je zaimportować do wybranego arkusza kalkulacyjnego. Zautomatyzowana analiza komórek ułatwia ilościowe określenie dużej liczby komórek. Dla każdego nowego typu komórki najpierw uruchom makro, aby ustalić parametry.Po zakończeniu makra wybierz opcję ustaw granice rozmiaru komórki. Kliknij etykietę najmniejszej i największej komórki, a następnie kliknij pozycję Zmierz. Ustaw wartość najmniejszej komórki i największych zmiennych komórki i zapisz zmiany.Zamknij wszystkie okna makr i wybierz obraz, który ma zostać przetworzony w skali szarości. Następnie ponownie uruchom makro. Makro udostępni tabelę wyników, która zawiera indeks kształtu komórki, współczynnik proporcji i dane listy wyborów regionów zainteresowania.Tutaj można zaobserwować reprezentatywne obrazy zrostów ogniskowych zliczonych za pomocą ImageJ, w tym końcowe ponumerowane kontury i nakładki konturów zrostów ogniskowej z oryginalnym obrazem zarówno dla linii komórek kontrolnych, jak i knockdown. Jak pokazano w tej analizie, komórki knockdown wykazywały większą liczbę zrostów na komórkę, a także zrosty o większych rozmiarach w porównaniu z komórkami linii kontrolnej. Na tych obrazach pokazano reprezentatywne regiony monowarstw komórkowych nieleczonych i leczonych chemioterapeutykiem.Komórki konturowe scharakteryzowano zgodnie z wartościami ich wskaźnika kształtu komórki, na przykład w tej analizie wykazując wzrost ostatniego pojemnika i spłaszczenie głównych pików dla komórek leczonych lekiem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Następnie można wygenerować rozkład częstości i rozkład skumulowany dla każdej hodowli komórkowej. Obrazowanie monowarstw w skali szarości, jak pokazano, pozwoliło na analizę i kwantyfikację 512 komórek z 12 pól widzenia, ujawniając względny rozkład częstości wskaźnika kształtu komórki.Aby ten protokół działał, ważne jest, aby używać obrazów o najlepszej możliwej jakości. Prawidłowe wysiewanie komórek, barwienie i obrazowanie powinno zapewnić obrazy o wystarczającej jakości eksperymentalnej.

quantification-cell-substrate-adhesion-area-cell-shape-distributions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Tutaj prezentujemy protokół do ciągłego ilościowego oznaczania procesów adhezji i deadhezji komórek z wysoką rozdzielczością czasową w sposób nieinwazyjny poprzez impedancję substratu komórkowego i analizy obrazowania żywych komórek. Podejścia te ujawniają dynamikę procesów adhezji/deadhezji komórek wyzwalanych przez modyfikację matrycy i ich czasowy związek ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi zależnymi od adhezji.

Wykorzystanie impedancji substratu komórkowego i obrazowania żywych komórek do pomiaru zmian w czasie rzeczywistym w adhezji komórkowej i deadhezji wywołanych modyfikacją matrycy

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Poznaj metodę kwantyfikacji obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach MCF7 przy użyciu mikroskopii konfokalnej i oprogramowania ImageJ.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Przeglądaj więcej filmów