Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7
24 czerwca 2020
Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.
Protokół ten umożliwia ilościowe określenie obszaru, obwodu i kształtu struktury wewnątrzkomórkowej na podstawie jej dwuwymiarowego obrazu. Technika ta jest szybka i łatwa, wymaga jedynie standardowych ustawień laboratoryjnych i mikroskopu konfokalnego oraz wykorzystuje oprogramowanie typu open source. Zabieg zademonstruje Anna Balcerak, doktorantka z mojego laboratorium.
Zacznij od wysiewu cztery razy od 10 do piątej komórki w 0,5 mililitra pożywki hodowlanej na dołek w czterodołkowym szkiełku kolagenowym z jedną pokrytą komorą na 24-godzinną hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu stopniach dwutlenku węgla. Następnego ranka użyj optycznego mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność co najmniej 90% zlewającej się monowarstwy i użyj mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy z pojedynczym plasterkiem Z. Aby przeprowadzić analizę przyczepności ogniskowej, otwórz obrazy w ImageJ i wybierz opcję Analizuj, Ustaw skalę, Usuń skalę i Globalnie, aby ustawić skalę obrazu w pikselach.
Aby uwzględnić nazwę pliku i obszar obszaru zainteresowania w opcjach pomiaru, kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź opcje obszaru i wyświetlaj etykietę. Aby odjąć tło, wybierz proces i odejmij tło. Ustaw promień toczącej się piłki na 50 pikseli i sprawdź paraboloidę przesuwu.
Aby określić obszar najmniejszego obszaru zainteresowania, obrysuj najmniejszą pojedynczą przyczepność ogniskową i kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby zmierzyć obszar. Po wybraniu i zmierzeniu co najmniej 20 obszarów zainteresowania należy obliczyć i zapisać średnią uzyskanych wyników. Ustaw górną granicę na 25% typowego obszaru komórki.
Aby nadać obrazowi plik binarny, kliknij pozycję obraz, dostosuj i próg, a następnie zaznacz domyślne, czarno-białe i ciemne tło. Aby zmierzyć liczbę i obszary obszarów zainteresowania, wybierz opcję Analizuj i analizuj cząstki oraz sprawdzaj jednostki pikseli, wyświetlaj wyniki, wyczyść wyniki i podsumuj. Przenieś dane dotyczące średniego rozmiaru wycinka, liczby i obszaru całkowitego z okna podsumowania do wybranego programu do zarządzania danymi.
Aby określić ilościowo przyczepność ogniskową, otwórz makro ImageJ adhezji ogniskowej i wprowadź obszar najmniejszego obszaru zainteresowania jako obszar najmniejszego obszaru zainteresowania. Ustaw wartość typu progu na ręczny lub automatyczny i zapisz zmiany. Następnie wywołaj makro z ImageJ i wybierz obraz do przetworzenia.
W celu ręcznej analizy kształtu komórki należy otworzyć obraz w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazu i wybrać parametry, które mają być mierzone. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie wyznaczyć granice komórek zgodnie z wybranymi białkami połączeniowymi. Wybrane parametry zostaną automatycznie obliczone dla każdej komórki.
Po obrysowaniu wszystkich komórek wybierz pozycję edytuj, zaznacz i dodaj do menedżera. Należy zaznaczać tylko kompletne, w pełni widoczne komórki z nieprzerwanymi obramowaniami. Aby dokonać pomiaru, zaznacz wszystkie liczby pojawiające się w lewym polu menedżera obszaru zainteresowania i kliknij przycisk Zmierz.
Wyniki pojawią się w polu wyników i będzie można je zaimportować do wybranego arkusza kalkulacyjnego. Zautomatyzowana analiza komórek ułatwia ilościowe określenie dużej liczby komórek. Dla każdego nowego typu komórki najpierw uruchom makro, aby ustalić parametry.
Po zakończeniu makra wybierz opcję ustaw granice rozmiaru komórki. Kliknij etykietę najmniejszej i największej komórki, a następnie kliknij pozycję Zmierz. Ustaw wartość najmniejszej komórki i największych zmiennych komórki i zapisz zmiany.
Zamknij wszystkie okna makr i wybierz obraz, który ma zostać przetworzony w skali szarości. Następnie ponownie uruchom makro. Makro udostępni tabelę wyników, która zawiera indeks kształtu komórki, współczynnik proporcji i dane listy wyborów regionów zainteresowania.
Tutaj można zaobserwować reprezentatywne obrazy zrostów ogniskowych zliczonych za pomocą ImageJ, w tym końcowe ponumerowane kontury i nakładki konturów zrostów ogniskowej z oryginalnym obrazem zarówno dla linii komórek kontrolnych, jak i knockdown. Jak pokazano w tej analizie, komórki knockdown wykazywały większą liczbę zrostów na komórkę, a także zrosty o większych rozmiarach w porównaniu z komórkami linii kontrolnej. Na tych obrazach pokazano reprezentatywne regiony monowarstw komórkowych nieleczonych i leczonych chemioterapeutykiem.
Komórki konturowe scharakteryzowano zgodnie z wartościami ich wskaźnika kształtu komórki, na przykład w tej analizie wykazując wzrost ostatniego pojemnika i spłaszczenie głównych pików dla komórek leczonych lekiem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Następnie można wygenerować rozkład częstości i rozkład skumulowany dla każdej hodowli komórkowej. Obrazowanie monowarstw w skali szarości, jak pokazano, pozwoliło na analizę i kwantyfikację 512 komórek z 12 pól widzenia, ujawniając względny rozkład częstości wskaźnika kształtu komórki.
Aby ten protokół działał, ważne jest, aby używać obrazów o najlepszej możliwej jakości. Prawidłowe wysiewanie komórek, barwienie i obrazowanie powinno zapewnić obrazy o wystarczającej jakości eksperymentalnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym artykule opisano protokół kwantyfikacji adhezji ogniskowych i wskaźnika kształtu komórek w zbieżnych monowarstwach komórek MCF7 z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Badanie podkreśla, jak wahania zarówno adhezji, jak i kształtu komórek można analizować za pomocą dostępnych technik obrazowania.
Kluczowe Elementy Badania
Obszar Badawczy
- Biologia Komórki
- Analiza Adhezji Ogniskowych
- Kwantyfikacja Kształtu Komórek
Wprowadzenie
- Adhezje ogniskowe są kluczowe dla adhezji i sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie kształtu komórek i adhezji może wpłynąć na badanie biologii nowotworów.
- Komórki MCF7 służą jako model badawczy dla badań nad rakiem piersi.
Wykorzystane Metody
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania struktur komórkowych.
- Oprogramowanie ImageJ do analizy powierzchni adhezji ogniskowych i wskaźnika kształtu komórek.
- Ręczne i zautomatyzowane protokoły analizy dla efektywnej ekstrakcji danych.
Główne Wyniki
- W komórkach z obniżonym poziomem ekspresji (knockdown) zaobserwowano większą liczbę i większe rozmiary adhezji ogniskowych w porównaniu do kontroli.
- Zauważono rozbieżności w wskaźniku kształtu komórek między komórkami niepoddanymi i poddanymi leczeniu lekami.
- Solidne metodologie umożliwiły analizę dużych próbek, zwiększając istotność statystyczną.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza wiarygodnego protokołu do analizy morfologii komórek i właściwości adhezyjnych.
- Odkrycia przyczyniają się do zrozumienia właściwości mechanicznych komórek, istotnych w badaniach nad rakiem i rozwoju.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying focal adhesion dynamics and cell shape distributions provides mechanistic insights into cancer cell behavior, supporting target validation in oncology drug discovery. This protocol enables reproducible, image-based assessment of adhesion and morphology, facilitating phenotypic screening and preclinical model characterization. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking molecular perturbations to functional cellular outputs relevant to therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in focal adhesion number and size as functional readouts of target modulation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, image-based metrics that correlate molecular interventions with cellular phenotypes.
- Predictive Value: Generates quantitative adhesion and shape data that enhance confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated, quantitative outputs (adhesion area, count, shape index) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Uses standardized staining, imaging, and open-source analysis to ensure consistent results across experiments and laboratories.
- Scalability: Automated macro-based analysis allows processing of large cell populations, supporting assay miniaturization and throughput.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to breast cancer models using MCF7 cells, enabling mechanistic de-risking of oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing quantifiable, morphology-based biomarkers of drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Shape and adhesion distributions inform predictive models for cellular behavior in therapeutic contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in cancer mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in adhesion and morphology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative image outputs that enable reliable compound effect assessment in adherent monolayers.
- Analytics: Provides numerical readouts (focal adhesion count, size, cell shape index) that facilitate condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through morphology-based biomarkers that reflect drug-induced cellular changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other cellular structures (e.g., mitochondria, nuclei) and cell types, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in mechanistic links between targets and cellular phenotypes.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined staining, imaging, and analysis parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing objective, quantifiable phenotypic data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional adhesion and shape outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunofluorescence staining, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to confocal microscopes and computers capable of running ImageJ and associated macros.
- Necessitates standardization of image acquisition settings (z-slice, lighting, focus) across users and experiments.
- Adaptation to new cell types or structures requires initial parameter optimization (e.g., size thresholds, staining validation).
- Limited to 2D image analysis; does not capture 3D adhesion dynamics or subcellular localization without modification.
