Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Protokół ten umożliwia ilościowe określenie obszaru, obwodu i kształtu struktury wewnątrzkomórkowej na podstawie jej dwuwymiarowego obrazu. Technika ta jest szybka i łatwa, wymaga jedynie standardowych ustawień laboratoryjnych i mikroskopu konfokalnego oraz wykorzystuje oprogramowanie typu open source. Zabieg zademonstruje Anna Balcerak, doktorantka z mojego laboratorium.

Zacznij od wysiewu cztery razy od 10 do piątej komórki w 0,5 mililitra pożywki hodowlanej na dołek w czterodołkowym szkiełku kolagenowym z jedną pokrytą komorą na 24-godzinną hodowlę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu stopniach dwutlenku węgla. Następnego ranka użyj optycznego mikroskopu odwróconego, aby sprawdzić obecność co najmniej 90% zlewającej się monowarstwy i użyj mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy z pojedynczym plasterkiem Z. Aby przeprowadzić analizę przyczepności ogniskowej, otwórz obrazy w ImageJ i wybierz opcję Analizuj, Ustaw skalę, Usuń skalę i Globalnie, aby ustawić skalę obrazu w pikselach.

Aby uwzględnić nazwę pliku i obszar obszaru zainteresowania w opcjach pomiaru, kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary, a następnie sprawdź opcje obszaru i wyświetlaj etykietę. Aby odjąć tło, wybierz proces i odejmij tło. Ustaw promień toczącej się piłki na 50 pikseli i sprawdź paraboloidę przesuwu.

Aby określić obszar najmniejszego obszaru zainteresowania, obrysuj najmniejszą pojedynczą przyczepność ogniskową i kliknij przycisk Analizuj i zmierz, aby zmierzyć obszar. Po wybraniu i zmierzeniu co najmniej 20 obszarów zainteresowania należy obliczyć i zapisać średnią uzyskanych wyników. Ustaw górną granicę na 25% typowego obszaru komórki.

Aby nadać obrazowi plik binarny, kliknij pozycję obraz, dostosuj i próg, a następnie zaznacz domyślne, czarno-białe i ciemne tło. Aby zmierzyć liczbę i obszary obszarów zainteresowania, wybierz opcję Analizuj i analizuj cząstki oraz sprawdzaj jednostki pikseli, wyświetlaj wyniki, wyczyść wyniki i podsumuj. Przenieś dane dotyczące średniego rozmiaru wycinka, liczby i obszaru całkowitego z okna podsumowania do wybranego programu do zarządzania danymi.

Aby określić ilościowo przyczepność ogniskową, otwórz makro ImageJ adhezji ogniskowej i wprowadź obszar najmniejszego obszaru zainteresowania jako obszar najmniejszego obszaru zainteresowania. Ustaw wartość typu progu na ręczny lub automatyczny i zapisz zmiany. Następnie wywołaj makro z ImageJ i wybierz obraz do przetworzenia.

W celu ręcznej analizy kształtu komórki należy otworzyć obraz w odpowiednim oprogramowaniu do przetwarzania obrazu i wybrać parametry, które mają być mierzone. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie wyznaczyć granice komórek zgodnie z wybranymi białkami połączeniowymi. Wybrane parametry zostaną automatycznie obliczone dla każdej komórki.

Po obrysowaniu wszystkich komórek wybierz pozycję edytuj, zaznacz i dodaj do menedżera. Należy zaznaczać tylko kompletne, w pełni widoczne komórki z nieprzerwanymi obramowaniami. Aby dokonać pomiaru, zaznacz wszystkie liczby pojawiające się w lewym polu menedżera obszaru zainteresowania i kliknij przycisk Zmierz.

Wyniki pojawią się w polu wyników i będzie można je zaimportować do wybranego arkusza kalkulacyjnego. Zautomatyzowana analiza komórek ułatwia ilościowe określenie dużej liczby komórek. Dla każdego nowego typu komórki najpierw uruchom makro, aby ustalić parametry.

Po zakończeniu makra wybierz opcję ustaw granice rozmiaru komórki. Kliknij etykietę najmniejszej i największej komórki, a następnie kliknij pozycję Zmierz. Ustaw wartość najmniejszej komórki i największych zmiennych komórki i zapisz zmiany.

Zamknij wszystkie okna makr i wybierz obraz, który ma zostać przetworzony w skali szarości. Następnie ponownie uruchom makro. Makro udostępni tabelę wyników, która zawiera indeks kształtu komórki, współczynnik proporcji i dane listy wyborów regionów zainteresowania.

Tutaj można zaobserwować reprezentatywne obrazy zrostów ogniskowych zliczonych za pomocą ImageJ, w tym końcowe ponumerowane kontury i nakładki konturów zrostów ogniskowej z oryginalnym obrazem zarówno dla linii komórek kontrolnych, jak i knockdown. Jak pokazano w tej analizie, komórki knockdown wykazywały większą liczbę zrostów na komórkę, a także zrosty o większych rozmiarach w porównaniu z komórkami linii kontrolnej. Na tych obrazach pokazano reprezentatywne regiony monowarstw komórkowych nieleczonych i leczonych chemioterapeutykiem.

Komórki konturowe scharakteryzowano zgodnie z wartościami ich wskaźnika kształtu komórki, na przykład w tej analizie wykazując wzrost ostatniego pojemnika i spłaszczenie głównych pików dla komórek leczonych lekiem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Następnie można wygenerować rozkład częstości i rozkład skumulowany dla każdej hodowli komórkowej. Obrazowanie monowarstw w skali szarości, jak pokazano, pozwoliło na analizę i kwantyfikację 512 komórek z 12 pól widzenia, ujawniając względny rozkład częstości wskaźnika kształtu komórki.

Aby ten protokół działał, ważne jest, aby używać obrazów o najlepszej możliwej jakości. Prawidłowe wysiewanie komórek, barwienie i obrazowanie powinno zapewnić obrazy o wystarczającej jakości eksperymentalnej.