Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja przestrzennego rozmieszczenia szczepów drobnoustrojów podczas roju, ślizgania się lub tworzenia biofilmu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii społecznej, takie jak to, w jaki sposób segregacja przestrzenna wpływa na interakcje mikrobiologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że dopasowanie i rozmieszczenie przestrzenne szczepów drobnoustrojów można łatwo ocenić za pomocą technik mikroskopowych i analizy obrazu podsegmentów.

Procedurę zademonstruje Theresa Holscher, doktorantka z mojego laboratorium. W dniu poprzedzającym eksperyment dodać trzy mililitry pożywki LB do probówki hodowlanej i zaszczepić ją z zapasu B.subtilis w zamrażarce. Powtórz tę inokulację z oddzielną probówką dla każdego interesującego szczepu.

Umieść probówki w poziomym inkubatorze wytrząsającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Aby przygotować płytki do eksperymentów rojowych i ślizgowych, wlej 20 mililitrów temperowanego podłoża LB do 90-milimetrowej polistyrenowej szalki Petriego. Natychmiast zamknij naczynie i umieść je po jednej stronie sterylnego kaptura, aby ostygło przez co najmniej godzinę.

Następnie przygotuj płytki do eksperymentów z biofilmem kolonii, wlewając 25 mililitrów agaru dwa razy razy pożywki SG do 90-milimetrowej szalki Petriego. Natychmiast zamknij płytki i pozwól im ostygnąć w stosach po cztery lub mniej przez co najmniej godzinę. Na początek umieść płytki rojające się i przesuwne LB agar w okapie z przepływem laminarnym i zdejmij pokrywki.

Pozostaw płytki do wyschnięcia na 20 minut. Wilgotność płytek w tych eksperymentach jest krytyczna. Podczas gdy nadmiar wilgoci pozwala bakteriom pływać, długotrwałe suszenie zapobiega rojeniu się i ślizganiu.

Podobnie struktura biofilmu kolonii zależy od suchości pożywki. Za pomocą spektrofotometru oznacz gęstości optyczne nocnych kultur starterowych przy 600 nanometrach. W 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówek gęstość mieszania znormalizowała ilości zielonego i czerwonego białka fluorescencyjnego, wytwarzając szczepy o łącznej objętości 200 mikrolitrów.

Obracaj rurkę przez trzy sekundy. Za pomocą mikropipety umieść dwa mikrolitry zmieszanej kultury na środku wstępnie wysuszonej płytki agarowej LB o średnicy 90 milimetrów w okapie z przepływem laminarnym. Umieść talerz do wyschnięcia na 10 minut.

Na koniec inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pozycji pionowej, aby zapobiec gromadzeniu się kondensatu na powierzchni agaru. Najpierw umieść dwa razy płytki agarowe SG w okapie z przepływem laminarnym na 15 minut do wyschnięcia. Następnie dodaj po 100 mikrolitrów każdego z zielonych i czerwonych szczepów biofilmu wytwarzających białko fluorescencyjne, kultur starterowych B.subtilis 168, do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Obracaj rurkę przez trzy sekundy. Przygotować probówki ze 100 mikrolitrami pożywki LB i używając mieszanej kultury, utworzyć 10-krotną serię inokulatów rozcieńczeń. Za pomocą mikropipety nanieś dwa mikrolitry nierozcieńczonej mieszanej kultury na dwukrotnie pokrojoną płytkę agarową SG.

Powtórz to z inokulacjami dla 10 do jednego, 10 do dwóch, 10 do trzech i 10 do czterech rozcieńczeń, rozmieszczając miejsca w równych odległościach, aby umożliwić wyhodowanie sześciu do dziewięciu kolonii na jednym szalu. Inkubuj płytki pionowo w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Na początek umieść płytki na platformie obrazowania mikroskopu wykrywającego fluorescencję.

W przypadku eksperymentów z przesuwaniem i rojeniem należy ustawić początek inokulacji, środek szalki Petriego, w rogu widzialnego pola, aby umożliwić pomiar promienistej ekspansji kolonii. Dostosuj powiększenie do najwyższej rozdzielczości, która umożliwia obrazowanie największego możliwego obszaru 90-milimetrowej płytki. Dostosuj odpowiednio czas naświetlania, w zależności od siły sygnału fluorescencyjnego.

W celu analizy biofilmu umieść interesującą kolonię w środku pola widzenia. Ustaw powiększenie na najwyższą rozdzielczość, która pozwala na oglądanie całej kolonii. Kolonie są teraz gotowe do pomiaru i analizy.

Na koniec przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Rysunek ten pokazuje wzrost typowej kolonii Bacillus subtilis zaszczepionej wspólnie przez dwa szczepy. Rój, który jest zależnym od wiczowców zbiorowym ruchem powierzchniowym, powoduje powstanie wysoce mieszanej populacji.

W tym filmie poklatkowym początkowy inokulant został umieszczony w środku rozsiewu na płytce. Wyraźnie obserwuje się rój cienkich warstw, a wraz z rozwojem kolonii dwa czerwone i zielone fluorescencyjne szczepy wydają się mieszane i nakładają się na siebie. I odwrotnie, obrazy zachowania ślizgowego pokazują zdefiniowane sektory wzrostu odpowiadające różnie oznakowanym szczepom fluorescencyjnym.

Ten film pokazuje wzrost ślizgającej się kolonii współinokulowanej, w której szczepy nie mają funkcjonujących wici. Kolonie te są nadal w stanie rozprzestrzeniać się przy użyciu kombinacji wydzielanego egzopolisacharydu, hydrofobiny i surfaktyny. Powstałe kolonie wykazują wyraźny przestrzenny zakres wzrostu w porównaniu ze szczepem roju.

Początkowe zagęszczenie komórek wytwarzających biofilm w dużym stopniu wpłynęło na asortyment przestrzenny powstałych kolonii. Kolonie zainicjowane z dużym zagęszczeniem komórek w populacjach mieszanych, wykazywały niewielki asortyment przestrzenny lub nie wykazywały go wcale. W przeciwieństwie do tego, gdy gęstość komórek w momencie inicjacji była niska, można było wykryć przezroczyste, zielone i czerwone sektory fluorescencyjne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić względną liczebność fluorescencyjnie znakowanych szczepów w koloniach drobnoustrojów, zbadać segregację przestrzenną i zbadać wpływ gęstości komórek założycielskich.