Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja rozkładu przestrzennego szczepów mikrobiologicznych podczas swarmingu, ślizgania się lub tworzenia biofilmu przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii społecznej, takie jak wpływ segregacji przestrzennej na interakcje mikrobiologiczne. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwej oceny przystosowania i rozkładu przestrzennego szczepów mikrobiologicznych za pomocą technik mikroskopowych oraz analizy obrazów podsegmentowych.

Procedurę zademonstruje Theresa Holscher, doktorantka z mojego laboratorium. W dniu poprzedzającym eksperyment należy dodać 3 mL medium LB do probówki kulturowej i zaszczepić ją z mrożonego banku szczepów B.subtilis. Powtórz ten proces szczepienia w oddzielnej probówce dla każdego badanego szczepu.

Umieść probówki w inkubatorze z wytrząsaniem w pozycji poziomej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Aby przygotować płytki do eksperymentów nad swarmingiem i slidingiem, wlej 20 mililitrów ostudzonego medium LB do polistyrenowej płytki Petri o średnicy 90 milimetrów. Natychmiast zamknij płytkę, a następnie odstaw ją na bok w sterylnej komorze z laminarem, aby ostygła przez co najmniej jedną godzinę.

Następnie przygotuj płytki do eksperymentów z biofilmami kolonialnymi, wlewając 25 mililitrów pożywki SG z agarem o dwukrotnym stężeniu do 90-milimetrowej szalki Petriego. Natychmiast zamknij płytki i pozostaw je do ostygnięcia w stosach nieprzekraczających czterech sztuk przez co najmniej jedną godzinę. Na początek umieść płytki z agarem LB do badania swarmingowania i ślizgania (sliding) w komorze z laminarnym przepływem powietrza i zdejmij pokrywki.

Pozostaw płytki do wyschnięcia na 20 minut. Wilgotność płytek w tych doświadczeniach ma krytyczne znaczenie. Nadmierna wilgoć umożliwia bakteriom pływanie, natomiast przedłużone suszenie zapobiega zjawiskom swarmingu i ślizgania (sliding).

Podobnie struktura biofilmu kolonii zależy od stopnia wysuszenia podłoża. Za pomocą spektrofotometru wyznacz gęstość optyczną nocnych kultur starterowych przy 600 nanometrach. W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra wymieszaj znormalizowane pod względem gęstości ilości szczepów produkujących zielone i czerwone białka fluorescencyjne, tak aby całkowita objętość wyniosła 200 mikrolitrów.

Mieszaj probówkę na wortexie przez trzy sekundy. Za pomocą mikropipety nanieś dwie µL mieszaniny kultur na środek uprzednio wysuszonej płytki z agarem LB o średnicy 90 mm w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na 10 minut.

Na koniec inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w pozycji pionowej, aby zapobiec skraplaniu się wody na powierzchni agaru. Najpierw umieść płytki z agarem 2x SG w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 15 minut w celu osuszenia. Następnie do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodaj po 100 µl kultur startowych szczepu B.subtilis 168 tworzącego biofilm, produkującego odpowiednio zielone i czerwone białko fluorescencyjne.

Mieszaj probówkę na wstrząsarze vortex przez trzy sekundy. Przygotuj probówki zawierające 100 µL pożywki LB i wykorzystując zmieszaną kulturę, przygotuj 10-krotny szereg rozcieńczeń szczepionek. Za pomocą mikropipety nanieś dwie µL nierozcieńczonej zmieszanej kultury na płytkę z agarem 2x SG.

Powtórz tę procedurę dla szczepionek z rozcieńczeń 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ i 10⁻⁴, zachowując równe odstępy między plamkami, aby na jednej płytce wyrosło od sześciu do dziewięciu kolonii. Inkubuj płytki w pozycji pionowej w temperaturze 30 °C przez okres od jednego do trzech dni. Na początek umieść płytki na platformie obrazowej mikroskopu z detekcją fluorescencji.

W eksperymentach dotyczących ślizgania i rojenia (sliding i swarming) ustaw miejsce inokulacji, znajdujące się na środku szalki Petriego, w narożniku pola widzenia, aby umożliwić pomiar radialnej ekspansji kolonii. Dostosuj powiększenie do najwyższej rozdzielczości, która pozwala na obrazowanie jak największego obszaru płytki o średnicy 90 milimetrów. Odpowiednio dostosuj czas ekspozycji, w zależności od natężenia sygnału fluorescencyjnego.

W celu analizy biofilmu należy umieścić interesującą kolonię w centrum pola widzenia. Ustaw powiększenie na najwyższą rozdzielczość, która pozwala na obejrzenie całej kolonii. Kolonie są teraz gotowe do pomiaru i analizy.

W końcu przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na tej rycinie przedstawiono wzrost typowej kolonii Bacillus subtilis zaszczepionej dwoma szczepami. Swarming (ruch rojący), będący zależnym od wici zbiorowym ruchem po powierzchni, prowadzi do powstania silnie wymieszanej populacji.

Na tym filmie poklatkowym początkowy inokulum umieszczono w centrum płytki. Wyraźnie widoczne jest rozprzestrzenianie się w cienkiej warstwie (thin layer swarming), a w miarę rozwoju kolonii dwa fluorescencyjne szczepy (czerwony i zielony) wydają się wymieszane i nakładające na siebie. Z kolei obrazy wykazujące zachowanie ślizgowe (sliding) pokazują wyraźnie zdefiniowane sektory wzrostu odpowiadające różnie oznakowanym szczepom fluorescencyjnym.

W tym filmie przedstawiono wzrost przesuwającej się kolonii po ko-inokulacji, w której szczepy nie posiadają funkcjonalnych wici. Kolonie te są nadal zdolne do rozprzestrzeniania się dzięki kombinacji wydzielanego egzopolisacharydu, hydrofobiny i surfaktyny. Powstałe kolonie wykazują odmienny przestrzenny układ wzrostu w porównaniu ze szczepem wykazującym zjawisko swarmingu.

Gęstość komórek początkowych w koloniach produkujących biofilm silnie wpływała na sortowanie przestrzenne powstałych kolonii. Kolonie zainicjowane wysoką gęstością komórek w populacjach mieszanych wykazywały niewielkie lub żadne sortowanie przestrzenne. W przeciwieństwie do tego, gdy gęstość komórek w momencie inicjacji była niska, można było wykryć wyraźne zielone i czerwone sektory fluorescencyjne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak określać względną liczebność szczepów znakowanych fluorescencyjnie w koloniach drobnoustrojów, badać segregację przestrzenną oraz analizować wpływ gęstości komórek założycielskich.