Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie pojedynczego kombinowanego testu w czasie rzeczywistym do identyfikacji specyficznych małocząsteczkowych inhibitorów wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii, które nie są toksyczne dla komórek gospodarza. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania środków przeciwdrobnoustrojowych. W szczególności: jakie rodzaje związków mogą przenikać do przedziałów wewnątrzkomórkowych i zabijać patogeny, nie uszkadzając komórki gospodarza?

Głównymi zaletami tej techniki jest jednoczesne wykrywanie wzrostu bakterii oraz toksyczności dla komórek ssaczych przy użyciu niedestrukcyjnych analiz w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności ze skalowalnością, jaką ona oferuje. Analiza więcej niż dziesięciu tysięcy związków w jednej serii wymaga zupełnie nowego zestawu technik i sprzętu.

Oprócz Luciusa, wspólne zaangażowanie w akademickie odkrywanie środków przeciwdrobnoustrojowych i translacyjną mikrobiologię diagnostyczną wykazują stypendyści podoktorscy: KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn oraz studentka studiów licencjackich Kat Truelson. Aby przygotować komórki gospodarza, należy hodować makrofagi J774A. 1 w zawiesinie w medium RPMI 1640 z dodatkiem 9% serum cielęcego suplementowanego żelazem.

Wstępnie pasażuj komórki w kolbach do hodowli tkankowej. Po osiągnięciu konfluencji komórek w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm² w 15 ml pożywki, rozdziel komórki poprzez zeskrobanie i rozcieńczenie do 65 ml tym samym typem pożywki. Przenieś 15 ml z powrotem do kolby do hodowli tkankowej, a 50 ml przelej do 250 ml kolby dla bakterii z wytrząsaniem.

Napowietrzaj, ustawiając prędkość obrotową na około 120 obrotów na minutę. W celu zapewnienia stabilnego wzrostu inkubuj w dokładnie 5% dwutlenku węgla i 37 °C. Zbierz komórki, gdy osiągną gęstość w zakresie od 2,5 mln komórek/ml do 5 mln komórek/ml.

Należy upewnić się, że odsetek martwych komórek nie przekracza 25%, ponieważ martwe komórki zwiększą szum tła w testach cytotoksyczności. Podczas dozowania dużych objętości makrofagów i bakterii za pomocą automatycznych systemów dozujących (liquid handlers) kluczowe jest zapobieganie sedymentacji komórek w zbiornikach. W trakcie dozowania należy mieszać zawartość zbiorników co kilka minut, aby uniknąć niejednorodności w studzienkach płytek testowych.

Przesiać komórki do białych mikroplatek 384-dołkowych traktowanych do hodowli tkankowych, w zagęszczeniu 50 000 komórek w 30 µL pożywki do hodowli tkankowych na dołek. Inkubować mikroplatek przez noc, aby w dniu eksperymentu uzyskać dziewięćdziesięcioprocentową konfluencję. Przygotować plamy bakterii do doświadczeń, rozprzestrzeniając organizmy gęsto na nowej płytce BCYE i inkubując przez jeden dzień w celu uzyskania konfluentnego wzrostu.

Ponownie zawiesić organizmy w tym samym medium do hodowli tkankowej, które zastosowano dla komórek J774A.1. Aby przeprowadzić infekcję makrofagów, dodać badane związki, w tym związki przesiewowe oraz kontrole dodatnie i ujemne dla hamowania wzrostu bakterii w lizie komórek eukariotycznych.

Roztwory zapasowe powinny być rozpuszczone w stężeniu większym lub równym 500x w DMSO lub roztworze wodnym, aby umożliwić odpowiednie rozcieńczenie rozpuszczalnika. Rozcieńczone bakterie luminescencyjne należy doprowadzić do docelowego stężenia 2,5 miliona CFU per milliliter w medium do hodowli tkankowej. Następnie należy dodać odpowiedni nietoksyczny, nieprzenikający przez błonę barwnik do wykrywania kwasów nukleinowych w stężeniu końcowym 2,5x dla przeprowadzanego testu.

Do każdej studzienki z kulturą dodaj 20 µL tej mieszaniny. Końcowa objętość testu wynosi 50 µL, a końcowe stężenie bakterii powinno wynosić 10⁶ CFU/mL dla reportera lux epron lub 4×10⁶ CFU/mL dla reportera białka fluorescencyjnego. Inkubuj w temperaturze 37 °C od jednego do trzech dni w atmosferze 5% CO₂ przy 100% wilgotności względnej, aby zapobiec efektom brzegowym wynikającym z parowania.

Aby uniknąć efektów brzegowych związanych z temperaturą podczas odczytu wyników analizy, należy zrównoważyć termicznie mikropłytki przed pomiarem luminescencji, umieszczając je w jednej warstwie na blacie laboratoryjnym z uchylonymi pokrywkami przez około 20 minut. Wzrost bakterii oraz toksyczność komórek eukaryotycznych należy odczytać za pomocą luminometru i fluorometru do mikropłytek, odpowiednio do stosowanych reporterów. W przypadku potrzeby odczytu w czasie rzeczywistym w późniejszych punktach czasowych, należy zwrócić mikropłytki do inkubatora.

Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W przypadku eksperymentów dotyczących odpowiedzi na dawkę i testowania synergii, przygotuj makrofagi z bakteriami w taki sam sposób jak wcześniej. Bezpośrednio przed zakażeniem makrofagów lub inkubacją akseniczną, wykorzystaj zautomatyzowany system dozowania cieczy, aby ułatwić badanie odpowiedzi na pojedynczą dawkę w zestawieniu testów synergii kombinacyjnej poprzez bezpośrednie, zautomatyzowane dodawanie rozcieńczeń środków przeciwdrobnoustrojowych zgodnie z protokołem producenta.

Dodaj środki przeciwdrobnoustrojowe będące przedmiotem badania w serii rozcieńczeń dwukrotnych. Celem jest objęcie zakresem, w górnej granicy, stężenia, które całkowicie eliminuje wzrost, a w dolnej granicy, stężenia, które nie wykazuje wyraźnej aktywności. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywne dla luminescencji bakteryjnej oraz fluorescencji związanej z cytotoksycznością w funkcji czasu.

Zwróć uwagę na przeciwstawne efekty działania leku przeciwdrobniczego oraz cytotoksycznego detergentu dla komórek eukaryotycznych. W celu określenia selektywności antybiotyku doksycykliny zastosowano jednoczesne wyznaczenie odpowiedzi na dawkę IC50 i CC50 w tych samych studzienkach przesiewowych. Replikacja bakterii była hamowana przez średnie stężenia antybiotyku.

Zaobserwowano jednak cytotoksyczność przy wysokich stężeniach, co jest zgodne z selektywnością na poziomie około 100. Ten sam format testu wykorzystano do zbadania dwuwymiarowej odpowiedzi na dawkę dla kombinacji minocykliny i azytromycyny. Izokontury łączą punkty o takim samym poziomie hamowania wzrostu wewnątrzkomórkowego.

W tym przypadku wklęsłe izokontury sugerowały silne efekty synergistyczne dla dwóch leków. Zrobotyzowane dozowanie cyfrowe w przygotowaniu testu, odczyt w czasie rzeczywistym oraz format wysokoprzepustowy umożliwiły kombinatoryczne badanie potrójnej synergii. Tutaj obserwacja wyraźnie wklęsłej powierzchni sugeruje wysoki stopień efektu synergistycznego dla kombinacji minocykliny, azytromycyny i ryfampicyny przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Legionella pneumophila.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat łączenia odczytów z testów fluorescencyjnych lub luminescencyjnych z testami cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w formacie wysokoprzepustowym. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak mikroskop konfokalny, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zdarzeń biologicznych w całej komórce, które są powiązane z aktywnością przeciwdrobną lub cytotoksycznością całych komórek. Chociaż badaliśmy wpływ na replikację Legionella, te same techniki można zastosować do innych patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak Brucella oraz mikobakterie.

Protokół ten został opracowany podczas poszukiwań metody analizy wystarczająco prostej i niezawodnej, aby można było ją zastosować w formacie przesiewowym o bardzo wysokiej przepustowości. Należy pamiętać, że praca z patogenami bakteryjnymi, liniami komórkowymi i sprzętem zrobotyzowanym wiąże się z pewnymi ryzykami, dlatego należy zachować odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie właściwych środków ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.