Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych
16 listopada 2016
Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.
Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie pojedynczego kombinowanego testu w czasie rzeczywistym do identyfikacji specyficznych małocząsteczkowych inhibitorów wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii, które są nietoksyczne dla komórek gospodarza. Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania środków przeciwdrobnoustrojowych. W szczególności, jakie rodzaje związków mogą przenikać do przedziałów wewnątrzkomórkowych i zabijać patogeny bez szkody dla komórki gospodarza?
Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wzrost bakterii, toksyczność komórek ssaków jest wykrywana jednocześnie za pomocą nieniszczących testów w czasie rzeczywistym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy ze skalowalnością, którą zapewnia. Oznaczenie więcej niż dziesięciu tysięcy związków w jednej sesji wymaga zupełnie nowego zestawu technik i sprzętu.
Oprócz Luciusa, wspólne zaangażowanie w akademickie odkrycia przeciwdrobnoustrojowe i translacyjną mikrobiologię diagnostyczną wykazują stypendyści podoktoranccy, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn i studentka Kat Truelson. Aby przygotować komórki gospodarza, hoduj J774A. 1 makrofag znajduje się w zawiesinie w RPMI 1640, z dziewięcioprocentową surowicą cielęcą uzupełnioną żelazem.
Początkowo pasażować komórki w kolbach do hodowli tkankowych. Po tym, jak komórki zlewają się w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w 15 mililitrach pożywki, podziel komórki, zeskrobując je i rozcieńczając do 65 mililitrów tym samym rodzajem pożywki. Umieścić 15 mililitrów z powrotem w kolbie do hodowli tkankowych i przenieść 50 mililitrów do 250-mililitrowej kolby z wytrząsarką bakteryjną.
Napowietrzać, ustawiając prędkość obrotową na około 120 obrotów na minutę. Aby uzyskać stały wzrost, inkubuj dokładnie w temperaturze pięciu procent dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Zbierz komórki, gdy osiągną gęstość w zakresie od dwóch przecinków pięć milionów komórek na mililitr, do pięciu milionów komórek na mililitr.
Upewnij się, że procent martwych komórek nie przekracza 25 procent, ponieważ martwe komórki zwiększą szum tła w testach cytotoksyczności. Bardzo ważne jest, aby zapobiec osadzaniu się komórek w zbiornikach, gdy dozujesz duże ilości makrofagów i bakterii za pomocą płynów. Wiruj zbiorniki co kilka minut podczas dozowania, aby uniknąć niejednorodności i studzienek na płytce testowej.
Płytki komórek w hodowli tkanek białych poddanych działaniu substancji 384 mikropłytki dołkowe po 50 000 komórek w 30 mikrolitrach pożywki do hodowli tkankowej na dołek. Inkubuj mikropłytki przez noc, aby osiągnąć dziewięćdziesiąt procent zbieżności w dniu eksperymentu. Przygotuj plamy bakterii do eksperymentów, rozprowadzając organizmy gęsto na nowej płytce BCYE i inkubując jeden dzień, aby uzyskać zlewny wzrost.
Ponownie zawiesić organizmy w tej samej pożywce do hodowli tkankowej, która jest używana do komórek J774A. 1. Aby przeprowadzić infekcję makrofagami, dodaj interesujące nas związki testowe, w tym związki przesiewowe oraz pozytywne i negatywne kontrole hamowania wzrostu bakterii w lizie komórek eukariotycznych.
Roztwory podstawowe powinny być rozpuszczone w ilości większej lub równej 500x w DMSO lub roztworze wodnym, aby umożliwić wystarczające rozcieńczenie nośnika. Rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do wartości docelowej dwa punkty pięć milionów CFU na milileter w pożywce do hodowli tkankowej. Następnie dodaj odpowiedni nietoksyczny barwnik nieprzeznaczonego kwasu nukleinowego z błoną o stężeniu dwupunktowym pięciokrotnym końcowym w teście.
Dodaj 20 mikrolitrów tej mieszaniny do każdej kultury. Ostateczna objętość testu wynosi 50 mikrolitrów, a końcowe stężenie bakterii powinno wynosić milion CFU na mililitr dla reportera lux epron lub cztery miliony CFU na mililitr dla reportera białka fluorescencyjnego. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni w pięcioprocentowym dwutlenku węgla przy 100% wilgotności względnej, aby zapobiec efektom parowania krawędzi.
Aby uniknąć wpływu temperatury na krawędź podczas odczytu wyników testu, należy zrównoważyć termicznie mikropłytki przed odczytem luminescencji, umieszczając je w jednej warstwie na stole laboratoryjnym z uchylonymi pokrywkami na około 20 minut. Odczytać wzrost bakterii i toksyczność komórek eukariotycznych na luminometrze mikropłytki i fluorometrze, odpowiednio do używanych reporterów. Zwróć mikropłytki do inkubatora, jeśli pożądany jest odczyt w czasie rzeczywistym w późniejszych punktach czasu.
Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do eksperymentów z dawką i testowaniem synergii należy przygotować makrofagi w bakteriach tak jak poprzednio. Tuż przed zakażeniem makrofagami lub inkubacją akseniczną należy użyć zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, aby ułatwić reakcję na pojedynczą dawkę w kombinatorycznych testach synergii ustawionych poprzez bezpośrednie automatyczne dodawanie rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych zgodnie z protokołem producenta.
Dodaj środki przeciwdrobnoustrojowe o znaczeniu eksperymentalnym w serii seryjnego podwajania rozcieńczeń. Celem jest rozciągnięcie, na wysokim końcu, stężenia, które całkowicie eliminuje wzrost, a na dolnym końcu, stężenie, które nie wykazuje oczywistej aktywności. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki w czasie dla fluorescencji związanej z luminescencją bakteryjną i cytotoksycznością.
Zwróć uwagę na kontrastujące efekty leczenia przeciwbakteryjnego i cytotoksycznego detergentu z komórek eukariotycznych. Do określenia selektywności antybiotyku Doksycykliny zastosowano podwójne oznaczanie odpowiedzi na dawkę IC50 i CC50 w tych samych studzienkach przesiewowych. Replikacja bakterii została zahamowana przez pośrednie stężenia antybiotyku.
Jednak cytotoksyczność obserwowano przy wysokich stężeniach zgodnych z selektywnością około 100. Ten sam format testu zastosowano do zbadania dwuwymiarowej odpowiedzi na dawkę dla kombinacji minocykliny i azytromycyny. Izokontury łączą punkty równego wewnątrzkomórkowego zahamowania wzrostu.
W tym przypadku wklęsłe izokontury sugerowały silne efekty synergiczne dla obu leków. Cyfrowa robotyka dozująca do konfiguracji testów, odczytu w czasie rzeczywistym i formatu o wysokiej przepustowości umożliwiły kombinatoryczne testowanie potrójnej synergii. W tym przypadku obserwacja wyraźnie wklęsłej powierzchni sugeruje wysoki stopień synergicznego działania kombinacji minocykliny, azytromycyny i ryfampicyny przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi legionella pheumophila.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć odczyt testu fluorescencyjnego lub luminescencyjnego z testami cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w formacie testu wysokoprzepustowego. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak mikroskop konfokalny, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zdarzeń biologicznych w całej komórce, które są również zlokalizowane z ich aktywnością przeciwdrobnoustrojową lub cytotoksycznością całej komórki. Chociaż badaliśmy wpływ na replikację legionelli, te same techniki można również zastosować do innych patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak Brucella i mikrobakterie.
Po raz pierwszy wpadliśmy na ten protokół, gdy próbowaliśmy opracować test wystarczająco prosty i wiarygodny, aby można go było stosować w formacie badań przesiewowych o bardzo wysokiej przepustowości. Nie zapominaj, że praca z patogenami bakteryjnymi, liniami komórkowymi i sprzętem zrobotyzowanym wiąże się z pewnym nieodłącznym ryzykiem i należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje wysoko przepustowy, czasowo rzeczywisty test zaprojektowany w celu zidentyfikowania przenikających do komórek eukariotycznych przeciwdrobnoustrojowych leków przeciwbakteryjnych, których celem są śródkomórkowe patogeny bakteryjne, jednocześnie oceniając cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Metoda ta pozwala na jednoczesne wykrywanie wzrostu bakterii i toksyczności dla komórek ssaków przy użyciu nietrwałych technik.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Farmakologia
- Biologia komórki
Tło
- Śródkomórkowe infekcje bakteryjne stanowią znaczne wyzwanie w leczeniu.
- Identyfikowanie nietoksycznych leków przeciwdrobnoustrojowych jest kluczowe dla skutecznej terapii.
- Testy czasowo rzeczywiste zapewniają nowatorskie podejście do odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych.
- Skalowalność jest kluczowym aspektem przy badaniu dużych bibliotek związków.
Cel badania
- Opracowanie metody identyfikacji małych cząsteczek inhibitorów wzrostu bakterii śródkomórkowych.
- Upewnienie się, że zidentyfikowane związki są nietoksyczne dla komórek gospodarza.
- Ułatwienie badań wysokiej rozdzielczości nad zależnością dawka-odpowiedź.
Zastosowane metody
- Testy czasowo rzeczywiste na jednoczesne wykrywanie wzrostu bakterii i toksyczności dla komórek.
- Technologia cyfrowego rozdzielania dla wysoko przepustowego przesiewania.
- Dwu- i trójwymiarowe badania synergii.
- Ocenienie ponad dziesięciu tysięcy związków w jednej sesji.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja przenikających do komórek eukariotycznych leków przeciwdrobnoustrojowych.
- Zadokumentowana nietoksyczność wybranych związków dla komórek ssaków.
- Ustanowienie skalowalnej metody do odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych o wysokiej przepustowości.
- Możliwość szczegółowej analizy zależności dawka-odpowiedź i synergii.
Wnioski
- Opracowany test jest cennym narzędziem w odkrywaniu leków przeciwdrobnoustrojowych.
- Umożliwia identyfikację skutecznych związków o minimalnej toksyczności dla gospodarza.
- Ta metoda może znacząco postępować w badaniach nad zwalczeniem śródkomórkowych infekcji bakteryjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput, real-time dual-readout assays for intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity address a critical bottleneck in early anti-infective discovery. By enabling simultaneous, non-destructive measurement of compound efficacy and host cell safety, this approach increases predictive confidence and accelerates triage of candidate molecules. The method supports scalable screening and robust data generation for portfolio-level decision making in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of compound penetration and intracellular pathogen inhibition.
- Supports functional target validation by linking antimicrobial action to host cell viability.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing selective inhibitors from cytotoxic agents.
- Improves predictive confidence for advancing hits to lead optimization.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, scalable assay formats for high-throughput compound evaluation.
- Provides quantitative, real-time readouts for both bacterial growth and host cytotoxicity.
- Enables reproducible, automated workflows compatible with digital dispensing robotics.
- Supports rapid dose-response and synergy testing in microplate formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro screening with disease-relevant intracellular infection models.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation for intracellular pathogens.
- Supports risk-adjusted advancement by integrating efficacy and safety data in a single assay.
- Facilitates translational biomarker development by correlating compound activity with host cell outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-readout assay bridges early discovery and lead identification, providing a foundation for downstream preclinical evaluation of anti-infective candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on compound selectivity and intracellular efficacy.
- Screening: Delivers high-throughput, reproducible, and quantitative outputs for compound triage.
- Analytics: Enables dual IC50/CC50 determination and synergy mapping for informed decision making.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant infection models for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, scalable platform adaptable to multiple intracellular pathogens and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates high-throughput screening with real-time, multiplexed readouts.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and capital allocation by integrating efficacy and safety data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates targeting intracellular pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, pathogen handling, and high-throughput assay design.
- Demands access to automated liquid handling, microplate readers, and digital dispensing robotics.
- Necessitates cross-team standardization for assay setup, data analysis, and quality control.
- Adaptable to various intracellular pathogens and compatible with both luminescent and fluorescent reporters.
- Practical limitations include managing cell viability, minimizing edge effects, and ensuring uniform dispensing at scale.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
Real Time Intracellular Growth and Eukaryotic Cell Cytotoxicity Assay
3:14
Preparing Luminescent or Fluorescent Legionella pneumophila and Macrophage Infection
4:49
Assay Readout, and Single and Multi-dimensional Dose-response Testing and Data Interpretation
6:09
Results: Simultaneous Real-time Assay Results for Intracellular Bacterial Growth and Eukaryotic Cell Cytotoxicity
7:41
Conclusion
