Name: Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym do identyfikacji przeciwdrobnoustrojowych związków wnikających do komórek eukariotycznych przy jednoczesnej ocenie cytotoksyczności. Metoda umożliwia przesiewanie ponad dziesięciu tysięcy związków w jednej sesji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem R01AI099122 dla J.E.K. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Chcielibyśmy podziękować Jennifer Smith, Davidowi Wróblowi, Su Chiangowi, Dougowi Floodowi, Seanowi Johnstonowi, Jennifer Nale, Stewartowi Rudnickiemu, Paulowi Yanowi, Richardowi Siu i Rachel Warden z ICCB-Longwood Screening Facility i/lub National Screening Laboratory for the New England Regional Centers of Excellence in Biodefense and Emerging Infectious Diseases (wspieranym przez U54AI057159) za ich pomoc w opracowywaniu i przeprowadzaniu wysokoprzepustowych testów przesiewowych. Chcielibyśmy również podziękować Kennethowi P. Smithowi za pomocne komentarze do manuskryptu.

1. Analiza wzrostu wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym i test cytotoksyczności komórek eukariotycznych
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek gospodarza (komórki J774A.1)
	<ol>
		<li>Hodowla J774A.1 Mus musculus komórki macrofagopodobne w zawiesinie w pożywce RPMI 1640 z 9% płodowej surowicy cielęcej uzupełnionej o żelazo. Początkowo pasażować w kolbach do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji w kolbie o powierzchni 75 cm²2 kolba do hodowli tkankowych w 15 ml pożywki, rozdzielona poprzez skrobanie i rozcieńczenie do 65 ml tym samym rodzajem pożywki, z czego 15 ml przeniesiono z powrotem do kolby do hodowli tkankowej, a 50 ml przeniesiono do 250 ml bakteryjnej kolby inkubacyjnej z wytrząsaniem.</li>
		<li>W celu zwiększenia skali hodowlę prowadzić w zawiesinie w kolbach bakteriologicznych o pojemności 250 ml i/lub 1000 ml, wypełnionych w jednej piątej objętości pożywką do hodowli tkankowych. Napowietrzanie zapewnić poprzez ustawienie prędkości obrotowej na około 120 obrotów na minutę. Aby zapewnić jednolity wzrost, inkubować przy stężeniu CO2 dokładnie 5%.2 i 37 °C.</li>
		<li>Zbierz komórki, gdy osiągną gęstość w zakresie 2,5 x 106 komórek/ml do 5 x 106 komórek/ml. Należy upewnić się, że odsetek martwych komórek (najłatwiej ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanu) nie przekracza 25%, ponieważ martwe komórki zwiększą szum tła w testach cytotoksyczności.</li>
		<li>Przenieść do białych, traktowanych do hodowli tkankowych mikropłytek 384-dołkowych w zagęszczeniu 5 x 104 komórki J774A.1 w 30 µl pożywki do hodowli tkankowych na każdą studzienkę. Inkubować mikropłytki przez noc, aby w dniu eksperymentu uzyskać 90% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek luminescencyjnych lub fluorescencyjnych Legionella pneumophila
	<ol>
		<li>Przejście L. pneumophila (Lp02::flaA::lux)8) bakterie na odpowiednim podłożu, t. j., podłoże buforowany ekstrakt drożdżowy z węglem aktywnym (BCYE). W przypadku użycia szczepu auksotroficznego względem tymidyny, uzupełnić podłoże o 100 µg/ml tymidyna. Przygotuj plamy bakterii do eksperymentów, gęsto nakładając organizmy na nową płytkę BCYE i inkubując je przez jeden dzień (jeśli pochodzą z poprzedniego pasażu na płytce) lub od dwóch do trzech dni (jeśli pochodzą z zamrożonego banku), aby uzyskać wzrost zlewający się.
		<ol>
			<li>Przygotować płytki BCYE, rozpuszczając 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g Nkwas -(2-acetamido)-2-aminoetanosulfonowy, 0,35 g K2HPO4oraz 1 g jednobazowego $\alpha$-ketoglutaranu potasu w 950 ml wody dejonizowanej. Dostosować pH do wartości 6,9 za pomocą wodorotlenku potasu ($\ge 2,5$ ml roztworu 11,9 M).</li>
			<li>Dodać 15 g agaru i 2 g węgla aktywnego, a następnie dopełnić do objętości końcowej 1 L. Włożyć mieszadło magnetyczne i wysterylizować w autoklawie. Schłodzić pożywkę do 55 °C następnie dodać roztwory sterylizowane przez filtr, zawierające 0,4 g L-cysteiny oraz 0,42 g cytrynianu amonu i żelaza(III) rozpuszczonych w wodzie dejonizowanej. Przed wylaniem na szalki Petriego wymieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
			<li>Do badania L. pneumophila wzrost w aksenicznym medium hodowlanym, przygotować bulion ACES-ekstrakt drożdżowy (AYE), łącząc wszystkie odczynniki chemiczne stosowane do BCYE z wyjątkiem węgla drzewnego i agaru. Poddaj sterylizacji przez filtrowanie i użyj niezwłocznie lub zamroź do późniejszych eksperymentów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Resuspender organizmy w tym samym medium do hodowli tkankowej, którego użyto dla komórek J774A.1, za pomocą 100 µg/ml suplementacja tymidyną w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Infekcja makrofagów
	<ol>
		<li>Należy dodać interesujące związki testowe (związki przesiewowe oraz kontrole pozytywne i negatywne w zakresie hamowania wzrostu bakterii i lizy komórek eukariotycznych). Zaleca się rozpuszczenie roztworów zapasowych w stężeniu ≥500x w DMSO (dimetylosulfoksydzie) lub roztworze wodnym, aby umożliwić odpowiednie rozcieńczenie nośnika.
		<ol>
			<li>Chociaż roztwory zapasowe można przechowywać w stanie zamrożonym, należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania w przypadku związków labilnych oraz środków przeciwdrobnoustrojowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do wartości docelowej 2,5 x 106 CFU (jednostka tworząca kolonię)/m oraz bakterie znakowane fluorescencyjnym reporterem do 1,0 x 107 CFU/ml w pożywce do hodowli tkankowych, a następnie dodać odpowiedni nietoksyczny, nieprzenikający przez błonę barwnik wiążący kwasy nukleinowe w stężeniu 2,5x stężenia końcowego w teście.</li>
		<li>Dodaj 20 µl mieszaniny do każdej studzienki z hodowlą J774A.1, końcowa objętość analizy 50 µl, końcowe stężenie bakterii 1 x 106 JTK/ml (reporter operonu lux) lub 4 x 10 106 Jtk/ml (reporter białka fluorescencyjnego).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–3 dni w 5% CO22 przy 100% wilgotności względnej, aby zapobiec efektowi brzegowemu wynikającemu z odparowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt analizy
	<ol>
		<li>Odczytać wzrost bakterii oraz toksyczność komórek eukariotycznych przy użyciu luminometru i fluorymetru do mikropłytek, odpowiednio do stosowanych genów reporterowych.
		<ol>
			<li>Aby uniknąć efektów brzegowych związanych z temperaturą, przed pomiarem luminescencji należy wyrównać temperaturę mikropłytek, umieszczając je w jednej warstwie na blacie laboratoryjnym z uchylonymi pokrywkami przez około 20 minut (lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza bez pokrywek przez około 10 minut).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wrócić mikroplatek do inkubatora, jeśli pożądany jest odczyt w czasie rzeczywistym w późniejszych punktach czasowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza danych
<ol>
	<li>Znormalizuj dane względem kontroli pozytywnej i negatywnej, aby obliczyć procent lub krotność hamowania wzrostu bakterii wewnątrzkomórkowych oraz procent cytotoksyczności dla komórek eukariotycznych.</li>
	<li>W celu oceny odporności testu oblicz statystyczną separację między kontrolami pozytywną i negatywną zarówno dla hamowania wzrostu bakterii, jak i cytotoksyczności, stosując analizę współczynnika Z (Z'), gdzie Z' = 1 - 3(σp + σn)/|µp + µn|. W tym równaniu σp i σn to odpowiednio odchylenia standardowe dla studzienek kontroli pozytywnej i negatywnej; µp i µn to odpowiednio wartości średnie dla studzienek kontroli pozytywnej i negatywnej.
	<ol>
		<li>W przypadku testów przesiewowych wysokoprzepustowych oblicz standardowe wyniki z (z-scores) (lub inne alternatywne, ilościowe miary statystyczne), aby ocenić działanie badanych związków. Alternatywnie oblicz prostą krotność redukcji lub logarytmiczną krotność redukcji jako potencjalnie bardziej istotną fizjologicznie miarę wielkości efektu dla bakterii replikujących się geometrycznie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Jednowymiarowe i wielowymiarowe (t. j., Synergia) Badanie zależności dawka-odpowiedź i interpretacja danych
<ol>
	<li>Przygotować makrofagi i bakterie zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu.</li>
	<li>Bezpośrednio przed zakażeniem lub inkubacją akseniczną dodać badane środki przeciwdrobnoustrojowe w seryjnym szeregu rozcieńczeń dwukrotnych, tak aby zakres stężeń obejmował w górnej granicy stężenie całkowicie hamujące wzrost (tj. minimalne stężenie hamujące lub MIC) oraz w dolnej granice stężenie niewykazujące widocznej aktywności.</li>
	<li>Aby ułatwić konfigurację testów pojedynczej odpowiedzi na dawkę oraz testów synergii kombinowanej, należy zastosować zautomatyzowany system dozowania cieczy, przeprowadzając bezpośrednie, zautomatyzowane dodawanie rozcieńczeń środków przeciwdrobnoustrojowych zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>W celu zwiększenia dokładności i powtarzalności danych należy rozważyć zastosowanie rozcieńczeń niebinarnych, na przykład serii rozcieńczeń <img alt="Schemat matematyczny symbolu pierwiastka kwadratowego, zastosowanie edukacyjne, wizualizacja formuły, analiza badawcza." src="/files/ftp_upload/54841/54841eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">-krotnych oraz powtórzenia analiz.</li>
	<li>W przypadku zakażenia makrofagów rozcieńczyć luminescencyjne bakterie do wartości docelowej 2,5 x 106 CFU (jednostek tworzących kolonie)/ml w pożywce do hodowli tkankowych. Dodać 20 µl mieszaniny do każdej studni z hodowlą J774A.1, tak aby końcowa objętość analizy wynosiła 50 µl, a końcowe stężenie bakterii 1 x 106 CFU/ml; inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przy 100% wilgotności względnej.
	<ol>
		<li>W celu przetestowania wzrostu aksenicznego rozcieńczyć luminescencyjne bakterie do końcowego stężenia 1 x 106 CFU/ml w pożywce AYE, dodać 50 µl do każdej studni płytki 384-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przy 100% wilgotności względnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć indeks frakcyjnego stężenia hamującego dla kombinacji środków przeciwdrobnoustrojowych, które hamują wzrost bakterii. Dla każdego leku w kombinacji (a, b, . . n), który powoduje całkowite lub &gt;99% hamowanie wzrostu bakterii, obliczyć indywidualne frakcyjne stężenie hamujące (FICa, b, . . n.) w następujący sposób: FICa = stężenie związku „a” podzielone przez minimalne stężenie hamujące związku „a” stosowanego samodzielnie.. Korzystając z tej samej formuły, obliczyć FICb, itd. Następnie obliczyć kombinacyjny indeks FIC lub <img alt="Równowaga statyczna, równanie ΣFx=0, ilustrujące koncepcję równowagi z symbolem fizycznym." src="/files/ftp_upload/54841/54841eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"> FIC = FICa + FICb + . . .FICn dla każdej kombinacji hamującej.
	<ol>
		<li>Do oceny synergii należy użyć indeksu kombinacyjnego, który najbardziej odbiega od wartości 1,0. Wartość ≤0,5 należy uznać za konserwatywny wskaźnik efektu synergistycznego, a wartość ≥4 za efekt antagonistyczny.12</li>
		<li>Sporządzić izobologramy, izobologramy izokonturowe i/lub izobologramy izopowierzchniowe6 jako alternatywne graficzne przedstawienia efektów kombinowanych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Garzoni, C., Kelley, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%3A+new+evidence+for+intracellular+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence.</a> Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).</li>
<li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li>
<li>Blango, M. G., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+face+of+multiple+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+impermeant%2C+DNA-binding+dye+fluorescence+as+a+real-time+readout+of+eukaryotic+cell+toxicity+in+a+high+throughput+screening+format%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format.</a> Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).</li>
<li>Edelstein, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+chemotherapy+for+legionnaires%27+disease%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review.</a> Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).</li>
<li>Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Intracellular+Antimicrobial+Susceptibility+Testing+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).</li>
<li>Pedro-Botet, L., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella%3A+macrolides+or+quinolones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Legionella: macrolides or quinolones?</a> Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).</li>
<li>Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+Legionella+pneumophila+growth+in+macrophages+requires+the+concerted+action+of+cytokine+and+Naip5%2FIpaf+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways.</a> Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+intravital+imaging+of+cellular+differentiation+with+a+bright+red-excitable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein.</a> Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).</li>
<li>Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEliopoulos%2C+GM+%22Antimicrobial+combinations.+In%3A+Antibiotics+in+Laboratory+Medicin%22">Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin</a>. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).</li>
<li>Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+direct+compound+dispensing+method+using+the+HP+D300+digital+dispenser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser.</a> J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy%2C+antagonism%2C+and+what+the+chequerboard+puts+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+intracellular+targeting+properties+associated+with+mutations+in+the+Legionella+pneumophila+dotA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene.</a> Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).</li>
<li>Vogel, J. P., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of Legionella pneumophila.</a> Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).</li>
<li>Kirby, J. E., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease%3A+the+pore+macrophage+and+the+legion+of+terror+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within.</a> Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).</li>
<li>Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+pore-forming+ability+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila.</a> Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279 (5352), 873-876 (1998).</li>
<li>Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Effects+of+Tetracycline+Analogues+%28Doxycycline%2C+Minocycline+and+COL-3%29+in+Acute+Myeloid+Leukemia+HL-60+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells.</a> PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).</li>
<li>Isberg, R. R., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+genetic+locus+encoded+by+Yersinia+pseudotuberculosis+permits+invasion+of+cultured+animal+cells+by+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12.</a> Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Chem+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Mayr, L. M., Bojanic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+trends+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel trends in high-throughput screening.</a> Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).</li>
<li>Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunlap%2C+P+%22Bioluminescence%3A+Fundamentals+and+Applications+in+Biotechnology+-+Volume+1%22">Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1</a>. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy testy w czasie rzeczywistym do jednoczesnego wykrywania wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i cytotoksyczności komórek gospodarza. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, aby zapewnić solidną wydajność testu, musi istnieć wystarczająca separacja spektralna między odczytami bakteryjnymi i cytotoksycznymi. Taka separacja jest nieodłączna dla kombinacji reporterów operonów lucyferazy i fluorescencyjnych barwników wiążących DNA. Jednak w oparciu o nasze doświadczenie (Tabela 1-3</st...

Patogeny, które tymczasowo rosną lub przebywają w przedziałach wewnątrzkomórkowych, są trudne do terapeutycznego wyeliminowania. Obligatoryjne lub względnie obligatoryjne patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis i Mycobacterium spp. często wymagają długotrwałych cykli terapii przeciwbakteryjnej w celu wyleczenia, które mogą trwać od miesięcy do nawet lat. Co więcej, patogeny zewnątrzkomórkowe mogą przejściowo zajmować nisze wewnątrzkomórkowe i w ten sposób unikać usuwania przez normalny przebieg terapii przeciwdrobnoustrojowej, a później pojawiają się, aby rozpocząć nowe rundy zjadliwej infekcji. Zakażenia Staphylococcus aureus1 i uropatogenne Enterobacteriaceae2,3 to dwa coraz częściej rozpoznawane przykłady. Dlatego podstawowym celem odkrywania leków jest identyfikacja nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, które przenikają do przedziałów wewnątrzkomórkowych. Szczególnie pożądana jest optymalna terapia w celu szybkiego wyeliminowania organizmów wewnątrzkomórkowych i zapobieżenia rozwojowi oporności poprzez subhamującą ekspozycję na środki przeciwdrobnoustrojowe.
W tym celu opracowaliśmy technologię wysokoprzepustowych badań przesiewowych, aby zidentyfikować wewnątrzkomórkowe środki przeciwdrobnoustrojowe ukierunkowane na wewnątrzkomórkowy wzrost modelowego patogenu, Legionella pneumophila. 4 Wcześniejsze obserwacje kliniczne wskazują, że standardowe testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe nie pozwalały dokładnie przewidzieć skuteczności terapeutycznej in vivo przeciwko temu organizmowi. 5 Wynikało to w szczególności z faktu, że główne klasy środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak β-laktamy i aminoglikozydy, chociaż wysoce skuteczne przeciwko bakterii Legionella hodowanej w osi, nie przenikają w wystarczającym stopniu do przedziałów wewnątrzkomórkowych, w których znajduje się Legionella. 5,6 Późniejsze dowody sugerowały, że technicznie bardziej złożone testy wzrostu wewnątrzkomórkowego skutecznie przewidywały skuteczność kliniczną. 7 Niestety, testy te były niezwykle pracochłonnymi testami końcowymi, wymagającymi lizy zakażonych makrofagów, traktowanych środkami przeciwdrobnoustrojowymi, w różnych punktach czasowych w celu zliczenia jednostek tworzących kolonie. Takie testy są niepraktyczne do wykonania na dużą skalę i nie nadają się do wysokoprzepustowego odkrywania leków.
Dlatego opracowaliśmy technologię do określania wzrostu bakterii wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym. 6 Osiągnięto to dzięki zastosowaniu szczepu bakteryjnego zmodyfikowanego przez integrację operonu8 lucyferazy bakteryjnej (test pierwszej generacji, opisany wcześniej)4 lub reporterów białka fluorescencyjnego9 (druga generacja, test ortogonalny, opisany tutaj) z chromosomem bakteryjnym. W ten sposób sygnał luminescencyjny lub fluorescencyjny zapewnia zastępczy odczyt liczby bakterii w czasie rzeczywistym.
Jednak te atrybuty nie rozwiązują głównego problemu w testach infekcji wewnątrzkomórkowych, niezamierzonego wpływu na komórki gospodarza. W szczególności śmierć komórki gospodarza z natury ogranicza wzrost wewnątrzkomórkowy i prowadzi do fałszywie dodatniej identyfikacji działania przeciwdrobnoustrojowego. Ponieważ wiele związków w bibliotekach przesiewowych jest toksycznych dla komórek eukariotycznych, takie fałszywie dodatnie wyniki przytłoczyłyby prawdziwe środki przeciwdrobnoustrojowe, co wymagałoby dużej liczby kontrolnych testów cytotoksyczności w punkcie końcowym w celu rozwiązania problemu.
Dlatego bardzo interesujące było możliwość jednoczesnej oceny żywotności komórek eukariotycznych i wzrostu wewnątrzkomórkowego. Warto zauważyć, że cechą niezdolnych do życia komórek eukariotycznych jest utrata integralności błony komórkowej. Sondy, które badają przepuszczalność błony komórkowej, mogą być zatem wykorzystywane do oceny żywotności komórek. Wcześniej scharakteryzowaliśmy zdolność serii przypuszczalnie nieprzepuszczalnych dla błony komórkowej, fluorescencyjnych barwników wiążących DNA do uzyskiwania dostępu i barwienia jądrowego DNA martwych komórek. 4 Po związaniu jądrowego DNA barwniki te wykazują duży wzrost wydajności fluorescencji kwantowej, co skutkuje zwiększonym sygnałem w stosunku do fluorescencji roztworu tła. W związku z tym barwniki te zapewniły ilościowy odczyt śmierci komórek eukariotycznych. 4 W szczególności stwierdziliśmy, że kilka z nich było nietoksycznych podczas długotrwałej koinkubacji z makrofagami J774. Po dodaniu podczas początkowej infekcji zapewniały one fluorescencyjny odczyt śmierci komórek eukariotycznych w czasie rzeczywistym, który można zmierzyć za pomocą fluorymetru na mikropłytkach lub obserwować pod mikroskopem.
Dlatego też, łącząc użycie bakteryjnego reportera i nietoksycznych, nieprzepuszczalnych dla błony, wiążących DNA barwników, byliśmy w stanie opracować prosty, nieniszczący test w czasie rzeczywistym do jednoczesnego pomiaru zarówno obciążenia bakteryjnego, jak i cytotoksyczności komórek eukariotycznych. Ten test pozwolił nam na badanie przesiewowe w formacie płytki 384-dołkowej ~ 10 000 znanych substancji bioaktywnych, w tym ~250 środków przeciwdrobnoustrojowych i > 240 000 małych cząsteczek o funkcjonalnie niescharakteryzowanej aktywności pod kątem zdolności do hamowania wewnątrzkomórkowego wzrostu Legionella pneumophila, jednocześnie generując dane dotyczące cytotoksyczności komórek eukariotycznych dla każdego związku. 6 Nasza analiza znanych środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi bakterii Legionella była jak dotąd najbardziej wszechstronnym badaniem tego typu. 6
Opierając się na skuteczności naszego formatu testu, następnie zbadaliśmy również potencjalnie synergiczne efekty znanych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w połączeniu. Jeden z najczęstszych testów synergii, tak zwany test szachownicy, jest standardowo wykonywany poprzez ocenę efektów kombinatorycznych dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych. 10 W tych testach synergię definiuje się poprzez zaobserwowanie większego efektu, gdy dwa lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych jest stosowanych razem, niż suma skutków każdego z nich zastosowanych oddzielnie. Warto zauważyć, że do tej pory przeprowadzano tylko ukierunkowane i selektywne testy synergiczne przeciwko wewnątrzkomórkowej Legionella pneumophila ze względu na ogromny wysiłek związany z tradycyjnymi testami końcowymi pomnożonymi przez wymagane permutacje kombinatoryczne.
Aby ułatwić testowanie synergii, wykorzystaliśmy nasz test wzrostu wewnątrzkomórkowego/cytotoksyczności eukariotycznej w czasie rzeczywistym w połączeniu z automatyczną technologią cyfrowego dozowania6. Ta automatyzacja pozwoliła nam na dozowanie seryjnych rozcieńczeń związków rozpuszczonych w DMSO lub roztworze wodnym samodzielnie lub w połączeniu w formacie 384-dołkowym. 11 Co więcej, tak solidna technologia obsługi cieczy pozwoliła nam z łatwością wykonać kombinacje rozcieńczeń o wyższej rozdzielczości, pierwiastku kwadratowym z dwóch (zamiast standardowego, o niższej rozdzielczości, podwajającego) rozcieńczenia, aby osiągnąć wyższe poziomy swoistości w naszej dwuwymiarowej analizie synergii w szachownicę. Rezolucja ta była szczególnie cenna w rozwianiu obaw w dziedzinie synergii dotyczących odtwarzalności w przypadku stosowania serii rozcieńczeńdwukrotnych 12. Wreszcie, nasz test był ilościowy, a zatem mierzył również gradacje hamowania. W rezultacie, test uchwycił całość informacji hamujących, wyrażalnych w izokonturowych izobologramach, w których izokontury łączą stężenia kombinatoryczne o podobnych poziomach zahamowania wzrostu. 6 Ta strategia kreślenia pozwoliła na wizualizację kombinatorycznych krzywych dawka-odpowiedź. Aby zilustrować naszą metodologię, opisujemy nasz protokół wykonywania tych testów i pokazujemy reprezentatywne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Komórki J774A.1</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>TIB-67</td><td>Komórka gospodarza</td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758&nbsp;</td><td>Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, ultrafiltrowany</td><td>Becton-Dickinson/Difco</td><td>210929</td><td>Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; niższe stopnie mogą powodować upośledzenie wzrostu i/lub zmianę wrażliwości Legionelli na inhibitory wzrostu</td></tr><tr><td>Kwas alfa-ketoglutarowy, sól monopotasowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2000</td><td>Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego Pożywka</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego</td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7755</td><td>Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu</td></tr> <tr><td>drożdżowegoCytrynian amonu żelaza(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879</td><td>Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; zamiast tego można użyć pirofosforanu żelaza, ale jest on trudniejszy do dokładnego zważenia</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku potasu, skoncentrowany</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP236-500</td><td>Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego</td></tr><tr><td>Woda odonionowana</td><td>Nie dotyczy</td><td></td> Nie dotyczy<td>Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego</td></tr><tr><td>Tymidyna (klasa hodowli tkankowej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895</td><td>Do uzupełniania zarówno RPMI 1640, jak i buforowanego ekstraktu drożdżowego agar / pożywka i mdash; niższa klasa tymidyny może być stosowana do tego ostatniego, ale może powodować upośledzenie wzrostu komórek i/lub śmierć komórek w RPMI 1640</td></tr><tr><td>RPMI 1640, standardowa formuła</td><td>Corning przez Thermo Fisher Scientific</td><td>10-040-CV</td><td>Do hodowli komórek J774A.1 przed posiewem; zawiera 2 mM L-glutaminy</td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej</td><td>Corning przez Thermo Fisher Scientific</td><td>17-105-CV</td><td>Do posiewania komórek J774A.1 w szalkach 384 dołków (nie nadaje się do wzrostu przed posiewem); brakuje również L-glutaminy &mdash; uzupełnienie do 2 mM przed użyciem</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM w 0,85% NaCl (klasa hodowli tkankowej)</td><td>HyClone przez Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td>Do uzupełnienia RPMI 1640 pozbawionego L-glutaminy, do 2 mM stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Surowica cielęca uzupełniona żelazem</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-510</td><td>Do uzupełnienia RPMI 1640, do 9,1% stężenia końcowego</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Do barwienia J774A.1 oznaczanie śmierci komórek podczas zliczania gęstości komórek</td></tr><tr><td>SYTOX Green, 5 mM roztwór w DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>Do barwienia w celu określenia śmierci komórki J774A.1 za pomocą odczytu fluorescencji lub mikroskopii epifluorescencyjnej (w połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi pomarańczowo-czerwonymi lub dalekiej czerwieni). Stosować przy stężeniu końcowym 125 nM.</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-255-26</td><td>Do inkubacji komórek J774A.1 (zarówno przed, jak i po zakażeniu); może być również używany do inkubacji bakterii lub zamiast niego można użyć inkubatora ze standardową atmosferą)</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-01010</td><td>Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem; mieści się w inkubatorze do hodowli komórkowych; zawiera podstawę wytrząsarki 7744-01000 i tacę 7740-01010 (są one również dostępne osobno)</td></tr><tr><td>Kolby do wytrząsania (250 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-04</td><td>Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed infekcją</td></tr><tr><td>Zaciski wytrząsarskie do kolb (250 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16250</td><td>Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem</td></tr><tr><td>Kolby wytrząsające (1,000 ml)</td><td>ChemGlass Life Sciences</td><td>CLS-2038-07</td><td>Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem</td></tr><tr><td>Zaciski wytrząsające do kolb (1,000 ml)</td><td>BellCo Glass</td><td>7744-16100</td><td>Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem</td></tr><tr><td>Nasadki z pianki gąbczastej do kolb (250 ml-1,000 ml)</td><td>ChemGlass Nauki przyrodnicze</td><td>CLS-1490-038</td><td>Do inkubacji wytrząsania komórek J774A.1 przed zakażeniem; zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia w porównaniu ze standardowymi nasadkami metalowymi</td></tr><tr><td>Programowalna wielokanałowa pompa perystaltyczna MultiDrop Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Do dozowania komórek J774A.1, pożywki i zawiesiny bakteryjnej zawierającej fluorofory do dużej liczby naczyń 384 dołków</td></tr><tr><td>Standardowy kolektor wiertniczy Combi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td>Domyślna objętość dozowania wstępnego 20 &#956; l jest niewystarczający do skompensowania osiadania &mdash; wzrost do 80 i #956; l</td></tr><tr><td>Białe 384 dobrze naczynia poddane hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>Do odczytu luminescencji i fluorescencji; Katalog Greiner # 781080 również pomyślnie przetestowany</td></tr><tr><td>DMSO (klasa hodowli tkankowej, w szczelnie zamkniętych ampułkach)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Do rozpuszczania kontroli pozytywnej i związków testowych</td></tr><tr><td>Azytromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1088</td><td>Antybiotykowa kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Saponina (z kory Quillaja)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4521</td><td>Cytoksyczność kontrola dodatnia</td></tr><tr><td>Pipetor</td> <td>wielokanałowyPipeta Thermo Fisher Scientific</td><td>Do</td><td>przenoszenia ustalonych ilości związków kontroli dodatniej; pipetor musi być wyposażony w cyfrowe dozowanie z zapadkami, aby umożliwić powtarzalne dozowanie o stałej objętości</td></tr><tr><td>Robot do przenoszenia pinów</td><td>Epson Epson/ICCB-L</td> <td>(wyposażenie niestandardowe)</td><td>Do transferu stałych ilości związków testowych z tablic bibliotecznych</td></tr><tr><td>Cyfrowy system dozowania D300</td><td>Hewlett-Packard przez Tecan</td><td>D300</td><td>Do przenoszenia zmiennych ilości badanych związków w zakresie od 11 pikolilitrów do 10 &mikro; l</td></tr><tr><td>Wkłady T8+ do cyfrowego systemu dozowania D300</td><td>Hewlett-Packard przez Tecan</td><td>T8+</td><td>Do dozowania związków testowych</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny z podłączoną do komputera kamerą cyfrową</td><td>Nikon</td><td>Ti</td><td>Do obrazowania żywych komórek; każdy standardowy mikroskop fluorescencyjny może zastąpić, z kontrastem fazowym lub optyką DIC, zdolny do obrazowania fluorescencji zielonej (fluoresceina), pomarańczowo-czerwonej do czerwonej (Texas Red) i dalekiej czerwonej (Cy5) fluorescencji, olejem 100X cel dla najwyższej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Do obrazowania żywych komórek. Anteny takie jak MatTek umożliwiają wizualizację mikroskopową przy powiększeniu 600X lub 1,000X dzięki zastosowaniu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Te specyficzne naczynia mają średnicę nominalną 3,5 cm, średnicę wewnętrzną 3,3 cm, z szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 20 mm o grubości #1,5 włożonymi w dno.</td></tr><tr><td>Photoshop, CS6</td>, <td>Adobe</td><td></td><td>, Adobe Photoshop lub podobne programy mogą być używane do pseudokolorowania i scalania jasnych, mikroskopijnych i fluorescencyjnych obrazów.</td></tr><tr><td>Mathematica 10</td><td>Wolfam</td><td></td><td>Do generowania dwuwymiarowych izokonturów izokonturowych i trójwymiarowych izokonturów powierzchniowych.</td></tr></tbody></table>

wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Tradycyjne miary wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych opierają się na testach końcowych. Takie testy punktów końcowych wymagają kilku dodatkowych etapów eksperymentalnych przed odczytem, takich jak liza komórek, oznaczanie jednostek tworzących kolonie lub dodawanie odczynników. Podczas wykonywania tysięcy testów, na przykład podczas wysokoprzepustowych badań przesiewowych, wysiłek wymagany w przypadku tego typu testów jest znaczny. Dlatego, aby ułatwić wysokoprzepustowe odkrywanie środków przeciwdrobnoustrojowych, opracowaliśmy test w czasie rzeczywistym, aby jednocześnie zidentyfikować inhibitory wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. W szczególności wykrywanie wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym było możliwe dzięki znakowaniu szczepów przesiewowych bakterii za pomocą operonu luksa bakteryjnego (test 1. generacji) lub fluorescencyjnych reporterów białkowych (test ortogonalny 2. generacji). Nietoksyczny, nieprzepuszczalny dla błony komórkowej, wiążący kwasy nukleinowe barwnik został również dodany podczas początkowej infekcji makrofagów. Barwniki te są wykluczone z żywotnych komórek. Jednak niezdolne do życia komórki gospodarza tracą integralność błony, umożliwiając wnikanie i znakowanie fluorescencyjne jądrowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego). Warto zauważyć, że wiązanie DNA wiąże się z dużym wzrostem fluorescencyjnej wydajności kwantowej, która zapewnia oparty na roztworze odczyt śmierci komórki gospodarza. Wykorzystaliśmy ten połączony test do przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego w formacie mikropłytki oraz do oceny wzrostu wewnątrzkomórkowego i cytotoksyczności za pomocą mikroskopii. W szczególności środki przeciwdrobnoustrojowe mogą wykazywać synergię, w której łączne działanie dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych razem jest większe niż w przypadku stosowania osobno. Testowanie synergii in vitro przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym jest zwykle ogromnym zadaniem, ponieważ należy ocenić kombinatoryczne permutacje antybiotyków w różnych stężeniach. Okazało się jednak, że nasz test w czasie rzeczywistym w połączeniu ze zautomatyzowaną, cyfrową technologią dozowania umożliwił łatwe testowanie synergii. Korzystając z tych podejść, byliśmy w stanie systematycznie badać działanie dużej liczby środków przeciwdrobnoustrojowych samodzielnie i w połączeniu przeciwko wewnątrzkomórkowemu patogenowi, Legionella pneumophila.

Test wzrostu wewnątrzkomórkowego na mikropłytkach
Rycina 1 przedstawia schemat etapów analizy. Przedstawione zautomatyzowane kroki można wykonać ręcznie. Jednakże przepustowość jest znacznie zwiększona przy zastosowaniu systemów do obsługi cieczy.
Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki z 384-dołkowej mikropłytki w teście wzrostu ...

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie pojedynczego kombinowanego testu w czasie rzeczywistym do identyfikacji specyficznych małocząsteczkowych inhibitorów wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii, które nie są toksyczne dla komórek gospodarza. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania środków przeciwdrobnoustrojowych. W szczególności: jakie rodzaje związków mogą przenikać do przedziałów wewnątrzkomórkowych i zabijać patogeny, nie uszkadzając komórki gospodarza?Głównymi zaletami tej techniki jest jednoczesne wykrywanie wzrostu bakterii oraz toksyczności dla komórek ssaczych przy użyciu niedestrukcyjnych analiz w czasie rzeczywistym. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności ze skalowalnością, jaką ona oferuje. Analiza więcej niż dziesięciu tysięcy związków w jednej serii wymaga zupełnie nowego zestawu technik i sprzętu.Oprócz Luciusa, wspólne zaangażowanie w akademickie odkrywanie środków przeciwdrobnoustrojowych i translacyjną mikrobiologię diagnostyczną wykazują stypendyści podoktorscy: KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn oraz studentka studiów licencjackich Kat Truelson. Aby przygotowa

high-throughput-real-time-dual-readout-testing-intracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.

Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Ulepszone testy neurotoksyczności in vitro pomogłyby w identyfikacji nowych związków neuroprotekcyjnych. Przedstawiono przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania cytotoksyczności i cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych oraz do wyznaczania udziału szlaków drugiego przekaźnika, uzyskując w ten sposób wgląd w mechanizm neuroprotekcji.

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym do identyfikacji przeciwdrobnoustrojowych związków wnikających do komórek eukariotycznych przy jednoczesnej ocenie cytotoksyczności. Metoda umożliwia przesiewanie ponad dziesięciu tysięcy związków w jednej sesji.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych (Wideo) | JoVE Journal

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Przeglądaj więcej filmów