Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie pojedynczego kombinowanego testu w czasie rzeczywistym do identyfikacji specyficznych małocząsteczkowych inhibitorów wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii, które są nietoksyczne dla komórek gospodarza. Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania środków przeciwdrobnoustrojowych. W szczególności, jakie rodzaje związków mogą przenikać do przedziałów wewnątrzkomórkowych i zabijać patogeny bez szkody dla komórki gospodarza?

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wzrost bakterii, toksyczność komórek ssaków jest wykrywana jednocześnie za pomocą nieniszczących testów w czasie rzeczywistym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy ze skalowalnością, którą zapewnia. Oznaczenie więcej niż dziesięciu tysięcy związków w jednej sesji wymaga zupełnie nowego zestawu technik i sprzętu.

Oprócz Luciusa, wspólne zaangażowanie w akademickie odkrycia przeciwdrobnoustrojowe i translacyjną mikrobiologię diagnostyczną wykazują stypendyści podoktoranccy, KP Smith, Yoon-Suk Kang, Jennifer Tsang, Thea Brennan-Krohn i studentka Kat Truelson. Aby przygotować komórki gospodarza, hoduj J774A. 1 makrofag znajduje się w zawiesinie w RPMI 1640, z dziewięcioprocentową surowicą cielęcą uzupełnioną żelazem.

Początkowo pasażować komórki w kolbach do hodowli tkankowych. Po tym, jak komórki zlewają się w kolbie do hodowli tkankowej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych w 15 mililitrach pożywki, podziel komórki, zeskrobując je i rozcieńczając do 65 mililitrów tym samym rodzajem pożywki. Umieścić 15 mililitrów z powrotem w kolbie do hodowli tkankowych i przenieść 50 mililitrów do 250-mililitrowej kolby z wytrząsarką bakteryjną.

Napowietrzać, ustawiając prędkość obrotową na około 120 obrotów na minutę. Aby uzyskać stały wzrost, inkubuj dokładnie w temperaturze pięciu procent dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Zbierz komórki, gdy osiągną gęstość w zakresie od dwóch przecinków pięć milionów komórek na mililitr, do pięciu milionów komórek na mililitr.

Upewnij się, że procent martwych komórek nie przekracza 25 procent, ponieważ martwe komórki zwiększą szum tła w testach cytotoksyczności. Bardzo ważne jest, aby zapobiec osadzaniu się komórek w zbiornikach, gdy dozujesz duże ilości makrofagów i bakterii za pomocą płynów. Wiruj zbiorniki co kilka minut podczas dozowania, aby uniknąć niejednorodności i studzienek na płytce testowej.

Płytki komórek w hodowli tkanek białych poddanych działaniu substancji 384 mikropłytki dołkowe po 50 000 komórek w 30 mikrolitrach pożywki do hodowli tkankowej na dołek. Inkubuj mikropłytki przez noc, aby osiągnąć dziewięćdziesiąt procent zbieżności w dniu eksperymentu. Przygotuj plamy bakterii do eksperymentów, rozprowadzając organizmy gęsto na nowej płytce BCYE i inkubując jeden dzień, aby uzyskać zlewny wzrost.

Ponownie zawiesić organizmy w tej samej pożywce do hodowli tkankowej, która jest używana do komórek J774A. 1. Aby przeprowadzić infekcję makrofagami, dodaj interesujące nas związki testowe, w tym związki przesiewowe oraz pozytywne i negatywne kontrole hamowania wzrostu bakterii w lizie komórek eukariotycznych.

Roztwory podstawowe powinny być rozpuszczone w ilości większej lub równej 500x w DMSO lub roztworze wodnym, aby umożliwić wystarczające rozcieńczenie nośnika. Rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do wartości docelowej dwa punkty pięć milionów CFU na milileter w pożywce do hodowli tkankowej. Następnie dodaj odpowiedni nietoksyczny barwnik nieprzeznaczonego kwasu nukleinowego z błoną o stężeniu dwupunktowym pięciokrotnym końcowym w teście.

Dodaj 20 mikrolitrów tej mieszaniny do każdej kultury. Ostateczna objętość testu wynosi 50 mikrolitrów, a końcowe stężenie bakterii powinno wynosić milion CFU na mililitr dla reportera lux epron lub cztery miliony CFU na mililitr dla reportera białka fluorescencyjnego. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni w pięcioprocentowym dwutlenku węgla przy 100% wilgotności względnej, aby zapobiec efektom parowania krawędzi.

Aby uniknąć wpływu temperatury na krawędź podczas odczytu wyników testu, należy zrównoważyć termicznie mikropłytki przed odczytem luminescencji, umieszczając je w jednej warstwie na stole laboratoryjnym z uchylonymi pokrywkami na około 20 minut. Odczytać wzrost bakterii i toksyczność komórek eukariotycznych na luminometrze mikropłytki i fluorometrze, odpowiednio do używanych reporterów. Zwróć mikropłytki do inkubatora, jeśli pożądany jest odczyt w czasie rzeczywistym w późniejszych punktach czasu.

Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do eksperymentów z dawką i testowaniem synergii należy przygotować makrofagi w bakteriach tak jak poprzednio. Tuż przed zakażeniem makrofagami lub inkubacją akseniczną należy użyć zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, aby ułatwić reakcję na pojedynczą dawkę w kombinatorycznych testach synergii ustawionych poprzez bezpośrednie automatyczne dodawanie rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych zgodnie z protokołem producenta.

Dodaj środki przeciwdrobnoustrojowe o znaczeniu eksperymentalnym w serii seryjnego podwajania rozcieńczeń. Celem jest rozciągnięcie, na wysokim końcu, stężenia, które całkowicie eliminuje wzrost, a na dolnym końcu, stężenie, które nie wykazuje oczywistej aktywności. Pokazano tutaj reprezentatywne wyniki w czasie dla fluorescencji związanej z luminescencją bakteryjną i cytotoksycznością.

Zwróć uwagę na kontrastujące efekty leczenia przeciwbakteryjnego i cytotoksycznego detergentu z komórek eukariotycznych. Do określenia selektywności antybiotyku Doksycykliny zastosowano podwójne oznaczanie odpowiedzi na dawkę IC50 i CC50 w tych samych studzienkach przesiewowych. Replikacja bakterii została zahamowana przez pośrednie stężenia antybiotyku.

Jednak cytotoksyczność obserwowano przy wysokich stężeniach zgodnych z selektywnością około 100. Ten sam format testu zastosowano do zbadania dwuwymiarowej odpowiedzi na dawkę dla kombinacji minocykliny i azytromycyny. Izokontury łączą punkty równego wewnątrzkomórkowego zahamowania wzrostu.

W tym przypadku wklęsłe izokontury sugerowały silne efekty synergiczne dla obu leków. Cyfrowa robotyka dozująca do konfiguracji testów, odczytu w czasie rzeczywistym i formatu o wysokiej przepustowości umożliwiły kombinatoryczne testowanie potrójnej synergii. W tym przypadku obserwacja wyraźnie wklęsłej powierzchni sugeruje wysoki stopień synergicznego działania kombinacji minocykliny, azytromycyny i ryfampicyny przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi legionella pheumophila.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć odczyt testu fluorescencyjnego lub luminescencyjnego z testami cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w formacie testu wysokoprzepustowego. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak mikroskop konfokalny, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące zdarzeń biologicznych w całej komórce, które są również zlokalizowane z ich aktywnością przeciwdrobnoustrojową lub cytotoksycznością całej komórki. Chociaż badaliśmy wpływ na replikację legionelli, te same techniki można również zastosować do innych patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak Brucella i mikrobakterie.

Po raz pierwszy wpadliśmy na ten protokół, gdy próbowaliśmy opracować test wystarczająco prosty i wiarygodny, aby można go było stosować w formacie badań przesiewowych o bardzo wysokiej przepustowości. Nie zapominaj, że praca z patogenami bakteryjnymi, liniami komórkowymi i sprzętem zrobotyzowanym wiąże się z pewnym nieodłącznym ryzykiem i należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej podczas wykonywania tej procedury.