Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania

Ten protokół morfometryczny umożliwia monitorowanie intensywności kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas wcześniejszych interwencji witryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu, a także zapewnia wgląd w skuteczność metod witryfikacji wirusa. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować w laboratoriach zapłodnienia in vitro wyposażonych w mikroskopy poklatkowe oraz komputery z zaawansowanym oprogramowaniem do edycji obrazu. W piątym lub szóstym dniu ekspansji poddaj blastocystę z co najmniej kilkoma wewnętrznymi komórkami masy komórkowej i spoistą trofektodermą impulsowi laserowemu o średnicy od 0,4 do 0,7 milisekundy o średnicy otworu w zakresie od 4,3 do 9,4 mikrometra skierowanej stycznie na osłonkę przejrzystą i połączenie dwóch sąsiednich komórek trofektodermalnych.

Następnie pozwól blastocoelowi całkowicie lub częściowo się zapadnąć przez pięć minut. Następnie za pomocą maleńkiej pipety aseptycznie dodaj pożywkę równoważącą do otworów w obszarze mikrokropel dziewięciodołkowej szalki Petriego, specjalnie zaprojektowanej do mikroskopii poklatkowej i zapisu. Po dodaniu całej pożywki pokryć obszar mikrokropelki około 30 mikrolitrami pożywki równoważącej.

I zanurz potraktowaną laserowo blastocystę w pożywce równoważącej na dnie jednej studzienki mikrokropelki naczynia z mikrokroplami. Jak tylko blastocysta zostanie przeniesiona, uruchom minutnik odliczający czas na 10 minut. I przenieś miskę z mikrokroplami na stolik mikroskopu wyposażonego w kamerę.

Korzystając z 200-krotnego powiększenia, wyreguluj miskę z mikrokroplami tak, aby blastocysta znajdowała się mniej więcej pośrodku okna nagrywania. Następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do nagrywania mikroskopu, zwracając uwagę na czas odliczania, w którym rozpoczyna się nagrywanie. Aby przechowywać blastocystę, po załadowaniu zarodka do słomki witryfikacyjnej, zamknij słomkę i zanurz słomkę w ciekłym azocie między 80 a 110 sekundami ładowania, przed umieszczeniem blastocysty w temperaturze minus 196 stopni Celsjusza.

Aby zmierzyć pole przekroju poprzecznego monitorowanej blastocysty w fazie równowagi, umieść znacznik narzędzia szybkiego wyboru wewnątrz blastocysty, aż dotknie krawędzi blastocysty i kilkakrotnie kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby obrysować zewnętrzną krawędź blastocysty, aż cały obszar przekroju poprzecznego blastocysty zostanie wybrany. Następnie w oknie osi czasu kliknij dziennik pomiarów i zapisz pomiary. W celu reekspansji blastocysty należy szybko przenieść słomkę HSV z zeszkloną blastocystą z magazynu do przenośnego zbiornika wypełnionego ciekłym azotem.

I użyj kleszczy, aby podnieść słomę na tyle wysoko, aby odsłonić kolorowy pręt manipulacyjny. Użyj samoregulującego się ściągacza izolacji, aby przeciąć słomę na wysokości kolorowego pręta manipulacyjnego. I wyjmij pręt manipulacyjny ze słomy szybkim, kontrolowanym ruchem.

Natychmiast zanurz zakrzywioną szpatułkę pręta manipulacyjnego w pojemniku z roztworem do rozmrażania o temperaturze 37 stopni Celsjusza. I delikatnie zakręć prętem manipulacyjnym, aby odłączyć blastocystę. Po jednej minucie przemyj blastocystę sekwencyjnymi czterominutowymi zanurzeniami i roztworem rozcieńczającym.

Pierwszy roztwór myjący i roztwór myjący drugi. Następnie przenieś podgrzaną blastocystę do naczynia z czterema dołkami zawierającego świeżą pożywkę regeneracyjną i za pomocą pipety przemyj blastocystę we wszystkich trzech kroplach pożywki. Po ostatnim płukaniu przenieś blastocystę do dziewięciodołkowego naczynia poklatkowego, zawierającego pożywkę regeneracyjną.

I umieść dziewięciostudzienkową miskę pod kamerą poklatkową w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 6% CO2 i 5% O2. Teraz otwórz oprogramowanie do nagrywania poklatkowego i wybierz kamerę nagrywającą. Wybierz tryb na żywo i umieść kursor na obrazie.

Przewiń, aby powiększyć obraz i użyj lewego przycisku myszy, aby ustawić studzienkę zawierającą blastocystę na środku ekranu. W obszarze ostrości użyj strzałek, aby ustawić ostrość płaszczyzny nagrywania blastocysty, a w obszarze Natężenie światła ustaw natężenie światła obrazu. Kliknij opcję Parametry mikroskopu, aby ustawić czas ekspozycji i krzywą gamma, a następnie kliknij przycisk Zamknij tryb na żywo.

Kliknij przycisk Rozpocznij projekt, aby wprowadzić dane projektu. Wybierz typ naczynia hodowlanego i odznacz wszystkie pozycje z wyjątkiem tej, która ma być nagrywana. Następnie ustaw czas przechwytywania, aby robić zdjęcie co pięć minut i kliknij zatwierdź, aby nagrywać ponowną ekspansję blastocysty przez co najmniej 150 minut.

W tym reprezentatywnym, stale monitorowanym, nienaruszonym zarodku, nienaruszona blastocysta nie zapadła się całkowicie w roztworze równowagi i ponownie rozszerzyła się do około 70% pierwotnej wielkości po 10 minutach ekspozycji na roztwór równoważący. W przeciwieństwie do tego, ta sztucznie zapadnięta blastocysta została całkowicie opróżniona z blastocoelu natychmiast po leczeniu laserowym i nie zaobserwowano znaczącej ponownej ekspansji w ciągu 10 minut ekspozycji na roztwór równoważący. Po potraktowaniu pożywką witryfikacyjną, zawierającą wysokie stężenie krioprotektantów, ta zrównoważona nienaruszona blastocysta uległa stopniowej redukcji blastocoelu.

Po podgrzaniu ponownie się rozszerzył po wystawieniu na działanie pożywki regeneracyjnej. Ta blastocysta impulsowa laserem wykazała jednak natychmiastowe zapadnięcie się blastocoelu po leczeniu laserem, który nie został odzyskany podczas etapów równoważenia lub witryfikacji, co stawia pod znakiem zapytania konieczność tak długiej fazy równowagi dla zapadniętych blastocyst. Protokół daje również wgląd w zdolność blastocyst do regeneracji blastocoelu po ociepleniu.

Na przykład ponowna ekspansja blastocoelu po ociepleniu może być liniowa lub może być przerwana kilkoma większymi lub mniejszymi skurczami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że zarodki muszą pozostać na dnie szalki Petriego podczas nagrywania, tak krótko, jak to możliwe. Nie zapominaj, że wysokie stężenia krioprotektantów mogą być toksyczne dla zarodków.

Po każdym opracowaniu technika ta torowała drogę naukowcom w dziedzinie kriobiologii do zbadania skuteczności protokołów kriokonserwacji w programie zapłodnienia in vitro.