Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Ten protokół SiMPull umożliwia ilościowe określenie fosforylacji białek poprzez poprawę warunków znakowania i wiązania przeciwciał, zmniejszenie autofluorescencji występującej w kanale zielonym i zapewnienie solidnych algorytmów analizy pojedynczych cząsteczek. Podstawową zaletą SiMPull jest to, że pozwala nam badać stan fosforylacji poszczególnych nienaruszonych białek. Dzięki tej metodzie możemy uzyskać nowe informacje, które nie są dostępne za pomocą tradycyjnych technik, takich jak western blotting i analiza mass spec.

Mamy zespół badaczy, którzy pomagają zademonstrować protokół. Najpierw Julian Rojo pokaże, jak wytrawić piranię na szkle nakrywkowym. Następnie Rachel Grattan pokaże etapy powlekania szkła nakrywkowego.

A Elizabeth Bailey pokaże, jak narysować tablicę i próbki obrazu. Na początek pirania wytrawia szkiełka osłonowe, delikatnie mieszając zlewkę reakcyjną co pięć minut przez 30 minut. Zneutralizował roztwór piranii, stopniowo dodając słabą zasadę.

Za pomocą szklanej pałeczki przenieś wytrawione szkiełka osłonowe do lejka Buchnera i płucz przez pięć minut w podwójnie destylowanej wodzie. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w szklanym słoiku Coplin i zalej metanolem. Uszczelnij pokrywkę folią uszczelniającą i zanurz w sonikacji przez 10 minut.

Po sonikacji przelać metanol do szklanej butelki do przechowywania. Powtórz ten krok z acetonem. Trzykrotnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą podwójnie destylowaną w słoiku Coplin.

Spuść wodę z szkiełek pokrywy i wysusz je, machając przez płomień palnika Bunsena. Umieść szkiełka nakrywkowe w suchym słoiku Coplin. Następnie dodaj roztwór aminosilanu do słoika Coplin, aby przeprowadzić aninalizację aminokwasów poślizgu nakrywkowego.

Przykryj i nałóż folię uszczelniającą, aby chronić przed światłem. Przepłukać szkiełka nakrywkowe metanolem i wyrzucić zużyty roztwór. Ponownie spłucz szkiełka nakrywki trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty każda.

Usuń nadmiar wilgoci i całkowicie wysusz na powietrzu przez 10 minut. Następnie narysuj siatkę za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Zaznacz identyfikator na szkiełku nakrywkowym, aby zidentyfikować właściwą orientację.

Po wyschnięciu tuszu umieść szkiełka nakrywkowe w nawilżonej komorze. Ponownie zawiesić 153 miligramy mPEG i 3,9 miligrama biotyny-PEG w 609 mikrolitrach 10-milimolowego wodorowęglanu sodu i wirować. Odwirować przy 10 000 x g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków.

Zastosuj od 10 do 15 mikrolitrów tego roztworu na kwadrat, aby całkowicie pokryć tablicę bez przepełnienia. Przechowuj pokrywę w komorze wilgotnościowej w ciemności przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno na 10 sekund w trzech zlewkach wypełnionych wodą podwójnie destylowaną.

Usuń całą wilgoć z szkiełek nakrywkowych za pomocą gazowego azotu. Przechowuj pokrywę w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów wypełnionej azotem i zamknij folią uszczelniającą. Owiń probówkę folią uszczelniającą i umieść ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Wyjmij z zamrażarki tablice funkcjonalizowane biotyną-PEG i wyrównaj je do temperatury pokojowej. Umieść szkiełko nakrywkowe z matrycą skierowaną do góry na 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych wyłożonym folią uszczelniającą. Inkubować każdy kwadrat układu z 10 miligramami na mililitr borowodorku sodu w PBS przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.

Umyj trzykrotnie PBS. Następnie inkubować z 0,2 miligrama na mililitr NeutrAvidin w T50 przez pięć minut, a następnie trzykrotnie przemywać T50 BSA. Powtórzyć inkubację z dwoma mikrogramami na mililitr biotynylowanego przeciwciała specyficznego dla POI w T50 BSA przez 10 minut, a następnie przemyć.

Najpierw rozmrozić i wymieszać lizat za pomocą pipetowania. Rozcieńczyć jeden mikrolitr lizatu w 100 mikrolitrach lodowatego T50 BSA PPI. Inkubować lizat na matrycy przez 10 minut, a następnie przemyć.

Przygotować sprzężone przeciwciało antyfosfotyrozynowe AF647 w lodowatym T50 BSA PPI i inkubować na matrycy przez godzinę. Umieść kroplę oleju na celu. Umieść nanosiatkę na stoliku w celu obrazowania.

Korzystając z przechodzącego białego światła, skup się na wzorze siatki. Uzyskaj serię 20 obrazów siatki, upewnij się, że piksele nie są nasycone i zapisz serię obrazów jako poufną. Rozogniskuj nanosiatkę, aby utworzyć przewiewny wzór, uzyskaj serię 20 obrazów do kalibracji wzmocnienia i zapisz obraz jako wzmocnienie.

Następnie uzyskaj serię 20 obrazów do przesunięcia aparatu, blokując całe światło do aparatu i zapisz tło obrazów. Aby uzyskać proste obrazy, najpierw wyczyść obiektyw olejowy i nałóż na niego dodatkową ilość oleju. Zamocuj matrycę szkiełek nakrywkowych na stoliku mikroskopu.

Uzyskaj obrazy dla każdej próbki, najpierw w kanale dalekiej czerwieni, a następnie we fluoroforach o niższej długości fali. Sprawdzaj poziom bufora co 30 do 45 minut i uzupełniaj w razie potrzeby. Korzystając z tej techniki, EGFR-GFP wychwycono z całkowitych lizatów białkowych.

Autofluorescencja tuszu hydrofobowego została wykorzystana jako wskazówka do znalezienia płaszczyzny ogniskowej próbki. Surowe obrazy danych zostały pozyskane z kanałami widmowymi oddzielonymi na chipie kamery. Nakładanie kanałów zielonego i dalekiego czerwonego zostało następnie zbadane w celu pozyskania danych.

Rejestrację kanałów przeprowadzono na obrazach pozyskanych z nanosieci. Nakładanie się obrazów odniesienia wskazywało na niepełną rejestrację. Wyrównanie zostało wykonane poprzez zastosowanie lokalnej transformacji średniej ważonej na współrzędnych kanału dalekiego czerwonego i zielonego, która została wykorzystana do zarejestrowania późniejszych danych SiMPull.

Pojedyncze emitery powyżej liczby fotonów tła z kanałów GFP i AF647 zostały zamknięte w pudełkach i przeprowadzono lokalizację Gaussa w celu zidentyfikowania lokalizacji. Kolokalizację EGFR-GFP w F647 przeprowadzono w celu identyfikacji receptorów fosforylowanych. Procent kolokalizacji wykorzystano do określenia frakcji receptorów fosforylowanych.

Wykrywanie tła zostało zmniejszone, gdy szkło trawione piranią potraktowano borowodorkiem sodu. Zaobserwowano silne wiązanie EGFR-GFP w lizacie przy minimalnym niespecyficznym wiązaniu PY99-AF647, co świadczy o zachowaniu funkcjonalizacji powierzchni przy użyciu tej techniki. SiMPull dostarcza informacji na temat fosforylacji białek i może odpowiedzieć na szeroki zakres pytań dotyczących samosygnalizacji.

Może to poszerzyć naszą wiedzę na temat sygnalizacji zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.