Name: Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test SiMPull do ilościowego oznaczania fosforylacji białek na poziomie pojedynczych cząsteczek. Metoda redukuje autofluorescencję i zapewnia dokładną analizę stanu fosforylacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 i R01CA248166 do DSL. EMB było wspierane przez program ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021), a JAR przez program UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Z wdzięcznością dziękujemy za korzystanie ze wspólnych zasobów mikroskopii fluorescencyjnej University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, wspieranych przez NIH P30CA118100. Pragniemy podziękować doktorom Ankurowi Jainowi i Taekijipowi Ha, których oryginalny rozwój SiMPull zainspirował nas do tej pracy. 
ES-C obecny adres: Grupa Immunodynamiczna, Laboratorium Integratywnej Immunologii Nowotworów, Centrum Badań nad Rakiem, National Cancer Institute, Bethesda

<ol><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+protein+modifications+with+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li>
<li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li>
<li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li>
<li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li>
<li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471(2012).</li>
<li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li>
<li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li>
<li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MARQUIS%3A+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li>
<li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li>
<li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695(2020).</li>
<li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+lenses+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li>
<li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendriks%2C+CLL+%22Dipimage%3A+a+scientific+image+processing+toolbox+for+MATLAB%22">Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB</a>. , (1999).</li>
<li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013).</li>
<li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., Müller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li>
<li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+single-cell+single-molecule+pull-down%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany, aby umożliwić ilościowe pomiary fosforylacji receptora na poziomie pojedynczego białka. Opracowano kilka prostych, ale ważnych modyfikacji protokołu SiMPull, które poprawiły wiarygodność pomiaru w celu wykrywania fosfo-tyrozyny, w tym zmniejszenie autofluorescencji za pomocą NaBH4 i postfiksowanie próbki w celu zapobieżenia dysocjacji przeciwciał. Użycie maski zielonego kanału do identyfikacji lokalizacji receptorów w celu obliczenia kolokalizacji z przeciwciałem ...

Sygnalizacja związana z błoną jest dostrajana przez kombinację indukowanej ligandem aktywacji receptora błonowego i rekrutacji dalszych białek pomocniczych, które propagują sygnał. Fosforylacja kluczowych tyrozyn w ogonach cytoplazmatycznych receptorów ma kluczowe znaczenie dla zainicjowania tworzenia kompleksów sygnałowych lub signalosomów1,2. Dlatego ważnym pytaniem w biologii jest to, w jaki sposób tworzone i utrzymywane są wzorce fosforylacji w celu rekrutacji partnerów sygnalizacyjnych i dyktowania wyników komórkowych. Obejmuje to zrozumienie niejednorodności fosforylacji receptorów, zarówno pod względem obfitości, jak i specyficznych wzorców fosfotyrozyny, które mogą zapewnić sposób manipulowania wyjściami sygnałowymi poprzez dyktowanie składu signalosomu3,4,5,6,7. Istnieją jednak ograniczenia w obecnych metodach badania fosforylacji białek. Analiza Western blot jest doskonała do opisywania trendów fosforylacji białek, ale jest półilościowa8 i nie dostarcza informacji na temat heterogeniczności systemu, ponieważ tysiące do milionów receptorów są uśredniane razem. Podczas gdy western blot pozwala na sondowanie próbki przy użyciu specyficznych dla fosfo przeciwciał przeciwko specyficznym tyrozynom, nie może dostarczyć informacji na temat wielomiejscowych wzorców fosforylacji w tym samym białku. Ilościowa fosfoproteomika donosi o obfitości fosfotyrozyny, ale istnieją ograniczenia w wykrywaniu fosforylacji wielomiejscowej, ponieważ interesujące reszty muszą znajdować się w tym samym peptydzie (zwykle 7-35 aminokwasów), który jest generowany przez trawienie enzymatyczne9,10,11.
Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, test pojedynczej cząsteczki (SiMPull) został dostosowany do ilościowego określania stanów fosforylacji nienaruszonych receptorów na poziomie pojedynczej cząsteczki. SiMPull został po raz pierwszy zademonstrowany jako potężne narzędzie do badania kompleksów makromolekularnych przez Jaina i wsp.12,13. W SiMputl kompleksy makromolekularne poddano immunoprecypitacji (IP) na szklanych szkiełkach nakrywkowych funkcjonalizowanych przeciwciałami, a następnie przeanalizowano za pomocą mikroskopii jednocząsteczkowej pod kątem liczby podjednostek białka i współIP ze złożonymi składnikami12. Modyfikacja autorstwa Kima i wsp.14, oznaczona jako SiMBlot, była pierwszą, w której zastosowano odmianę SiMpull do analizy fosforylacji zdenaturowanych białek. Protokół SiMBlot opiera się na wychwytywaniu biotynylowanych białek powierzchniowych komórek za pomocą szkiełek nakrywkowych pokrytych NeutrAvidin, które są następnie badane pod kątem fosforylacji za pomocą znakowania przeciwciałami specyficznymi dla fosfo14. Pomimo tych postępów konieczne były ulepszenia, aby kwantyfikacja modyfikacji potranslacyjnej była bardziej niezawodna i miała zastosowanie do szerszego zakresu białek.
Obecny protokół opisuje zoptymalizowane podejście SiMputl, które zostało użyte do ilościowego określenia wzorców fosforylacji nienaruszonego receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) w odpowiedzi na szereg warunków ligandowych i mutacji onkogennych15. Chociaż prace te koncentrują się na EGFR, podejście to można zastosować do dowolnego receptora błonowego i białek cytozolowych (POI), dla których dostępne są wysokiej jakości przeciwciała. Protokół obejmuje kroki mające na celu zmniejszenie autofluorescencji próbek, projekt matrycy próbek, który wymaga minimalnej objętości próbki przy jednoczesnym przygotowaniu do 20 próbek, oraz optymalizację warunków znakowania i utrwalania przeciwciał. Opracowano algorytmy analizy danych do wykrywania pojedynczych cząsteczek i kwantyfikacji fosforylowanych białek.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td>T50 Bufor</td>100 mm NaCl Na50 <td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na hodowle tkankowe</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Przechowywanie szkła/tablic trawionych piranią</td></tr><tr><td>15 mL Probówka</td><td></td><td></td><td></td>stożkowa</tr><tr><td>16% Paraformaldehyd Wodny Rozwiązanie</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>rurka</td><td></td><td></td> stożkowa 50 ml <td>Funkcjonalizowane przechowywanie szkła / ponowne użycie KOH</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7,2 / 150 mM NaCl</td><td>Składnik buforowy do lizy</td>60 mm Naczynie <td></td><td></td></tr><tr><td>do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>8% Wodny roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16020</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>aceton (C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>Wolny od zwierząt rekombinowany ludzki EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human EGFR (domena zewnętrzna) &ndash; Biotyna</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>surowicy bydlęcejGold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Składnik buforowy Tyrode'a Lejek</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Buchnera</td></tr><tr>Palnik <td></td><td></td><td></td><td>Bunsena</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Skrobak do komórek ze składnikiem buforowym Tyrode'a</td></tr><tr><td></td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa kolba filtrująca</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Słoik z kopiny</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II Automatyczny licznik komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 #1.5</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>Kamera emCCD</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, Optima</td><td>Bio-Techne S12450H</td><td></td><td>Oprogramowanie Heat</td></tr><tr><td>Inactivated Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfate</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>Szklane pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne</tr><tr><td>Szklany pręt</td><td></td><td></td><td></td>mieszający</tr><tr><td>Glukoza (D-(+)-glukoza)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Składnik buforowy Tyrode'a</td></tr><tr><td>Halt Koktajl inhibitorów fosfotazy i proteazy (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Składnik buforowy do lizy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>TyrodeSkładnik buforowy</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>nadtlenek wodoru (H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Składnik bufora do lizy</td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrofobowy długopis barierowy Vector</td><td>Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny Immersol 518F</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>własna linia</td><td></td><td></td><td></td>próżniowa</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Komponent buforowy Tyrode'a</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox oraz Zestaw narzędzi do statystyk i uczenia maszynowego</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>woda</td> <td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix-n-Stain CF Barwnik Zestawy do znakowania przeciwciał</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Sugerowany zestaw do koniugacji</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>walerianian mPEG-sukcynimidylu, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-aminoetylo)-3-aminopropylotrimetoksysilan</td><td>UCT United</td><td>Chemical A0700</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>nanosiatka</td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotyna Białko wiążące</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Azot (sprężony gaz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procesor graficzny NVIDIA z CUDA</td><td></td><td></td><td>Poszukaj kompatybilności na https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Mikroskop Olympus iX71</td><td>Folia</td> uszczelniająca Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Keson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Analogowa płyta grzejna</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U / ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Receptor fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12) Mysia</td> technologia <td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb <td>2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Składnik buforowy Tyrode</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>filament PLA premium, średnica 1,75 mm</td><td>Podnieś 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>Zakres temperatur drukowania: 205-235 &deg; </td></tr><tr><td>Drukarka 3D C Pro2</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L zlewka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 ml butelki do przechowywania</td><td>Corning</td><td>1395-100</td><td>CH3OH/C3H6O ponowne wykorzystanie</td></tr><tr><td>zlewek</td><td></td><td></td><td></td>Pyrex 250 mL</tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td><td></td>Pyrex 4 L</tr><tr><td>Widok poczwórny Obraz Splitter</td><td>Photometrics</td><td>Model QV2</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount Liczniki komórek, prowadnice do liczenia komórek EVE</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Filtry emisji Semrock: niebieskie (445/45 nm), zielone (525/45 nm), czerwone (600/37 nm), dalekie czerwone (685/40 nm)</td><td>Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td>Serologiczny kontroler pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td>serologiczne</tr><tr><td>Zestaw do analizy</td><td></td><td></td> pojedynczych cząsteczek <td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>borowodorek sodu (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Składnik buforowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Aktywuj przez kolejne cykle ciepła i pH</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanan sodu (Na3VO4)</td><td>Millipore</td><td>Sigma S6508</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>Niebezpieczne</td></tr><tr><td>mikrosfery TetraSpeck</td><td>Koraliki wielofluorescencyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td></tr><tr><td>Baza Tris (Trizma)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Fosforylacja jest konieczną modyfikacją potranslacyjną, która reguluje funkcję białka i kieruje wynikami sygnalizacji komórkowej. Obecne metody pomiaru fosforylacji białek nie są w stanie zachować niejednorodności fosforylacji poszczególnych białek. Test ściągania pojedynczej cząsteczki (SiMPull) został opracowany w celu zbadania składu kompleksów makromolekularnych poprzez immunoprecypitację białek na szklanym szkiełku nakrywkowym, a następnie obrazowanie pojedynczych cząsteczek. Obecna technika polega na adaptacji SiMpull, która zapewnia solidną ocenę ilościową stanu fosforylacji receptorów błonowych o pełnej długości na poziomie pojedynczej cząsteczki. Obrazowanie tysięcy pojedynczych receptorów w ten sposób pozwala na ilościowe określenie wzorców fosforylacji białek. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowaną procedurę SiMputl, od przygotowania próbki po obrazowanie. Optymalizacja protokołów przygotowania szkła i utrwalania przeciwciał dodatkowo poprawia jakość danych. Obecny protokół zawiera kod do analizy danych pojedynczej cząsteczki, który oblicza frakcję receptorów fosforylowanych w próbce. Chociaż praca ta koncentruje się na fosforylacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), protokół można uogólnić na inne receptory błonowe i cytozolowe cząsteczki sygnałowe.

Schemat przedstawiający proces SiMPull pokazano na Rysunku 1A. Szkiełka zakrywkowe są funkcjonalizowane przy użyciu NeutrAvidyny jako kotwicy dla biotynilowanych przeciwciał anty-EGFR w celu wychwycenia EGFR-GFP z lizatów białek całkowitych. Po wypłukaniu niezwiązanych białek, fosforylowane receptory są znakowane przeciwciałem anty-fosfotyrozynowym (anty-PY)15. Rysunek 1B przedstawia obraz matrycy hydrofobowej, na której można przygotować...

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Ten protokół SiMPull umożliwia ilościowe określenie fosforylacji białek poprzez poprawę warunków znakowania i wiązania przeciwciał, zmniejszenie autofluorescencji występującej w kanale zielonym i zapewnienie solidnych algorytmów analizy pojedynczych cząsteczek. Podstawową zaletą SiMPull jest to, że pozwala nam badać stan fosforylacji poszczególnych nienaruszonych białek. Dzięki tej metodzie możemy uzyskać nowe informacje, które nie są dostępne za pomocą tradycyjnych technik, takich jak western blotting i analiza mass spec.Mamy zespół badaczy, którzy pomagają zademonstrować protokół. Najpierw Julian Rojo pokaże, jak wytrawić piranię na szkle nakrywkowym. Następnie Rachel Grattan pokaże etapy powlekania szkła nakrywkowego.A Elizabeth Bailey pokaże, jak narysować tablicę i próbki obrazu. Na początek pirania wytrawia szkiełka osłonowe, delikatnie mieszając zlewkę reakcyjną co pięć minut przez 30 minut. Zneutralizował roztwór piranii, stopniowo dodając słabą zasadę.Za pomocą szklanej pałeczki przenieś wytrawione szkiełka osłonowe do lejka Buchnera i płucz przez pięć minut w podwójnie destylowanej wodzie. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w szklanym słoiku Coplin i zalej metanolem. Uszczelnij pokrywkę folią uszczelniającą i zanurz w sonikacji przez 10 minut.Po sonikacji przelać metanol do szklanej butelki do przechowywania. Powtórz ten krok z acetonem. Trzykrotnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą podwójnie destylowaną w słoiku Coplin.Spuść wodę z szkiełek pokrywy i wysusz je, machając przez płomień palnika Bunsena. Umieść szkiełka nakrywkowe w suchym słoiku Coplin. Następnie dodaj roztwór aminosilanu do słoika Coplin, aby przeprowadzić aninalizację aminokwasów poślizgu nakrywkowego.Przykryj i nałóż folię uszczelniającą, aby chronić przed światłem. Przepłukać szkiełka nakrywkowe metanolem i wyrzucić zużyty roztwór. Ponownie spłucz szkiełka nakrywki trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną przez dwie minuty każda.Usuń nadmiar wilgoci i całkowicie wysusz na powietrzu przez 10 minut. Następnie narysuj siatkę za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Zaznacz identyfikator na szkiełku nakrywkowym, aby zidentyfikować właściwą orientację.Po wyschnięciu tuszu umieść szkiełka nakrywkowe w nawilżonej komorze. Ponownie zawiesić 153 miligramy mPEG i 3,9 miligrama biotyny-PEG w 609 mikrolitrach 10-milimolowego wodorowęglanu sodu i wirować. Odwirować przy 10 000 x g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pęcherzyków.Zastosuj od 10 do 15 mikrolitrów tego roztworu na kwadrat, aby całkowicie pokryć tablicę bez przepełnienia. Przechowuj pokrywę w komorze wilgotnościowej w ciemności przez trzy do czterech godzin w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno na 10 sekund w trzech zlewkach wypełnionych wodą podwójnie destylowaną.Usuń całą wilgoć z szkiełek nakrywkowych za pomocą gazowego azotu. Przechowuj pokrywę w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów wypełnionej azotem i zamknij folią uszczelniającą. Owiń probówkę folią uszczelniającą i umieść ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Wyjmij z zamrażarki tablice funkcjonalizowane biotyną-PEG i wyrównaj je do temperatury pokojowej. Umieść szkiełko nakrywkowe z matrycą skierowaną do góry na 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych wyłożonym folią uszczelniającą. Inkubować każdy kwadrat układu z 10 miligramami na mililitr borowodorku sodu w PBS przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.Umyj trzykrotnie PBS. Następnie inkubować z 0,2 miligrama na mililitr NeutrAvidin w T50 przez pięć minut, a następnie trzykrotnie przemywać T50 BSA. Powtórzyć inkubację z dwoma mikrogramami na mililitr biotynylowanego przeciwciała specyficznego dla POI w T50 BSA przez 10 minut, a następnie przemyć.Najpierw rozmrozić i wymieszać lizat za pomocą pipetowania. Rozcieńczyć jeden mikrolitr lizatu w 100 mikrolitrach lodowatego T50 BSA PPI. Inkubować lizat na matrycy przez 10 minut, a następnie przemyć.Przygotować sprzężone przeciwciało antyfosfotyrozynowe AF647 w lodowatym T50 BSA PPI i inkubować na matrycy przez godzinę. Umieść kroplę oleju na celu. Umieść nanosiatkę na stoliku w celu obrazowania.Korzystając z przechodzącego białego światła, skup się na wzorze siatki. Uzyskaj serię 20 obrazów siatki, upewnij się, że piksele nie są nasycone i zapisz serię obrazów jako poufną. Rozogniskuj nanosiatkę, aby utworzyć przewiewny wzór, uzyskaj serię 20 obrazów do kalibracji wzmocnienia i zapisz obraz jako wzmocnienie.Następnie uzyskaj serię 20 obrazów do przesunięcia aparatu, blokując całe światło do aparatu i zapisz tło obrazów. Aby uzyskać proste obrazy, najpierw wyczyść obiektyw olejowy i nałóż na niego dodatkową ilość oleju. Zamocuj matrycę szkiełek nakrywkowych na stoliku mikroskopu.Uzyskaj obrazy dla każdej próbki, najpierw w kanale dalekiej czerwieni, a następnie we fluoroforach o niższej długości fali. Sprawdzaj poziom bufora co 30 do 45 minut i uzupełniaj w razie potrzeby. Korzystając z tej techniki, EGFR-GFP wychwycono z całkowitych lizatów białkowych.Autofluorescencja tuszu hydrofobowego została wykorzystana jako wskazówka do znalezienia płaszczyzny ogniskowej próbki. Surowe obrazy danych zostały pozyskane z kanałami widmowymi oddzielonymi na chipie kamery. Nakładanie kanałów zielonego i dalekiego czerwonego zostało następnie zbadane w celu pozyskania danych.Rejestrację kanałów przeprowadzono na obrazach pozyskanych z nanosieci. Nakładanie się obrazów odniesienia wskazywało na niepełną rejestrację. Wyrównanie zostało wykonane poprzez zastosowanie lokalnej transformacji średniej ważonej na współrzędnych kanału dalekiego czerwonego i zielonego, która została wykorzystana do zarejestrowania późniejszych danych SiMPull.Pojedyncze emitery powyżej liczby fotonów tła z kanałów GFP i AF647 zostały zamknięte w pudełkach i przeprowadzono lokalizację Gaussa w celu zidentyfikowania lokalizacji. Kolokalizację EGFR-GFP w F647 przeprowadzono w celu identyfikacji receptorów fosforylowanych. Procent kolokalizacji wykorzystano do określenia frakcji receptorów fosforylowanych.Wykrywanie tła zostało zmniejszone, gdy szkło trawione piranią potraktowano borowodorkiem sodu. Zaobserwowano silne wiązanie EGFR-GFP w lizacie przy minimalnym niespecyficznym wiązaniu PY99-AF647, co świadczy o zachowaniu funkcjonalizacji powierzchni przy użyciu tej techniki. SiMPull dostarcza informacji na temat fosforylacji białek i może odpowiedzieć na szeroki zakres pytań dotyczących samosygnalizacji.Może to poszerzyć naszą wiedzę na temat sygnalizacji zarówno w stanie normalnym, jak i chorobowym.

an-optimized-single-molecule-pull-down-assay-for-quantification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opis ilościowej procedury fosforylacji z wykorzystaniem kriolizy, solubilizacji mocznikiem, frakcjonowania HILIC oraz wzbogacania peptydów fosforylowanych metodą IMAC.

Ilościowa fosfoproteomika w Saccharomyces cerevisiae stymulowanych kwasami tłuszczowymi

Ten film demonstruje czułą technikę fosforylacji białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki. Funkcjonalizacja glikolu polietylenowego-biotyny i zastosowanie znakowanych przeciwciał zwiększa wykrywalność fosforylowanej tyrozyny ze swoistością.

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Przedstawiamy i demonstrujemy zoptymalizowany test wiązania nitrocelulozy, który może być użyty do ilościowego określenia autofosforylacji oczyszczonych bakteryjnych kinaz histydynowych. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami opartymi na SDS-PAGE, stanowiąc cenną alternatywę dla charakterystyki tych ważnych białek.

Kwantyfikacja autofosforylacji bakteryjnej kinazy histydynowej przy użyciu testu wiązania nitrocelulozy

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych fosfataz fosfoproteinowych i ich oddziałujących białek z komórek i tkanek oraz ich identyfikacji i kwantyfikacji za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Podejście oparte na spektrometrii mas do identyfikacji fosfataz fosfoproteinowych i ich interaktorów

Poznaj zoptymalizowany test SiMPull do ilościowego oznaczania fosforylacji białek na poziomie pojedynczych cząsteczek. Metoda redukuje autofluorescencję i zapewnia dokładną analizę stanu fosforylacji białek.

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Przeglądaj więcej filmów