Dwie techniki tworzenia myszy z niedoczynnością przytarczyc: paratyreoidektomia przy użyciu gruczołów GFP i ablacja przytarczyc za pośrednictwem toksyny błoniczej

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie dwóch mysich modeli nabytej niedoczynności przytarczyc, które są łatwe w użyciu, wytwarzają stabilny fenotyp i pozostawiają nienaruszoną funkcję tarczycy. Główną zaletą tych dwóch modeli jest to, że umożliwiają one precyzyjne usunięcie przytarczyc u myszy, albo za pomocą operacji sterowanej fluorescencją, albo przez specyficzną dla PTH ekspresję receptora toksyny błoniczej, co pozwala na selektywne celowanie i niszczenie komórek bez ingerencji w sąsiednią tarczycę. Mamy nadzieję, że nasze mysie modele będą w stanie odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu niedoczynności przytarczyc.

Na przykład, czy terapie analogowe PTH mogą pomóc w utrzymaniu prawidłowego poziomu wapnia w surowicy bez zwiększania wydalania wapnia z moczem? Modele te mogą być również wykorzystywane do badania innych kwestii klinicznych w niedoczynności przytarczyc. Na przykład, czy niedoczynność przytarczyc wpływa na wytrzymałość kości i czy zmienia się ona wraz z leczeniem?

Na takie pytania trudno jest odpowiedzieć u pacjentów, ale te modele myszy można wykorzystać do ich rozwiązania. Zacznij od znieczulenia myszy w wieku od 8 do 10 tygodni, wykazujących ekspresję GFP specyficznie w przytarczycach zgodnie z zatwierdzonym protokołem. Ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na plecach i zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia przy braku odruchu szczypania palców u nóg lub w inny sposób.

Przedłuż brzuszną część szyi i przygotuj się do operacji, goląc sierść. Zdezynfekuj ogoloną skórę antyseptyczną podkładką z jodonem powidonu, a następnie przygotuj miejsce nacięcia za pomocą peelingu chirurgicznego i płukanki nasączonej alkoholem zgodnie z zatwierdzonym protokołem. Następnie przykryj zwierzę sterylnymi obłożeniami chirurgicznymi, aby zmniejszyć zanieczyszczenie miejsca operowanego.

Po przecięciu 2-centymetrowego nacięcia podłużnego skalpelem chirurgicznym, użyj zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy do wypreparowania powięzi i odepchnij gruczoły ślinowe na bok. Następnie, oglądając pole operacyjne przez mikroskop preparacyjny, użyj końcówek ostrych kleszczy, aby przeciąć i oddzielić mięśnie przytchawicze i odsłonić tchawicę. Zidentyfikuj prawy i lewy płat tarczycy znajdujący się obok tchawicy.

Następnie przełącz źródło światła na światło fluorescencyjne i uwidocznij dwa zielone fluorescencyjne przytarczyce. Gryzonie zazwyczaj mają tylko dwa przytarczyce. Jeśli nie możesz zidentyfikować dwóch przytarczyc obok tarczycy po każdej stronie, należy podejrzewać ektopowo zlokalizowane przytarczyce i przeprowadzić dokładne poszukiwanie ich wzdłuż tchawicy.

Następnie za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek ostrożnie usuń zielone przytarczyce i dokładnie sprawdź wzdłuż tchawicy, aby upewnić się, że cała zielona tkanka została usunięta. Użyj sterylnej gazy do hemostazy. Zamknij mięśnie przytchawicze przerwanymi szwami.

Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwów Halsteada. Umieść zwierzę po operacji w osobnej klatce na podkładce rozgrzewającej, aby odzyskać temperaturę ciała. Gdy mysz się obudzi, połóż na podłodze klatki granulkę i wodę z odrobiną żelatyny.

Po dwugodzinnym okresie obserwacji pooperacyjnej należy zwrócić mysz do placówki dla zwierząt. Trzy dni po paratyreoidektomii przeanalizuj 10 mikrolitrów krwi ogonowej pod kątem zjonizowanego wapnia za pomocą analizatora, takiego jak gazometria krwi, analizator wapnia i pH. Jeśli paratyreoidektomia zakończy się sukcesem, wapń zjonizowany we krwi będzie równy lub mniejszy niż minus dwa odchylenia standardowe u myszy kontrolnych operowanych pozorowano.

Rozpocznij od przygotowania roztworu toksyny błoniczej poprzez rozcieńczenie proszku toksyny błoniczej sterylnym roztworem soli fizjologicznej do stężenia 0,5 mikrograma na mililitr. Sterylnie przefiltrować roztwór i alloquot. Wstrzyknąć pięć mikrogramów na kilogram masy ciała toksyny błoniczej myszom w wieku od 8 do 10 tygodni, powodując ekspresję receptorów toksyny błoniczej specyficznie w przytarczycach.

Trzy dni po drugim wstrzyknięciu toksyny błoniczej przeanalizuj 10 mikrolitrów krwi ogona pod kątem zjonizowanego wapnia, tak jak poprzednio. Poniżej znajdują się reprezentatywne obrazy różnych lokalizacji przytarczyc u myszy wykazujących ekspresję GFP specyficznie w przytarczycach. Myszy miały albo dwa, albo trzy zielone gruczoły przytarczyc.

Większość przytarczyc znajdowała się w pobliżu górnej granicy lub w pobliżu dolnej granicy tarczycy. W rzadkich przypadkach niektóre przytarczyce były zlokalizowane ektopowo. Jedną z zalet naszego modelu myszy jest to, że tarczyca pozostaje nienaruszona.

Ten rysunek pokazuje poziom TSH myszy GFP-PTX trzy miesiące po paratyreoidektomii. Ten rysunek przedstawia pomiary T4. Myszy GFP-PTX wykazują stężenia TSH i T4, które nie różniły się od myszy kontrolnych.

Ten obraz pokazuje poziom wapnia we krwi i poziom PTH u myszy GFP-PTX. Ten obraz pokazuje poziom wapnia we krwi i poziom PTH u myszy PTHcre-iDTR, którym wstrzyknięto toksynę błoniczą. Zarówno myszy GFP-PTX, jak i myszy z wstrzykniętym DT PTHcre-iDTR wykazywały stabilną hipokalcemię i obniżone poziomy PTH w ciągu trzymiesięcznego okresu obserwacji.

Po opanowaniu, paratyreoidektomię pod kontrolą GFP można wykonać w ciągu około 20 minut na całą procedurę. Pojedyncze wstrzyknięcie toksyny błoniczej trwa nie dłużej niż minutę, jeśli jest wykonane prawidłowo. Po tej procedurze u myszy tych rozwija się niedoczynność przytarczyc i mogą być używane jako przedkliniczny model choroby.

Można odpowiedzieć na takie pytania, jak skuteczność różnych analogów hormonu PTH w leczeniu niedoczynności przytarczyc. Nie zapominaj, że toksyna błonicza jest niebezpieczna i że pracownicy powinni być uodpornieni na toksynę błoniczą ze zwykłymi szczepieniami. Podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, takie jak maski i rękawiczki.