Name: Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Naucz się przygotowywać próbki przydatków chrząszcza Chlorophorus caragana do SEM i TEM. Dodatek Tween 20 do utrwalacza zapobiega deformacjom i poprawia penetrację tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy hojną pomoc ze strony Pekińskiej Wyższej Szkoły Rolniczej, Instytutu Zastosowania Energii Atomowej (Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych), Centrum Biobadań Pekińskiego Uniwersytetu Leśnego oraz profesora Shan-gan Zhanga z Instytutu Zoologii Chińskiej Akademii Nauk. Badania te były wspierane przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFD0600103), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 31570643, 81774015), Leśne Badania Naukowe w Dobrobycie Publicznym Chin (201504304), Plan Start-upu Wysokiego Szczebla Badań nad Talentami Uniwersytetu Rolniczego Mongolii Wewnętrznej (203206038) oraz Projekt Badawczy Szkolnictwa Wyższego Regionu Autonomicznego Mongolii Wewnętrznej (NJZZ18047), Region Autonomiczny Mongolii Wewnętrznej Linxue "Podwójna Pierwszorzędna" Budowa projektu (170001).

UWAGA: Przed użyciem odczynników zapoznaj się z ich kartami charakterystyki. Wiele z chemikaliów stosowanych podczas przygotowywania próbek jest toksycznych, mutagennych, rakotwórczych i/lub reprotoksycznych. Podczas pracy z próbkami należy stosować środki ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny, długie spodnie i pełne obuwie) oraz pracować pod wyciągiem dyfuzyjnym.
1. Przygotowanie próbek i obrazowanie SEM
<ol>
	<li>Fiksacja i oczyszczanie próbek
	<ol>
		<li>Pracując na obszarach, gdzie występuje C. caragana, należy zwabić osobniki dorosłe do pułapek terenowych z użyciem atraktantów roślinnych, takich jak izoforon16. Czyste ciała dorosłych C. caragana należy konserwować w 0,1 mol L-1 fosforanie buforze solnym (PBS, pH 7,2), 2,5% (masa/obj.) glutaraldehydzie (Anhydrous EM Grad) i 0,06% (obj./obj.) Tween 20. Próbkę utrwalać w temperaturze 4 °C przez weekend.</li>
		<li>Wyjąć ciała z cieczy konserwującej i opłukać w buforze fosforanowym. Używając stereomikroskopu, usunąć wyrostki i oczyścić je ultradźwiękowo (40 kHz) w 0,1 mol L-1 fosforanie buforze solnym (pH 7,2) z 0,06% (obj./obj.) Tween 20 (PBST). Po 10 s czyszczenia przenieść próbkę pod mikroskop, aby sprawdzić stopień czystości. W normalnych warunkach czyścić przez 400 s, aby upewnić się, że próbka jest wystarczająco czysta do obserwacji i nie została uszkodzona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwadnianie, montaż i suszenie próbek
	<ol>
		<li>Odwodnić próbki, stosując następujące 20-minutowe inkubacje w szeregu stężeń etanolu: 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% i 10% (wszystkie obj./obj.). Pod stereomikroskopem, za pomocą dwustronnej taśmy węglowej, przymocować oddzielnie 3 powierzchnie obserwacyjne (grzbietową, brzuszną i boczną) do uchwytów (stubów). Należy pamiętać, aby wszystkie powierzchnie obserwacyjne pozostały czyste i wolne od zanieczyszczeń. Umieścić uchwyt z próbką w szalce Petriego zawierającej żel krzemionkowy jako środek osuszający na 48 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napylanie i umieszczenie próbki
	<ol>
		<li>Używając urządzenia do napylania jonowego Hitachi Koki (E-1010), przekręcić MAIN VALVE do pozycji OPEN, zdjąć pokrywę komory próbek i umieścić próbkę w komorze. Włączyć przełącznik POWER, aż zapali się kontrolka READY. Ustawić czas napylania (Sputtering time) na 45 sekund, a grubość powłoki na 70,875 Å. Gdy wskaźnik próżni pompy mechanicznej spadnie poniżej 7, nacisnąć DISCHARGE i rozpocząć napylanie platyny. Po zakończeniu procedury wyłączyć zasilanie i wyjąć próbkę z komory. Grubość powłoki: d = KIVt (gdzie „d” to grubość filmu w jednostce „Å”; „K” to stała zależna od napylanego metalu i gazu; np. dla powietrza K wynosi 0,07; „I” to natężenie przepływu plazmy w mA; „V” to przyłożone napięcie w jednostce „kV”; „t” to czas w sekundach).</li>
		<li>Umieścić uchwyt z próbką na stole SEM. Upewnić się, że wysokość uchwytu z próbką jest wystarczająca do uzyskania dobrego obrazu. Uruchomić oprogramowanie SEM i wybrać pożądane napięcie robocze, zaczynając od 20 kV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowywanie próbek i obrazowanie TEM
<ol>
	<li>Pobrać i utrwalić próbkę zgodnie z krokami 1.1.1 i 1.1.2.</li>
	<li>Oczyszczanie, utrwalanie wtórne i odwodnienie
	<ol>
		<li>Wyjąć dorosłe osobniki C. caragana z płynu konserwującego. Za pomocą stereomikroskopu usunąć wyrostki, przemyć próbki w PBST przez 3 h, a następnie poddać utrwaleniu wtórnemu w 1% (mas/obj) czetrotlenku osmu w PBS przez 1 h w temperaturze 25 °C. Odwodnić próbki, stosując następujące 20-minutowe serie obróbek w etanolu o stężeniach 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 10% i 100% (wszystkie obj/obj) w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zalewanie żywicą i polimeryzacja
	<ol>
		<li>Zalać próbki żywicą w płaskich formach do zalewania. Próbkę umieścić na dnie płytki, jak najbliżej krawędzi wgłębienia. Włożyć etykietę w puste miejsce, a następnie inkubować płytkę z próbką w temperaturze 60 °C przez 72 h. Wyjąć kapsułkę z inkubatora i sprawdzić, czy żywica spolimeryzowała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcjonowanie i barwienie próbek
	<ol>
		<li>Po upewnieniu się, że próbka stwardniała, umieścić każdy blok żywicy pod mikroskopem fluorescencyjnym i sfotografować w świetle niebieskim. Przesunąć źródło światła fluorescencyjnego mikroskopu tak, aby naświetlało próbkę od góry. Umożliwi to wyraźną obserwację sensyll w bloku żywicy. Sfotografować i zmierzyć odległości, aby zlokalizować docelowe sensylle (Rycina 1).</li>
		<li>Opierając się na obrazie SEM palpów (Rycina 2A), naciąć zgrubnie blok żywicy ostrzem skalpela, aby zbliżyć się do docelowego receptora (Rycina 2B).</li>
		<li>Następnie, korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej w świetle niebieskim, sfotografować zgrubnie nacięty blok żywicy, regulując źródło światła od góry tak, aby sensylle były wyraźnie widoczne. Światło zielone wzbudzone światłem niebieskim zapewniło optymalne warunki obserwacji. Podczas obrazowania do stolika mikroskopu fluorescencyjnego dodano mikrometr obiektywowy (DIV 0,01 mm), a następnie zmierzono odległość do celu za pomocą oprogramowania ImageJ (U.S. National Institute of Health) (Rycina 2C). Linijkę obrazu wykonano w programie Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Następnie, podczas krojenia na ultramikrotomie, ustawiono dystans cięcia, stosując grubość plastrów 50-60 nm, aż do osiągnięcia pozycji celu. Do precyzyjnego zlokalizowania docelowego receptora wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną.</li>
		<li>Zamocować sekcje na miedzianych siatkach o oczkach 10 mesh powlekanych Formvarem, poddając je podwójnemu barwieniu octanem uranylu i cytrynianem ołowiu.
		<ol>
			<li>Najpierw dodać 3,75 g octanu uranylu do 50 mL 50% metanolu. Barwić siatki za pomocą strzykawki z przefiltrowanym (0,45 µm) nasyconym roztworem octanu uranylu w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przykryć sekcje podczas barwienia, aby zapobiec wytrącaniu osadów indukowanych światłem. Płukać 2x w 50% metanolu oraz 2x w przefiltrowanej wodzie odgazowanej.</li>
			<li>Następnie dodać 0,02 g cytrynianu ołowiu do 10 mL odgazowanej wody destylowanej w probówce do wirowania. Dodać 0,1 mL 10 N wodorotlenku sodu, szczelnie zamknąć i wstrząsnąć do rozpuszczenia. Barwić siatki roztworem cytrynianu ołowiu przez 8 min. Wirować przed użyciem. Barwienie musi być przeprowadzone w środowisku wolnym od dwutlenku węgla, aby zapobiec tworzeniu się osadów węglanu ołowiu. Nanosić krople barwnika na kwadraty plastikowych naczyń Petri. Płukać w odgazowanej przefiltrowanej wodzie i wysuszyć17. Obserwować za pomocą TEM przy napięciu 80 kV.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Mikroskopowe porównanie wierzchołków korzeni roślin; widok szczegółowy; skala 70 µm; analiza struktur biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59251/59251fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Mikroskop fluorescencyjny sfotografował blok żywiczny zawierający wyrostek Chlorophorus caragana. (A) blok żywiczny anteny; (B) Blok żywicy na końcu pokładlicy. Strzałka wskazuje krawędź bloku żywicy; przerywany okrąg wskazuje docelowe sensylla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59251/59251fig1alarge.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Skaningowa mikroskopia elektronowa skrzydła owada; analiza strukturalna; porównanie mikrofotografii; pasy skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59251/59251fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Procedury metody precyzyjnego lokalizowania sensylli. (A) czwarty podsegment palpa szczękowego Chlorophorus caraganalinie przerywane wyznaczały sensilla poddane analizie SEM. (B) 4. podsegment palpa szczękowego C. caragana obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Biała strzałka wskazuje przybliżoną krawędź bloku żywicy, a przerywany okrąg wskazuje dokładną lokalizację. (C) zaznaczona odległość od krawędzi bloku żywicznego do docelowego miejsca położenia wyrostka podniebiennego szczęki (28 µm w tej próbce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59251/59251fig2alarge.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscope+Technology+of+Insect+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Hubei+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material.</a> Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+scanning+electron+microscopy+%28sem%29+and+its+application+in+polymer+materials+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Graduates+Sun+Yat-Sen+University+%28Natural+Sciences+Medicine%29%22%5BJournal%5D)">The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research.</a> Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).</li>
<li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of cells.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).</li>
<li>Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+the+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ.</a> The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).</li>
<li>Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Observation+of+Thick+Biological+Samples+by+Scanning+Transmission+Electron+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55215(2017).</li>
<li>Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+coleopteran+insect+species+antennal+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anhui+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla.</a> Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).</li>
<li>Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+chemical+ecology+research+in+the+United+States+Department+of+Agriculture-Agricultural+Research+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service.</a> Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).</li>
<li>Thomas, C. B., Marlin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromone+mating+disruption%3A+Novel%2C+non-toxic+control+of+the+European+corn+borer%5BTitle%5D)+AND+%22Leopold+Center%22%5BJournal%5D)">Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer.</a> Leopold Center. 8, 57-60 (1999).</li>
<li>Chen, X. F., Hu, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+specimen+preparation+techniques+of+scanning+electron+microscope+of+Ficus+simplicissima+Lour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhongkai+Agrotechnical+College%22%5BJournal%5D)">Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour.</a> Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).</li>
<li>Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhou%2C+W+%22Scanning+Microscopy+for+Nanotechnology%22">Scanning Microscopy for Nanotechnology</a>. , Springer. 1-40 (2006).</li>
<li>Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+the+Properties+of+Tween-20%2C+Tween-60%2C+Tween-80%2C+Arlacel-60%2C+and+Arlacel-80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dispersion+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80.</a> Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).</li>
<li>Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositions+and+Physicochemical+Properties+of+Tween+Type+Surfactants-Based+Microemulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dispersion+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions.</a> Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).</li>
<li>Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+and+applications+of+surfactants+%28XV%29+Detergency+of+surfactants+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22China+Surfactant+Detergent+and+Cosmetics%22%5BJournal%5D)">Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications.</a> China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).</li>
<li>Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under-water+superoleophobic+glass%3A+unexplored+role+of+the+surfactant-rich+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent.</a> Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).</li>
<li>Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtomy+of+insect+sensilla+embedded+in+resin+blocks+for+transmission+electronic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Applied+Entomology%22%5BJournal%5D)">Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy.</a> Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).</li>
<li>Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+semiochemical+attractants+for+monitoring+and+controlling+Chlorophorus+caragana%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana.</a> Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).</li>
<li>Sumner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxy+resins+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Microtechniques+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Epoxy resins for light and transmission electron microscopy.</a> Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).</li>
<li>Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+antennae%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Insect antennae.</a> Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).</li>
<li>Zacharuk, R. Antennae and sensilla. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZacharuk%2C+R+%22Comprehensive+Insect+Physiology%2C+Biochemistry+and+Pharmacology%22">Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology</a>. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).</li>
<li>Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+digitiform+sensilla+on+the+labial+palp+of+a+larval+elaterid+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera).</a> Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).</li>
<li>Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atlas+of+olfactory+organs+of+Drosophila+melanogaster%3A+1%2C+Types%2C+external+organization%2C+innervation+and+distribution+of+olfactory+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Insect+Morphology+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla.</a> International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).</li>
<li>Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+ultrastructure+of+the+antennal+chemoreceptors+and+mechanoreceptors+of+worker+Coptotermes+formosanus+Shiraki%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki.</a> Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).</li>
<li>Zacharuk, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+insect+chemosensilla%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of insect chemosensilla.</a> Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).</li>
<li>Li, Y. Z., Zhong, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+detergents+and+floating+carriers+for+treating+potato+golden+nematode+cysts+to+improve+the+original+appearance+of+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+quarantine%22%5BJournal%5D)">Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy.</a> Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).</li>
<li>Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pH-sensitive+non-ionic+surfactant+vesicles%3A+comparison+between+tween+21+and+tween+20%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).</li>
<li>Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antenna+morphology+and+sensilla+ultrastructure+of+Tetrigus+lewisi+Cand%C3%A8ze+%28Coleoptera%3A+Elateridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae).</a> Micron. 60, 29-38 (2014).</li>
<li>Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+morphology+and+sensillar+ultrastructure+of+Dastarcus+helophoroides+%28Fairmaire%29+%28Coleoptera%3A+Bothrideridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae).</a> Micron. 43, 921-928 (2012).</li>
<li>Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+distribution+of+ovipositor+sensilla+of+female+Helicoverpa+armigera+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+11th+Henan+Plant+Protection+Society%2C+the+10th+Henan+Insect+Society%2C+and+the+5th+Member+Congress+and+Academic+Symposium+of+Henan+Plant+Pathology+Society%22%5BJournal%5D)">Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae).</a> The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).</li>
<li>Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+specimens+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Beijing+University+of+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Insect specimens for scanning electron microscopy.</a> Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).</li>
<li>Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+distribution+of+sensilla+on+the+maxillary+and+labial+palps+of+Chlorophorus+caragana+%28Coleoptera%3A+Cerambycidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae).</a> Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).</li>
<li>Harrison, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+and+preparing+adult+beetles+%28Coleoptera%29+for+light+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy.</a> African Entomology. 20, 395-401 (2012).</li>
<li>Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+methods+of+biological+sample+preparation+for+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Exploration+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope.</a> Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).</li>
<li>Graef, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGraef%2C+MD+%22Introduction+to+Conventional+Transmission+Electron+Microscopy%22">Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. 1(2003).</li>
</ol>

Nie mamy do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

W artykule przedstawiono przykładowy schemat przygotowania skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej dla chrząszcza drzewnego. Wykorzystując wyrostek owadów jako reprezentatywny obiekt badania, wykazaliśmy kilka ulepszeń w porównaniu z tradycyjnymi metodami przygotowywania próbek.
Ciekły olej oderwany od powierzchni ciała stałego jest emulgowany w małe kropelki, które można dobrze zdyspergować i zawiesić w medium myjącym, aby ograniczyć ponowne osadzanie się na powierzchni przedmiot...

Skaningowa mikroskopia elektronowa jest ważnym narzędziem w wielu badaniach morfologicznych, które SEM pokazuje struktury powierzchniowe1,2. Atrakcyjność transmisyjnej mikroskopii elektronowej polega na tym, że można ją wykorzystać do badania szerokiego zakresu struktur biologicznych w skali nanometrowej, od architektury komórek i ultrastruktury organelli, po strukturę kompleksów makromolekularnych i białek. TEM pokazuje struktury wewnętrzne3,4,5.
Coleoptera to największa grupa owadów, obejmująca około 182 rodziny i 350 000 gatunków. Większość owadów chrząszczy (Coleoptera), w szczególności chrząszcz drzewny, żywi się roślinami, z których wiele jest ważnymi szkodnikami lasów i drzew owocowych, powodując niszczycielskie uszkodzenia drzew6. Obecnie coraz większą uwagę poświęca się zapobieganiu i kontroli populacji szkodników w oparciu o teorię ekologii chemicznej7. Skuteczne, niskotoksyczne, wolne od zanieczyszczeń metody kontroli feromonów stały się skutecznym sposobem8. Badanie morfologii i ultrastruktury owadów jest ważną częścią badań nad ekologią chemiczną owadów. Skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa (odpowiednio SEM i TEM) są wykorzystywane z dużym powodzeniem do badania ich morfologii i anatomii wewnętrznej. Jednak podczas przygotowywania próbek owadów do mikroskopii elektronowej (EM) obiektywność i autentyczność miejsca obserwacji może ulec pogorszeniu9. Ogólnie rzecz biorąc, przygotowanie próbek SEM owadów wymaga czyszczenia, utrwalania tkanek, odwodnienia, metatezy, suszenia i napylania10. Ze względu na złożone środowisko, w którym żyją chrząszcze drzewne, na powierzchni ciała często znajdują się różne zanieczyszczenia, a ich wyrostki często mają wiele delikatnych, długich czubek lub szczeciny. W szczególności niektóre świdry nie są dostępne z hodowli laboratoryjnej, które zbiera się bezpośrednio na polu, a następnie umieszcza w płynie utrwalającym, aby zapewnić świeżość, a następnie myje w laboratorium. Jeśli próbka jest najpierw utrwalana, a następnie myta, oczywiście znacznie trudniej jest usunąć zanieczyszczenia, ponieważ aldehyd glutarowy silnie wiąże je z próbką. Tween 20 to środek powierzchniowo czynny11,12,13,14, który odgrywa ważną rolę w procesie prania, w tym zmniejsza napięcie powierzchniowe wody i poprawia zwilżalność wody na powierzchni prania. W tym badaniu Tween 20 dodano do roztworu utrwalającego i roztworu czyszczącego PBS, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe cieczy i zapobiec osadzaniu się brudu na powierzchni ciała chrząszcza do drewna, co sprawiło, że powierzchnia ciała była czystsza w SEM.
Korzystając z TEM, sensilla na różnych organach owadów może być cięta, aby odsłonić wyraźne struktury w ich wnętrzu, co stanowi podstawę do analizy funkcji sensilla. Gdy badany owad, taki jak chrząszcz drzewny, jest duży, a jego ściana ciała ma znaczny stopień sklerotyzacji, więc utrwalacz może nie w pełni nasycić tkanek narządów wewnątrz ciała owada. Tween 20 może zwiększyć dyspersję i zdolność zawieszania brudu. W tym badaniu Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby zwiększyć penetrację płynu utrwalającego do ściany ciała owada chrząszcza drzewnego, unikając deformacji i zapadania się epidermmi11,12,13. Ponadto, korzystając z ogólnej technologii krojenia, trudno jest dokładnie zlokalizować różne typy sensilli, w szczególności w przypadku niektórych małych sensilla15. Opierając się na tradycyjnym przygotowaniu próbki TEM, badanie to połączyło mikroskopię fluorescencyjną i SEM w celu określenia pozycji czułki owadów w osadzonym bloku, poprawiając w ten sposób dokładność krojenia.

<table><tbody><tr><td>Soczewka anatomiczna</td><td>Chongqing Auto Optical spółka z ograniczoną odpowiedzialnością</td><td>1425277</td><td></td></tr><tr><td>Taśma samoprzylepna węglowa</td><td>SPI Supplies, Oddział Sond Strukturalnych, Inc.</td><td>7311</td><td></td></tr><tr><td>Czterochlorek węgla</td><td>Sigma</td><td>56-23-5</td><td></td></tr><tr><td>Siatki miedziane</td><td>GilderGrids</td><td>G300</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy</td><td>Odczynnik chemiczny grupy Sinopharm co., LTD</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>J.T. Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Płaskie formy do zatapiania</td><td>Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>LEICA</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td>Bezwodny</td></tr><tr><td>izoforon</td><td>klasy EM Sigma</td><td>78-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>Sigma</td><td>512-26-5</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan sodu</td><td>Jego grupa odczynnik chemiczny co., LTD</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr obiektywowy</td><td>Olympus</td><td>0-001-034</td><td></td></tr><tr><td>Tetroksyd osmu</td><td>Sigma</td><td>541-09-3</td><td></td></tr><tr><td>szalka</td><td>Petriego Aldrich</td><td>1998</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica</td><td>Spurr</td><td>ERL4221</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Lianhui</td><td>GB/ T19001-2008</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Hitachi</td><td>S-3400</td><td></td></tr><tr><td>Osuszacz z żelem krzemionkowym</td><td>Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.</td><td>112926-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Mała</td><td>szczotka Martol</td><td>G1220</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do rozpylania jonów</td><td>Hitachi Koki Co. Ltd., Tokio, Japonia</td><td>E-1010</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>EZ4 HD</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>Hitachi</td><td>H-7500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Tianjin Damao Odczynnik chemiczny</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>GT Sonic</td><td>GT-X1</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Sigma</td><td>6159-44-0</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Ten raport opisuje metody przygotowania próbek, które skanują i transmitują obserwacje mikroskopu elektronowego, zademonstrowane przez przygotowanie przydatków chrząszcza drzewnego, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), dla obu typów mikroskopii elektronowej. Protokół przygotowania próbki skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) opierał się na chemicznym utrwalaniu próbki, odwadnianiu w serii kąpieli etanolowych, suszeniu i napylaniu. Poprzez dodanie Tween 20 (laurynian polioksyetylenosorbitolu) do utrwalacza i roztworu myjącego, powierzchnia ciała owada chrząszcza drzewnego została czystsza w SEM. Przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w tym badaniu obejmowało szereg etapów, w tym utrwalanie, odwadnianie etanolu, zatapianie w żywicy, pozycjonowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cięcie i barwienie. Utrwalacz z Tween 20 umożliwił penetrację ścianki ciała owada chrząszcza drzewnego łatwiej niż byłoby to możliwe bez Tween 20, a następnie lepiej utrwalił tkanki i narządy w ciele, dając w ten sposób wyraźne obserwacje ultrastruktur czusów owadów za pomocą mikroskopu elektronowego. Kolejnym etapem tego przygotowania było wyznaczenie pozycji sensilli owadów w próbce osadzonej w bloku żywicy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zwiększenia precyzji pozycjonowania sensoryki docelowej. Poprawiło to dokładność krojenia.

Zastosowanie roztworu czyszczącego i utrwalającego z dodatkiem Tween 20 pozwoliło uzyskać czystszy obraz SEM niż w przypadku próbek bez Tween 20 (Rycina 3). Roztwór utrwalający z Tween 20 ułatwił przenikanie glutaraldehydu do tkanki. Struktura mikrotubul była wyraźnie widoczna. Obraz TEM wewnętrznej struktury próbki bez Tween 20 był rozmyty (Rycina 4).
<img alt="Obraz z...

Aby zaobserwować ultrastrukturę wrażliwości owadów, w badaniu przedstawiono protokół przygotowania próbki za pomocą skaningowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (odpowiednio SEM i TEM). Tween 20 został dodany do utrwalacza, aby uniknąć deformacji próbki w SEM. Mikroskopia fluorescencyjna była pomocna w poprawie dokładności krojenia w TEM.

Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...

Chrząszcz Woodboring ich powierzchnia ciała jest zawsze twarda w SEM. Tween-20 dodaje się do roztworu utrwalającego i myjącego. Powierzchnia ciała chrząszcza drążącego drewno W TEM Tween-20 może zwiększyć penetrację utrwalacza w ścianę ciała i lepiej utrwalić tkankę i narząd w ciele.Mikroskop fluorescencyjny jest pomocny w poprawie dokładności krojenia. Technika ta jest pomocna w myciu powierzchni ciała i wnikaniu w ścianę ciała u chrząszcza do drewna. W ten sposób oczyściłoby to wizję SEM i TEM.Mikroskop fluorescencyjny jest pomocny w poprawie dokładności krojenia w TEM. Procedurę zademonstruje Zhang Yanru, doktorant z naszego laboratorium. Na obszarze, na którym żyją Chlorophorus caragana, umieść pułapki polowe z przynętą z atraktantami roślinnymi, takimi jak izoforon, na pułapce lejkowej.Przyciągnij dorosłe chrząszcze do pułapek. Zachowaj czyste ciała dorosłego Chlorophorus caragana w 0,1 mola na litr PBS przy pH 7,2, 2,5% wagowo aldehydu glutarowego i 0,06% objętości Tween-20. Utrwal próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na trzy dni.Wyjmij ciała z płynu konserwującego i spłucz w PBS. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków, aby usunąć przydatki i wyczyść je ultradźwiękowo przy 40 kilohercach w PBST. Po czyszczeniu przez 100 sekund przenieś próbkę do mikroskopu, aby sprawdzić, czy jest czysta.Nie czyść dłużej niż 400 sekund, aby uniknąć uszkodzenia. Następnie zanurzyć próbki w etanolu w różnych stężeniach na 20 minut każda, aby przeprowadzić odwodnienie. Po odwodnieniu, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj węglowej dwustronnej taśmy klejącej, aby oddzielnie przymocować trzy powierzchnie obserwacyjne, grzbietową, brzuszną i boczną, do kikutów.Upewnij się, że wszystkie viewpowierzchnie są czyste i wolne od zanieczyszczeń. Umieścić stolik z próbką na szalce Petriego zawierającej środek osuszający z żelem krzemionkowym na 48 godzin. Następnie na przyrządzie do rozpylania jonów obrócić główny zawór do pozycji otwartej, zdjąć pokrywę komory próbki i włożyć próbkę do komory.Włącz wyłącznik zasilania i upewnij się, że świeci się kontrolka gotowości. Ustaw czas rozpylania na 45 sekund, a grubość powłoki na 70,875 angstrema. Gdy wskaźnik próżni pompy mechanicznej spadnie poniżej siedmiu, naciśnij wyładowanie i rozpocznij natryskiwanie platyny.Po zakończeniu procedury wyłącz zasilanie i wyjmij próbkę z komory. Obliczyć grubość warstwy natryskowej D w angstremach równą K razy I razy V razy T.K jest stałą określoną przez rozpylany metal i gaz. I to przepływ plazmy w miliamperach, podczas gdy V to napięcie przyłożone w kilowoltach, a T to czas w sekundach.Włóż króciec zawierający próbkę na stolik SEM. Upewnij się, że stolik na próbkę z króćcem próbki ma wystarczającą wysokość, aby umożliwić uzyskanie dobrego obrazu. Otwórz oprogramowanie SEM i wybierz żądane napięcie robocze zaczynające się od 20 kilowoltów.Po uzyskaniu przydatków od dorosłego Chlorophorus caragana, umyj próbki w PBST w kąpieli ultradźwiękowej przez trzy godziny, a następnie utrwal je w 1% wagowo tetroksydku osmu w PBS przez jedną godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odwodnić próbki, stosując 20-minutowe kolejne zabiegi w etanolu o zawartości 50%60%70%80%85%90%95%100% i 100% objętości w temperaturze pokojowej. Za pomocą kleszczyków nałóż podgrzaną żywicę w płaskiej formie do zatapiania i zanurz próbki w żywicy.Upewnij się, że próbka znajduje się na dnie płytki i jest umieszczona jak najbliżej krawędzi wgłębionego rowka. Oznaczyć, a następnie inkubować płytkę zawierającą próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po inkubacji wyjmij płytkę z inkubatora i sprawdź, czy żywica uległa polimeryzacji.Po zestaleniu się próbki umieść każdy blok żywicy pod mikroskopem fluorescencyjnym, przesuń fluorescencyjne źródło światła mikroskopu, aby naświetlić próbkę niebieskim światłem z góry i sfotografuj je. Upewnij się, że sensilla w bloku żywicy jest dobrze widoczna. Zmierz odległość między krawędzią bloku żywicy a czujnikiem celu, aby wycelować w sensillę.Zapoznaj się z obrazem SEM palpów i z grubsza przetnij blok żywicy żyletką w pobliżu docelowego receptora. Następnie, pod mikroskopią fluorescencyjną światła niebieskiego, wyreguluj źródło światła od góry, aby czułki były wyraźnie obserwowane. Dodaj mikrometr obiektywowy do stolika mikroskopu fluorescencyjnego.Sfotografuj grubo przycięty blok żywicy, a następnie za pomocą ImageJ zmierz odległość między celem a krawędzią żywicy. Umieść próbkę żywicy na ultramikrotomie i tnij odcinki o grubości od 50 do 60 nanometrów, aż do osiągnięcia pozycji docelowej. Zamontuj sekcje na miedzianych siatkach o oczkach 100 na szalkach Petriego.Zabarwić siatki nasyconym, przefiltrowanym roztworem octanu uranylu w temperaturze pokojowej. Przykryj sekcje podczas barwienia, aby zablokować wytrącanie się światła. Plama przez 10 minut.W dygestorium spłukać dwukrotnie w 50% metanolu, a następnie dwukrotnie w przefiltrowanej odgazowanej wodzie. Umieść krople przygotowanej plamy z cytrynianu ołowiu na kwadratach plastikowych szalek Petriego i pozostaw je na osiem minut. Spłucz w odgazowanej, przefiltrowanej wodzie i wysusz.Zamontuj siatki na stoliku na próbki w maszynie TEM. Ustaw napięcie na 80 kilowoltów i sprawdź sekcje. W tym protokole, przy użyciu roztworu czyszczącego i utrwalającego z Tween-20, zaobserwowano wyraźny obraz SEM niż bez Tween-20.Dzięki roztworowi utrwalającemu Tween-20, który umożliwiał przenikanie roztworu utrwalającego aldehyd glutarowy do tkanki, struktury mikrotubul były wyraźnie widoczne na obrazie TEM, podczas gdy wewnętrzna struktura próbki przygotowanej bez Tween-20 była rozmyta. Ciągłe przekroje poprzeczne kołka gałązki sensilla basiconica typu one na palpach szczękowych wykazały, że osłonka dendrytyczna otaczała zewnętrzne segmenty dendrytyczne i rozciągała się do porów końcowych. Siedem nierozgałęzionych zewnętrznych segmentów dendrytycznych istniało wewnątrz wewnętrznej jamy limfatycznej receptora, która była otoczona zewnętrzną jamą.Rurkowaty korpus był oddzielony osłonką dendrytyczną od innych zewnętrznych segmentów dendrytycznych u każdej podstawy gniazda sensillar. W okolicy rzęskowej zidentyfikowano osiem dendrytów o różnych średnicach, co wskazuje na obecność ośmiu neuronów dwubiegunowych. Technika ta może być wykorzystana do dalszych badań nad funkcjami nerwów, takimi jak zapis pojedynczych komórek lub hybrydyzacja in situ.

sample-preparation-method-scanning-transmission-electron-microscope

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Udostępniamy technikę zachowania nienaruszonego łyka drzewnego i przygotowania go do obserwacji.  Tworzymy aparat zwany kanapką łyka, który pozwala na wprowadzenie i obserwację stawonogów, drobnoustrojów i innych organizmów zasiedlających tkanki łyka.

Technika badania zbiorowisk stawonogów i mikroorganizmów w tkankach drzew

Pokazana tutaj jest metoda wizualizacji ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej w zdecelularyzowanych tkankach serca.

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Pokazujemy użycie różnych metod mikroskopowych, które są przydatne do obserwacji zwapnienia tubeworma, Hydroides elegans, a także do lokalizowania i charakteryzowania pierwszego zwapniałego materiału. Mikroskopia na żywo i mikroskopia elektronowa są używane razem w celu dostarczenia informacji funkcjonalnych i materiałowych, które są ważne w badaniu biomineralizacji.

Charakterystyka zwapnień przy użyciu technik mikroskopii optycznej i elektronowej na żywo w rurowcu morskim

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

To badanie przedstawia niezawodne i łatwe procedury uzyskiwania seryjnych ultracienkich odcinków mikroorganizmu bez drogiego sprzętu w transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Metoda otrzymywania seryjnych ultracienkich przekrojów mikroorganizmów w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Naucz się przygotowywać próbki przydatków chrząszcza Chlorophorus caragana do SEM i TEM. Dodatek Tween 20 do utrwalacza zapobiega deformacjom i poprawia penetrację tkanek.

Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

Przeglądaj więcej filmów