Metoda przygotowania próbki skaningowego i transmisyjnego mikroskopu elektronowego dla przydatków chrząszcza leśnego

Chrząszcz Woodboring ich powierzchnia ciała jest zawsze twarda w SEM. Tween-20 dodaje się do roztworu utrwalającego i myjącego. Powierzchnia ciała chrząszcza drążącego drewno W TEM Tween-20 może zwiększyć penetrację utrwalacza w ścianę ciała i lepiej utrwalić tkankę i narząd w ciele.

Mikroskop fluorescencyjny jest pomocny w poprawie dokładności krojenia. Technika ta jest pomocna w myciu powierzchni ciała i wnikaniu w ścianę ciała u chrząszcza do drewna. W ten sposób oczyściłoby to wizję SEM i TEM.

Mikroskop fluorescencyjny jest pomocny w poprawie dokładności krojenia w TEM. Procedurę zademonstruje Zhang Yanru, doktorant z naszego laboratorium. Na obszarze, na którym żyją Chlorophorus caragana, umieść pułapki polowe z przynętą z atraktantami roślinnymi, takimi jak izoforon, na pułapce lejkowej.

Przyciągnij dorosłe chrząszcze do pułapek. Zachowaj czyste ciała dorosłego Chlorophorus caragana w 0,1 mola na litr PBS przy pH 7,2, 2,5% wagowo aldehydu glutarowego i 0,06% objętości Tween-20. Utrwal próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na trzy dni.

Wyjmij ciała z płynu konserwującego i spłucz w PBS. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków, aby usunąć przydatki i wyczyść je ultradźwiękowo przy 40 kilohercach w PBST. Po czyszczeniu przez 100 sekund przenieś próbkę do mikroskopu, aby sprawdzić, czy jest czysta.

Nie czyść dłużej niż 400 sekund, aby uniknąć uszkodzenia. Następnie zanurzyć próbki w etanolu w różnych stężeniach na 20 minut każda, aby przeprowadzić odwodnienie. Po odwodnieniu, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj węglowej dwustronnej taśmy klejącej, aby oddzielnie przymocować trzy powierzchnie obserwacyjne, grzbietową, brzuszną i boczną, do kikutów.

Upewnij się, że wszystkie viewpowierzchnie są czyste i wolne od zanieczyszczeń. Umieścić stolik z próbką na szalce Petriego zawierającej środek osuszający z żelem krzemionkowym na 48 godzin. Następnie na przyrządzie do rozpylania jonów obrócić główny zawór do pozycji otwartej, zdjąć pokrywę komory próbki i włożyć próbkę do komory.

Włącz wyłącznik zasilania i upewnij się, że świeci się kontrolka gotowości. Ustaw czas rozpylania na 45 sekund, a grubość powłoki na 70,875 angstrema. Gdy wskaźnik próżni pompy mechanicznej spadnie poniżej siedmiu, naciśnij wyładowanie i rozpocznij natryskiwanie platyny.

Po zakończeniu procedury wyłącz zasilanie i wyjmij próbkę z komory. Obliczyć grubość warstwy natryskowej D w angstremach równą K razy I razy V razy T.K jest stałą określoną przez rozpylany metal i gaz. I to przepływ plazmy w miliamperach, podczas gdy V to napięcie przyłożone w kilowoltach, a T to czas w sekundach.

Włóż króciec zawierający próbkę na stolik SEM. Upewnij się, że stolik na próbkę z króćcem próbki ma wystarczającą wysokość, aby umożliwić uzyskanie dobrego obrazu. Otwórz oprogramowanie SEM i wybierz żądane napięcie robocze zaczynające się od 20 kilowoltów.

Po uzyskaniu przydatków od dorosłego Chlorophorus caragana, umyj próbki w PBST w kąpieli ultradźwiękowej przez trzy godziny, a następnie utrwal je w 1% wagowo tetroksydku osmu w PBS przez jedną godzinę w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Odwodnić próbki, stosując 20-minutowe kolejne zabiegi w etanolu o zawartości 50%60%70%80%85%90%95%100% i 100% objętości w temperaturze pokojowej. Za pomocą kleszczyków nałóż podgrzaną żywicę w płaskiej formie do zatapiania i zanurz próbki w żywicy.

Upewnij się, że próbka znajduje się na dnie płytki i jest umieszczona jak najbliżej krawędzi wgłębionego rowka. Oznaczyć, a następnie inkubować płytkę zawierającą próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Po inkubacji wyjmij płytkę z inkubatora i sprawdź, czy żywica uległa polimeryzacji.

Po zestaleniu się próbki umieść każdy blok żywicy pod mikroskopem fluorescencyjnym, przesuń fluorescencyjne źródło światła mikroskopu, aby naświetlić próbkę niebieskim światłem z góry i sfotografuj je. Upewnij się, że sensilla w bloku żywicy jest dobrze widoczna. Zmierz odległość między krawędzią bloku żywicy a czujnikiem celu, aby wycelować w sensillę.

Zapoznaj się z obrazem SEM palpów i z grubsza przetnij blok żywicy żyletką w pobliżu docelowego receptora. Następnie, pod mikroskopią fluorescencyjną światła niebieskiego, wyreguluj źródło światła od góry, aby czułki były wyraźnie obserwowane. Dodaj mikrometr obiektywowy do stolika mikroskopu fluorescencyjnego.

Sfotografuj grubo przycięty blok żywicy, a następnie za pomocą ImageJ zmierz odległość między celem a krawędzią żywicy. Umieść próbkę żywicy na ultramikrotomie i tnij odcinki o grubości od 50 do 60 nanometrów, aż do osiągnięcia pozycji docelowej. Zamontuj sekcje na miedzianych siatkach o oczkach 100 na szalkach Petriego.

Zabarwić siatki nasyconym, przefiltrowanym roztworem octanu uranylu w temperaturze pokojowej. Przykryj sekcje podczas barwienia, aby zablokować wytrącanie się światła. Plama przez 10 minut.

W dygestorium spłukać dwukrotnie w 50% metanolu, a następnie dwukrotnie w przefiltrowanej odgazowanej wodzie. Umieść krople przygotowanej plamy z cytrynianu ołowiu na kwadratach plastikowych szalek Petriego i pozostaw je na osiem minut. Spłucz w odgazowanej, przefiltrowanej wodzie i wysusz.

Zamontuj siatki na stoliku na próbki w maszynie TEM. Ustaw napięcie na 80 kilowoltów i sprawdź sekcje. W tym protokole, przy użyciu roztworu czyszczącego i utrwalającego z Tween-20, zaobserwowano wyraźny obraz SEM niż bez Tween-20.

Dzięki roztworowi utrwalającemu Tween-20, który umożliwiał przenikanie roztworu utrwalającego aldehyd glutarowy do tkanki, struktury mikrotubul były wyraźnie widoczne na obrazie TEM, podczas gdy wewnętrzna struktura próbki przygotowanej bez Tween-20 była rozmyta. Ciągłe przekroje poprzeczne kołka gałązki sensilla basiconica typu one na palpach szczękowych wykazały, że osłonka dendrytyczna otaczała zewnętrzne segmenty dendrytyczne i rozciągała się do porów końcowych. Siedem nierozgałęzionych zewnętrznych segmentów dendrytycznych istniało wewnątrz wewnętrznej jamy limfatycznej receptora, która była otoczona zewnętrzną jamą.

Rurkowaty korpus był oddzielony osłonką dendrytyczną od innych zewnętrznych segmentów dendrytycznych u każdej podstawy gniazda sensillar. W okolicy rzęskowej zidentyfikowano osiem dendrytów o różnych średnicach, co wskazuje na obecność ośmiu neuronów dwubiegunowych. Technika ta może być wykorzystana do dalszych badań nad funkcjami nerwów, takimi jak zapis pojedynczych komórek lub hybrydyzacja in situ.