Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Protokół ten można wykorzystać do oceny integralności i plastyczności połączenia nerwowo-mięśniowego w warunkach normalnych i patologicznych. Technika ta polega na jednoczesnym znakowaniu komórek Schwanna oraz zwierząt laboratoryjnych przed i po na pojedynczych odcinkach mięśni. Po eutanazji dorosłego samca szczura umieść go w kapturze i otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca za pomocą nożyczek i kleszczy.

Wprowadzić cewnik dożylny z lewej komory serca w kierunku aorty i przeciąć prawą wyrocznię. Następnie rozpocznij perfuzję od 100 mililitrów 0,9% soli fizjologicznej, aż krew wypływająca z prawej wyroczni będzie czysta. Następnie kontynuuj perfuzję z 250 do 300 mililitrami 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym lub PB pH 7,4 przez 10 minut.

Po perfuzji usuń skórę obustronnej kończyny tylnej za pomocą ostrza chirurgicznego i odsłoń obustronny nerw kulszowy i mięsień brzuchaty łydki. Ostrożnie wyciąć obustronny mięsień brzuchaty łydki od kończyny tylnej za pomocą ostrza i umieścić cały mięsień w 10 mililitrach 4% paraformaldehydu. Po dwóch godzinach usuń mięsień z roztworu i zabezpiecz go krioprotekcją w 10 mililitrach 25% sacharozy w 0,1 molowym PB przez jeden dzień w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zanurzeniu tkanki mięśniowej w roztworze sacharozy, należy ją przymocować do etapu zamrażania w przesuwanym systemie mikrotomowym za pomocą zamrożonego podłoża sekcyjnego. Pokrój mięsień poziomo wzdłuż długiej osi mięśnia o grubości 80 mikronów. Za pomocą pędzla umieść siedem sekcji kriogenicznych w każdym dołku w uporządkowany sposób na sześciodołkowej płytce hodowlanej z 10 mililitrami 0,1 mola PB. W przypadku barwienia fluorescencyjnego inkubuj cztery sekcje na studzienkę z 1,5 mililitra 0,1 molowego PB zawierającego 75 mikrolitrów 10% Triton X 100 i 45 mikrolitrów normalnej surowicy osła na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 20 obr./min.

Po 30 minutach przenieś skrawki do 1,5 mililitra mieszanego roztworu pierwszorzędowych przeciwciał zawierających królicze włókno anty-neurologiczne 200, kozi przeciwpęcherzykowy transporter acetylocholiny w 0,1 molowym PB, w 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X 100 i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj sekcje trzy razy przez pięć minut każda w 0,1 molowym PB włączonym w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 20 obr./min. Po ostatnim przemyciu inkubować wycinek w mieszanym roztworze przeciwciał drugorzędowych zawierających AF 488 przeciwko królikowi i AF 546 przeciwko kozom osła, a także biomarkery toksyny alfa bungaro AF 647 i falloidyny 350 zawierające w 0,1 M PB zawierające 1% normalnej surowicy osła i 0,5 Tritona x 100 przez jedną godzinę, Ochrona ich przed światłem.

Po inkubacji umyj skrawki w PB i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym. Nałóż szkło nakrywkowe na sekcję, używając 50% gliceryny w wodzie destylowanej. Obserwuj i zobrazuj preparat za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w obiektyw subiektywny 20x o aperturze numerycznej 0,75 i obiektyw 40x o aperturze numerycznej 0,95.

W przypadku wielokrotnego obrazowania fluorescencyjnego należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji każdego biomarkera zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Ustaw rozdzielczość przechwytywania obrazu na 640 na 640 pikseli. Następnie ustaw początkową i końcową płaszczyznę ogniskowej.

Ustaw rozmiar kroku na jeden lub dwa mikrony. Następnie wybierz wzór głębi, przechwytywanie obrazu i serię Z. W przypadku obrazów o mniejszym powiększeniu przy 20 pikselach uchwyć obrazy stosu 40 Z w krokach co dwa mikrony za pomocą otworu o średnicy 105 mikronów.

Wybierz tryb projekcji lub topografii i projekcję intensywności na osi Z, aby zintegrować wszystkie obrazy w jednym ostrości. Aby uzyskać obrazy o większym powiększeniu przy 40 pikselach, uchwyć obrazy stosu 80 Z w kroku co jeden mikron z zoomem ustawionym na dwa i otworkiem 105 mikronów. Zintegruj wszystkie obrazy w jednym ostrym obrazie.

Zrekonstruuj obrazy w trójwymiarowym wzorze za pomocą systemu przetwarzania obrazu. Wykazano tutaj reprezentatywną korelację przestrzenną mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego z włóknami nerwowymi 200 dodatnimi, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny dodatnim zakończeniem presynaptycznym, postsynaptycznym receptorami acetylocholiny dodatnimi alfa bungaro, perysynaptycznymi komórkami Schwanna S100 dodatnimi, włóknami mięśniowymi faloidyno-dodatnimi i jądrami komórkowymi znakowanymi DAPI. Neurofilament 200 dodatnich włókien nerwowych biegł w wiązce.

Te włókna nerwowe dały gałęzie do pęcherzykowych zakończeń presynaptycznych dodatnich transportera acetylocholiny, które tworzyły lustrzany związek z postsynaptycznymi receptorami acetylocholiny dodatnimi dodatnimi dla toksyny alfa bungaro. Ponadto wykryto S100 dodatnie perysynaptyczne komórki Schwanna wokół 200 dodatnich włókien nerwowych neurofilamentu w pobliżu zakończeń presynaptycznych. Korelacja przestrzenna została następnie zademonstrowana w postaci trójwymiarowego wzorca ukazującego szczegółową charakterystykę morfologiczną połączenia nerwowo-mięśniowego z różnych perspektyw.

Aby zaobserwować więcej obrazowania w sekcjach mięśniowych, ważne jest, aby przeciąć mięsień poziomo wzdłuż długiej osi o grubości 80 mikronów.