Name: Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemii fluorescencyjnej do wizualizacji złącza nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowej szczura. Technika ta pozwala badać integralność i plastyczność struktur nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Fundusz Innowacji CACMS (No. CI2021A03407), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 82004299) oraz fundusze badań podstawowych dla Centralnych Instytutów Badawczych Opieki Społecznej (nr ). ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Akupunktury i Moxibustion, Chińskiej Akademii Chińskich Nauk Medycznych (zatwierdzenie nr 2021-04-15-1). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Waszyngton, D.C., 1996). Wykorzystano trzy dorosłe samce szczurów (Sprague-Dawley, waga 230 ± 15 g). Szczury trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością oraz ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Instrumenty i materiały do tego badania są pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
1. Perfuzja
<ol>
	<li>Wstrzyknąć dootrzewnowo roztwór tribromoetanolu w dawce 250 mg/kg mc. w celu wywołania eutanazji szczurów.</li>
	<li>Gdy oddech ustanie, otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca za pomocą nożyczek i kleszczy. Wprowadzić cewnik dożylny z lewej komory serca w kierunku aorty, a następnie przeciąć prawą małżowinę uszną.</li>
	<li>Przelej eksperymentalne szczury w kapturze. Zacznij od perfuzji ze 100 ml 0,9% soli fizjologicznej, aż krew wychodząca z prawej małżowiny usznej będzie czysta, a następnie kontynuuj perfuzję z 250-300 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB, pH 7,4) przez około 10 minut, aż ogon będzie trudny do zgięcia.</li>
</ol>
2. Anatomia regionalna
<ol>
	<li>Po perfuzji usuń skórę obustronnej kończyny tylnej za pomocą ostrza chirurgicznego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A) i odsłonij obustronny nerw kulszowy i mięsień brzuchaty łydki przyśrodkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć obustronny mięsień brzuchaty łydki przyśrodkowej od kończyny tylnej za pomocą ostrza (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2C) i umieścić cały mięsień w 10 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M PB przez 2 godziny.</li>
	<li>Usunąć mięsień z roztworu i kriochronić mięsień w 10 ml 25% sacharozy w 0,1 M PB przez 1 dzień w temperaturze 4 °C, aż mięsień zostanie całkowicie zanurzony w roztworze.</li>
</ol>
3. Kriosekcja mięśnia
<ol>
	<li>Po zanurzeniu tkanki mięśniowej w roztworze, utrwalić ją na etapie zamrażania w przesuwanym systemie mikrotomowym za pomocą zamrożonego podłoża sekcyjnego. Przeciąć mięsień poziomo wzdłuż długiej osi mięśnia o grubości 80 μm.</li>
	<li>Umieść siedem kriosekcji na studzience w uporządkowany sposób na sześciodołkowej płytce hodowlanej z 10 ml 0,1 M PB (pH 7,4) za pomocą pędzla. 
	UWAGA: Sekcje są ułożone w takiej kolejności, aby sekcje w różnych studzienkach przylegały do siebie, co sprawia, że sekcje używane do różnych plam są bardziej spójne.</li>
</ol>
4. Wielokrotne barwienie fluorescencyjne za pomocą NF200, VAChT, α-BTX i Pha
UWAGA: Wielokrotne barwienie fluorescencyjne za pomocą NF200, VAChT, α-BTX i Pha zostało zastosowane w celu ujawnienia włókien nerwowych, zakończeń presynaptycznych, postsynaptycznych nikotynowych receptorów acetylocholiny i włókien mięśniowych.
<ol>
	<li>Inkubować cztery sekcje na studzienkę z 1,5 ml 0,1 M PB zawierającego 75 μl 10% Triton X-100 (0,5%) i 45 μl normalnej surowicy osła (3%) na wytrząsarce orbitalnej przy 20 obr./min przez 30 min.</li>
	<li>Przenieść skrawki do 1,5 ml zmieszanego roztworu pierwszorzędowych przeciwciał zawierających króliczy anty-NF200 (1:1,000), kozi anty-VAChT (1:500) w 0,1 M PB (pH 7,4) z 1% normalną surowicą osła i 0,5% Triton X-100 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia umyj sekcje 3x po 5 minut w 0,1 M PB (pH 7,4) na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 20 obr./min.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 1,5 ml mieszanego roztworu przeciwciał drugorzędowych zawierających AF488 (1:500) (1:500) i anty-kozi AF546 (1:500), a także biomarkery α-BTX, AF647 (1:500) i falloidyny 350 (1:500) w 0,1 M PB (pH 7,4) zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem.</li>
	<li>Po umyciu 3x po 5 min w 0,1 M PB (pH 7,4), zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych. Nałóż szkło nakrywkowe na sekcje, używając 50% gliceryny w wodzie destylowanej do obserwacji.</li>
</ol>
5. Wielokrotne barwienie fluorescencyjne za pomocą NF200, S100, α-BTX i DAPI
UWAGA: Procedury są podobne do tej z kroku 4; główna różnica polega na tym, że przeciwciała pierwszorzędowe a odpowiadającymi im przeciwciała drugorzędowe.
<ol>
	<li>Należy użyć następujących przeciwciał pierwszorzędowych: anty-NF200 kurczaka (1:6 000), królika anty-S100 (1:2 500) w kroku 4.2 i odpowiadających im przeciwciał drugorzędowych: AF488 przeciwko kurczakowi osła (1:500) i przeciwko królikowi AF546 (1:500), a także biomarkery α-BTX AF647 (1:500) i DAPI (1:50000) w kroku 4.3.</li>
</ol>
6. Obserwacja i analizy
<ol>
	<li>Obserwuj preparat i rób zdjęcia za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w następujące soczewki obiektywowe: soczewka 20x z NA 0,75 i soczewka 40x z NA 0,95.</li>
	<li>Stosować długości fal wzbudzenia i emisji 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT i S100), 647 nm (α-BTX) lub DAPI odpowiadających wielokrotnemu barwieniu fluorescencyjnemu. Ustaw rozdzielczość przechwytywania obrazu na 640 x 640 pikseli. 
	UWAGA: Rozdzielczość 640 x 640 pikseli została wybrana, ponieważ obrazy zostały przechwycone w stosach Z. Rozdzielczość 1024 x 1024 pikseli powoduje powolne obrazowanie i fotowybielanie w stosach Z.</li>
	<li>Ustaw początkową płaszczyznę ogniskowej i końcową płaszczyznę ogniskowej. Ustaw rozmiar kroku na 1 μm lub 2 μm. Wybierz wzorzec głębi, przechwytywanie obrazu i serię Z.</li>
	<li>W przypadku obrazów o mniejszym powiększeniu wykonanych przy powiększeniu 20x, uchwyć 40 obrazów (stosy Z) w odstępach co 2 μm z każdego odcinka o grubości 80 μm za pomocą otworu 105 μm. Wybierz tryb projekcji/topografii i projekcji intensywności na osi Z, aby zintegrować wszystkie obrazy w jednym ostrym miejscu.</li>
	<li>Aby uzyskać obrazy o większym powiększeniu wykonane przy powiększeniu 40x, uchwyć 80 obrazów (stosy Z) w kroku 1 μm z każdego odcinka o grubości 80 μm z zoomem ustawionym na 2 i otworkiem 105 μm. Zintegruj wszystkie obrazy w jednym ostrym miejscu.</li>
	<li>Zrekonstruuj obrazy we wzorcu trójwymiarowym za pomocą systemu przetwarzania obrazu, jak opisano wcześniej w27.</li>
</ol>

<ol><li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells%2C+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22TheAnatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li>
<li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li>
<li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156(2020).</li>
<li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease%3A+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964(2020).</li>
<li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscienc+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li>
<li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats%3A+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li>
<li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy%3A+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li>
<li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury%3A+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468(2016).</li>
<li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interactions%3A+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li>
<li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li>
<li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li>
<li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li>
<li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li>
<li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032(2021).</li>
<li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions%2C+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li>
<li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309(2017).</li>
<li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220(2021).</li>
<li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li>
<li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates%3A+Endocytosis%2C+recycling%2C+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434(2019).</li>
<li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li>
<li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li>
<li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisaliśmy szczegóły techniczne wymagane do przeprowadzenia udanego wielokrotnego barwienia wycinków mięśni i zastosowania immunohistochemii fluorescencyjnej w celu ujawnienia cech morfologicznych NMJ na grubych odcinkach przyśrodkowego mięśnia brzuchatego łydki szczura. Dzięki zastosowaniu tego podejścia, drobne szczegóły i korelacja przestrzenna PSC oraz elementów pre- i postsynaptycznych mogą być analizowane i oceniane pod mikroskopią konfokalną, a następnie rekonstruowane w trójwymiarowym wzorze. W tym przypadku zast...

Jako trzy podstawowe składniki strukturalne połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ)1,2,3,4, szeroko zbadano morfologiczne aspekty presynaptycznych zakończeń aksonów ruchowych, postsynaptyczną błonę zawierającą nikotynowe receptory acetylocholiny (AchR) oraz okołosynaptyczne komórki Schwanna (PSC). Cienkie przekroje i całe próbki mięśni szkieletowych zostały zbadane za pomocą różnych technik histologicznych, takich jak mikroskopia elektronowa5,6, mikroskopia konfokalna7,8 i mikroskopia arkuszowa9,10. Chociaż cechy morfologiczne NMJ zostały wykazane przez te techniki z różnych aspektów, dla porównania, mikroskopia konfokalna jest nadal idealnym wyborem do obrazowania szczegółowej morfologii NMJ.
Ostatnio opracowano wiele nowych technologii do pokazywania elementów strukturalnych NMJ. Na przykład transgeniczne myszy fluorescencyjne thy1-YFP zostały bezpośrednio wykorzystane do obserwacji aksonów motorycznych i płytek końcowych silnika in vivo i in vitro10,11. Dodatkowo, dożylne wstrzyknięcie fluorescencyjnego α-BTX zostało zastosowane w celu ujawnienia przestrzennego rozkładu płytek końcowych silnika w całych mięśniach szkieletowych myszy fluorescencyjnych typu dzikiego i transgenicznego, poprzez zastosowanie optycznego oczyszczania tkanek do badania za pomocą mikroskopii świetlanej9,12. Jednak poza elementami pre- i postsynaptycznymi, które można oglądać za pomocą tych zaawansowanych metod, PSC nie można wykazać w tym samym czasie.
Coraz więcej dowodów wskazuje, że PSC, jako obwodowe komórki glejowe, są ściśle związane z pre-synaptycznymi zakończeniami, przyczyniając się do rozwoju i stabilności NMJ, modulacji aktywności synaptycznej NMJ w warunkach fizjologicznych oraz regeneracji NMJ po uszkodzeniu nerwów13,14,15. Biorąc pod uwagę architekturę komórkową NMJ, protokół ten jest odpowiednim kandydatem do jednoczesnego znakowania PSC, elementów pre- i postsynaptycznych i jest potencjalnie stosowany do oceny integralności i plastyczności NMJ w normalnych i patologicznych warunkach. Na przykład porównaj intensywność NMJ, morfologię i objętość postsynaptycznych płytek końcowych motorycznych, unerwienie i odnerwienie NMJ oraz liczbę PSC w mięśniach o stanie fizjologicznym i patologicznym.
Mięsień brzuchaty łydki jest największym mięśniem tworzącym wybrzuszenie w łydce, które łatwo można usunąć poprzez usunięcie skóry i mięśnia dwugłowego uda z kończyny. Mięsień jest często wybierany do oceny atrofii mięśni, zwyrodnienia nerwowo-mięśniowego, wydajności mięśni i siły jednostki motorycznej ex vivo lub in vivo16,17,18. Jednak technika ta nadaje się również do ujawniania cech morfologicznych NMJ z różnych mięśni szkieletowych. Jednocześnie grube sekcje mięśniowe mogą ujawnić bardziej kompletną morfologię i ilość NMJ w porównaniu z cienkimi sekcjami7,8 i drażnionymi włóknami mięśniowymi19.
Zgodnie z tymi badaniami, przyśrodkowy mięsień brzuchaty łydki szczura został wybrany jako tkanka docelowa w tym badaniu i został pokrojony na grubość 80 μm w celu wielokrotnego barwienia fluorescencyjnego różnymi rodzajami biomarkerów zgodnie ze składnikami strukturalnymi NMJ. Tutaj neurofilament 200 (NF200)20,21, pęcherzykowy transporter acetylocholiny (VAChT)22, alfa-bungarotoksyna (α-BTX)23,24, a S10025,26 zostały użyte do oznaczania włókien nerwowych, zakończeń presynaptycznych, postsynaptycznych AchR i PSC. Ponadto tło tkanki mięśniowej i jąder komórkowych zostało dodatkowo podbarwione falloidyną i DAPI.
W tym badaniu spodziewamy się opracować wyrafinowany protokół jednoczesnego barwienia architektury komórkowej NMJ wraz z odpowiadającymi jej biomarkerami na grubszych utrwalonych próbkach, co jest wygodniejsze do użycia w mikroskopii konfokalnej i pomaga uzyskać znacznie więcej informacji na temat szczegółowej struktury PSC, elementów pre- i postsynaptycznych, a także ich przestrzennej korelacji między sobą. Z punktu widzenia metodologii, protokół ten może być korzystny dla oceny cech morfologicznych NMJ w warunkach normalnych i patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Dichlorowodorek 4',6-diamidino-2-fenyloindolu</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-kurczak AF488</td><td>Jackson</td><td>149973 (703-545-155)</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-koza AF546</td><td>ThermoFisher</td><td>A11056</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik AF488</td><td>ThermoFisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-królik AF546</td><td>ThermoFisher</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja mrożona Średnia</td><td>ThermoFisher</td><td>Neg-50</td><td>Bezbarwna</td></tr><tr><td>szklana osłona mikroskopu</td><td>Citotest</td><td>10212450C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikrotom Yamato</td><td>REM-710</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Neurofilament 200</td><td>Abcam</td><td>ab4680</td><td>Kurczak</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej</td><td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td><td>H37022750</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td>Macklin P804536</td><td>500g</td></tr><tr><td>Falloidyna AF350</td><td>ThermoFisher</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pompa perystaltyczna</td><td>Longer</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>S100-&beta;</td><td>Abcam</td><td>ab52642</td><td></td></tr><tr><td>Królik Fosforan sodu dbasic dwunastowodny</td><td>Macklin</td><td></td><td>S818118 500g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Macklin</td><td></td><td>S817463 500g</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Macklin</td><td>S818046</td><td>500g</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>ThermoFisher</td><td>4951PLUS-001E</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Nauki Biologiczne</td><td>9002-93-1</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Transporter acetylocholiny pęcherzykowej</td><td>Milipore</td><td>ANB100</td><td>Koza</td></tr> <tr><td>i alfa-bungarotoksyna AF647 sprzężona</td><td>ThermoFisher</td><td>B35450</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest złożoną strukturą służącą do komunikacji sygnału z neuronu ruchowego do mięśnia szkieletowego i składa się z trzech podstawowych elementów histologicznych: presynaptycznych zakończeń aksonów ruchowych, postsynaptycznych nikotynowych receptorów acetylocholiny (AchR) i okołosynaptycznych komórek Schwanna (PSC). W celu wykazania cech morfologicznych NMJ, przyśrodkowy mięsień brzuchaty łydki szczura został wybrany jako tkanka docelowa i zbadany przy użyciu wielu barwień fluorescencyjnych z różnymi rodzajami biomarkerów, w tym neurofilamentem 200 (NF200) i pęcherzykowym transporterem acetylocholiny (VAChT) dla włókien nerwowych ruchowych i ich zakończeń presynaptycznych, alfa-bungarotoksyną (α-BTX) dla postsynaptycznego nikotynowego AchR, i S100 dla pojedynczych punktów kontaktowych. W tym badaniu barwienie przeprowadzono w dwóch grupach: w pierwszej grupie próbki barwiono NF200, VAChT i α-BTX, a w drugiej grupie próbki barwiono NF200, α-BTX i S100. Wykazano, że oba protokoły mogą skutecznie zademonstrować szczegółową strukturę NMJ. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zaobserwowano charakterystykę morfologiczną zakończeń presynaptycznych, receptorów postsynaptycznych i PSC, a ich obrazy stosów Z zrekonstruowano w trójwymiarowy wzór, aby dokładniej przeanalizować korelację przestrzenną między różnymi znakowaniami. Z punktu widzenia metodologii protokoły te stanowią cenne odniesienie do badania cech morfologicznych NMJ w warunkach fizjologicznych, które mogą być również odpowiednie do oceny patologicznych zmian NMJ, takich jak uszkodzenie i regeneracja nerwów obwodowych.

Po wielokrotnym barwieniu fluorescencyjnym, odpowiednie znakowanie zostało uporządkowanie zaprezentowane na przekrojach mięśnia brzuchatego przyśrodkowego szczura o grubości 80 µm, wykazujących obecność włókien nerwowych dodatnich dla NF200, terminali presynaptycznych dodatnich dla VAChT, postsynaptycznych receptorów AchR dodatnich dla α-BTX, komórek PSC dodatnich dla S100, włókien mięśniowych dodatnich dla falloidyny oraz jąder komórkowych znakowanych DAPI (Rycina 3 i R...

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Protokół ten można wykorzystać do oceny integralności i plastyczności połączenia nerwowo-mięśniowego w warunkach normalnych i patologicznych. Technika ta polega na jednoczesnym znakowaniu komórek Schwanna oraz zwierząt laboratoryjnych przed i po na pojedynczych odcinkach mięśni. Po eutanazji dorosłego samca szczura umieść go w kapturze i otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca za pomocą nożyczek i kleszczy.Wprowadzić cewnik dożylny z lewej komory serca w kierunku aorty i przeciąć prawą wyrocznię. Następnie rozpocznij perfuzję od 100 mililitrów 0,9% soli fizjologicznej, aż krew wypływająca z prawej wyroczni będzie czysta. Następnie kontynuuj perfuzję z 250 do 300 mililitrami 4% paraformaldehydu w 0,1-molowym buforze fosforanowym lub PB pH 7,4 przez 10 minut.Po perfuzji usuń skórę obustronnej kończyny tylnej za pomocą ostrza chirurgicznego i odsłoń obustronny nerw kulszowy i mięsień brzuchaty łydki. Ostrożnie wyciąć obustronny mięsień brzuchaty łydki od kończyny tylnej za pomocą ostrza i umieścić cały mięsień w 10 mililitrach 4% paraformaldehydu. Po dwóch godzinach usuń mięsień z roztworu i zabezpiecz go krioprotekcją w 10 mililitrach 25% sacharozy w 0,1 molowym PB przez jeden dzień w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zanurzeniu tkanki mięśniowej w roztworze sacharozy, należy ją przymocować do etapu zamrażania w przesuwanym systemie mikrotomowym za pomocą zamrożonego podłoża sekcyjnego. Pokrój mięsień poziomo wzdłuż długiej osi mięśnia o grubości 80 mikronów. Za pomocą pędzla umieść siedem sekcji kriogenicznych w każdym dołku w uporządkowany sposób na sześciodołkowej płytce hodowlanej z 10 mililitrami 0,1 mola PB. W przypadku barwienia fluorescencyjnego inkubuj cztery sekcje na studzienkę z 1,5 mililitra 0,1 molowego PB zawierającego 75 mikrolitrów 10% Triton X 100 i 45 mikrolitrów normalnej surowicy osła na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 20 obr./min.Po 30 minutach przenieś skrawki do 1,5 mililitra mieszanego roztworu pierwszorzędowych przeciwciał zawierających królicze włókno anty-neurologiczne 200, kozi przeciwpęcherzykowy transporter acetylocholiny w 0,1 molowym PB, w 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X 100 i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj sekcje trzy razy przez pięć minut każda w 0,1 molowym PB włączonym w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 20 obr./min. Po ostatnim przemyciu inkubować wycinek w mieszanym roztworze przeciwciał drugorzędowych zawierających AF 488 przeciwko królikowi i AF 546 przeciwko kozom osła, a także biomarkery toksyny alfa bungaro AF 647 i falloidyny 350 zawierające w 0,1 M PB zawierające 1% normalnej surowicy osła i 0,5 Tritona x 100 przez jedną godzinę, Ochrona ich przed światłem.Po inkubacji umyj skrawki w PB i zamontuj je na szkiełku mikroskopowym. Nałóż szkło nakrywkowe na sekcję, używając 50% gliceryny w wodzie destylowanej. Obserwuj i zobrazuj preparat za pomocą systemu obrazowania konfokalnego wyposażonego w obiektyw subiektywny 20x o aperturze numerycznej 0,75 i obiektyw 40x o aperturze numerycznej 0,95.W przypadku wielokrotnego obrazowania fluorescencyjnego należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji każdego biomarkera zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Ustaw rozdzielczość przechwytywania obrazu na 640 na 640 pikseli. Następnie ustaw początkową i końcową płaszczyznę ogniskowej.Ustaw rozmiar kroku na jeden lub dwa mikrony. Następnie wybierz wzór głębi, przechwytywanie obrazu i serię Z. W przypadku obrazów o mniejszym powiększeniu przy 20 pikselach uchwyć obrazy stosu 40 Z w krokach co dwa mikrony za pomocą otworu o średnicy 105 mikronów.Wybierz tryb projekcji lub topografii i projekcję intensywności na osi Z, aby zintegrować wszystkie obrazy w jednym ostrości. Aby uzyskać obrazy o większym powiększeniu przy 40 pikselach, uchwyć obrazy stosu 80 Z w kroku co jeden mikron z zoomem ustawionym na dwa i otworkiem 105 mikronów. Zintegruj wszystkie obrazy w jednym ostrym obrazie.Zrekonstruuj obrazy w trójwymiarowym wzorze za pomocą systemu przetwarzania obrazu. Wykazano tutaj reprezentatywną korelację przestrzenną mięśnia brzuchatego łydki przyśrodkowego z włóknami nerwowymi 200 dodatnimi, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny dodatnim zakończeniem presynaptycznym, postsynaptycznym receptorami acetylocholiny dodatnimi alfa bungaro, perysynaptycznymi komórkami Schwanna S100 dodatnimi, włóknami mięśniowymi faloidyno-dodatnimi i jądrami komórkowymi znakowanymi DAPI. Neurofilament 200 dodatnich włókien nerwowych biegł w wiązce.Te włókna nerwowe dały gałęzie do pęcherzykowych zakończeń presynaptycznych dodatnich transportera acetylocholiny, które tworzyły lustrzany związek z postsynaptycznymi receptorami acetylocholiny dodatnimi dodatnimi dla toksyny alfa bungaro. Ponadto wykryto S100 dodatnie perysynaptyczne komórki Schwanna wokół 200 dodatnich włókien nerwowych neurofilamentu w pobliżu zakończeń presynaptycznych. Korelacja przestrzenna została następnie zademonstrowana w postaci trójwymiarowego wzorca ukazującego szczegółową charakterystykę morfologiczną połączenia nerwowo-mięśniowego z różnych perspektyw.Aby zaobserwować więcej obrazowania w sekcjach mięśniowych, ważne jest, aby przeciąć mięsień poziomo wzdłuż długiej osi o grubości 80 mikronów.

visualizing-morphological-characteristics-neuromuscular-junction-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest używane jako model do badania morfologii i funkcji synaps. Ten film opisuje ważne cechy, które naukowcy określają ilościowo, aby scharakteryzować NMJ. Przykładowy protokół demonstruje oprogramowanie zdolne do automatycznego wykonywania kwantyfikacji.

Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

Źródło: Marinello, M., et al. Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia przygotowanie, barwienie immunologiczne i obrazowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w tkance mięśniowej szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej do wizualizacji i analizy struktur presynaptycznych i postsynaptycznych.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

W tym filmie demonstrujemy protokół do preparacji mięśnia poprzecznego brzucha myszy i używamy immunofluorescencji i mikroskopii do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych.

Rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Dwa algorytmy analizy obrazu, "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały stworzone, aby automatycznie określić ilościowo dziewięć cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Dwa algorytmy wysokoprzepustowej i wieloparametrycznej kwantyfikacji morfologii połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila

Tutaj udostępniamy protokół do generowania in vitro NMJ z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ta metoda może indukować NMJ o dojrzałej morfologii i funkcji w ciągu 1 miesiąca w jednym dołku. Powstałe w ten sposób NMJ mogą być potencjalnie wykorzystane do modelowania powiązanych chorób, badania mechanizmów patologicznych lub badań przesiewowych związków leczniczych do terapii.

Połączenie nerwowo-mięśniowe in vitro indukowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj metodę immunohistochemii fluorescencyjnej do wizualizacji złącza nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowej szczura. Technika ta pozwala badać integralność i plastyczność struktur nerwowych.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Przeglądaj więcej filmów