System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

Ogólnym celem tego opartego na wkładce filtra systemu hodowli 3D komórek pierwotnych pochodzących od pacjenta jest ustanowienie bardziej istotnego biologicznie systemu modelowego in vitro do badań nad rakiem prostaty. Wykorzystując pierwotne komórki ludzkie, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju prostaty, a także w raku prostaty. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to stosunkowo szybka metodologia in vitro do tworzenia zróżnicowanych pierwotnych komórek gruczołu krokowego, która pozwala również na szybką izolację biomolekuł, takich jak RNA, DNA i białko.

Wizualna demonstracja tych metod ma kluczowe znaczenie, ponieważ przetwarzanie komórek na wkładzie filtracyjnym do badania histologicznego lub do zbierania RNA i białek jest delikatne i wrażliwe na czas. Aby ograniczyć dyfuzję między komorami w komorze bezpieczeństwa biologicznego, nałóż cienką warstwę 0,1% żelatyny na dolną stronę wkładek i pozostaw do wyschnięcia. Powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy.

Następnie umieść komórki w wewnętrznej komorze wkładek pokrytych żelatyną i hoduj je przez okres do dwóch tygodni. Po dwóch tygodniach należy zastosować wkłady filtracyjne z kulturą fermentacyjną bezpośrednio do jednego z odpowiednich zastosowań wyszczególnionych poniżej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odessać PBS z komory zewnętrznej i ostrożnie usunąć PBS z komory wewnętrznej.

Wkładki hodowlane można przechowywać przez krótki czas w PBS do czasu rozpoczęcia aplikacji, ale nie należy dopuścić do wyschnięcia membrany. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 0,25% trypsyny EDTA do każdej komory wewnętrznej. Następnie inkubuj je przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie krótko i ostrożnie zeskrobać komórki na powierzchni membrany pipetą o pojemności 200 mikrolitrów, pipetując w górę iw dół. Następnie inkubuj je przez minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po minucie dodaj 250 mikrolitrów kondycjonowanego podłoża do pierwszej komory wewnętrznej i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przepłukać filtr.

Następnie przenieś zawieszone komórki do sąsiedniej komory filtracyjnej, która zawiera te same warunki pożywki i powtórz pipetowanie w górę iw dół. Powtórz tę procedurę dla każdej z wstawek pojedynczego warunku. Następnie zbierz komórki i przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Przepłucz każdą wewnętrzną komorę dodatkowymi 100 do 200 mikrolitrami kondycjonowanego podłoża, aby zebrać pozostałe komórki i dodać je do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie wiruj komórki w mikrowirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie odessać supernatant i przemyć osad komórkowy raz 1 000 mikrolitrów PBS.

Ponownie wiruj komórki w mikrowirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po pięciu minutach odessać PBS i zamrozić próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. W tej procedurze dodać 200 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny, fenolu, chloroformu lub podobnego odczynnika ekstrakcyjnego do komory wewnętrznej i krótko poruszyć komórki na powierzchni membrany, pipetując w górę iw dół.

Następnie inkubować komórki w odczynniku ekstrakcyjnym przez pięć minut w temperaturze pokojowej i pozostawić komorę zewnętrzną do wyschnięcia. Następnie umyj membranę filtra, pipetując roztwór ekstrakcyjny w górę iw dół. Zebrać jak najwięcej odczynnika ekstrakcyjnego, przechylając płytkę sześciodołkową i zasysając resztki cieczy.

Należy pamiętać, że filtr może odłączyć się od wkładu. Umyj zdysocjowaną membranę filtra, jeśli jest podłączona. Następnie zbierz jak najwięcej odczynnika ekstrakcyjnego i postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym oczyszczania i odzyskiwania DNA, RNA lub białka.

Należy zachować ostrożność podczas mycia komórek i filtrowania tiocyjanianem guanidyny, ponieważ nadmierne mieszanie może skutkować niską jakością RNA. W celu wyizolowania białka z wkładu filtracyjnego należy umieścić wkład filtra w płytce sześciodołkowej na lodzie. Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu do lizy białek do komory wewnętrznej.

Mieszać i zeskrobywać komórki na powierzchni membrany za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów podczas pipetowania w górę iw dół i unikać tworzenia pęcherzyków w buforze do lizy. Następnie inkubować sześciodołkową płytkę z wkładami filtracyjnymi na lodzie przez dziesięć minut. Powtórz skrobanie, a następnie spłucz powierzchnię membrany buforem do lizy.

Zbierz lizaty z sześciu wkładek i przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Następnie przepłucz pierwszą membranę dodatkowymi 10 mikrolitrami buforu do lizy i przenieś ją do następnego filtra. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich wkładek w danym warunku doświadczalnym, zbierając wszelkie pozostałości roztworu buforowego do lizy i dodać do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Inkubować próbkę na lodzie przez dodatkowe pięć minut. Następnie wiruj z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu odpipetować lizat do świeżej probówki o średnicy 1,5 milimetra.

Następnie przystąp do analizy stężenia białka lub przechowuj lizaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W tej procedurze dodaj 500 mikrolitrów i jeden mililitr 10% NBF odpowiednio do komory wewnętrznej i zewnętrznej. Inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia odessać NBF z komory zewnętrznej i dodać jeden mililitr żelu do przetwarzania HEA do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Powoli rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej przy użyciu małej mocy i powtarzaj 10-sekundowe impulsy, aż agaroza się rozpuści. Przechowuj HEA w ciepłej kąpieli o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec zestaleniu, aż będzie gotowy do użycia.

Następnie wyjmij NBF z komory wewnętrznej. Nałóż 25 mikrolitrów stopionego HEA do komory wewnętrznej i pozwól agarozie zestalić się przez dwie do pięciu minut. Następnie zwilż dwie piankowe podkładki histologiczne w 10% NBF i umieść jedną podkładkę w kasecie do zatapiania.

Zabezpieczenie integralności warstw komórkowych na wkładzie filtracyjnym za pomocą HistoGel jest kluczowym krokiem w celu zachowania nienaruszonej warstwy komórkowej do przekroju histologicznego. Następnie użyj skalpela z ostrzem numer 11, aby naciąć filtr od spodu plastikowej komory wkładu, częściowo go zwalniając. Umieść 100-200 mikrolitrów NBF na szalce Petriego i zanurz częściowo usunięty filtr w NBF.

Za pomocą skalpela z ostrzem 10 delikatnie dociśnij środek filtra od wewnątrz komory wkładu, aby całkowicie wysunąć filtr z cylindra wkładu. Jeśli jakakolwiek część filtra jest nadal przymocowana do lufy, odetnij ją skalpelem. Następnie przeciąć filtr z powłoką HEA na pół.

Umieść każdą połówkę filtra na podkładce piankowej w przygotowanej kasecie histologicznej. Następnie dodaj drugą gąbkę nasączoną 10% NBF do kasety, układając filtr. Następnie zamknij kasetę zatrzaskowo.

Umieść go w NBF i inkubuj przez noc. Ten obraz w jasnym polu pokazuje wielowarstwowe warstwy komórek na szczycie porowatej błony. Pokazano poszczególne obrazy fluorescencyjne jąder, P63 i receptora androgenowego, a także połączenie wszystkich trzech markerów fluorescencyjnych.

Na koniec pokazano kompozytowe jasne pole i nakładkę immunofluorescencyjną, ustalając lokalizację sygnału fluorescencyjnego względem komórek i filtra. Tutaj pokazany jest przekrój poprzeczny naszego wkładu filtracyjnego w porównaniu z warstwami nabłonka przewodowego nienaruszonej prostaty. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch tygodni, a końcowa izolacja komórek i wkładu filtrującego lub pożądanej biomolekuły zajmuje mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas pracy z wkładami filtrującymi, aby nie doszło do uszkodzenia warstwy komórkowej lub leżącego pod nią filtra. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak Western Blots, mikromacierze RNA i analizy proteomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące analizy szlaków i komórek nowotworowych. Technika ta pomoże utorować drogę naukowcom zajmującym się rakiem gruczołu krokowego do lepszego zbadania biologii prostaty, a także podstaw raka prostaty przy użyciu pierwotnych komórek prostaty.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć doskonałe zrozumienie, jak prawidłowo skonfigurować i odzyskać hodowane pierwotne komórki prostaty z tego systemu hodowli 3D.