Name: System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj system hodowli 3D na wkładce filtrującej do różnicowania komórek gruczołu krokowego. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskanie zróżnicowanych komórek pierwotnych oraz izolację RNA, DNA i białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez T32(CA 9686-18) i TL1 (TL1TR001431) granty na staż podoktorski (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) oraz U01 PAR-12-095 (Kumar) i P30 CA051008-21 (Weiner). Utrwalanie, cięcie i barwienie próbek przeprowadzono w Lombardi Comprehensive Cancer Center Histology and Tissue Shared Resource. Dziękujemy Richardowi Schlegelowi za pomocne dyskusje. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Cancer Institute lub National Institutes of Health.

1. Ustanowienie Systemu Wstawiania Kultur Komórkowych 3D
<ol>
	<li>Umieść 2 wkładki do hodowli komórek poliwęglanowych w odwróconej orientacji (filtrem do góry) w dół na płytce 6-dołkowej (rysunek 1A).</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę 0,1% żelatyny w wodzie na spód wkładu i pozostaw do wyschnięcia (10-20 min) w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Powtórz krok 1.2 jeszcze dwa razy, w sumie 3 aplikacje 0,1% żelatyny na wkładki. 
	UWAGA: Powłoka żelatynowa pomoże ograniczyć dyfuzję między komorami.</li>
	<li>Aby zebrać pierwotne CRC ze standardowych warunków hodowli, dodać 5 ml PBS w celu umycia kolby hodowlanej.
	<ol>
		<li>Trypsynizować komórki za pomocą (1 ml dla T-25 i 2 ml dla T-75) 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Delikatnie postukaj w bok kolby, aby pomóc w usunięciu komórek. Następnie przystąp do zatrzymania reakcji trypsyny i zbierz komórki, dodając 5 ml kompletnego DMEM.</li>
		<li>Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C i 188 x g i policzyć za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.</li>
		<li>Ponownie zawiesić 600 000 CRC w 250 μl kondycjonowanej pożywki (CM) i dodać do prawidłowo zorientowanej (filtrem stroną do dołu) wkładki hodowlanej (Rysunek 1B). Nazywa się to komorą wewnętrzną. 
		Uwaga: CM jest kondycjonowany przez napromieniowane komórki J2 i zawiera 10 μm Y-27632, jak opisano wcześniej7,8,9,11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieść 2 ml CM na zewnętrzną komorę płytki 6-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (przez co najmniej 18 godzin).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij CM z komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl i powoli dodaj pożywkę różnicującą (DM) do komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż do napełnienia. Uważaj, aby nie naruszyć warstwy komórek.</li>
</ol>
2. Utrzymanie kultur 3D
<ol>
	<li>Codziennie sprawdzaj kultury. Zdrowe komórki pojawiają się, jak pokazano na rysunku 2.</li>
	<li>Zmieniaj CM w komorze zewnętrznej codziennie lub co drugi dzień w zależności od metabolizmu komórek.</li>
	<li>Gdy pożywka w komorze wewnętrznej zmieni kolor (żółty), ostrożnie wyjmij pożywkę z wewnętrznej komory filtra za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl.</li>
	<li>Zassać pożywkę w zewnętrznej komorze na płytkę 6-dołkową za pomocą końcówki zasysającej.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml powoli nanieś świeżą masę do komory wewnętrznej, aż do jej wypełnienia. Uważaj, aby nie zeskrobać ani w inny sposób nie usunąć warstwy komórek.</li>
	<li>Zastąp pożywkę w komorze zewnętrznej 2 ml świeżego CM.</li>
	<li>Utrzymuj kultury przez 2 tygodnie, a następnie przystąp do przetwarzania w celu uzyskania pożądanej izolacji dwucząsteczkowej. 
	UWAGA: Każdy rząd na płytce 6-dołkowej, w sumie sześć wkładek (Figura 1B), powinien być przetworzony na eksperyment, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do analizy, DNA, RNA lub białka</li>.
	<li>Odessać pożywkę w komorze zewnętrznej i przepłukać 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij pożywkę z komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl i dodaj 500 μl PBS. Unikaj skrobania lub w inny sposób naruszania komórek na membranie.</li>
	<li>Odessać PBS z komory zewnętrznej i ostrożnie usunąć PBS z komory wewnętrznej za pomocą pipety o pojemności 1 ml lub 200 μl. Po usunięciu PBS przejdź bezpośrednio do odpowiedniej aplikacji opisanej poniżej. Nie dopuścić do wyschnięcia membrany. Kulturę można przechowywać przez krótki czas w PBS, dopóki aplikacja nie będzie gotowa do rozpoczęcia.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie filtrów do bankowania peletów
<ol>
	<li>Dodać 100 μl 0,25% trypsyny-EDTA do każdej komory wewnętrznej i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Krótko i ostrożnie wymieszać/zeskrobać komórki na powierzchni membrany pipetą o pojemności 200 μl, pipetując w górę i w dół (unikać nakłuwania membrany). Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 250 μl CM do pierwszej komory wewnętrznej i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby przepłukać filtr.</li>
	<li>Przenieś zawieszone komórki do sąsiedniej komory filtracyjnej, która zawiera te same warunki pożywki i powtórz pipetowanie w górę iw dół.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla każdej z wstawek pojedynczego warunku. Zebrać i przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przepłucz każdą komorę wewnętrzną dodatkowymi 100-200 μl CM, aby zebrać pozostałe komórki. Dodaj do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml w kroku 3.5.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 423 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i przemyć osad komórkowy jednorazowo 1000 μl PBS.</li>
	<li>Wirować ponownie w temperaturze 423 x g w mikrowirówce w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Odessać PBS i zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie filtrów do izolacji RNA lub DNA
<ol>
	<li>Dodać 200 μl tiocyjanianu guanidyny, chloroformu fenolowego lub podobnego odczynnika ekstrakcyjnego do komory wewnętrznej i krótko wymieszać komórki na powierzchni membrany, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować w odczynniku ekstrakcyjnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej z suchą komorą zewnętrzną.
	<ol>
		<li>Ponieważ filtr może odłączyć się od wkładu, należy umyć odłączoną membranę filtra, pipetując roztwór ekstrakcyjny w górę iw dół. Zbierz jak najwięcej odczynnika ekstrakcyjnego, przechylając płytkę 6-dołkową i zasysając resztki cieczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym oczyszczania i odzyskiwania DNA, RNA lub białka.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie filtrów do izolacji białek
<ol>
	<li>Umieść wkład filtra w płytce 6-dołkowej na lodzie. Do komory wewnętrznej dodać 10 μl buforu do lizy białek uzupełnionego 1 mM fluorku sodu (NaF), 1 mM wanadanu sodu (NaV), 100 mM ditiotreitolu (DTT) i 100 μL koktajlu antyproteazy.</li>
	<li>Mieszać/zeskrobywać komórki na powierzchni membrany za pomocą pipety o pojemności 20 μl, pipetując w górę i w dół. Unikaj generowania pęcherzyków w buforze do lizy.</li>
	<li>Inkubować 6-dołkową płytkę z wkładami filtrującymi na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Powtórz skrobanie, a następnie spłucz powierzchnię membrany buforem do lizy.</li>
	<li>Zebrać lizaty z 6 wkładek i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.</li>
	<li>Przepłukać pierwszą membranę dodatkowymi 10 μl buforu do lizy i przenieść do następnego filtra.</li>
	<li>Powtórzyć krok 5.6 dla wszystkich wkładek, zbierając resztki roztworu buforowego do lizy i dodać do probówki o pojemności 1,5 ml (krok 5.5).</li>
	<li>Próbkę należy inkubować na lodzie przez dodatkowe 5 minut.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (16 873 x g w wirówce stołowej) przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odpipetować lizat supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przystąpić do analizy stężenia białka lub przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie dla H&E i barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Dodać 500 μl i 1 ml 10% NBF (neutralnej buforowanej formaliny) do komory wewnętrznej i zewnętrznej i pozostawić na noc do inkubacji w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zassać NBF z komory zewnętrznej i dodać 1 ml żelu przetwórczego hydroksyetyloagarozy (HEA) do wirówki o pojemności 1,5 ml. Powoli rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej przy użyciu małej mocy i powtarzaj impulsy przez 10-20 s, aż agaroza się rozpuści.</li>
	<li>Przechowuj HEA w ciepłej kąpieli o temperaturze 37 °C, aby zapobiec zestaleniu, aż będzie gotowy do użycia.</li>
	<li>Wyjmij NBF z komory wewnętrznej i nałóż 25 μl stopionego HEA do komory wewnętrznej i pozwól agarozie zestalić się przez 2-5 minut.</li>
	<li>Zwilż 2 piankowe podkładki histologiczne w 10% NBF i umieść jedną podkładkę w kasecie do zatapiania (patrz rysunek 3D).</li>
	<li>Użyj skalpela z ostrzem #11 (który ma bardzo ostre, drobno zakończone ostrze), aby naciąć filtr od spodu komory wkładu, częściowo zwalniając go z plastikowej komory wkładu.</li>
	<li>Umieść niewielką ilość (100-200 μl) NBF na szalce Petriego i zanurz częściowo usunięty filtr w NBF (rysunek 3A).</li>
	<li>Za pomocą skalpela z ostrzem #10 delikatnie dociśnij środek filtra od wewnętrznej strony komory wkładu, aby całkowicie wysunąć filtr z cylindra wkładu (Rysunek 3B). Jeśli jakakolwiek część filtra jest nadal przymocowana do lufy, odetnij ją skalpelem.</li>
	<li>Przetnij filtr pokryty technologią HEA na pół za pomocą skalpela z ostrzem #10 (Rysunek 3C).</li>
	<li>Umieść każdą połówkę filtra na podkładce piankowej w kasecie histologicznej przygotowanej w kroku 6.4 (Rysunek 3D).</li>
	<li>Dodaj drugą gąbkę nasączoną 10% NBF do kasety, układając filtr w warstwie.</li>
	<li>Zatrzaskowo zamknij kasetę, umieść w NBF i inkubuj przez noc.</li>
	<li>Filtry przetworzyć na bloki parafinowe w celu przekrojenia i barwienia, jak opisano wcześniej12.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwotne linie komórkowe są ważną i szybko rozwijającą się platformą badań nad rakiem. System hodowli 3D oparty na wkładkach hodowlanych wspomaga różnicowanie pierwotnego raka jelita grubego gruczołu krokowego w ciągu dwóch tygodni. Metoda filtracji CRC stanowi nową, średnio przepustową metodę badań nad prostatą. Istniejące mysie modele PDX są czasochłonne i niezwykle drogie, a wielu próbek PDX nie można hodować w kulturze, co ogranicza eksperymenty inicjowane przez badaczy i ich użyteczność. Ponadto, podczas gdy wskaźn...

Identyfikacja i stosowanie terapii przeciwnowotworowych, które są spersonalizowane dla poszczególnych osób, jest głównym celem badań nad rakiem. Ostatnio opracowano nowe podejścia, które pozwalają na większą łatwość w tworzeniu pierwotnych kultur komórkowych, potencjalnie zapewniając sposoby zarówno identyfikacji, jak i testowania spersonalizowanych terapii. Na przykład metoda organoidów prostaty oparta na R-spondynie1 pozwala na trójwymiarową (3D) hodowlę prawidłowych i przerzutowych komórek raka prostaty w komercyjnej macierzy zewnątrzkomórkowej (np. Matrigel), podczas gdy metoda warunkowego przeprogramowania komórek (CRC) opracowana w Georgetown2,3 wykorzystuje bardziej standardowe warunki hodowli 2D. W szczególności połączenie inhibitora kinazy Rho (Y-27632) i napromieniowanych komórek żywiących mysie fibroblasty J2 prowadzi do nieograniczonej hodowli keratynocytów CRCs2. Metodologia CRC jest niezwykle solidna, z pierwotnymi liniami komórkowymi z powodzeniem ustanowionymi i utrzymywanymi w nieskończoność z prostaty i wielu innych normalnych i złośliwych tkanek nabłonkowych3. Co ważne, nasza technologia CRC pozwoliła na szybką identyfikację podłoża etiologicznego nawrotu brodawczakowatości oddechowej u pacjenta, u którego nie powiodło się kilka wcześniejszych terapii farmakologicznych. Ponadto, przy użyciu normalnych i pochodzących z nowotworu jelit grubych, pomyślna identyfikacja zatwierdzonego przez FDA leku, worinostatu, została dokonana w ciągu dwóch tygodni od wstępnej biopsji tkanki. Pacjent został umieszczony na worinostacie, co zaowocowało skutecznym leczeniem jego choroby4.
Normalny gruczoł krokowy składa się z komórek luminalnych, bazalnych i rzadkich komórek neuroendokrynnych5. Komórki luminalne tworzą walcową warstwę nabłonkową gruczołu i wyrażają receptor androgenowy (AR), a także inne markery świetlne, takie jak cytokeratyny 8 i 18 oraz antygen specyficzny dla prostaty (PSA)6. I odwrotnie, komórki podstawne są zlokalizowane pod warstwą luminalną i wyrażają cytokeratynę 5 i p63, ale niskie poziomy klasy AR5. My7,8,9 i inni10 z powodzeniem wykorzystali rak jelita grubego prostaty w przedklinicznych badaniach mechanistycznych wrażliwości na leki. Jednak podczas hodowli w standardowych warunkach hodowli tkankowej 2D, komórki te nie są w stanie w pełni zaangażować sygnalizacji AR10. Co ważne, po umieszczeniu pod torebką nerkową myszy z niedoborem odporności, CRC odzyskały normalną architekturę i funkcję gruczołów gruczołowych prostaty, co wskazuje, że rak gruczołu krokowego zachowuje swoje zobowiązanie rodowe, gdy zostanie umieszczony w środowisku permisywnym. Opisany tutaj rozwój systemu hodowli komórkowych opartego na wkładkach filtrujących pozwala na szybkie (2 tygodnie) różnicowanie in vitro CRC gruczołu krokowego, o czym świadczy zwiększona ekspresja genów docelowych AR i AR, a także obniżony poziom p63.
Użyte wkłady filtracyjne zawierają membrany poliwęglanowe (wielkość porów, 0,4 μm), które mogą wspierać hodowlę komórek ssaków. System, w takiej formie, w jakiej został opracowany, wykorzystuje normalne i złośliwe raki jelita grubego prostaty, 6-dołkowe szalki hodowlane i wkłady filtracyjne. Pożywkę do hodowli komórkowej kondycjonowaną przez komórki J211 umieszcza się w dolnej komorze, a pożywkę różnicującą prostatę w górnej komorze. Techniki opisane w niniejszym dokumencie wspierają różnicowanie komórek świetlnych prostaty w ciągu 2 tygodni, zgodnie z celami medycyny spersonalizowanej. Konieczne było również opracowanie metodologii, które pozwolą na kompleksowe profilowanie molekularne, genetyczne i komórkowe kultur. Opracowano i usprawniono metody izolowania DNA, RNA i białek z komórek uwolnionych z powierzchni filtra w celu dokładnego przetwarzania powtarzających się próbek. Na koniec w pełni opisano metodologię wymaganą do usunięcia filtra w celu umożliwienia zatapiania, dzielenia na sekcje oraz barwienia H&E, immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego.

<table><tbody><tr><td>Corning Costar Snapwell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Inserts</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 Well</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna 0,1% w wodzie</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny standardowy skalpel 11 ostrzy</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Bufor do lizy i ekstrakcji</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Wanadan sodu</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (AEBSF, aprotynina, bestatyna, E-64, leupeptyna i pepstatyna A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Mieszanka składników odżywczych</td><td>Media Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek Inhibitor skał</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Żel do przetwarzania próbek ( agaroza hydroksyetylowa (HEA))Thermo</td> <td>Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierający opatrunek</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Kasety do przetwarzania / zatapiania tkanek</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

system hodowli 3d oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Warunkowo przeprogramowane komórki (CRC) zapewniają zrównoważoną metodę pierwotnej hodowli komórek i możliwość rozwoju rozległych "żywych biobanków" linii komórkowych pochodzących od pacjentów. Dla wielu typów komórek nabłonkowych opisano różne podejścia do hodowli trójwymiarowych (3D), które wspierają poprawę stanu zróżnicowanego. Podczas gdy CRC zachowują swoje przywiązanie do linii, z tkanki, z której są izolowane, nie wyrażają wielu markerów różnicowania związanych z tkanką pochodzenia, gdy są hodowane w normalnych dwuwymiarowych (2D) warunkach hodowli. Aby zwiększyć zastosowanie jelit grubych pochodzących od pacjentów w badaniach nad rakiem gruczołu krokowego, zdefiniowano format hodowli 3D, który umożliwia szybkie (łącznie 2 tygodnie) różnicowanie komórek świetlnych zarówno w normalnych, jak i pochodzących z guza komórkach nabłonka prostaty. W niniejszym artykule opisano format oparty na wkładce filtracyjnej, służący do hodowli i różnicowania zarówno normalnych, jak i złośliwych raków jelita grubego gruczołu krokowego. Przedstawiono szczegółowy opis procedur wymaganych do pobierania i przetwarzania komórek do barwienia immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego. Łącznie opisany format hodowli 3D, w połączeniu z podstawowymi liniami CRC, stanowi ważny system modeli o średniej i wysokiej przepustowości do badań nad prostatą opartych na biopróbkach.

System oparty na wkładkach do hodowli komórkowych jest stosunkowo prostą i szybką procedurą wytwarzania trójwymiarowych (3D) kultur raków prostaty (CRC), która wspomaga różnicowanie komórek luminalnych. Przedstawiono schemat tego systemu (Rycina 1A) przedstawiające nakładanie powłoki żelatynowej na dolną powierzchnię wkładu filtra. Wkłady są odwracane wyłącznie na czas nakładania żelatyny. W Rysunek 1B filtry są ustawione w odpowiedniej orientacji do hodo...

Tutaj prezentujemy metodę tworzenia szybkiego systemu in vitro, który wspiera trójwymiarową hodowlę i późniejsze różnicowanie światła pierwotnych komórek nabłonka prostaty.

System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Ogólnym celem tego systemu hodowli 3D opartego na wkładkach filtracyjnych dla pierwotnych komórek pochodzących od pacjentów jest stworzenie bardziej istotnego biologicznie modelu in vitro do badań nad rakiem prostaty. Dzięki zastosowaniu pierwotnych ludzkich komórek metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju prostaty, a także w badaniach nad rakiem prostaty. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona stosunkowo szybką metodologię in vitro pozwalającą na uzyskanie zróżnicowanych pierwotnych komórek prostaty, a jednocześnie umożliwia szybką izolację biomolekuł, takich jak RNA, DNA i białka.Wizualna demonstracja tych metod jest kluczowa, ponieważ przetwarzanie komórek na wkładzie filtracyjnym do badań histologicznych lub do pozyskiwania RNA i białek jest delikatne i wrażliwe na czas. Aby pomóc ograniczyć dyfuzję między komorami w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś cienką warstwę 0,1% żelatyny na dolną stronę wkładów i pozwól im wyschnąć. Powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy.Następnie nanieś komórki do wewnętrznej komory wkładów pokrytych żelatyną i inkubuj je przez okres do dwóch tygodni. Po dwóch tygodniach wykorzystaj wyhodowane wkłady filtracyjne bezpośrednio w jednej z odpowiednich aplikacji końcowych opisanych poniżej. Aby rozpocząć tę procedurę, odessaj PBS z komory zewnętrznej i ostrożnie usuń PBS z komory wewnętrznej.Hodowane wkłady można przez krótki czas przechowywać w PBS do momentu rozpoczęcia procedury, jednak nie należy dopuścić do wyschnięcia membrany. Następnie do każdej wewnętrznej komory należy dodać 100 µL 0,25% Trypsyny EDTA. Potem inkubować je przez pięć minut w temperaturze 37 °C.Następnie krótko i ostrożnie zeskrobuj komórki z powierzchni membrany za pomocą pipety 200 µL, pipetując w górę i w dół. Następnie inkubuj je przez jedną minutę w temperaturze 37 °C. Po minucie dodaj 250 µL pożywki warunkującej do pierwszej komory wewnętrznej i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wypłukać filtr.Po tym transferze przenieś resuspendsowane komórki do sąsiedniej komory filtra zawierającej te same warunki pożywki i powtórz pipetowanie w górę i w dół. Powtórz tę procedurę dla każdego z wkładów w ramach jednego warunku. Następnie zbierz komórki i przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.Przepłucz każdą wewnętrzną komorę dodatkowymi 100 do 200 µL warunkowanej pożywki, aby zebrać pozostałe komórki, i przenieś je do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL. Następnie odwiruj komórki w mikrocentryfudze w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po tym czasie odessij nadsącz i jednokrotnie przemyj osad komórkowy 1 000 µL PBS.Ponownie odwiruj komórki w mikrocentryfudze w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po 5 minutach odessaj PBS i zamroź próbkę w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia. W tej procedurze dodaj 200 µL tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu lub podobnego odczynnika do ekstrakcji do wewnętrznej komory, a następnie krótko wymieszaj komórki na powierzchni membrany, pipetując ciecz w górę i w dół.Następnie inkubować komórki w odczynniku do ekstrakcji przez pięć minut w temperaturze pokojowej, pozostawiając komorę zewnętrzną suchą. Po tym czasie przemyć membranę filtra, pipetując roztwór ekstrakcyjny w górę i w dół. Zebrać jak najwięcej odczynnika do ekstrakcji, przechylając płytkę 6-dołkową i odsysając pozostałą ciecz.Należy pamiętać, że filtr może oddzielić się od wkładu. W takim przypadku należy przemyć oddzieloną membranę filtracyjną. Następnie należy zebrać jak największą ilość odczynnika do ekstrakcji i postępować zgodnie z protokołem producenta w celu oczyszczania i odzyskiwania DNA, RNA lub białka.Należy zachować ostrożność podczas płukania komórek i filtra tiocyjanianem guanidynium, ponieważ zbyt intensywne mieszanie może obniżyć jakość uzyskanego RNA. Aby wyizolować białko z wkładu filtra, należy umieścić wkład filtra w płytce sześciodołkowej na lodzie. Następnie do komory wewnętrznej należy dodać 10 µL buforu do lizy białek.Agituj i zeskrobuj komórki z powierzchni membrany za pomocą pipety 20 µL, wykonując ruchy zasysania i wydmuchiwania, unikając przy tym powstawania pęcherzyków powietrza w buforze lizującym. Następnie inkubuj płytkę sześciodołkową z wkładkami filtrującymi na lodzie przez dziesięć minut. Powtórz zeskrobywanie, a następnie przemyj powierzchnię membrany buforem lizującym.Zebrać lizaty z sześciu wkładów i przenieść je do probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml, umieszczonej w lodzie. Następnie przemyć pierwszą membranę dodatkowymi 10 µL buforu do lizy i przenieść ją na kolejny filtr. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich wkładów dla danej warunku eksperymentalnego, zbierając wszelkie pozostałości roztworu buforu do lizy i dodając je do probówki 1,5 ml.Inkubować próbkę na lodzie przez dodatkowe pięć minut. Następnie wirować z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsius. Po zakończeniu wirowania przenieść lizat pipetą do nowej probówki 1,5 milimetra.Następnie należy przystąpić do analizy stężenia białka lub przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C. W tej procedurze do komory wewnętrznej i zewnętrznej należy dodać odpowiednio 500 µL oraz 1 mL 10% NBF. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego dnia odessać NBF z komory zewnętrznej i dodać 1 ml żelu przetwarzającego HEA do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powoli roztopić agarozę w mikrofalówce, używając niskiej mocy i powtarzających się 10-sekundowych impulsów, aż do całkowitego roztopienia agarozy. Przechowywać HEA w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec krzepnięciu do momentu użycia.Następnie usuń NBF z komory wewnętrznej. Nanieś 25 µL roztopionego HEA do komory wewnętrznej i odczekaj od dwóch do pięciu minut, aż agar zastygnie. Następnie namocz dwa piankowe wkładki histologiczne w 10% NBF i umieść jedną wkładkę w kasecie do zatapiania.Zabezpieczenie integralności warstw komórek na wkładzie z filtrem za pomocą HistoGel jest krytycznym krokiem w celu zachowania nienaruszonej warstwy komórek do sekcjonowania histologicznego. Następnie należy użyć skalpela z ostrzem nr 11, aby naciąć filtr od dolnej strony komory plastikowego wkładu, częściowo go uwalniając. Do szalki Petriego należy wlać 100-200 µL NBF i zanurzyć w nim częściowo wyjęty filtr.Za pomocą skalpela z ostrzem nr 10 delikatnie naciśnij środek filtra od wewnętrznej strony komory wkładu, aby całkowicie oddzielić filtr od korpusu wkładu. Jeśli jakakolwiek część filtra nadal przylega do korpusu, odetnij ją skalpelem. Następnie przetnij filtr powlekany HEA na pół.Umieść każdą połowę filtra na podkładce piankowej w przygotowanej kasecie histologicznej. Następnie dodaj do kasety drugą gąbkę nasączoną 10% NBF, tak aby filtr znalazł się pomiędzy nimi. Na koniec szczelnie zamknij kasetę.Umieścić próbkę w NBF i inkubować przez noc. Ten obraz w świetle przechodzącym przedstawia wielowarstwowe pokłady komórek na powierzchni porowatej membrany. Przedstawiono poszczególne obrazy fluorescencyjne dla jąder komórkowych, P63 oraz receptora androgenowego, a także obraz po nałożeniu wszystkich trzech markerów fluorescencyjnych.Na koniec przedstawiono obraz kompozytowy z nałożeniem pola jasnego i immunofluorescencji, co pozwala określić lokalizację sygnału fluorescencyjnego względem komórek i filtra. Tutaj pokazano obraz przekroju poprzecznego naszego wkładu filtra w porównaniu z warstwami nabłonka przewodowego nienaruszonej prostaty. Po opanowaniu tej techniki proces ten można przeprowadzić w ciągu dwóch tygodni, a końcowa izolacja komórek i wkładu filtra lub pożądanej biomolekuły zajmuje mniej niż 30 minut, jeśli jest wykonana prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować ostrożność w obchodzeniu się z wkładami filtracyjnymi, aby nie doprowadzić do uszkodzenia warstwy komórek lub znajdującego się pod nią filtra. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak Western blot, mikromacierze RNA i analizy proteomu, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące analizy szlaków sygnałowych i komórek nowotworowych. Technika ta pomoże badaczom w dziedzinie raka prostaty lepiej zgłębić biologię prostaty oraz mechanizmy powstawania raka prostaty z wykorzystaniem pierwotnych komórek prostaty.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać doskonałą wiedzę na temat tego, jak prawidłowo przygotować i odzyskać hodowlane pierwotne komórki prostaty z tego systemu hodowli 3D.

a-rapid-filter-insert-based-3d-culture-system-for-primary-prostate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie demonstrujemy hodowlę izolowanych komórek nabłonka prostaty myszy przy użyciu techniki hodowli opartej na pierścieniu żelowym matrycy. Takie podejście może dostarczyć uzupełniających informacji na temat zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty do tworzenia struktur gruczołowych 3D w odpowiedzi na manipulację genetyczną lub farmakologiczną.

Test organoidów prostaty: technika hodowli ex vivo oparta na pierścieniu żelowym Matrix w celu zbadania zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.

Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro

Tutaj prezentujemy protokół, który pomaga w postępowaniu z ludzkimi organoidami pierwotnymi prostaty, a następnie sugerujemy punkty końcowe do oceny fenotypu. Opisano wysiew, utrzymanie kultur, odzysk z żelu matrycowego, kwantyfikację morfologiczną, osadzanie i sekcjonowanie, cięcie FFPE, barwienie całego mocowania oraz zastosowanie testów komercyjnych.

Postępowanie z ludzką pierwotną hodowlą organoidów gruczołu krokowego i ich ocena

Organoidy prostaty myszy stanowią obiecujący kontekst do oceny mechanizmów regulujących różnicowanie. W artykule opisano ulepszone podejście do ustalania organoidów prostaty i przedstawiono metody (1) zbierania lizatu białkowego z organoidów oraz (2) utrwalania i barwienia organoidów do mikroskopii konfokalnej z pełną mocą.

Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Korzystając z ludzkich pierwotnych komórek nabłonka prostaty, przedstawiamy nową, wolną od biomarkerów metodę funkcjonalnej charakterystyki komórek macierzystych za pomocą testu retencji znaczników opartego na sferoidach. Opisano protokół krok po kroku dla znakowania komórek BrdU, CFSE lub Far Red 2D; trójwymiarowe tworzenie sferoid; identyfikacja komórek macierzystych zachowujących znacznik za pomocą immunocytochemii; i izolacja przez FACS.

Izolacja komórek macierzystych z trójwymiarowych kultur sferoidalnych

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Poznaj system hodowli 3D na wkładce filtrującej do różnicowania komórek gruczołu krokowego. Ta metoda umożliwia szybkie uzyskanie zróżnicowanych komórek pierwotnych oraz izolację RNA, DNA i białka.

System hodowli 3D oparty na szybkiej wkładce filtrującej do pierwotnego różnicowania komórek gruczołu krokowego

Przeglądaj więcej filmów