Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Ogólnym celem tego protokołu jest hodowla jelitowych komórek Caco-2 w trzech wymiarach oraz zademonstrowanie zastosowania komory Ussinga w badaniach nad regulacją transportera serotoniny. Przedstawione tutaj metody mogą odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu nabłonkowego, takie jak to, w jaki sposób regulowany jest transporter serotoniny w jelitach, SERT. Główną zaletą 3D Caco-2 jest to, że odzwierciedlają one interakcje między komórkami i komórka-komórka do macierzy zewnątrzkomórkowej dokładniej niż monowarstwy.

Technika komory Ussinga umożliwia precyzyjne pomiary funkcji transportowej w nabłonku jelitowym. Implikacje 3D, kultur Caco rozciągają się w kierunku odkrycia środków terapeutycznych, ponieważ modele te umożliwiają badania przesiewowe pod kątem czynników przeciwko chorobom związanym ze zmienioną funkcją transportu. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w regulację transportera serotoniny, może być również stosowana do badań nad innymi transporterami elektrolitów, takimi jak sód i chlorek.

Wizualna demonstracja tych technik ma kluczowe znaczenie, ponieważ zdejmowanie warstwy surowiczo-mięśniowej i zakładanie błony śluzowej jelit w komorach Ussing jest trudne do nauczenia. Procedury 3D z komórkami Caco-2 zademonstrują Ishita Chatterjee, instruktor i Anoop Kumar, adiunkt z naszej grupy. Sposób usuwania warstwy surowiczo-mięśniowej z jelita krętego myszy zademonstruje Sangeeta Tyagi, starszy specjalista ds. badań z mojego laboratorium.

Również demonstrowanie montażu ogołoconej błony śluzowej i umieszczanie jej w komorach Ussing będą pokazywać Shubha Priyamvada i Arivarasu Natarajan, instruktorzy z mojego laboratorium. Na początek rozmrozić galaretowaty roztwór białka o zredukowanym czynniku wzrostu przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu przygotuj jeden mililitr lub 500 mikrolitrów porcji.

W dniu hodowli wstępnie schłodzić szkiełka komorowe na lodzie. Następnie dodaj 30 mikrolitrów galaretowatego roztworu białka do każdego dołka szklanego szkiełka z ośmioma komorami i równomiernie rozprowadź go. Podczas powlekania galaretowatej mieszaniny w szkiełku lub płytkach komory należy zachować ostrożność, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ponieważ komórki mogą się oderwać.

Umieść naczynie z kulturą w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 do 30 minut, aby roztwór zastygł. Następnie, za pomocą trypsyny, odłącz zlewające się komórki Caco-2 od kolby hodowlanej. Następnie policz komórki w hemocytometrze i odwiruj je w temperaturze 500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Ponownie zawiesić powstałą osadkę komórkową w podłożu 3D Caco-2, aby uzyskać zawiesinę o pożądanej gęstości. Korzystając z przygotowanej zawiesiny komórek, wysiew 4 000 komórek na studzienkę na szkiełka podstawowe i pozwól im rosnąć przez 12 do 14 dni w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wybarwić komórki, najpierw odessaj pożywkę i utrwal komórki 400 mikrolitrami 2% PFA.

Kontynuuj utrwalanie komórek przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu komórek w PBS, należy je przepuścić 0,5% roztworem Triton w PBS nie dłużej niż 15 minut. Przepłukać komórki dwukrotnie w buforze glicyny PBS, a następnie umyć permeabilizowane komórki w buforze IF przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

Zablokuj komórki za pomocą 5% normalnej surowicy koziej w buforze IF. Następnie inkubować komórki z 200 mikrolitrami pierwszorzędowego przeciwciała rozcieńczonego w buforze IF uzupełnionym 1% surowicą kozią przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie buforem IF.

Inkubować umyte komórki z 200 mikrolitrami przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w buforze IF uzupełnionym 1% surowicą kozią przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki buforem IF trzykrotnie przez dziesięć minut. Aby odłączyć komorę na szkiełko, najpierw umieść szkiełko w uchwycie podstawy prowadnicy, a następnie wsuń biały podnośnik przez uchwyt, aż zetknie się z krawędzią studzienek.

Delikatnie pociągnij komorę, aby wyjąć ją z zamka. Użyj zakrytego czarnego pudełka, aby chronić szkiełka przed światłem. Zamontuj szkiełka za pomocą powolnego środka zapobiegającego blaknięciu i przykryj je szkiełkami nakrywkowymi.

Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej, przed obrazowaniem uszczelnij je lakierem do paznokci. Odizoluj jelito kręte myszy zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie za pomocą nożyczek otwórz jelito wzdłużnie.

Powstały wycinek tkanki inkubować w lodowato zimnym buforze KBR do gazowania zawierającym jedną mikromolową indometacynę przez dziesięć minut. Przypnij około centymetrowy odcinek jelita, śluzówką do dołu, do płytki zawierającej 7% agarozy o grubości 0,5 centymetra lub utwardzony elastomer silikonowy. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego z dolnym oświetleniem usuń warstwy surowiczo-mięśniowe.

Następnie przetnij warstwę surowiczo-mięśniową ostrzem skalpela z piór. Użyj cienkich kleszczy, aby podnieść krawędź warstwy wzdłuż osi podłużnej jelita. Na koniec ostrożnie zamontuj błonę śluzową na kołkach suwaka.

Trzymaj oczyszczoną tkankę błony śluzowej za krawędzie, aby uniknąć rozdarcia. Podczas montażu odartej błony śluzowej kości biodrowej na kołkach suwaka należy zachować środki ostrożności, aby zapobiec rozerwaniu tkanki na główkach szpilek i zminimalizować uszkodzenie krawędzi tkanki. Przed obróbką tkanek należy przygotować roztwór Krebsa zagazowany 95% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla.

Następnie wlej roztwór do komory Usinga. Do kąpieli surowiczej dodać 10 mikromolowych glukozy jako substrat energetyczny i 10 mikromolowych mannitolów w celu utrzymania równowagi osmotycznej do kąpieli błony śluzowej. Następnie włóż suwak z zamontowaną błoną śluzową do komory, aby wystawić zarówno wierzchołkową, jak i podstawno-boczną stronę tkanki na działanie roztworu Krebsa.

Zrównoważ tkankę jelita krętego w kąpieli przez dziesięć minut. Następnie należy wstępnie potraktować stronę wierzchołkową 10-mikromolową fluoksetyną przez 30 minut w celu pomiaru strumienia od błony śluzowej do surowicy. Ostatecznie należy traktować podstawno-boczną stronę tkanki 10 nanogramami na mililitr TGF beta 1 przez jedną godzinę, a następnie inkubować stronę wierzchołkową z 20 nanomolowymi tritacjami 5-HT przez 30 minut.

Aby obliczyć szybkość przepływu błony śluzowej do błony surowiczej, należy zebrać 0,75 mililitra podwielokrotności ze zbiornika surowiczego, zastępując je identycznymi objętościami pożywki do kąpieli, aby zapobiec różnicom ciśnienia hydrostatycznego w błonie śluzowej. Aby określić ilościowo trytiowany 5-HT nagromadzony w tkance, usuń błonę śluzową z suwaka. Umyj go raz lodowatym buforem KRB i umieść w szklanej probówce hodowlanej.

Inkubuj błonę śluzową w 0,5 mililitra 10% KOH przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zlizować tkankę. Następnie zmierz radioaktywność w 150 mikrolitrowych podwielokrotnościach lizatów w trzech egzemplarzach za pomocą płynnego licznika scyntylacyjnego. Stosując metodę Bradforda, zmierz stężenie białka w trzech do pięciu mikrolitrowych podwielokrotnościach lizatów.

Pokazano tutaj torbiele Caco-2 wyhodowane w kulturze 3D barwione na obecność aktyny oraz torbiele Caco-2 3D barwione jednocześnie na aktynę, jądra i białko SERT. SERT jest widoczny w membranie luminalnej i w przedziałach podwierzchołkowych. Aby jeszcze bardziej potwierdzić przewagę sferek Caco-2 3D nad monowarstwami Caco-2 2D, przeprowadzono analizę western blot ekspresji białka SERT.

Wyniki wykazały zwiększoną ekspresję białka SERT w kulkach Caco-2 3D w porównaniu z komórkami Caco-2 2D. Wreszcie, zastosowano system komór Usinga, aby wykazać, że TGF beta zwiększa strumień błony śluzowej do błony surowiczej, odzwierciedlając zwiększony wychwyt 5-HT z błony świetlnej i zwiększoną akumulację 5-HT obserwowaną w błonie śluzowej jelita krętego. Wyniki te są poparte zaobserwowaną wrażliwością wychwytu 5-HT na leczenie fluoksetyną, która odpowiada ekspresji SERT na błonie świetlnej.

Po opanowaniu tę technikę zdejmowania i montowania błony śluzowej jelita krętego można wykonać w 15 minut. Stosując tę procedurę, należy pamiętać, że po usunięciu ze zwierzęcia preparat jelitowy extravio ma ograniczoną żywotność i może trwać do trzech godzin. Torbiele 3D Caco-2 mogą być wykorzystywane do różnych badań, takich jak zdarzenia transportu błonowego, ekspresja genów lub interakcja białko-białko transporterów nabłonkowych.

Po opracowaniu, technika 3D Caco-2 toruje drogę naukowcom zajmującym się transportem jelitowym do badania ruchu płynów i badania patofizjologii chorób stawu moczowego. Nie zapominaj, że praca z radioaktywnością może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony indywidualnej i odpowiednie procedury odkażania. Po obejrzeniu tego filmu będziesz mógł hodować komórki Caco-2 w kulturach 3D i wykorzystywać te kultury do badania ekspresji transportera nabłonka.

Będziesz mógł również wykorzystać komorę Ussing do badania funkcji transportu serotoniny w rodzimym jelicie myszy.