Name: Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj metody badania regulacji transportera serotoniny SERT w komórkach Caco-2 hodowanych w 3D i jelitach myszy przy użyciu komory Ussing. Techniki te umożliwiają precyzyjne pomiary funkcji transportowej nabłonka jelitowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu Christopherowi Manzelli, doktorantowi w laboratorium RKG, za pomoc w redagowaniu i korekcie naszego rękopisu.

1. Badanie transporterów jelitowych w systemie hodowli 3D Caco-2: Hodowla komórek 3D Caco-2 na galaretowatej mieszance białek
<ol>
	<li>Rozmrażanie czynnika wzrostu zredukowało galaretowatą mieszaninę białek na lodzie przez 8 godzin (lub O/N) w temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu przygotować 1 ml lub 500 μl porcji do wykorzystania lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
	<li>W dniu hodowli należy wstępnie schłodzić płytki hodowlane (do ekstrakcji RNA i białka) lub szkiełka komorowe (do barwienia immunologicznego) na lodzie. Dodać 30 μl galaretowatej mieszaniny białek do każdego dołka ośmiodołkowego szkiełka szklanego (lub 120 μl na zagłębienie na 6-dołkowej płytce) i równomiernie rozprowadzić. Uważaj, aby podczas procesu nie wytwarzać pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Umieścić szkiełka/płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 15-30 minut i pozostawić galaretowatą mieszaninę białek do zestalenia się.</li>
	<li>Podczas gdy galaretowata mieszanina białek krzepnie, trypsynizuj zlewającą się kolbę komórek Caco-2.</li>
	<li>Policz liczbę komórek i obracaj je w proporcji 500 x g w wirówce stołowej przez 5 minut. W razie potrzeby ponownie zawiesić osad komórek w pożywce 3D Caco-2</li>.
	<li>Zasiej szkiełka szklanej komory w ilości 4 000 komórek na dołek (w przypadku płytek 20 000 na dołek). Pozwolić komórkom rosnąć w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Zmieniaj podłoże co 3 - 4 dni.</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne transporterów nabłonka w komórkach 3D Caco-2: Dzień 1
<ol>
	<li>Odessać pożywkę i utrwalić komórki 400 μl 2% paraformaldehydu (PFA) (w PBS o pH dostosowanym do 8,5 z NaOH) przez 30 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Roztwór PFA nie powinien być przechowywany dłużej niż 1 tydzień w temperaturze 4 °C i można użyć świeżo przygotowanego roztworu. ostrożność: PFA jest wysoce toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Zawsze należy obchodzić się z nim ostrożnie w kapturze chemicznym i przy użyciu środków ochrony osobistej.</li>
	<li>Przepłukać studzienki dwukrotnie 1x PBS i przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C w PBS (400 μl/studzienkę). Po utrwaleniu przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
	<li>Ogrzej szkiełka komory do temperatury mokrej (spowoduje to utwardzenie galaretowatego złoża mieszanki białkowej i ułatwi jej zasysanie podczas etapów mycia).</li>
	<li>Przepuszczalność komórek z 0,5% trytonem w PBS nie dłużej niż 15 minut.</li>
	<li>Przygotować bufor PBS-glicyny (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3,5 mM NaH2PO4 i 100 mM glicyny). Płukać 3x 1x PBS-glicyną przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj bufor immunofluorescencyjny (IF): 130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3,5 mM NaH2PO4, 100 mM glicyny, 7,7 mM NaN3, 0,1% BSA, 0,2% TritonX-100 i 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Przemyć 3x w buforze IF przez 10 minut w RT. Zablokować 5% normalnej surowicy koziej (NGS) w buforze IF. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w surowicy koziej IF + 1%, 200 μl/basenik, przez 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemywać buforem IF 3x przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:200) rozcieńczonym w IF + 1% NGS, 200 μl/basenik, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć buforem IF trzy razy przez 10 minut każdy. Od tego kroku trzymaj slajdy w ciemności. Podnieś plastikowe komory ze szklanych szkiełek, umieszczając szkiełko komory w czarnym uchwycie i przesuwając biały podnośnik przez uchwyt, aż jego krawędź zetknie się z krawędzią studzienek. Delikatnie pociągnij komory do góry (uchwyt i podnośnik powinny być wyposażone w szkiełka hodowlane).</li>
	<li>Zamontuj za pomocą powolnego podłoża zapobiegającego blaknięciu i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i zobrazuj je za pomocą mikroskopii konfokalnej. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie lub w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja RNA i białek z komórek 3D Caco-2
<ol>
	<li>Komórki hodowane na galaretowatej mieszaninie białek należy traktować przez 12 - 14 dni za pomocą czynnika testowego, takiego jak TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h).</li>
	<li>Po zabiegu umyj komórki 1x PBS. Trzymaj komórki na lodzie przez 30 minut, aby upłynnić galaretowatą mieszaninę białek.</li>
	<li>Umyć studzienki schłodzonym PBS i zebrać komórki do indywidualnych probówek wirówkowych. Zebrać komórki, odwirowując je na niskiej prędkości przy 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ekstrakcja RNA przy użyciu standardowych procedur i użycie RT-PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>W celu ekstrakcji białka należy lizować komórki za pomocą 1x buforu do lizy komórek uzupełnionego 1x inhibitorem koktajlu proteazy. Po dodaniu buforu do lizy komórek do osadu, poddać komórki lizie przez sonikację i usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 7 500 x g i 4 °C przez 10 minut.</li>
</ol>
4. Pomiar wychwytu 5-HT w jelicie krętym myszy za pomocą komory usingowej: przygotowanie jelit i stripping surowo-mięśniowy
<ol>
	<li>Po eutanazji należy przeprowadzić sekcję myszy i usunąć jelito cienkie (za żołądkiem i przed jelitem ślepym). Podziel jelito cienkie na trzy części. Odrzuć środkową trzecią, użyj bliższej trzeciej jako jelita czczego i użyj dystalnej trzeciej jako jelita krętego. Unikaj wyciągania jelita z przyczepu krezkowego, aby zapobiec uszkodzeniu nabłonka. Utrzymuj wycinek tkanki w chłodzie, przykrywając go lodowatym buforem wodorowęglanowym Krebsa-Ringera (KBR).</li>
	<li>Otwórz jelito wzdłużnie za pomocą nożyczek. Świeżo wycięte skrawki jelita inkubować w lodowatym, gazującym KBR zawierającym 1 μM indometacynę przez 10 minut przed oddzieleniem surowiczo-mięśniowym.</li>
	<li>Przypiąć odcinek jelitowy (~1 cm długości) stroną śluzówkową do płytki zawierającej 7% agarozy lub utwardzonego elastomeru silikonowego (o grubości 0,5 cm).</li>
	<li>Usuń warstwy surowiczo-mięśniowe pod stereomikroskopem preparacyjnym z dolnym oświetleniem. Przetnij warstwę surowiczo-mięśniową za pomocą ostrza skalpela z piór. Użyj cienkich kleszczyków, aby uzyskać krawędź warstwy wzdłuż osi podłużnej jelita. 
	UWAGA: Podczas procedury usuwania powłoki dolne oświetlenie mikroskopu stereoskopowego pomaga zidentyfikować i uniknąć obszarów z plamami Peyera.</li>
	<li>Po zakończeniu usuwania surowiczo-mięśniowego, ostrożnie zamontuj błonę śluzową na kołkach półkomory Usinga. Podczas całego procesu należy uważać, aby trzymać pozbawioną tkanki błony śluzowej za krawędzie, aby jej nie rozerwać się.</li>
</ol>
5. Równowaga i leczenie tkanek
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Kreba: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 2,4 mM K2HPO4, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 i 0,4 mM KH2PO4 przy pH 7,4, zagazowane 95% O2/5% CO2 w temperaturze 37 °C. Dodać 10 mM glukozy do kąpieli surowiczej, aby służyła jako substrat energetyczny i 10 mM mannitol do kąpieli śluzówkowej, aby utrzymać równowagę osmotyczną. 
UWAGA: Roztwór Kreba jest uzupełniany kwasem L-askorbinowym (100 μM) i pargyliną (100 μM, inhibitorem monoaminooksydazy) w celu zapobieżenia wewnątrzkomórkowej degradacji 5-HT.</li>
	<li>Włóż suwak do komory, aby wystawić zarówno stronę wierzchołkową (luminalną), jak i podstawno-boczną (surowiczą) tkankę na działanie roztworu Kreba.</li>
	<li>Po okresie równowagi wynoszącym 10 minut, wstępnie potraktować tkankę jelita krętego fluoksetyną (10 μM) przez 30 minut po stronie wierzchołkowej dla Jm-s (strumień śluzówkowo-surowiczy</li>).
	<li>Traktować tkankę TGF-β1 (10 ng / ml) przez 1 godzinę po stronie podstawno-bocznej, a następnie inkubować ją z 3[H]-5-HT (20 nM) przez 30 minut po stronie wierzchołkowej.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja strumienia błony śluzowej do błony surowiczej (Jm-s) i akumulacji 3[H]-5-HT w tkance
<ol>
	<li>Zebrać 0,75 ml podwielokrotności ze zbiornika surowiczego (łącznie 5 ml) w celu zmierzenia radioaktywności w liczniku scyntylacyjnym cieczy i obliczenia szybkości strumienia od błony śluzowej do surowiczej (Jm-s); strumień wrażliwy na fluoksetynę reprezentuje wychwyt 3[H]-5-HT za pośrednictwem SERT.</li>
	<li>Aby uniknąć różnic ciśnienia hydrostatycznego w błonie śluzowej w okresie strumienia, należy pobrać próbki od strony surowiczej i zastąpić je identycznymi objętościami podłoża do kąpieli. 
	UWAGA: Obliczenie strumienia koryguje rozcieńczenie próbki końcowej (4,25 ml / 5 ml = 0,85).</li>
	<li>W celu ilościowego określenia 3[H]-5-HT nagromadzonego w tkance, należy zdjąć błonę śluzową z suwaka, przemyć ją raz lodowatym buforem KRB i umieścić w szklanych probówkach hodowlanych.</li>
	<li>Inkubować błonę śluzową w 0,5 ml 10% KOH przez noc w temperaturze 37 °C. Zmierzyć radioaktywność w 150 μl podwielokrotności lizatów (w trzech powtórzeniach) za pomocą płynnego licznika scyntylacyjnego.</li>
	<li>Do pomiaru stężenia białka metodą Bradforda należy użyć podwielokrotności (3 - 5 μl) lizatów. 
	UWAGA: Jako wzorzec stosuje się 10 ml pożywki inkubacyjnej zawierającej radioaktywną serotoninę. 5-HT zatrzymany w tkance jest wyrażony jako pmol/mg białka/min.</li>
</ol>

<ol><li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li>
<li>Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+3D+printed+insert+for+hanging+culture+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells.</a> Biofabrication. 7 (1), 015003(2014).</li>
<li>Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+controls+spindle+orientation+to+position+the+apical+surface+during+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis.</a> J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).</li>
<li>Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+serotonin+at+the+apical+and+basolateral+membranes+of+human+intestinal+epithelial+%28Caco-2%29+cells+occurs+through+the+neuronal+serotonin+transporter+%28SERT%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT).</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).</li>
<li>Gill, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+expression%2C+and+characterization+of+the+serotonin+transporter+in+the+native+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).</li>
<li>Esmaili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteropathogenic+Escherichia+coli+infection+inhibits+intestinal+serotonin+transporter+function+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression.</a> Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).</li>
<li>Wade, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).</li>
<li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+induces+changes+in+the+subcellular+distribution+of+actin+and+5%27-nucleotidase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase.</a> Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).</li>
<li>Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BDetection+of+rabies+virus+antibodies+in+human+blood+serum+by+an+immunoenzyme+method%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Virusol%22%5BJournal%5D)">[Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method].</a> Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).</li>
<li>Woods, G. L., Mills, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+on+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+conventional+cell+culture+and+rapid+24-well+plate+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation.</a> J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).</li>
<li>Chase, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+for+shingles%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+J+%28Clin+Res+Ed%22%5BJournal%5D)">Acyclovir for shingles.</a> Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).</li>
<li>Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+rat+liver+cytochrome+P-450UT-H+cDNA+clone+and+comparison+of+mRNA+levels+with+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity.</a> Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).</li>
<li>Steiner, M., Tateishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+transport+of+calcium+in+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Distribution and transport of calcium in human platelets.</a> Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).</li>
<li>McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Mbo+II+methylase+%28GAAGmA%29+from+Moraxella+bovis%3A+site+specific+cleavage+of+DNA+at+nine+and+ten+base+pair+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).</li>
<li>Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. <a target="_blank" href="http://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(14)62381-7/abstract">3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters.</a> Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654(2014).</li>
<li>Fagg, R. H., Hyslop, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+variant+strain+of+foot-and-mouth+disease+virus+%28type+O%29+during+passage+in+partly+immunized+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hyg+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle.</a> J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).</li>
<li>Shilkina, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+aspects+of+the+problem+of+systemic+vasculitis+open+to+discussion%5D%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ter+Arkh%22%5BJournal%5D)">[The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]).</a> Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).</li>
<li>Derichs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+current+measurement+for+diagnostic+classification+of+patients+with+questionable+cystic+fibrosis%3A+validation+and+reference+data%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data.</a> Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pełni zróżnicowane monowarstwy komórek Caco-2 były szeroko stosowane jako monowarstwy spolaryzowanego nabłonka do badania transportu jelitowego 10,11,12,13,14,15. Jednak, aby naśladować fizjologiczną organizację komórek nabłonka jelitowego, pojawiło się duże zainteresowanie opracowaniem kultury Caco-2 w 3D. Niedawno opracow...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Arivarasu N. Anabazhagan
to:
Arivarasu N. Anbazhagan

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/55304">Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D</a>.

Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Nabłonek jelitowy jest wyposażony w różne białka transportowe (kanały, ATPazy, kotransportery i wymienniki), które pełnią liczne funkcje, począwszy od wchłaniania składników odżywczych, elektrolitów i leków, a skończywszy na wydzielaniu płynów i jonów w świetle. Białka transportowe generują gradienty elektrochemiczne, które umożliwiają ruch jonów lub cząsteczek w sposób wektorowy. Osiąga się to dzięki asymetrycznemu rozkładowi systemów transportowych w błonach wierzchołkowych i podstawno-bocznych spolaryzowanych komórek nabłonkowych. Ponadto ścisłe połączenia, które wiążą sąsiednie komórki nabłonkowe, odgrywają ważną rolę w tym procesie, służąc jako bariera dla wewnątrzbłonowej dyfuzji składników między wierzchołkowymi i podstawnobocznymi domenami błonowymi. Odpowiednie systemy modelowe naśladujące te charakterystyczne cechy jelita natywnego (tj. polarność, różnicowanie i integralność połączeń ścisłych) mają kluczowe znaczenie dla badania funkcjonalności systemów transportu nabłonkowego.
Jeśli chodzi o modele, typowymi liniami komórkowymi używanymi obecnie w badaniach nad transportem nabłonka jelitowego są Caco-2, model w pełni zróżnicowanych, chłonnych komórek nabłonka jelita cienkiego; oraz komórki T84 lub subklony HT-29, modele komórek nabłonka jelita grubego pochodzących z krypty1. Konwencjonalnie te linie komórkowe są hodowane jako monowarstwy na powierzchniach z tworzywa sztucznego lub w powlekanych wkładkach transwell. Wkładki do hodowli komórkowych trans-well do pewnego stopnia przypominają środowisko in vivo, umożliwiając spolaryzowanym komórkom odżywianie się podstawkowo-bocznie. Jednak ograniczeniem w konwencjonalnych systemach hodowli 2D jest to, że komórki są zmuszone do przystosowania się do sztucznej, płaskiej i sztywnej powierzchni. W związku z tym fizjologiczna złożoność natywnego nabłonka nie jest dokładnie odzwierciedlona w systemie 2D. To ograniczenie zostało przezwyciężone przez metody hodowli komórek w 3D w określonym mikrośrodowisku, takie jak galaretowata mieszanina białek, zawierająca różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej2,3. Niemniej jednak hodowle in vitro nie mogą symulować złożoności nabłonka jelitowego, który ma wiele typów komórek i specyficzną dla regionu architekturę w jelicie. W związku z tym badania z wykorzystaniem modeli kultur komórkowych wymagają dalszej walidacji w jelicie natywnym. Korzystając z hodowli komórkowej 3D in vitro i błony śluzowej jelit myszy, opisujemy tutaj proste metody badania regulacji jelitowego transportera serotoniny (SLC6A4, SERT).
Transporter SERT reguluje pozakomórkową dostępność ważnego hormonu i neuroprzekaźnika, 5-hydroksytryptaminy (5-HT), szybko transportując ją przez proces zależny od Na+/Cl. SERT jest znanym celem leków przeciwdepresyjnych, a ostatnio pojawił się jako nowy cel terapeutyczny w zaburzeniach żołądkowo-jelitowych, takich jak biegunka i zapalenie jelit. Metody badania wychwytu 5-HT w komórkach nabłonka jelitowego zostały już wcześniej opisane. Na przykład wykazano, że komórki Caco-2 hodowane na plastikowych podporach lub przepuszczalnych wkładkach wykazują wrażliwy na fluoksetynę wychwyt 3H-5-HT zarówno w domenie wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej4. Pomiar funkcji SERT w izolowanych pęcherzykach błony granicznej szczotki (BBMV) przygotowanych z jelita cienkiego dawcy narządów ludzkich został również opisany przez us5. 3Wykazano, że wychwyt H-5-HT w ludzkich BBVM jest wrażliwy na fluoksetynę i zależny od Na+/Cl oraz wykazywał kinetykę nasycenia przy Km wynoszącym 300 nM5. Korzystając z podobnych metod, wcześniej zmierzyliśmy funkcję SERT jako wychwyt 3H-5-HT w jelitach myszy BBMVs6. Jednak przygotowanie czystych pęcherzyków błony plazmatycznej wymaga dużej ilości błony śluzowej tkanki. Inne metody, takie jak radiograficzna wizualizacja 3miejsc wychwytu H-5-HT, zostały również pokazane wcześniej w jelicie cienkim świnki morskiej i szczura7.
Komora Ussing dostarcza bardziej fizjologicznego systemu do pomiaru transportu jonów, składników odżywczych i leków przez różne tkanki nabłonkowe. Główną zaletą techniki komory Ussinga jest to, że umożliwia ona precyzyjny pomiar parametrów elektrycznych i transportowych nienaruszonego, spolaryzowanego nabłonka jelitowego. Ponadto, aby zminimalizować wpływ wewnętrznego układu nerwowo-mięśniowego, można przeprowadzić surowiczo-mięśniowe usuwanie błony śluzowej jelit w celu zbadania regulacji transporterów w nabłonku8.
Pokazujemy, że komórki Caco-2 hodowane w 3D na galaretowatym białku tworzą puste światło wyrażające wyraźne markery wierzchołkowe i podstawno-boczne. Komórki te wykazują wyższą ekspresję SERT niż komórki 2D Caco-2. Opisano metody hodowli komórek 3D oraz wykonywania barwienia immunologicznego lub ekstrakcji RNA i białek. Ponadto opisujemy metody badania funkcji i regulacji SERT przez TGF-β1, cytokinę plejotropową, w błonie śluzowej jelita cienkiego z wykorzystaniem techniki komory Usinga.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; HTB&nieśmiały; 37&handel;</td><td>Komórek</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microsope do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>3[H]-5-HT&nbsp;</td><td>LabtekII</td><td>152453</td><td>Komórki hodowlane do mikroskopii</td></tr><tr><td>5-HT&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>70013-032</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>95% O2- 5% CO2 butla</td><td>KPL</td><td>71-00-27</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>Agar (do płytek agarowych)</td><td>Fischer</td><td>BP151-100</td><td>Toksyczność ostra, Ora</td></tr><tr><td>Agar (do elektrody)</td><td>Sigma</td><td>G7126-1KG</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>C3867-1VL</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Działa szkodliwie w przypadku połknięcia lub wdychania</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>LifeTechnologies</td><td>A12380</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>Komórki Caco-2</td><td>Sigma</td><td>A8806-5G</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>Bufor do lizy komórek</td><td>Fischer</td><td>BP337-100</td><td>Nie a substancja niebezpieczna</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie zamazane</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td>Nie jest substancją niebezpieczną</td></tr><tr><td>Roztwór kolagenu typu 1</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Używana jako macierz zewnątrzkomórkowa</td></tr><tr><td>Fluoksetyna</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sygnalizacja komórkowa, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny ciecz&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>70013--032</td><td></td></tr><tr><td>LSM710 Meta</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>EM-CSYS-8</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2304</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>VCC MC8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>DM MC6</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowy zacisk napięciowy/prądowy</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2300</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Physiologic Instruments, San Diego, CA&nbsp;</td><td>P2023-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS, 10%)</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strp</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>10420</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteinaz</td><td>MEDOX, Chicago, IL&nbsp;</td><td>styl G- 12300</td><td></td></tr><tr><td>RNA easy Mini kit</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowy moduł wejściowy elektrody&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Suwaki do komór snapwell</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>F132</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>T7039</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Perkin-Elmer, Waltham, MA</td><td>NFT1167250UC</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Packard Instruments, Downers Grove, IL</td><td>B1600</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Chamber (tylko komora)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Systemy studzienek użytkowych</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr></tbody></table>

metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i caco-2 hodowanych w 3d

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

Nabłonek jelitowy pełni ważne funkcje transportowe i barierowe, które odgrywają kluczową rolę w normalnych funkcjach fizjologicznych organizmu, stanowiąc jednocześnie barierę dla obcych cząstek. Upośledzony transport nabłonkowy (jonów, składników odżywczych lub leków) jest związany z wieloma chorobami i może mieć konsekwencje wykraczające poza normalne funkcje fizjologiczne transporterów, na przykład wpływając na integralność nabłonka i mikrobiom jelitowy. Zrozumienie funkcji i regulacji białek transportowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania ulepszonych interwencji terapeutycznych. Największym wyzwaniem w badaniach nad transportem nabłonkowym jest opracowanie odpowiedniego systemu modelowego, który podsumowuje ważne cechy natywnych komórek nabłonka jelitowego. Kilka modeli hodowli komórkowych in vitro, takich jak komórki Caco-2, T-84 i HT-29-Cl.19A, jest zwykle wykorzystywanych w badaniach nad transportem nabłonkowym. Te linie komórkowe reprezentują redukcjonistyczne podejście do modelowania nabłonka i były wykorzystywane w wielu badaniach mechanistycznych, w tym w badaniu interakcji nabłonkowo-mikrobiologicznych. Jednak monowarstwy komórkowe nie odzwierciedlają dokładnie interakcji komórka-komórka i mikrośrodowiska in vivo. Komórki hodowane w 3D okazały się obiecującymi modelami do badań nad przepuszczalnością leków. Pokazujemy, że komórki Caco-2 w 3D mogą być wykorzystywane do badania transporterów nabłonkowych. Ważne jest również, aby badania na komórkach Caco-2 zostały uzupełnione innymi modelami, aby wykluczyć efekty specyficzne dla komórek i uwzględnić złożoność jelita natywnego. Do oceny funkcjonalności transporterów stosowano już kilka metod, takich jak pęcherzyk pęcherzykowy i wychwyt w izolowanych komórkach nabłonka lub w izolowanych pęcherzykach błony komórkowej. Biorąc pod uwagę wyzwania w tej dziedzinie w odniesieniu do modeli i pomiaru funkcji transportu, demonstrujemy tutaj protokół hodowli komórek Caco-2 w 3D i opisujemy zastosowanie komory Ussinga jako skutecznego podejścia do pomiaru transportu serotoniny, takiego jak w nienaruszonym spolaryzowanym nabłonku jelitowym.

Immunobarwienie w cystach Caco-2 3D przedstawiono na Rysunku 1. Reprezentatywny obraz w płaszczyźnie XY, pokazujący wyraźnie odgraniczone światło w cystcie 3D barwionej falloidyną na aktynę, przedstawiono na Rysunku 1A. Strona skierowana w stronę światła oznacza stronę apikalną. Komórki nabłonkowe hodowane w środowisku 3D wykazują silny fenotyp nabłonkowy. Różne cysty Caco-2 w 12. dniu, w którym przeprowadzono współbarwienie na aktynę i SERT, przedstawion...

Opisujemy proste metody badania regulacji funkcji i ekspresji transportera serotoniny w jelitach (SERT) za pomocą modelu hodowli in vitro komórek Caco-2 hodowanych w 3D oraz modelu ex vivo jelit myszy. Metody te mają zastosowanie do badania innych transporterów nabłonkowych.

Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest hodowla komórek jelitowych Caco-2 w trzech wymiarach oraz zademonstrowanie zastosowania komory Ussinga w badaniach nad regulacją transportera serotoniny. Przedstawione tutaj metody pozwalają odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu nabłonkowego, takie jak sposób regulacji jelitowego transportera serotoniny, SERT. Główną zaletą hodowli 3D Caco-2 jest to, że dokładniej odzwierciedlają one oddziaływania międzykomórkowe oraz oddziaływania komórek z macierzą zewnątrzkomórkową niż monowarstwy.Technika komory Ussinga umożliwia precyzyjne pomiary funkcji transportowych w nabłonku jelitowym. Zastosowanie hodowli 3D Caco-2 wykracza poza podstawowe badania i obejmuje poszukiwanie nowych środków terapeutycznych, ponieważ modele te pozwalają na przesiewowe badanie substancji przeciwdziałających chorobom związanym z zaburzoną funkcją transportu. Choć metoda ta dostarcza informacji na temat regulacji transportera serotoniny, może być ona również stosowana w badaniach nad innymi transporterami elektrolitów, takimi jak sodu i chlorków.Wizualna demonstracja tych technik jest kluczowa, ponieważ usuwanie warstwy surowiczo-mięśniowej oraz montowa

methods-to-study-epithelial-transport-protein-function-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Prezentujemy protokoły izolacji struktur 3D jelit z organoidów in vivo i in vitro w macierzy podstawnej, a także szczegółowo opisujemy różne protokoły utrwalania i barwienia zoptymalizowane pod kątem znakowania immunologicznego białek mikrotubulowych, centrosomalnych i łączących, a także markerów komórkowych, w tym białka komórek macierzystych Lgr5.

Znakowanie immunofluorescencyjne mikrotubul i białek centrosomalnych w tkance jelitowej ex vivo oraz organoidy jelitowe 3D in vitro

Ten protokół opisuje pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w czasie rzeczywistym po leczeniu farmakologicznym w organoidach jelitowych człowieka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii żywych komórek.

Pomiar przepuszczalności bariery nabłonkowej w organoidach jelitowych człowieka w czasie rzeczywistym

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Poznaj metody badania regulacji transportera serotoniny SERT w komórkach Caco-2 hodowanych w 3D i jelitach myszy przy użyciu komory Ussing. Techniki te umożliwiają precyzyjne pomiary funkcji transportowej nabłonka jelitowego.

Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Przeglądaj więcej filmów