Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest hodowla komórek jelitowych Caco-2 w trzech wymiarach oraz zademonstrowanie zastosowania komory Ussinga w badaniach nad regulacją transportera serotoniny. Przedstawione tutaj metody pozwalają odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transportu nabłonkowego, takie jak sposób regulacji jelitowego transportera serotoniny, SERT. Główną zaletą hodowli 3D Caco-2 jest to, że dokładniej odzwierciedlają one oddziaływania międzykomórkowe oraz oddziaływania komórek z macierzą zewnątrzkomórkową niż monowarstwy.

Technika komory Ussinga umożliwia precyzyjne pomiary funkcji transportowych w nabłonku jelitowym. Zastosowanie hodowli 3D Caco-2 wykracza poza podstawowe badania i obejmuje poszukiwanie nowych środków terapeutycznych, ponieważ modele te pozwalają na przesiewowe badanie substancji przeciwdziałających chorobom związanym z zaburzoną funkcją transportu. Choć metoda ta dostarcza informacji na temat regulacji transportera serotoniny, może być ona również stosowana w badaniach nad innymi transporterami elektrolitów, takimi jak sodu i chlorków.

Wizualna demonstracja tych technik jest kluczowa, ponieważ usuwanie warstwy surowiczo-mięśniowej oraz montowanie błony śluzowej jelita w komorach Ussinga są trudne do opanowania. Procedury dotyczące komórek Caco-2 3D zaprezentują Ishita Chatterjee, instruktorka, oraz Anoop Kumar, stażysta podoktorski z naszej grupy. Usuwanie warstwy surowiczo-mięśniowej z jelita krętego myszy zaprezentuje Sangeeta Tyagi, starsza specjalistka ds. badań z mojego laboratorium.

Montaż złuszczonej błony śluzowej oraz jej umieszczanie w komorach Ussinga zaprezentują Shubha Priyamvada i Arivarasu Natarajan, instruktorzy z mojego laboratorium. Na początek rozmroź roztwór białka żelatynowego o zredukowanej zawartości czynników wzrostu przez noc na lodzie w lodówce o temperaturze 4 °C. Po rozmrożeniu przygotuj alikwoty o objętości 1 mL lub 500 µL.

W dniu hodowli schłodzić uprzednio szkiełka komorowe na lodzie. Następnie do każdej studni ośmiokomorowego szkiełka szklanego dodać 30 µl roztworu białka żelatynowego i rozprowadzić go równomiernie. Podczas nakładania mieszaniny żelatynowej do szkiełka komorowego lub na płytki należy zachować ostrożność, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, gdyż może to spowodować odklejenie się komórek.

Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze do hodowli komórek w temperaturze 37 °C na 15 do 30 minut, aby roztwór mógł stężeć. Następnie, używając trypsyny, odklej konfluentne komórki Caco-2 z kolby hodowlanej. Następnie policz komórki w hemocytometrze i odwiruj je przy 500 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut.

Ponownie zawiesić otrzymany osad komórkowy w pożywce 3D Caco-2, aby uzyskać zawiesinę o pożądanej gęstości. Używając przygotowanej zawiesiny komórkowej, wysiać 4 000 komórek na dołek na szklanych szkiełkach komorowych i inkubować przez 12 do 14 dni w inkubatorze z wilgotną atmosferą, w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide. W celu zabarwienia komórek, najpierw odessać pożywkę, a następnie utrwalić komórki za pomocą 400 µL 2% PFA.

Kontynuuj utrwalanie komórek przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym przemyciu komórek w PBS, przeprowadź ich permeabilizację za pomocą 0,5% roztworu Triton w PBS przez nie więcej niż 15 minut. Przepłucz komórki dwukrotnie w buforze PBS z glicyną, a następnie przemyj permeabilizowane komórki w buforze IF przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

Zablokuj komórki, używając 5% normalnego surowicy koziej w buforze IF. Następnie inkubuj komórki z 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze IF uzupełnionym o 1% surowicy koziej przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie buforem IF.

Inkubować przemyte komórki z 200 µL przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w buforze IF uzupełnionym o 1% surowicy koziej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki buforem IF trzykrotnie przez dziesięć minut. Aby zdjąć komorę z szkiełka przedmiotowego, należy najpierw umieścić szkiełko w uchwycie podstawy, a następnie przesunąć biały podnośnik przez uchwyt, aż zetknie się on z krawędzią studni.

Ostrożnie pociągnij komorę, aby zdjąć ją z preparasu. Użyj zakrytego czarnego pudełka, aby chronić preparaty przed światłem. Zamontuj preparaty, używając wolno twardniejącego medium antyblaknącego, i przykryj je szkiełkami nakrywkowymi.

Po pozostawieniu preparatów do wyschnięcia przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej, należy je zabezpieczyć lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Wyizolować jelito kręte myszy zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Następnie, za pomocą nożyczek, otworzyć jelito wzdłużnie.

Inkubować otrzymany przekrój tkanki w lodowatym buforze KBR nasyconym gazem, zawierającym 1 µM indometacyny, przez dziesięć minut. Przymocować za pomocą szpilek odcinek jelita o długości około 1 cm, stroną śluzową do dołu, do płytki zawierającej 0,5 cm grubą warstwę 7% agarozy lub utwardzonego elastomeru silikonowego. Używając stereomikroskopu sekcyjnego z oświetleniem dolnym, usunąć warstwy surowiczo-mięśniowe.

Następnie należy naciąć warstwę surowiczówkowo-mięśniową za pomocą skalpela z ostrzem typu feather. Używając precyzyjnej pęsety, należy unieść krawędź warstwy wzdłuż osi podłużnej jelita. Na koniec ostrożnie przymocuj śluzówkę do pinów suwaka.

Trzymać oddzieloną tkankę błony śluzowej za krawędzie, aby uniknąć jej rozerwania. Podczas mocowania oddzielonej błony śluzowej jelita cienkiego do pinezek na podstawce, należy zachować ostrożność, aby nie przerwać tkanki w miejscach wbijania pinezek oraz zminimalizować uszkodzenia krawędzi tkanki. Przed przystąpieniem do obróbki tkanki należy przygotować roztwór Krebsa napowietrzony mieszaniną 95% oxygen i 5% carbon dioxide.

Następnie wlej roztwór do komory Ussinga. Do kąpieli serozalnej dodaj 10 µM glukozy jako substratu energetycznego, a do kąpieli śluzówkowej 10 µM mannitolu w celu utrzymania równowagi osmotycznej. Następnie wsuń do komory element z zamontowaną błoną śluzową, aby wystawić zarówno stronę apikalną, jak i bazolateralną tkanki na działanie roztworu Krebsa.

Równoważyć tkankę jelita cienkiego w kąpieli przez dziesięć minut. Następnie poddać stronę apikalną obróbce wstępnej fluoksetyną w stężeniu 10 µM przez 30 minut w celu pomiaru strumienia z błony śluzowej do błony surowiczej. Na koniec poddać stronę bazolateralną tkanki działaniu TGF beta 1 w stężeniu 10 ng/mL przez jedną godzinę, a następnie inkubować stronę apikalną z trytowaną 5-HT w stężeniu 20 nM przez 30 minut.

Aby obliczyć szybkość przepływu z błony śluzowej do surowiczej, należy pobierać aliquoty o objętości 0,75 ml z rezerwuaru surowiczego, zastępując je identycznymi objętościami medium kąpielowego, aby zapobiec różnicom ciśnienia hydrostatycznego w obrębie błony śluzowej. W celu ilościowego oznaczenia trytowanej 5-HT nagromadzonej w tkance, należy usunąć błonę śluzową z prowadnicy. Przemyć ją raz lodowatym buforem KRB i umieścić w szklanej probówce hodowlanej.

Inkubować błonę śluzową w 0,5 ml 10% KOH przez noc w temperaturze 37 °C w celu lizy tkanki. Następnie zmierzyć radioaktywność w 150 µl aliquotach lizatów w trzech powtórzeniach, używając licznika scyntylacyjnego z cieczą. Przy użyciu metody Bradforda zmierzyć stężenie białka w aliquotach lizatów o objętości od trzech do pięciu µl.

Przedstawiono tutaj torbiele Caco-2 hodowane w kulturze 3D zabarwione na aktynę oraz torbiele Caco-2 3D zabarwione jednocześnie na aktynę, jądra komórkowe i białko SERT. SERT jest widoczny w błonie luminalnej oraz w przedziałach podapikalnych. Aby dodatkowo potwierdzić przewagę sfer Caco-2 3D nad monowarstwami Caco-2 2D, przeprowadzono analizę ekspresji białka SERT metodą western blot.

Wyniki wykazały zwiększoną ekspresję białka SERT w 3D sferach Caco-2 w porównaniu do 2D komórek Caco-2. Ostatecznie wykorzystano system komory Ussinga, aby wykazać, że TGF beta zwiększa przepływ od strony błony śluzowej do surowiczej, co odzwierciedla zwiększony wychwyt 5-HT z błony luminalnej oraz zwiększoną akumulację 5-HT zaobserwowaną w błonie śluzowej jelita krętego. Wnioski te są wspierane przez zaobserwowaną wrażliwość wychwytu 5-HT na leczenie fluoksetyną, co odpowiada ekspresji SERT na błonie luminalnej.

Po opanowaniu, ta technika oddzielania i montowania błony śluzowej jelita krętego może zostać wykonana w 15 minut. Przy stosowaniu tej procedury należy pamiętać, że po wyjęciu ze zwierzęcia preparat jelitowy pozacieleśnie ma ograniczoną żywotność, która może trwać do trzech godzin. Cysty Caco-2 3D mogą być wykorzystywane w różnych badaniach, takich jak zdarzenia transportu błonowego, ekspresja genów lub oddziaływania białko-białko transporterów nabłonkowych.

Po opracowaniu, technika 3D Caco-2 utorowała drogę badaczom w dziedzinie transportu jelitowego do badania ruchu płynów oraz patofizjologii chorób jelit. Należy pamiętać, że praca z substancjami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej (PPE) i odpowiednich procedur dekontaminacji. Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo w stanie hodować komórki Caco-2 w kulturach 3D oraz wykorzystywać te kultury do badania ekspresji transporterów nabłonkowych.

Będzie można również wykorzystać komorę Ussinga do badania funkcji transportu serotoniny w natywnym jelicie mysim.