Name: Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę Golgiego-Coxa do obrazowania neuronów z długimi drzewkami dendrytycznymi w grubych sekcjach mózgu gryzoni. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfologii neuronów w pojedynczych próbkach histologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Grant Discovery dla CDCB od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), grant na infrastrukturę badawczą John R. Evans Leaders Fund dla CDCB od Canada Foundation for Innovation (numer projektu CFI 30381) oraz przez Discovery Grant dla NJM od NSERC. ELL był wspierany przez stypendium dla absolwentów Ontario oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph. CDS był wspierany przez asystenturę naukową dla studentów studiów licencjackich z NSERC. ALM był wspierany przez stypendium Alexandra Grahama Bella z NSERC oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph.

W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice myszy szczepu CD1. Podobne barwienie można osiągnąć przy użyciu obu płci w różnym wieku. Zwierzęta doświadczalne były opiekowane zgodnie z zasadami i wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami, a protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Guelph.
1. Barwienie metodą Golgiego-Coxa
<ol>
	<li>Impregnacja mózgu metodą Golgiego-Coxa
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór Golgiego-Coxa składający się z 1% (m/v) dichromianu potasu, 0,8% (w/v) chromianu potasu i 1% (w/v) chlorku rtęci, rozpuszczając oddzielnie dichromian potasu i chromian potasu w wodzie wysokiej jakości. Wymieszaj roztwory, dodaj chlorek rtęci i przefiltruj końcowy roztwór za pomocą bibuły filtracyjnej klasy 1. Roztwór należy przechowywać w ciemności przez okres do jednego miesiąca.</li>
		<li>Znieczulij mysz za pomocą 5% izofluranu.</li>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez ścięcie głowy i szybko usuń mózg.</li>
		<li>Umieścić mózg w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej 17 ml roztworu Golgiego-Coxa i inkubować w ciemności w temperaturze RT przez 25 dni.</li>
		<li>Krioprotektoratuj mózg, umieszczając go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml krioprotektantu sacharozy (30% (w/v) sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24 godziny 
		UWAGA: Następujące opcjonalne trzy kroki mogą być zastosowane jako alternatywa dla głównego protokołu, w celu zamrożenia mózgu na tym etapie w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Zamroź cały mózg, zanurzając go w 200 ml izopentanu, który został wstępnie schłodzony na suchym lodzie.</li>
		<li>Umieścić zamrożony mózg w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w ciemności w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, rozmrozić mózg, umieszczając go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml krioprotektantu sacharozy w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcja mózgu
	<ol>
		<li>Usuń mózg z sacharozy i zablokuj go do podziału, odcinając móżdżek za pomocą żyletki i pozostawiając płaską krawędź na pozostałym ogonowym końcu mózgu.</li>
		<li>Podgrzej agar (3% (w/v) w wodzie), aż się rozpuści i pozostaw do ostygnięcia, aż osiągnie nieco wyższą temperaturę topnienia.</li>
		<li>Umieść mózg w małym jednorazowym naczyniu wagowym końcem ogonowym skierowanym do dołu i dodaj wystarczającą ilość stopionego agaru, aby przykryć mózg.</li>
		<li>Gdy agar zastygnie, odetnij nadmiar agaru, pozostawiając około 2 - 4 mm otaczając mózg i przyklej mózg do etapu wibratomu końcem ogonowym skierowanym w dół za pomocą niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego etylu.</li>
		<li> Wypełnij obszar wibratomu wystarczającą ilością krioprotektantu sacharozy, aby pokryć mózg, i podziel mózg na plasterki o grubości 400 - 500 μm (w zależności od badanego obszaru mózgu) przy użyciu częstotliwości drgań 86 Hz i prędkości posuwu ostrza 0,125 mm/s.</li>
		<li>Za pomocą małego pędzla umieść skrawki mózgu w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej dostępne w handlu wkładki z siatkowym dnem i wstępnie napełnionej 10 ml 6% (w/v) sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4.</li>
		<li>Inkubować sekcje w ciemności w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwijanie sekcji mózgu
	<ol>
		<li>Za pomocą wkładek z siatkowym dnem przenieś skrawki mózgu do nowego dołka zawierającego 5 ml 2% (w/v) paraformaldehydu (PBD) w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Wysiaduj na kołysaku poruszającym się z małą prędkością w ciemności przy RT przez 15 minut.</li>
		<li>Umyj skrawki dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Prać na bujaczku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść skrawki do nowej studzienki zawierającej 5 ml 2,7% (v/v) wodorotlenku amonu. Wysiaduj na kołysaku poruszającym się z małą prędkością w ciemności przy RT przez 15 minut.</li>
		<li>Umyj skrawki dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Prać na bujaczku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieś skrawki do nowej studzienki zawierającej 5 ml utrwalacza A (patrz tabela materiałów), który został rozcieńczony w wodzie 10 razy w stosunku do pierwotnie zakupionego stężenia. Wysiaduj na kołysce poruszającej się z małą prędkością w ciemności przy natężeniu kierunkowym przez 25 minut.</li>
		<li>Umyj skrawki dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Prać na bujaczku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż sekcji mózgu
	<ol>
		<li>Za pomocą małego pędzla zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych. Usuń nadmiar wody i agaru za pomocą pęsety i małej chusteczki. Upewnij się, że cały agar został usunięty przed przystąpieniem do odwadniania.</li>
		<li>Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 45 minut (sekcje 400 μm) lub 90 minut (sekcje 500 μm). 
		UWAGA: Czas i właściwy poziom wysuszenia ma kluczowe znaczenie i może być konieczne określenie w każdym laboratorium w zależności od temperatury otoczenia i poziomu wilgotności. Zbyt krótki czas schnięcia prowadzi do odpadania odcinków od szkiełek podczas kolejnych etapów odwadniania, a zbyt długi czas schnięcia prowadzi do pękania sekcji. Sekcje nadal będą wydawać się błyszczące przy odpowiednim poziomie wysuszenia.</li>
		<li>Skrawki zabarwić fioletem krezylowym, umieszczając szkiełka w słoikach do barwienia z kopliny, jak wskazano. 
		UWAGA: Ten opcjonalny krok może być zastosowany w przypadku odcinków, które nigdy nie były zamrażane, w celu barwienia jąder neuronalnych fioletem krezylowym. Odkryliśmy, że oczyszczanie i ponowne nawadnianie sekcji przed inkubacją w fiołku krezylowym prowadzi do równomiernego zabarwienia i niskiego tła we wszystkich sekcjach.
		<ol>
			<li>Umieścić w środku czyszczącym na 5 minut. Powtórzyć raz.</li>
			<li>Umieść w 100% etanolu na 5 minut. Powtórz raz.</li>
			<li>Umieścić 95% etanolu w wodzie, następnie 75% etanolu w wodzie, a następnie 50% etanolu w wodzie na 2 minuty każde.</li>
			<li>Umieść w wodzie na 5 minut.</li>
			<li>Umieścić 0,5% (m/v) fioletu krezylowego w wodzie na 7 min.</li>
			<li>Umieść w wodzie na 2 minuty. Powtórz raz.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwodnić sekcje, umieszczając szkiełka w słoikach do barwienia Coplin zgodnie ze wskazaniami.
		<ol>
			<li>Umieść 50% etanolu w wodzie, następnie 75% etanolu w wodzie, a następnie 95% etanolu w wodzie na 2 minuty każde.</li>
			<li>Umieść w 100% etanolu na 5 minut. Powtórz raz.</li>
			<li>Umieścić w klarowniku na 5 minut. Powtórzyć raz. 
			UWAGA: Te czasy odwodnienia i oczyszczania są wystarczające do przetworzenia mózgów myszy zgodnie z opisem w tym manuskrypcie. Jednak zaobserwowaliśmy w przypadku innych gatunków, w tym szczurów i krów, że ostatni etap oczyszczania może wymagać wydłużenia do 15 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odcinki szkiełek nakrywkowych za pomocą bezwodnego podłoża montażowego.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia poziomo w ciemności w temperaturze RT przez co najmniej 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie barwionych neuronów w grubych sekcjach mózgu
<ol>
	<li>Przechwytywanie stosów obrazów
	<ol>
		<li>Włącz żarówkę mikroskopu, kamerę i kontroler sceny.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie mikroskopu (np. Neurolucida).</li>
		<li>Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.</li>
		<li>Uchwyć szerokokątny obraz 2D sekcji mózgu za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, takiego jak 1,25X 0,4 N.A. PlanAPO lub 4X 0,16 N.A.
		<ol>
			<li>Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym czas ekspozycji i balans bieli.</li>
			<li>Utwórz punkt odniesienia, klikając lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu sekcji</li>
			<li>Przechwyć obraz, wybierając opcję "uzyskaj pojedynczy obraz" w oknie akwizycji obrazu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uchwyć stosy obrazów o średniej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujące neurony za pomocą obiektywu 10X 0,3 N.A. UPlan FL N.
		<ol>
			<li>Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.</li>
			<li>Ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji i wybierając "ustaw" obok "góry stosu" w oknie akwizycji obrazu, a następnie skupiając się na dole sekcji i wybierając "ustaw" obok "na dole stosu" w oknie akwizycji obrazu.</li>
			<li>Ustaw odległość kroku na 5 μm, wpisując "5 μm" obok "odległość między obrazami" w oknie akwizycji obrazu.</li>
			<li>Przechwyć stos obrazów, wybierając opcję "uzyskaj stos obrazów" w oknie akwizycji obrazu.</li>
			<li>Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie o co najmniej 10% w osiach X i Y.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uchwyć stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości obszaru zawierającego neuron będący przedmiotem zainteresowania, używając obiektywu 30X 1,05 N.A. z olejem silikonowym.
		<ol>
			<li>Nałóż 3-4 krople silikonowego olejku immersyjnego na szkiełko i umieść obiektyw nad szkiełkiem, upewniając się, że obiektyw ma kontakt z olejkiem.</li>
			<li>Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.</li>
			<li>Ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji i wybierając "ustaw" obok "góry stosu" w oknie akwizycji obrazu, a następnie skupiając się na dole sekcji i wybierając "ustaw" obok "na dole stosu" w oknie akwizycji obrazu.</li>
			<li>Ustaw odległość kroku na 1 μm, wpisując "1 μm" obok "odległość między obrazami" w oknie akwizycji obrazu.</li>
			<li>Przechwyć stos obrazów, wybierając opcję "uzyskaj stos obrazów" w oknie akwizycji obrazu.</li>
			<li>Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie o co najmniej 10% w osiach X i Y.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zapisz plik danych i zapisz wszystkie pliki obrazów w formacie TIFF do przetwarzania zewnętrznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie obrazów i montaży obrazów z projekcją Z
	<ol>
		<li>Tworzenie obrazów z projekcją Z w ImageJ
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie ImageJ z zainstalowaną wtyczką Bio-Formats.</li>
			<li>Wybierz "Wtyczki" -> "Bio-formaty" -> "Importer bio-formatów".</li>
			<li>Wybierz plik stosu obrazów, który chcesz otworzyć.</li>
			<li>Po otwarciu pliku zmień format na RGB, wybierając "Obraz" -> "Typ" -> "Kolor RGB".</li>
			<li>Utwórz projekcję Z, wybierając "Obraz" -> "Stosy" -> "Projekt Z...".</li>
			<li>Zapisywanie dwuwymiarowego obrazu w projekcji Z jako pliku TIFF.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Stwórz dwuwymiarowy montaż obrazu całego obszaru zainteresowania.
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie (np. Adobe Photoshop).</li>
			<li>Wybierz "Plik" -> "Automatyzuj" -> "Photomerge".</li>
			<li>Wybierz "Przeglądaj", a następnie dodaj wszystkie pliki obrazów do scalenia.</li>
			<li>Upewnij się, że wybrano opcję "Łącz obrazy razem", a następnie wybierz "OK".</li>
			<li>Zapisz wynikowy obraz montażowy całego obszaru zainteresowania jako plik TIFF.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Golgi, C. <a target="_blank" href="http://ppp.unipv.it/camillogolgi/pdf/Sullasostanza%20grigia.pdf">Sulla struttura della sostanza grigia del cervello.</a> Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).</li>
<li>Cox, W. H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF02954290">Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen.</a> Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+Staining+Step+by+Step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox Staining Step by Step.</a> Front Neuroanat. 10, 38(2016).</li>
<li>Levine, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+thin+tissue+Golgi-Cox+impregnation%3A+fast%2C+reliable+methods+for+multi-assay+analyses+in+rodent+and+non-human+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain.</a> J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).</li>
<li>Ranjan, A., Mallick, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+consistent+and+reliable+Golgi-Cox+staining+in+significantly+reduced+time%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time.</a> Front Neurosci. 1, 157(2010).</li>
<li>Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+vibratome+sectioning+of+Golgi-Cox+stained+whole+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain.</a> J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Narayanan, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraisal+of+the+effect+of+brain+impregnation+duration+on+neuronal+staining+and+morphology+in+a+modified+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method.</a> J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocampus+makes+a+significant+contribution+to+experience-dependent+neocortical+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity.</a> Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).</li>
<li>Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+binge-like+alcohol+exposure+decreases+dendritic+complexity+while+increasing+the+density+of+mature+spines+in+mPFC+Layer+II%2FIII+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons.</a> Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressive-like+behaviours+and+decreased+dendritic+branching+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+mice+with+tumors%3A+A+novel+validated+model+of+cancer-induced+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression.</a> Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).</li>
<li>Frauenknecht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+experimental+antiphospholipid+syndrome+display+hippocampal+dysfunction+and+a+reduction+of+dendritic+complexity+in+hippocampal+CA1+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).</li>
<li>Camacho-Abrego, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangement+of+the+dendritic+morphology+of+the+neurons+from+prefrontal+cortex+and+hippocampus+after+subthalamic+lesion+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats.</a> Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).</li>
<li>Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+changes+in+dendritic+structure+and+complexity+in+the+adult+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus.</a> Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).</li>
<li>Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+alpha5+subunits+drive+developmental+changes+in+the+activation+and+morphology+of+prefrontal+cortex+layer+VI+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons.</a> Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).</li>
<li>Lytton, W. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLytton%2C+WW+%22From+computer+to+brain+%3A+foundations+of+computational+neuroscience%22">From computer to brain : foundations of computational neuroscience</a>. , Springer. (2002).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd, Academic. (2001).</li>
<li>Ha, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi-Cox+method+with+counterstain+for+the+study+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses.</a> Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+coeruleus%3A+a+cytoarchitectonic%2C+Golgi+and+immunohistochemical+study+in+the+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat.</a> Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).</li>
<li>Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+combining+Golgi+and+Nissl+staining+to+study+neuronal+morphology+and+cytoarchitecture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture.</a> J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy tutaj protokół barwienia Golgiego-Coxa wraz z dwoma przydatnymi wariantami do wizualizacji neuronów w grubych sekcjach mózgu. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, zastosowanie obiektywu o wysokiej rozdzielczości, który ma dużą odległość roboczą 800 μm, pozwala na wiarygodną wizualizację całych neuronów na całej głębokości odcinków mózgu wyciętych na 500 μm. To badanie stosunkowo grubych skrawków mózgu zwiększa prawdopodobieństwo, że barwione neurony dowolnego typu są w pełni zawarte w wycinku, co jest szc...

Wizualizacja pojedynczych neuronów w próbkach tkanek pozwala na analizę in situ cech morfologicznych neuronów, co znacznie poszerzyło nasze zrozumienie mózgu i tego, jak mogą na niego wpływać choroby endogenne lub egzogenne czynniki środowiskowe. Metoda barwienia Golgiego-Coxa jest opłacalnym, stosunkowo prostym sposobem barwienia losowej próbki neuronów w mózgu. Po raz pierwszy opracowana przez Golgi1 i zmodyfikowana przez Cox2 w 1800 roku, naukowcy udoskonalili tę technikę na przestrzeni lat, aby uzyskać wyraźne, dobrze wybarwione neurony, które można wykorzystać do wizualizacji i ilościowego określenia zarówno morfologii drzew dendrytycznych, jak i gęstości kręgosłupa3,4,5,6,7,8,9.
Głównym technicznym czynnikiem dla wizualizacji zabarwionych neuronów w sekcjach mózgu jest maksymalna grubość warstwy, która jest ograniczona przez odległość roboczą dostępnych obiektywów mikroskopowych o dużym powiększeniu/wysokiej rozdzielczości. Typowe obiektywy olejowe w zakresie 60 - 100X zapewniają doskonałą rozdzielczość, ale są ograniczone przez odległości robocze, które zwykle nie są większe niż 200 μm. Wycinki mózgu wycięte w zakresie 200 μm mogą być wystarczające do wizualizacji pewnych typów neuronów, które mogą być zawarte w tym wycinku, na przykład neurony piramidowe w płytkich warstwach kory mózgowej10,11,12, neurony piramidowe w regionie CA1 hipokampa13,14 oraz komórki ziarniste w zakręcie zębatym hipokampa15. Neurony ze stosunkowo dłuższymi drzewami dendrytycznymi, takimi jak neurony piramidalne w głębokich warstwach kory mózgowej, które dla myszy mogą rozciągać się na więcej niż 800 μm od ciała komórki16, stanowią większe wyzwanie, ponieważ mózgi musiałyby być podzielone pod idealnym kątem, aby pomieścić całe drzewo dendrytowe w warstwach 200 μm. Może to nie być nawet wykonalne, jeśli dendryt lub którakolwiek z jego gałęzi rozciąga się w kierunku rostralnym lub ogonowym. Chociaż możliwe jest rozwiązanie tego ograniczenia poprzez śledzenie neuronu w wielu sąsiednich sekcjach mózgu, takie podejście wprowadza poważne wyzwanie techniczne w dokładnym dopasowaniu sekcji do śledzenia17. Bardziej praktycznym podejściem byłaby wizualizacja całych neuronów zawartych w sekcjach mózgu, które są cięte na większą grubość.
Przedstawiamy tutaj technikę barwienia neuronów w obrębie 400 - 500 μm grubych odcinków mózgu myszy za pomocą metody Golgiego-Coxa oraz wizualizacji ich morfologii za pomocą obiektywu o wysokiej rozdzielczości z olejem silikonowym, który ma odległość roboczą 800 μm. Protokół impregnacji i przetwarzania Golgiego-Coxa, który opisujemy, jest zmodyfikowany w stosunku do jednego z najczęściej cytowanych współczesnych protokołów w literaturze6. Nasze podejście z grubymi sekcjami mózgu ma tę zaletę, że zwiększa prawdopodobieństwo zidentyfikowania neuronów dowolnego typu, które są w pełni zawarte w sekcji. Oprócz głównego protokołu przedstawiamy również dwie odmiany, które zapewniają wyjątkowe korzyści: (1) barwienie Golgiego-Coxa za pomocą fioletu krezylowego na powierzchni zamontowanych sekcji, w celu określenia granic regionów mózgu i identyfikacji warstw kory mózgowej, oraz (2) barwienie Golgiego-Coxa z pośrednim etapem zamrażania w celu długotrwałego przechowywania zaimpregnowanych całych mózgów przed sekcją i ostatecznym przetwarzaniem.

<table><tbody><tr><td>dwuchromian potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P188-100</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>chromian potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P220-100</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>chlorek rtęci</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25423</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>bibuła filtracyjna Whatman klasy 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>1001-185</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada</td><td></td><td></td>CP0406V2</tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Bioshop Kanada</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>jednozasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5011-500G</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9390-500G</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>izopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC126470010</td><td>Znany również jako 2-metylobutan; niebezpieczny</td></tr><tr><td>agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296-100G</td><td></td></tr><tr><td>mała waga naczynie</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>wibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1b</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli tkankowych z siatkowym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-214</td><td></td></tr><tr><td>paraformadelhyd (PFA), 16%</td> <td>Mikroskop elektronowy Sciences</td><td>15710-S</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>wodorotlenek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>Niebezpieczny</td></tr><tr><td>Kodak Fixative A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7542</td><td></td></tr><tr><td>superfrost plus prowadnice</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Środek czyszczący CitroSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-143-975</td><td></td></tr><tr><td>bezwodny alkohol etylowy</td><td>Alkohole handlowe</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>fioletu krezylowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1791</td><td></td></tr><tr><td>permount</td> Mikroskop pionowy <td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>model</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Olympus BX53kamera kolorowa, 12-bitowa</td><td>MBF Biosciences</td><td>DV-47d</td><td>QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td></tr><tr><td>Mikroskop 3D zmotoryzowany stolik, kontroler i enkoder</td><td>MBF Biosciences</td><td>N/A</td><td>Dostarczony i zintegrowany z mikroskopem przez MBF Biosciences</td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy 4X</td><td>Olympus</td><td>4x 0.16 N.A. UplanSApo</td><td></td></tr><tr><td>10X Obiektyw mikroskopowy</td><td>Olympus</td><td>10x 0.3 N.A. UPlan FL N&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy 30x</td><td>Olympus</td><td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy 60X</td><td>Olympus</td><td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td><td></td></tr><tr><td>silikonowy olejek immersyjny</td><td>Olympus</td><td>Z-81114</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Neurolucida</td><td>MBF Biosciences</td><td>Wersja 10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>U.S. National Institutes of Health</td><td>Aktualna wersja</td><td>Z zainstalowaną wtyczką OME Bio-Formats</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>PhotoshopAdobe</td><td>w wersji CS6</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą golgiego-coxa

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Metoda barwienia neuronów metodą Golgiego-Coxa jest stosowana od ponad dwustu lat, aby poszerzyć nasze zrozumienie morfologii neuronów w histologicznych próbkach mózgu. Chociaż z praktycznego punktu widzenia preferowane jest przygotowanie skrawków mózgu o jak największej grubości, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa identyfikacji barwionych neuronów, które są w pełni zawarte w pojedynczych sekcjach, podejście to jest ograniczone z technicznego punktu widzenia przez odległość roboczą obiektywów mikroskopowych o dużym powiększeniu. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia neuronów za pomocą metody Golgiego-Coxa w sekcjach mózgu myszy, które są cięte na grubość 500 μm, oraz wizualizacji neuronów na całej głębokości tych odcinków za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju silikonowym o wysokiej rozdzielczości 30X 1,05 N.A., który ma odległość roboczą 800 μm. Zgłaszamy również dwa użyteczne warianty tego protokołu, które mogą być wykorzystane do przeciwdziałania barwieniu powierzchni zamontowanych skrawków mózgu barwieniem Nissl w kolorze fioletu krezylo-fioletowego lub do zamrażania całych mózgów w celu długotrwałego przechowywania przed sekcją i ostatecznym przetwarzaniem. Główny protokół i jego dwa warianty wytwarzają barwione grube odcinki mózgu, w których pełne drzewa dendrytyczne neuronów i kolce dendrytowe mogą być wiarygodnie wizualizowane i określane ilościowo.

Niniejszy protokół barwienia metodą Golgiego-Coxa oraz jego dwa opisane warianty opcjonalne mogą być stosowane do wizualizacji pojedynczych neuronów w przekrojach mózgu o grubości 400 - 500 μm. Reprezentatywne montaże obrazów z dwuwymiarowych projekcji Z, wykonane przy użyciu obiektywu 10X&#160;i kroków 5 μm w osi Z, przedstawiono na Rysunku 1: A1 - C1&#160;dla dużego obszaru koronalnych przekrojów mózgu, obejmującego obszar 1 przedniej kory zakrętu obręczy oraz wtórną ko...

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie skuteczności działania danej terapii na morfologię neuronów w mózgu gryzonia. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak analiza prawidłowej oraz eksperymentalnie zmodyfikowanej morfologii neuronów w różnych obszarach mózgu gryzonia. Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie prawdopodobieństwa identyfikacji i wizualizacji znakowanych neuronów, które znajdują się w całości w obrębie pojedynczych próbek histologicznych.Rozpocznij barwienie metodą Golgi-Cox, umieszczając świeży mózg myszy w 20 mililitrowej szklanej fiolce do scyntylacji zawierającej 17 mililitrów roztworu do barwienia Golgi-Cox. Chroniąc przed światłem, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 dni. Po upływie okresu inkubacji poddaj mózg krioprotekcji, umieszczając go w 40 mililitrach krioprotektanta sacharozowego i inkubując w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Po inkubacji w sacharozie mózg można zamrozić do długotrwałego przechowywania lub natychmiast poddać procesowi blokowania w celu wykonania przekrojów, zgodnie z instrukcją przedstawioną w następnej sekcji filmu. W przypadku zamrażania, z

imaging-neurons-within-thick-brain-sections-using-the-golgi-cox-method

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje proces wizualizacji interneuronu wypełnionego biocytyną w sekcji hipokampa szczura, podkreślając jego tożsamość neurochemiczną dzięki zastosowaniu specyficznych przeciwciał i mikroskopii fluorescencyjnej.

Barwienie immunologiczne interneuronów w odcinku hipokampa szczura

Źródło: Louth, E. L.,  i inni. Obrazowanie neuronów w grubych odcinkach mózgu metodą Golgiego-Coxa. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje obrazowanie neuronów w grubym fragmencie mózgu zabarwionym metodą Golgiego-Coxa, ustawiając górną i dolną granicę ostrości oraz rejestrując nakładające się obrazy. Obrazowanych jest wiele lokalizacji, aby zapewnić szczegółowe projekcje neuronów, które są łączone w celu stworzenia reprezentacji 3D.

Obrazowanie mikroskopowe neuronów w wycinku mózgu myszy przy użyciu metalicznego barwienia metodą Golgiego-Coxa

Ten artykuł opisuje procedury stymulacji dotykowej szczeniąt szczurów i późniejszego barwienia morfologii neuronów metodą Golgiego-Coxa. Stymulacja dotykowa to pozytywne doświadczenie, które podaje się w okresie okołoporodowym poprzez głaskanie szczeniąt domowym miotełkiem do kurzu. Barwienie metodą Golgiego-Coxa jest niezawodną procedurą pozwalającą na wizualizację całych neuronów.

Wizualizacja wpływu pozytywnego wczesnego doświadczenia, stymulacji dotykowej, na morfologię dendrytyczną i łączność synaptyczną za pomocą barwienia Golgiego-Coxa

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Ten protokół opisuje zakrojone na szeroką skalę rekonstrukcje selektywnych populacji neuronów, oznaczonych po wstecznym zakażeniu zmodyfikowanym wirusem wścieklizny wyrażającym markery fluorescencyjne, oraz niezależne, bezstronne analizy klastrów, które umożliwiają kompleksową charakterystykę wskaźników morfologicznych wśród różnych podklas neuronów.

Rekonstrukcje na dużą skalę i niezależne, bezstronne grupowanie oparte na wskaźnikach morfologicznych w celu klasyfikacji neuronów w selektywnych populacjach

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Poznaj metodę Golgiego-Coxa do obrazowania neuronów z długimi drzewkami dendrytycznymi w grubych sekcjach mózgu gryzoni. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfologii neuronów w pojedynczych próbkach histologicznych.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Przeglądaj więcej filmów