Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Ogólnym celem tej procedury jest określenie skutecznego leczenia morfologii neuronów w mózgu gryzonia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak normalna i eksperymentalnie manipulowana morfologia neuronów w różnych regionach mózgu gryzoni. Technika ta ma główną zaletę polegającą na zwiększeniu prawdopodobieństwa identyfikacji i wizualizacji znakowanych neuronów, które są w pełni zawarte w pojedynczych próbkach histologicznych.

Rozpocznij barwienie Golgiego-Coxa, umieszczając świeży mózg myszy w 20-mililitrowej szklanej fiolce scyntylacyjnej zawierającej 17 mililitrów roztworu Golgiego-Coxa. Chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 dni. Po upływie okresu inkubacji krioenzym chroni mózg, umieszczając go w 40 mililitrach krioprotektantu sacharozowego i inkubując w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Po inkubacji w sacharozie mózg może zostać zamrożony do długotrwałego przechowywania lub natychmiast zablokowany do sekcji, jak pokazano w następnej części filmu. W przypadku zamrożenia zanurz cały mózg w 200 mililitrach izopentanu, który został wstępnie schłodzony na suchym lodzie. Następnie umieść zamrożony mózg w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i przechowuj w ciemności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Na początek usuń mózg z sacharozy. I użyj żyletki, aby zablokować go do cięcia, odcinając móżdżek, pozostawiając płaską krawędź na pozostałym ogonowym końcu mózgu. Mózg musi być zablokowany pod precyzyjnym kątem, aby zapewnić, że neurony będące przedmiotem zainteresowania są w pełni zawarte w powstałych sekcjach.

Na przykład używamy płaszczyzny koronalnej, która jest idealnie prostopadła do osi ogonowej rostralnej dla neuronów piramidowych kory mózgowej. Następnie podgrzej agar, aż się rozpuści. I pozwól mu ostygnąć, aż będzie nieco powyżej temperatury topnienia.

Następnie umieść mózg w małym jednorazowym naczyniu wagowym z końcem ogonowym skierowanym w dół. Dodaj stopiony agar, aby przykryć mózg. Gdy agar stężeje, odetnij nadmiar, pozostawiając około dwóch do czterech mililitrów otaczających mózg.

Następnie użyj niewielkiej ilości cyjanoakrylanu etylu, aby przykleić mózg do etapu wibratomu z ogonowym końcem skierowanym w dół. Wypełnij obszar etapu wibratomu wystarczającą ilością krioprotektantu sacharozy, aby pokryć mózg. Następnie należy podzielić mózg na sekcje o grubości od 400 do 500 mikronów, w zależności od badanego obszaru mózgu.

Za pomocą małego pędzla umieść skrawki mózgu w studzienkach sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej wkładki z siatki i wstępnie wypełnionej buforem fosforanu M sacharozy. Chronić przed światłem podczas cięcia. Po zakończeniu krojenia inkubuj sekcje w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Za pomocą dolnych wkładek z siatki przenieś sekcje mózgu do nowej studzienki zawierającej pięć mililitrów paraformaldehydu w buforze fosforanowym. Inkubować na bujaku poruszającym się z małą prędkością w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Umyj sekcje dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających pięć mililitrów wody.

Chronić przed światłem i prać z umiarkowaną prędkością w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie przenieś skrawki do nowej studzienki zawierającej pięć mililitrów wodorotlenku amonu. Kołysz się powoli w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Umyj sekcje dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających pięć mililitrów wody. Prać na bujaku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieść skrawki do nowej studzienki zawierającej pięć mililitrów rozcieńczonego utrwalacza A. Inkubować na kołysce poruszającej się z małą prędkością w ciemności w temperaturze pokojowej przez 25 minut.

Umyj sekcje w wodzie dwa razy niż poprzednio. Użyj małego pędzla, aby umieścić skrawki na szkiełku mikroskopowym, a następnie użyj pęsety i małej chusteczki, aby usunąć nadmiar wody i agaru. Upewnij się, że cały agar został usunięty przed przystąpieniem do etapów odwadniania.

Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Odpowiedni czas schnięcia ma kluczowe znaczenie i powinien być określony dla każdego laboratorium. Zbyt krótki czas może spowodować, że sekcje spadną ze zjeżdżalni podczas etapów odwadniania, a zbyt długi czas może spowodować pękanie sekcji.

Po wyschnięciu najpierw umieść szkiełka w środku czyszczącym na pięć minut. Umieść szkiełka w 100% etanolu na pięć minut. Następnie przechodź przez serię malejących stężeń etanolu przez dwie minuty każda.

Po serii alkoholowej umieść szkiełka w wodzie na pięć minut. Następnie zabarwić 0,5% fioletu krezylowego w wodzie przez siedem minut. Po plamie z fioletu krezylowego umieść szkiełka w wodzie na dwie minuty.

Następnie odwadniaj sekcje za pomocą serii zwiększających się stężeń alkoholu przez dwie minuty każda. Następnie dwa prania w 100% etanolu przez pięć minut. Umieścić w środku czyszczącym na pięć minut.

Na koniec dodaj bezwodne podłoże montażowe i umieść szkiełko nakrywkowe na sekcjach. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia poziomo w ciemności w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć dni. Aby uchwycić stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujący nas neuron, najpierw wybierz w mikroskopie obiektyw zanurzeniowy z olejkiem silikonowym 30X 1,05 NA.

Następnie nałóż trzy do czterech kropli silikonowego olejku immersyjnego na szkiełko. Umieść obiektyw na szkiełku, zapewniając kontakt między obiektywem a olejem. Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli, w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.

Następnie ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji, a następnie wybierając pozycję ustaw obok góry stosu w oknie akwizycji obrazu. Następnie skoncentruj się na dole sekcji i wybierz pozycję ustaw obok dołu stosu. Ustaw odległość kroku na jeden mikron, wprowadzając jeden mikron obok odległości między obrazami w oknie akwizycji obrazu.

Na koniec przechwyć stos obrazów, wybierając opcję Pobierz stos obrazów w oknie akwizycji obrazu. Powtórz poprzednie kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie na co najmniej 10% w osiach X i Y. Ten obraz kory mózgowej jest scaloną projekcją Z stosów obrazów uzyskanych z odcinka o grubości 500 mikronów przy użyciu obiektywu 10X.

Tkanka na tym zdjęciu została przetworzona przy użyciu głównego protokołu All Fresh. Obszar oznaczony czerwonym kwadratem został zobrazowany za pomocą 30-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem silikonowym i uzyskano stos obrazów z projekcją Z o wyższej rozdzielczości. Czerwona strzałka pokazuje dwuwymiarową projekcję Z neuronu, który został prześledzony na podstawie stosu obrazów o wysokiej rozdzielczości 30X.

W tym przypadku zastosowano świeży wariant protokołu z barwieniem fioletem krezylowym. Ten obraz o wyższej rozdzielczości pokazuje sekcję zabarwioną na fiolet krezylowy. I to jest uzyskane śledzenie neuronów.

Ostatecznie tkanka ta została przetworzona przy użyciu wariantu protokołu, w którym mózgi są zamrażane po zapłodnieniu Golgiego-Coxa. W tym przypadku wcześniej zamrożona tkanka jest widoczna w wyższej rozdzielczości. I po raz kolejny uzyskuje się wysokiej jakości dwuwymiarową projekcję Z śledzenia neuronów.

Technikę tę można wykonać w ciągu jednego miesiąca, a etapy przetwarzania i obrazowania zostaną zakończone w ciągu ostatniego tygodnia. Mózgi można alternatywnie zamrozić po impregnacji metodą Golgiego-Coxa, co pozwala na zakończenie przetwarzania i obrazowania w późniejszym terminie. Zgodnie z tą procedurą, neuronaukowcy mogą wykorzystać przechwycone obrazy do przeprowadzenia szczegółowych analiz morfologicznych, takich jak złożoność dendrytów lub gęstość kręgosłupa, w celu określenia, w jaki sposób eksperymentalna manipulacja może zmienić strukturę neuronów w mózgu.