Name: Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Naucz się wykonywać bezreferencyjną mikroskopię sił trakcyjnych z wykorzystaniem litografii wielofotonowej i fluorescencyjnych markerów w hydrogelach PEG. Ta metoda upraszcza pomiar naprężeń 3D i obliczanie sił komórkowych dla badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O. A. Banda był wspierany przez fundusze ze stypendium NSF IGERT SBE2 (1144726), fundusze na start zapewnione przez University of Delaware oraz National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). JHS jest wspierany przez fundusze z National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) oraz National Science Foundation CAREER Award Program (1751797). Dostęp do mikroskopii był wspierany przez granty z NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) i stanu Delaware. Mikroskop oświetlenia strukturalnego został zakupiony dzięki środkom z Federalnego Programu Grantów Badawczo-Rozwojowych Stanu Delaware (16A00471). Mikroskop konfokalny LSM880 używany do dwufotonowej laserowej litografii skaningowej został zakupiony w ramach wspólnego grantu na oprzyrządowanie (S10 OD016361).

<ol><li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li>
<li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Cyclin+D1%2C+p27Kip1%2C+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li>
<li>Álvarez-González, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del Álamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li>
<li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li>
<li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 103(2015).</li>
<li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li>
<li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li>
<li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+reference+free+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li>
<li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles%3A+An+approach+to+isolate+mechanical+force%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li>
<li>Desai, R. a, Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Post-Array-Detectors+%28mPADs%29%3A+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. (0), 1-5 (2007).</li>
<li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li>
<li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+flow+in+augmented+networks+%28AFAN%29%3A+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li>
<li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li>
<li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li>
<li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li>
<li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived%2C+Biomimetic+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li>
<li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li>
<li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon+Nanomaterials+for+Biomedical+Applications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li>
<li>Banda, O. A., Slater, J. H. Slater Lab Code Repositories. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019).</li>
<li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li>
<li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., López-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution%2C+large+deformation+3D+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li>
<li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Lithography%22%5BJournal%5D)">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem tego protokołu jest zapewnienie przepływu pracy, który łagodzi wiele trudności związanych z generowaniem i analizą danych TFM. Po przygotowaniu, hydrożele z fotowzorem są proste w użyciu, wymagają jedynie znajomości standardowych praktyk hodowli tkankowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Aspekt bez referencji umożliwia bezproblemową nawigację po hydrożelach wypełnionych komórkami i eliminuje kłopotliwe etapy przetwarzania obrazu, takie jak rejestracja obrazu między obrazami referencyjnymi a zdeformowanymi. Uzyskana...

Mikroskopia siły trakcyjnej (TFM) to proces przybliżania trakcji komórkowych za pomocą interpolowanych pól przemieszczenia markerów odniesienia generowanych przez przylegającą i kurczliwą komórkę. Korzystając z TFM, można badać wpływ sygnałów mechanicznych w środowisku zewnątrzkomórkowym na ważne procesy komórkowe, takie jak proliferacja, różnicowanie i migracja1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. Niestety, wiele istniejących podejść może być trudnych do wdrożenia lub wymagać znajomości wysoce wyspecjalizowanych narzędzi analitycznych i obliczeniowych, co utrudnia korzystanie z TFM niedoświadczonym badaczom. Opisujemy metodologię generowania platformy TFM, która eliminuje niektóre trudności w analizie, a jednocześnie zapewnia pozyskiwanie danych o wysokiej przepustowości.
Spośród istniejących metod TFM, najczęściej używane do ilościowego określania naprężeń materiału polegają na włączeniu małych markerów fluorescencyjnych (zazwyczaj nano- lub mikrometrowych kulek fluorescencyjnych) do odkształcalnego hydrożelu, takiego jak poliakrylamid (PAA) lub poli(glikol etylenowy) diakrylan (PEGDA)13,14,15. Te podejścia oparte na koralikach zapewniają możliwość gęstego grupowania znaczników odniesienia wokół komórki będącej przedmiotem zainteresowania, aby zmaksymalizować próbkowanie przemieszczenia. Niestety, rozmieszczenie kulek w całym hydrożelu nie może być bezpośrednio kontrolowane, więc organizacja przestrzenna jest losowa. To losowe rozmieszczenie prowadzi do problemów, takich jak koraliki, które są zbyt blisko siebie, aby można je było dokładnie rozwiązać, lub tak się rozprzestrzeniają, że plamy podłoża dostarczają danych o niskiej jakości. Niemożność przewidzenia, gdzie znajdują się markery referencyjne w przypadku braku komórek, stwarza również ograniczenie, zgodnie z którym dla każdego zebranego zestawu danych trakcyjnych komórek musi być również uchwycony dodatkowy obraz referencyjny leżących poniżej markerów w stanie swobodnym. Obraz referencyjny jest wymagany, aby przemieszczenie w obrazie naprężonym można było przybliżyć jako różnicę między obrazami naprężonymi i nieobciążonymi. Aby osiągnąć stan relaksu, mierzone komórki są albo chemicznie zrelaksowane, albo całkowicie usunięte. Proces ten często uniemożliwia uzyskanie dalszych pomiarów eksperymentalnych, hamuje długoterminowe badania komórek i ogranicza przepustowość. Obraz referencyjny wymaga również technik rejestracji obrazu, aby uwzględnić dryft, który mógł wystąpić podczas eksperymentów, często prowadząc do kłopotliwego ręcznego dopasowywania obrazów stanu naprężenia do obrazów referencyjnych.
Inne metody TFM uznane za wolne od odniesień, implementują pewną formę kontroli nad dystrybucją znaczników referencyjnych, czy to poprzez litografię w wysokiej rozdzielczości, druk mikrokontaktowy, czy mikroformowanie16,17,18,19,20. TFM bez odniesień osiąga się przy założeniu, że stan zrelaksowany dla każdego markera odniesienia można przewidzieć na podstawie tego, jak pozycje markerów zostały określone podczas procesu wytwarzania. Metody te pozwalają na pełne uchwycenie stanu napięcia komórki w ramach pojedynczego przechwytywania obrazu, w którym zmierzone są przemieszczenia znaczników odniesienia w porównaniu z domniemanym odniesieniem, które można wywnioskować z geometrii znacznika odniesienia. Chociaż spójność w umieszczaniu znaczników jest zwykle osiągana przy użyciu tych platform, na ogół cierpią one na własne niedociągnięcia w stosunku do powszechnie stosowanych podejść opartych na koralikach, w tym: 1) zmniejszona rozdzielczość trakcji; 2) zmniejszona dokładność przemieszczeń poza płaszczyzną (w niektórych przypadkach całkowita niemożność pomiaru); oraz 3) zmniejszona możliwość dostosowania podłoży i materiałów platformy (np. prezentacja ligandów, właściwości mechaniczne).
Aby zaradzić tym niedociągnięciom, zaprojektowaliśmy nową platformę TFM bez referencji. Platforma wykorzystuje chemię aktywowaną wielofotonami do sieciowania niewielkiej objętości fluoroforu w określonych lokalizacjach 3D w hydrożelu, które służą jako markery referencyjne do pomiaru naprężenia materiału. W ten sposób zaprojektowaliśmy platformę, która działa podobnie do podejść opartych na koralikach, ale ze znaczącą korzyścią polegającą na tym, że znaczniki odniesienia są zorganizowane w siatkowe tablice, co pozwala na śledzenie odkształceń materiału bez odniesień. Ta nieruchomość bez referencji ma wiele zalet. Przede wszystkim pozwala na nieinwazyjne monitorowanie stanów trakcji komórkowej (tj. omija konieczność rozluźniania lub usuwania komórek w celu uzyskania pozycji odniesienia przemieszczonych markerów odniesienia). To był nasz główny cel przy projektowaniu tego systemu, ponieważ zamierzaliśmy włączyć inne metody analityczne w połączeniu z TFM, co może być trudne w przypadku destrukcyjnych podejść TFM do punktu końcowego. Po drugie, użycie domniemanego odniesienia opartego na tablicach siatkowych pozwala na niemal całkowitą automatyzację analizy przemieszczeń. Regularność tablic tworzy przewidywalny przepływ pracy, w którym występowanie wyjątkowych przypadków (tj. danych z komórek próbki zawierających nieprzewidziane artefakty, takie jak nieoptymalne odstępy między znacznikami lub niezgodności rejestracji) może być utrzymane na minimalnym poziomie. Po trzecie, rezygnacja z konieczności uzyskiwania obrazu referencyjnego zapewnia swobodę monitorowania wielu komórek na jednej próbce przez dłuższy czas. Kontrastuje to z tradycyjnymi podejściami opartymi na kulkach, w których, w zależności od wierności zautomatyzowanych ruchów stolika mikroskopu, błędy w pozycjonowaniu mogą się kumulować i zwiększać trudności w prawidłowym rejestrowaniu obrazów referencyjnych na obrazach napięcia komórek. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta ułatwia większą przepustowość w gromadzeniu danych o napięciu komórkowym.
Dzięki temu protokołowi mamy nadzieję zapoznać czytelników z techniką dwufotonowej, laserowej litografii skaningowej, którą zaimplementowaliśmy do wygenerowania tej niewymagającej odniesień platformy TFM do pomiaru składowych trakcyjnych w płaszczyźnie i poza płaszczyzną generowanych przez komórki rozsiane na powierzchni. W tym protokole nie uwzględniono syntezy niektórych składników monomerycznych. Ogólnie rzecz biorąc, reakcje te obejmują prawie identyczne schematy reakcji syntezy "jednogarnkowej" opisane wcześniej21, a alternatywy dla tych produktów można również kupić. Naszym celem jest również zapoznanie czytelników z narzędziami opartymi na oprogramowaniu, które stworzyliśmy, aby promować wykorzystanie dostępnych na rynku laserowych mikroskopów skaningowych jako narzędzi do druku 3D oraz ułatwić analizę przemieszczeń znaczników odniesienia.

<table><tbody><tr><td>Filtr strzykawkowy Acrodisc, 0,2 &mu; m Membrana Supor, Low Protein Binding</td><td>Pall</td><td>PN 4602</td><td>Pozwala na filtrowanie roztworów makromerów przed syntezą żelu bazowego i kolejnymi etapami litografii.</td></tr><tr><td>Akrylany funkcjonalizowane silanem #1.5 Szkiełka nakrywkowe</td><td>in-house</td><td>in-house</td><td>Acrylany umożliwiają wiązanie hydrożelu bazowego z powierzchnią szkła w celu unieruchomienia hydrożeli. Zobacz odniesienie: 21-24</td></tr><tr><td>Axio-Observer Z1 z mikroskopem Apotome</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Widefield z modułem oświetlenia strukturalnego służącym do wykonywania obrazów dla TFM.</td></tr><tr><td>Chameleon Vision ii</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td>Wyposażony w laserowy mikroskop skaningowy używany do litografii wielofotonowej.</td></tr><tr><td>Podwójnie powlekana taśma, 9500 sztuk, 6,0 mil</td><td>3M</td><td></td><td>Wiąże akrylowo-silanowe szkiełka nakrywkowe z szalkami Petriego.</td></tr><tr><td>Flexmark90 PFW Liner</td><td>FLEXcon</td><td>FLX000620</td><td>Umożliwia wyłożenie taśmą podwójnie powlekaną, umożliwiając podawanie taśmy do plotera.</td></tr><tr><td>LSM-880</td> Laserowy mikroskop skaningowy <td>Zeiss</td><td></td><td>używany do litografii wielofotonowej.</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018a</td><td>Uruchamia niestandardowe skrypty do generowania instrukcji litograficznych dla mikroskopu i do analizy danych TFM.</td></tr><tr><td>Model SC Ploter</td><td>USCutter</td><td>SC631E</td><td>Tnie podwójnie powlekaną taśmę w pierścienie do wiązania szkiełek nakrywkowych na szalkach Petriego.</td></tr><tr><td>Obiektyw C-Apochromat 40x/1,20 W Corr M27</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Wyposażony zarówno w mikroskop szerokokątny, jak i laserowy mikroskop skaningowy, do użytku zarówno w litografii, jak i TFM.</td></tr><tr><td>PEG-AF633</td><td>in-house</td><td>in-houseWariant</td> <td>PEG z akrylanem znakowanym fluoroforem do tworzenia markerów referencyjnych. Zobacz indeks: 21</td></tr><tr><td>PEG-DA</td><<td>em>in-house<</td><td>em>in-house</td><td>Materiał bazowy do hydrożeli. Zobacz odniesienie: 21</td></tr><tr><td>PEG-RGDS</td><<td>em>in-house<</td><td>em>in-house</td><td>RGDS monoakrylowy wariant PEG znakowany peptydem w celu promowania adhezji komórek. Zobacz odniesienie: 21</td></tr><tr><td>szalek Petriego</td><td>CELLTREAT</td><td>229638</td><td>Otwory o średnicy 8 mm są wycinane w środku każdej szalki za pomocą wiertła rdzeniowego, aby pasowały do hydrożeli bazowych.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Do tworzenia przekładek do kontroli grubości hydrożelu bazowego (aka PDMS).</td></tr><tr><td>Strzykawka, Leur-Lok, 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Pozwala na filtrowanie roztworów makromerów przed syntezą żelu bazowego i kolejnymi etapami litografii.</td></tr><tr><td>Lampa UV</td><td>UVP</td><td>Blak-Ray&reg; B-100AP</td><td>Polimeryzuje hydrożel bazowy.</td></tr><tr><td>1-winylo-2-pirolidynon (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td>Akcelerator rodników i komonomer. Poprawia wprowadzanie pegylowanego fluoroforu podczas litografii.</td></tr></tbody></table>

wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Kwantyfikacja deformacji materiału wywołanej przez komórkę dostarcza użytecznych informacji na temat tego, jak komórki wyczuwają i reagują na fizyczne właściwości swojego mikrośrodowiska. Chociaż istnieje wiele podejść do pomiaru naprężeń materiału wywołanych przez komórkę, tutaj przedstawiamy metodologię monitorowania odkształcenia z rozdzielczością submikronową w sposób bezreferencyjny. Korzystając z procesu modelowania fotolitograficznego aktywowanego dwoma fotonami, pokazujemy, jak generować mechanicznie i bioaktywnie przestrajalne podłoża syntetyczne zawierające wbudowane matryce fluorescencyjnych znaczników odniesienia w celu łatwego pomiaru trójwymiarowych (3D) profili deformacji materiału w odpowiedzi na przyczepność powierzchni. Korzystając z tych substratów, profile napięcia komórek mogą być mapowane przy użyciu pojedynczego stosu obrazów 3D interesującej komórki. Naszym celem przy tej metodologii jest uczynienie mikroskopii sił trakcyjnych bardziej dostępnym i łatwiejszym do wdrożenia narzędziem dla badaczy zajmujących się procesami mechanotransdukcji komórkowej, zwłaszcza nowicjuszy w tej dziedzinie.

W całym protokole znajduje się szereg punktów kontrolnych, które dostarczają informacji zwrotnych pozwalających ocenić jakość procedury wzorowania. Aby przybliżyć sposób oceny postępów w każdym z tych punktów, przedstawiamy reprezentatywne wyniki rzeczywistego eksperymentu. Wyniki te ilustrują zastosowanie niniejszego protokołu w odniesieniu do fotowzorowanego hydrożelu przygotowanego do analizy TFM komórek śródbłonka żyły pępowinowej człowieka (HUVECs). Wyniki obejmują surowe dane obrazowe, a także przetworzone wyniki d...

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Mikroskopia sił trakcyjnych służy do pomiaru sił generowanych przez komórki. Protokół ten upraszcza gromadzenie danych dotyczących siły pociągowej, aby były one bardziej dostępne dla niedoświadczonych użytkowników. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi bezreferencyjnymi platformami mikroskopii siły pociągowej jest to, że litografia wielofotonowa umożliwia szybkie i łatwe przeprojektowanie ustawień wzoru zgodnie z indywidualnymi potrzebami eksperymentalnymi.Istnieje wiele kluczowych etapów produkcji i wdrożenia tej nowej, wolnej od odniesień platformy trakcyjnej, które są łatwiejsze do zrozumienia dzięki reprezentacji wizualnej, a nie samemu tekstowi. W celu fotopolimeryzacji hydrożelu bazowego, najpierw dodaj trzy mikrolitry roztworu prepolimeru na cienki, płaski arkusz alkanów perfluoroalkoksylowych i umieść płaskie paski PDMS o grubości 150 mikrometrów otaczające, ale nie stykające się z kroplą roztworu prepolimeru. Umieść akrylowe silanizowane szkiełko nakrywkowe na PDMS, tak aby kropla prepolimeru była wyśrodkowana pod szkiełkiem nakrywkowym, aby spłaszczyć kroplę prepolimeru do grubości przekładek PDMS.Wystaw warstwowy roztwór prepolimeru na działanie światła UV przez około jedną minutę. Gdy hydrożel jest w pełni uformowany, ostrożnie oddziel szkiełko nakrywkowe od przekładek PDMS. Użyj wysokowydajnego dwustronnego kleju akrylowego, aby przymocować szalkę Petriego z otwartym dnem do szkiełka nakrywkowego.Zachowaj szczególną ostrożność podczas przyklejania hydrożelowego szkiełka nakrywkowego do szalki Petriego. Mokre naczynie lub zbyt mały nacisk podczas aplikacji pozwoli na tworzenie się nieszczelności, niszcząc próbkę. Wywieraj nacisk na powierzchnię styku kleju, aby uzyskać całkowite uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym, klejem i szalką Petriego, uważając, aby nie pęknąć szkła.Użyj sterylnego, przefiltrowanego PBS do wypłukania hydrożelu. Następnie dodać osiem mikrolitrów NVP do 800 mikrolitrów roztworu laboratoryjnego przygotowanego do syntezy hydrożelu. Aby przekonwertować obraz binarny na maskę cyfrową, otwórz program MATLAB, a następnie otwórz i uruchom skrypt uruchamiania.m Skrypt MATLAB. Wybierz binarny plik TIF do konwersji i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki regionu. Wprowadź żądany rozmiar końcowy wybranego obrazu w mikronach.Obraz wejściowy zostanie przeskalowany i zwymiarowany tak, aby odpowiadał tym parametrom. Aby utworzyć tablicę pojedynczych pikseli, w opcjach generatora regionów zainteresowania odznacz pole Usuń znacznik w obszarze Małe regiony/Pojedyncze piksele, zaznacz pole Kwadraty tic i odznacz opcję Użyj w obszarze Poziome linie podziału. Następnie kliknij przycisk OK. Plik OVL zostanie znaleziony we wcześniej określonym folderze.Otwórz plik w oprogramowaniu mikroskopu i załaduj żądane obszary, które sterowały migawką laserową podczas dwufotonowej litografii skaningowej laserem. Poniższe czynności należy wykonywać w warunkach o minimalnym oświetleniu. W celu wytworzenia układów znaczników odniesienia w warunkach słabego oświetlenia, dokładnie wymieszaj 200 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu laboratoryjnego NVP z 20 miligramami Alexa Fluor 633 i usuń cały PBS z naczynia zawierającego hydrożel.Dodaj mieszaninę PEG-633 do hydrożelu w postaci kropli, która całkowicie obejmuje hydrożel bazowy i załaduj szalkę Petriego na uchwyt próbki stolika mikroskopowego. Następnie przykryj naczynie i pozwól roztworowi do modelowania wsiąknąć w hydrożel przez co najmniej 30 minut, chroniąc przed światłem. Aby skonfigurować mikroskop do obrazowania, wybierz odpowiednie lasery i filtry do wizualizacji Alexa Fluor 488.Zlokalizuj hydrożel za pomocą sygnału PEG-488 i zablokuj odbiór dłuższych fal emisyjnych z detektora. Użyj skanowania płytek w pionie i poziomie, aby zlokalizować środek hydrożelu w płaszczyźnie XY i wyzerować stolik w tej pozycji. Użyj skanowania linii w funkcji Z-stack, aby zlokalizować powierzchnię hydrożelu i wyzerować ostrość w tej pozycji.Wypoziomuj hydrożel, powtarzając skany linii z dala od środka XY, aby określić położenie powierzchni, w razie potrzeby dostosowując dociskowe do stolika mikroskopu. W przestrzeni roboczej oprogramowania mikroskopu utwórz osobny plik eksperymentu do tworzenia fotowzorów i ustaw moc wielu fotonów na 1,8%, a prędkość skanowania na sześć. Dostosuj rozmiar ramki obrazu i pikseli, aby uzyskać rozmiar piksela 0,1 mikrometra na piksel i współczynnik proporcji 100 do jednego, a następnie załaduj plik regionów na kartę regionu.Użyj makra, aby ustawić wszystkie regiony, które mają być pobierane i włączać funkcję Z-stack. Ustaw odstępy na 3,5 mikrometra, aby uzyskać całkowitą głębokość 28 mikrometrów i całkowitą liczbę plasterków Z wynoszącą dziewięć. Następnie użyj funkcji Positions, aby ustawić określone miejsca na hydrożelu, w których zostaną wykonane matryce znaczników odniesienia w formie fotowzoru.Gdy czas namaczania zbliża się do 30 minut, co pięć minut wykonuj kolejne skany linii Z-stack powierzchni hydrożelu, aby sprawdzić, czy nie ma pęcznienia w oparciu o zmiany położenia powierzchni względem wyzerowanej pozycji ostrości. Jeśli w ciągu pięciu minut nie nastąpiła żadna zmiana położenia powierzchni, uruchom ustawienia wzoru i użyj lasera 488 nanometrów, aby sprawdzić, czy powierzchnia hydrożelu nie poruszyła się podczas modelowania. Następnie wyjąć hydrożel z mikroskopu, odessać roztwór PEG-633 z szalki Petriego i przepłukać naczynie sterylnym przefiltrowanym PBS.Aby uzyskać obrazy komórek i znaczników odniesienia, zwróć szalkę Petriego do uchwytu na próbkę, aby zlokalizować wzorzyste obszary. Zlokalizuj komórkę będącą przedmiotem zainteresowania i uzyskaj transmitowany lub fluorescencyjny obraz komórki. Następnie uzyskaj stos Z wzorzystej matrycy pod komórką, jak pokazano, i uzyskaj drugi zestaw przesyłanych lub fluorescencyjnych obrazów komórki.Podczas zbierania stosu obrazów wynikowe obrazy powinny wyświetlać regularny układ wzorzystych cech, które oscylują pod względem intensywności w funkcji pozycji Z w stosie obrazów. Śledzenie. Skrypt m zapewnia kilka obrazów diagnostycznych, w tym projekcję Z fluorescencyjnych markerów odniesienia w celu oceny jakości przetwarzania wstępnego, wykres wykrytych centroidów, oznaczony kolorami w funkcji pozycji Z w celu oceny jakości wykrywania obiektów oraz wykres ścieżek reprezentujących wykryte centroidy znaczników, które zostały połączone w kolumny w kierunku Z w celu oceny jakości śledzenia obiektu.Skrypt DISP 3D. m udostępnia wykres intensywności w funkcji pozycji Z dla każdej kolumny wykrytych cech w danym stosie obrazów w celu oceny jakości profili intensywności znaczników odniesienia. Zarówno DISP 3D.m i ścinanie DISP. m razem dostarczają histogramy zmierzonego szumu przemieszczenia w każdym z wymiarów współrzędnych kartezjańskich, a także interpolowane mapy cieplne przemieszczenia. Dodatkowo interp final3D_2.M dostarcza mapy cieplne trakcji powierzchniowych obliczonych przy użyciu kodu zleconego na zewnątrz. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że roztwory zawierające LAP są wrażliwe na światło i powinny być w jak największym stopniu chronione przed źródłami światła otoczenia. Pamiętaj, że NVP jest lotnym związkiem organicznym i zawsze powinien być przenoszony w chemicznym okapie przepływowym.

fabrication-implementation-reference-free-traction-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób wytwarzania i wykorzystywania mikrofabrykowanych detektorów w postaci macierzy słupków (mPADs) do oceny modulacji kurczliwości komórkowej.

Mikrofabrykowane detektory w postaci macierzy słupków (mPADs): podejście do izolowania sił mechanicznych

Ten film opisuje test mikroskopii siły pociągowej. Test określa trakcję komórkową ludzkich komórek raka jelita grubego na macierzy zewnątrzkomórkowej obecnej na miękkim elastycznym hydrożelu z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi. Wynikowe przemieszczenie kulek fluorescencyjnych mierzy się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Tutaj prezentujemy protokół używany do przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły trakcyjnej na komórkach B. Opisujemy przygotowanie miękkich żeli poliakrylamidowych i ich funkcjonalizację, a także pozyskiwanie danych pod mikroskopem i podsumowanie analizy danych.

Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

Naucz się wykonywać bezreferencyjną mikroskopię sił trakcyjnych z wykorzystaniem litografii wielofotonowej i fluorescencyjnych markerów w hydrogelach PEG. Ta metoda upraszcza pomiar naprężeń 3D i obliczanie sił komórkowych dla badaczy.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Przeglądaj więcej filmów