Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych
October 6th, 2019
Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.
Mikroskopia sił trakcyjnych służy do pomiaru sił generowanych przez komórki. Protokół ten upraszcza gromadzenie danych dotyczących siły pociągowej, aby były one bardziej dostępne dla niedoświadczonych użytkowników. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi bezreferencyjnymi platformami mikroskopii siły pociągowej jest to, że litografia wielofotonowa umożliwia szybkie i łatwe przeprojektowanie ustawień wzoru zgodnie z indywidualnymi potrzebami eksperymentalnymi.
Istnieje wiele kluczowych etapów produkcji i wdrożenia tej nowej, wolnej od odniesień platformy trakcyjnej, które są łatwiejsze do zrozumienia dzięki reprezentacji wizualnej, a nie samemu tekstowi. W celu fotopolimeryzacji hydrożelu bazowego, najpierw dodaj trzy mikrolitry roztworu prepolimeru na cienki, płaski arkusz alkanów perfluoroalkoksylowych i umieść płaskie paski PDMS o grubości 150 mikrometrów otaczające, ale nie stykające się z kroplą roztworu prepolimeru. Umieść akrylowe silanizowane szkiełko nakrywkowe na PDMS, tak aby kropla prepolimeru była wyśrodkowana pod szkiełkiem nakrywkowym, aby spłaszczyć kroplę prepolimeru do grubości przekładek PDMS.
Wystaw warstwowy roztwór prepolimeru na działanie światła UV przez około jedną minutę. Gdy hydrożel jest w pełni uformowany, ostrożnie oddziel szkiełko nakrywkowe od przekładek PDMS. Użyj wysokowydajnego dwustronnego kleju akrylowego, aby przymocować szalkę Petriego z otwartym dnem do szkiełka nakrywkowego.
Zachowaj szczególną ostrożność podczas przyklejania hydrożelowego szkiełka nakrywkowego do szalki Petriego. Mokre naczynie lub zbyt mały nacisk podczas aplikacji pozwoli na tworzenie się nieszczelności, niszcząc próbkę. Wywieraj nacisk na powierzchnię styku kleju, aby uzyskać całkowite uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym, klejem i szalką Petriego, uważając, aby nie pęknąć szkła.
Użyj sterylnego, przefiltrowanego PBS do wypłukania hydrożelu. Następnie dodać osiem mikrolitrów NVP do 800 mikrolitrów roztworu laboratoryjnego przygotowanego do syntezy hydrożelu. Aby przekonwertować obraz binarny na maskę cyfrową, otwórz program MATLAB, a następnie otwórz i uruchom skrypt uruchamiania.
m Skrypt MATLAB. Wybierz binarny plik TIF do konwersji i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki regionu. Wprowadź żądany rozmiar końcowy wybranego obrazu w mikronach.
Obraz wejściowy zostanie przeskalowany i zwymiarowany tak, aby odpowiadał tym parametrom. Aby utworzyć tablicę pojedynczych pikseli, w opcjach generatora regionów zainteresowania odznacz pole Usuń znacznik w obszarze Małe regiony/Pojedyncze piksele, zaznacz pole Kwadraty tic i odznacz opcję Użyj w obszarze Poziome linie podziału. Następnie kliknij przycisk OK. Plik OVL zostanie znaleziony we wcześniej określonym folderze.
Otwórz plik w oprogramowaniu mikroskopu i załaduj żądane obszary, które sterowały migawką laserową podczas dwufotonowej litografii skaningowej laserem. Poniższe czynności należy wykonywać w warunkach o minimalnym oświetleniu. W celu wytworzenia układów znaczników odniesienia w warunkach słabego oświetlenia, dokładnie wymieszaj 200 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu laboratoryjnego NVP z 20 miligramami Alexa Fluor 633 i usuń cały PBS z naczynia zawierającego hydrożel.
Dodaj mieszaninę PEG-633 do hydrożelu w postaci kropli, która całkowicie obejmuje hydrożel bazowy i załaduj szalkę Petriego na uchwyt próbki stolika mikroskopowego. Następnie przykryj naczynie i pozwól roztworowi do modelowania wsiąknąć w hydrożel przez co najmniej 30 minut, chroniąc przed światłem. Aby skonfigurować mikroskop do obrazowania, wybierz odpowiednie lasery i filtry do wizualizacji Alexa Fluor 488.
Zlokalizuj hydrożel za pomocą sygnału PEG-488 i zablokuj odbiór dłuższych fal emisyjnych z detektora. Użyj skanowania płytek w pionie i poziomie, aby zlokalizować środek hydrożelu w płaszczyźnie XY i wyzerować stolik w tej pozycji. Użyj skanowania linii w funkcji Z-stack, aby zlokalizować powierzchnię hydrożelu i wyzerować ostrość w tej pozycji.
Wypoziomuj hydrożel, powtarzając skany linii z dala od środka XY, aby określić położenie powierzchni, w razie potrzeby dostosowując dociskowe do stolika mikroskopu. W przestrzeni roboczej oprogramowania mikroskopu utwórz osobny plik eksperymentu do tworzenia fotowzorów i ustaw moc wielu fotonów na 1,8%, a prędkość skanowania na sześć. Dostosuj rozmiar ramki obrazu i pikseli, aby uzyskać rozmiar piksela 0,1 mikrometra na piksel i współczynnik proporcji 100 do jednego, a następnie załaduj plik regionów na kartę regionu.
Użyj makra, aby ustawić wszystkie regiony, które mają być pobierane i włączać funkcję Z-stack. Ustaw odstępy na 3,5 mikrometra, aby uzyskać całkowitą głębokość 28 mikrometrów i całkowitą liczbę plasterków Z wynoszącą dziewięć. Następnie użyj funkcji Positions, aby ustawić określone miejsca na hydrożelu, w których zostaną wykonane matryce znaczników odniesienia w formie fotowzoru.
Gdy czas namaczania zbliża się do 30 minut, co pięć minut wykonuj kolejne skany linii Z-stack powierzchni hydrożelu, aby sprawdzić, czy nie ma pęcznienia w oparciu o zmiany położenia powierzchni względem wyzerowanej pozycji ostrości. Jeśli w ciągu pięciu minut nie nastąpiła żadna zmiana położenia powierzchni, uruchom ustawienia wzoru i użyj lasera 488 nanometrów, aby sprawdzić, czy powierzchnia hydrożelu nie poruszyła się podczas modelowania. Następnie wyjąć hydrożel z mikroskopu, odessać roztwór PEG-633 z szalki Petriego i przepłukać naczynie sterylnym przefiltrowanym PBS.
Aby uzyskać obrazy komórek i znaczników odniesienia, zwróć szalkę Petriego do uchwytu na próbkę, aby zlokalizować wzorzyste obszary. Zlokalizuj komórkę będącą przedmiotem zainteresowania i uzyskaj transmitowany lub fluorescencyjny obraz komórki. Następnie uzyskaj stos Z wzorzystej matrycy pod komórką, jak pokazano, i uzyskaj drugi zestaw przesyłanych lub fluorescencyjnych obrazów komórki.
Podczas zbierania stosu obrazów wynikowe obrazy powinny wyświetlać regularny układ wzorzystych cech, które oscylują pod względem intensywności w funkcji pozycji Z w stosie obrazów. Śledzenie. Skrypt m zapewnia kilka obrazów diagnostycznych, w tym projekcję Z fluorescencyjnych markerów odniesienia w celu oceny jakości przetwarzania wstępnego, wykres wykrytych centroidów, oznaczony kolorami w funkcji pozycji Z w celu oceny jakości wykrywania obiektów oraz wykres ścieżek reprezentujących wykryte centroidy znaczników, które zostały połączone w kolumny w kierunku Z w celu oceny jakości śledzenia obiektu.
Skrypt DISP 3D. m udostępnia wykres intensywności w funkcji pozycji Z dla każdej kolumny wykrytych cech w danym stosie obrazów w celu oceny jakości profili intensywności znaczników odniesienia. Zarówno DISP 3D.
m i ścinanie DISP. m razem dostarczają histogramy zmierzonego szumu przemieszczenia w każdym z wymiarów współrzędnych kartezjańskich, a także interpolowane mapy cieplne przemieszczenia. Dodatkowo interp final3D_2.
M dostarcza mapy cieplne trakcji powierzchniowych obliczonych przy użyciu kodu zleconego na zewnątrz. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że roztwory zawierające LAP są wrażliwe na światło i powinny być w jak największym stopniu chronione przed źródłami światła otoczenia. Pamiętaj, że NVP jest lotnym związkiem organicznym i zawsze powinien być przenoszony w chemicznym okapie przepływowym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej w celu wytworzenia trójwymiarowych tablic znaczników fluorescencyjnych osadzanych w żelach poli(etilenoglikolu) do zastosowania jako platformy mikroskopii sił traccyjnych bez odniesienia. Metoda upraszcza pomiar 3D odkształcenia materiału i obliczanie traccji komórkowych, promując wysokowydajne pomiary sił traccyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biologia komórki
Tło
- Mikroskopia sił traccyjnych mierzy siły generowane przez komórki.
- Ten protokół jest przeznaczony dla niedoświadczonych użytkowników, aby uprościć zbieranie i analizę danych.
- Litografia wielofotonowa pozwala na szybkie i łatwe dostosowania wzorców.
- Wiзуalna reprezentacja poprawia rozumienie kluczowych etapów wytwarzania.
Cel badania
- Aby zapewnić platformę mikroskopii sił traccyjnych bez odniesienia.
- Aby ułatwić wysokowydajne pomiary traccji komórkowych.
- Aby poprawić dostępność dla badaczy o różnym poziomie doświadczenia.
Stosowane metody
- Wytwarzanie fluorescencyjnych znaczników fiducial za pomocą litografii wielofotonowej.
- Osadzenie znaczników w żelach poli(etilenoglikolu).
- Fotopolimeryzacja żelu bazowego.
- Wykorzystanie pasków PDMS i szkiełek pokrywowych do spłaszczania kropel.
Główne wyniki
- Skuteczna implementacja platformy mikroskopii sił traccyjnych bez odniesienia.
- Skuteczna procedura pomiaru 3D odkształcenia materiału.
- Poprawiona zdolność do obliczania traccji komórkowych.
- Poprawiona dostępność dla niedoświadczonych badaczy.
Wnioski
- Protokół upraszcza mikroskopion sił traccyjnych dla szerszej aplikacji.
- Litografia wielofotonowa oferuje elastyczność w projektowaniu eksperymentów.
- Pomoce wizualne są kluczowe dla zrozumienia złożonych etapów produkcji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This reference-free traction force microscopy platform enables precise quantification of cellular forces in 3D microenvironments, supporting mechanistic de-risking in target validation by linking phenotypic responses to biophysical cues. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, sub-micron resolution data on cell-material interactions, which informs pathway clarification and functional target assessment. Its accessibility and adaptability via multiphoton lithography allow rapid iteration in assay development for mechanobiology-focused screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of cell-generated forces in response to tunable substrate mechanics.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying how cells sense and respond to physical microenvironmental properties.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by providing quantitative traction profiles that correlate with mechanotransduction pathway activation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible hydrogel substrates with embedded fiducial markers for reliable force measurement across experimental conditions.
- Scalability: Allows rapid redesign of patterning parameters via multiphoton lithography to accommodate diverse cell types and substrate stiffnesses.
- Quantitative Output: Produces 3D displacement maps and traction heat maps enabling objective comparison of cellular responses.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of pathophysiological mechanisms in fibrosis, cancer, and stem cell differentiation where altered mechanosignaling drives disease progression.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanobiology insights to preclinical models by maintaining consistent quantification of cellular traction forces.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying compounds that modulate pathological force generation in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification by providing biophysical readouts that complement biochemical assays in mechanosensitive pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying how cellular traction forces change in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible fabrication of tunable substrates with embedded markers for high-content force imaging.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (displacement, traction vectors) via scripts that generate centroid tracking, Z-projection plots, and interpolated heat maps for objective condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing consistent force measurement across model systems to validate target engagement in disease-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Positions the platform as a reusable capability where substrate patterning can be rapidly adapted via lithography to support multiple projects without revalidation of core imaging and analysis workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in how cells transduce mechanical signals into biochemical responses.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through reference-free design and scripted analysis pipelines that minimize user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ineffective mechanomodulators, reducing late-stage failure risk due to unanticipated biophysical liabilities.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target modulation efficacy in physiologically relevant mechanical microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiphoton lithography, hydrogel fabrication, and fluorescence microscopy for successful substrate patterning and imaging.
- Depends on access to two-photon laser scanning microscopes and compatible software for region-based photopatterning and Z-stack acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of fiducial marker detection and tracking parameters to ensure data comparability across users and experiments.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different hydrogel formulations or cell types, particularly regarding swelling control and marker penetration.
- Involves practical limitations including light sensitivity of LAP-containing solutions and the need for chemical fume hood handling of NVP due to its volatility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:40
Base Hydrogel Photopolymerization
2:04
Binary Image to Digital Mask Conversion
3:02
Base Hydrogel Soak
3:44
Microscope Configuration
5:15
Fiducial Marker Array Photopatterning
6:01
Fiducial Marker and Cell Imaging
6:31
Results: Representative Reference-Free Traction Force Microscopy
7:43
Conclusion
