Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Mikroskopia sił trakcyjnych służy do pomiaru sił generowanych przez komórki. Protokół ten upraszcza gromadzenie danych dotyczących siły pociągowej, aby były one bardziej dostępne dla niedoświadczonych użytkowników. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi bezreferencyjnymi platformami mikroskopii siły pociągowej jest to, że litografia wielofotonowa umożliwia szybkie i łatwe przeprojektowanie ustawień wzoru zgodnie z indywidualnymi potrzebami eksperymentalnymi.

Istnieje wiele kluczowych etapów produkcji i wdrożenia tej nowej, wolnej od odniesień platformy trakcyjnej, które są łatwiejsze do zrozumienia dzięki reprezentacji wizualnej, a nie samemu tekstowi. W celu fotopolimeryzacji hydrożelu bazowego, najpierw dodaj trzy mikrolitry roztworu prepolimeru na cienki, płaski arkusz alkanów perfluoroalkoksylowych i umieść płaskie paski PDMS o grubości 150 mikrometrów otaczające, ale nie stykające się z kroplą roztworu prepolimeru. Umieść akrylowe silanizowane szkiełko nakrywkowe na PDMS, tak aby kropla prepolimeru była wyśrodkowana pod szkiełkiem nakrywkowym, aby spłaszczyć kroplę prepolimeru do grubości przekładek PDMS.

Wystaw warstwowy roztwór prepolimeru na działanie światła UV przez około jedną minutę. Gdy hydrożel jest w pełni uformowany, ostrożnie oddziel szkiełko nakrywkowe od przekładek PDMS. Użyj wysokowydajnego dwustronnego kleju akrylowego, aby przymocować szalkę Petriego z otwartym dnem do szkiełka nakrywkowego.

Zachowaj szczególną ostrożność podczas przyklejania hydrożelowego szkiełka nakrywkowego do szalki Petriego. Mokre naczynie lub zbyt mały nacisk podczas aplikacji pozwoli na tworzenie się nieszczelności, niszcząc próbkę. Wywieraj nacisk na powierzchnię styku kleju, aby uzyskać całkowite uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym, klejem i szalką Petriego, uważając, aby nie pęknąć szkła.

Użyj sterylnego, przefiltrowanego PBS do wypłukania hydrożelu. Następnie dodać osiem mikrolitrów NVP do 800 mikrolitrów roztworu laboratoryjnego przygotowanego do syntezy hydrożelu. Aby przekonwertować obraz binarny na maskę cyfrową, otwórz program MATLAB, a następnie otwórz i uruchom skrypt uruchamiania.

m Skrypt MATLAB. Wybierz binarny plik TIF do konwersji i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki regionu. Wprowadź żądany rozmiar końcowy wybranego obrazu w mikronach.

Obraz wejściowy zostanie przeskalowany i zwymiarowany tak, aby odpowiadał tym parametrom. Aby utworzyć tablicę pojedynczych pikseli, w opcjach generatora regionów zainteresowania odznacz pole Usuń znacznik w obszarze Małe regiony/Pojedyncze piksele, zaznacz pole Kwadraty tic i odznacz opcję Użyj w obszarze Poziome linie podziału. Następnie kliknij przycisk OK. Plik OVL zostanie znaleziony we wcześniej określonym folderze.

Otwórz plik w oprogramowaniu mikroskopu i załaduj żądane obszary, które sterowały migawką laserową podczas dwufotonowej litografii skaningowej laserem. Poniższe czynności należy wykonywać w warunkach o minimalnym oświetleniu. W celu wytworzenia układów znaczników odniesienia w warunkach słabego oświetlenia, dokładnie wymieszaj 200 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu laboratoryjnego NVP z 20 miligramami Alexa Fluor 633 i usuń cały PBS z naczynia zawierającego hydrożel.

Dodaj mieszaninę PEG-633 do hydrożelu w postaci kropli, która całkowicie obejmuje hydrożel bazowy i załaduj szalkę Petriego na uchwyt próbki stolika mikroskopowego. Następnie przykryj naczynie i pozwól roztworowi do modelowania wsiąknąć w hydrożel przez co najmniej 30 minut, chroniąc przed światłem. Aby skonfigurować mikroskop do obrazowania, wybierz odpowiednie lasery i filtry do wizualizacji Alexa Fluor 488.

Zlokalizuj hydrożel za pomocą sygnału PEG-488 i zablokuj odbiór dłuższych fal emisyjnych z detektora. Użyj skanowania płytek w pionie i poziomie, aby zlokalizować środek hydrożelu w płaszczyźnie XY i wyzerować stolik w tej pozycji. Użyj skanowania linii w funkcji Z-stack, aby zlokalizować powierzchnię hydrożelu i wyzerować ostrość w tej pozycji.

Wypoziomuj hydrożel, powtarzając skany linii z dala od środka XY, aby określić położenie powierzchni, w razie potrzeby dostosowując dociskowe do stolika mikroskopu. W przestrzeni roboczej oprogramowania mikroskopu utwórz osobny plik eksperymentu do tworzenia fotowzorów i ustaw moc wielu fotonów na 1,8%, a prędkość skanowania na sześć. Dostosuj rozmiar ramki obrazu i pikseli, aby uzyskać rozmiar piksela 0,1 mikrometra na piksel i współczynnik proporcji 100 do jednego, a następnie załaduj plik regionów na kartę regionu.

Użyj makra, aby ustawić wszystkie regiony, które mają być pobierane i włączać funkcję Z-stack. Ustaw odstępy na 3,5 mikrometra, aby uzyskać całkowitą głębokość 28 mikrometrów i całkowitą liczbę plasterków Z wynoszącą dziewięć. Następnie użyj funkcji Positions, aby ustawić określone miejsca na hydrożelu, w których zostaną wykonane matryce znaczników odniesienia w formie fotowzoru.

Gdy czas namaczania zbliża się do 30 minut, co pięć minut wykonuj kolejne skany linii Z-stack powierzchni hydrożelu, aby sprawdzić, czy nie ma pęcznienia w oparciu o zmiany położenia powierzchni względem wyzerowanej pozycji ostrości. Jeśli w ciągu pięciu minut nie nastąpiła żadna zmiana położenia powierzchni, uruchom ustawienia wzoru i użyj lasera 488 nanometrów, aby sprawdzić, czy powierzchnia hydrożelu nie poruszyła się podczas modelowania. Następnie wyjąć hydrożel z mikroskopu, odessać roztwór PEG-633 z szalki Petriego i przepłukać naczynie sterylnym przefiltrowanym PBS.

Aby uzyskać obrazy komórek i znaczników odniesienia, zwróć szalkę Petriego do uchwytu na próbkę, aby zlokalizować wzorzyste obszary. Zlokalizuj komórkę będącą przedmiotem zainteresowania i uzyskaj transmitowany lub fluorescencyjny obraz komórki. Następnie uzyskaj stos Z wzorzystej matrycy pod komórką, jak pokazano, i uzyskaj drugi zestaw przesyłanych lub fluorescencyjnych obrazów komórki.

Podczas zbierania stosu obrazów wynikowe obrazy powinny wyświetlać regularny układ wzorzystych cech, które oscylują pod względem intensywności w funkcji pozycji Z w stosie obrazów. Śledzenie. Skrypt m zapewnia kilka obrazów diagnostycznych, w tym projekcję Z fluorescencyjnych markerów odniesienia w celu oceny jakości przetwarzania wstępnego, wykres wykrytych centroidów, oznaczony kolorami w funkcji pozycji Z w celu oceny jakości wykrywania obiektów oraz wykres ścieżek reprezentujących wykryte centroidy znaczników, które zostały połączone w kolumny w kierunku Z w celu oceny jakości śledzenia obiektu.

Skrypt DISP 3D. m udostępnia wykres intensywności w funkcji pozycji Z dla każdej kolumny wykrytych cech w danym stosie obrazów w celu oceny jakości profili intensywności znaczników odniesienia. Zarówno DISP 3D.

m i ścinanie DISP. m razem dostarczają histogramy zmierzonego szumu przemieszczenia w każdym z wymiarów współrzędnych kartezjańskich, a także interpolowane mapy cieplne przemieszczenia. Dodatkowo interp final3D_2.

M dostarcza mapy cieplne trakcji powierzchniowych obliczonych przy użyciu kodu zleconego na zewnątrz. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas tej procedury, jest to, że roztwory zawierające LAP są wrażliwe na światło i powinny być w jak największym stopniu chronione przed źródłami światła otoczenia. Pamiętaj, że NVP jest lotnym związkiem organicznym i zawsze powinien być przenoszony w chemicznym okapie przepływowym.