Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Ogólnym celem tej metody obrazowania mikrobiologicznego jest zapewnienie bardziej opisowego sposobu rozróżniania efektów fenotypowych leczenia farmakologicznego. Z tego względu metoda ta może być bardzo pomocna w dziedzinie chorób zakaźnych. W szczególności pozwala ona na analizę efektów morfologicznych niektórych antybiotyków oraz mechanizmów, w jaki sposób zabijają one C.Difficile.

Główną zaletą tej techniki jest połączenie obrazowania o wysokiej rozdzielczości z technikami hodowli komórkowych in vitro, co pozwala na szczegółową analizę mechanizmu działania leków w procesie niszczenia komórek. Zastosowanie tej metody może rozciągać się na terapię zakażeń Clostridium difficile, w skrócie CDI. Wynika to z faktu, że technika ta może stanowić narzędzie do identyfikacji sposobu, w jaki dany antybiotyk może być skuteczny w leczeniu CDI.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat działania farmakologicznego, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak modele kultur mieszanych lub badania in vivo na zwierzętach. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą nową metodą napotykają trudności, ponieważ hodowla C.difficile oraz obsługa skaningowego mikroskopu elektronowego są wymagające. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas prób rozróżnienia mechanizmów działania różnych antybiotyków.

Chciałbym przedstawić Państwu zespół badawczy, z którym dziś się zapoznacie. Jahangir Alam jest profesorem i mikrobiologiem. Koordynuje on wszystkie działania laboratoryjne, które zobaczycie dzisiaj.

Tasnuva Rashid jest doktorantką w laboratorium. Zajmuje się ona większością codziennych prac mikrobiologicznych. Eugenie Bassere jest stypendystką podoktorską.

Nauczyła ona Tasnuvę wielu umiejętności i pomaga również w laboratorium. Brad Endres jest kolejnym stażystą podoktorskim w laboratorium. Będzie on przeprowadzać wiele badań mikroskopowych z pomocą Long Chang.

Aby przygotować izolaty środowiskowe, należy w sterylnych rękawiczkach przetrzeć wstępnie wysterylizowaną gazą bawełnianą powierzchnię wybranego obszaru, takiego jak podłoga, drzwi, klamka lub półka. Następnie wymaz z gazy należy umieścić w wysterylizowanej probówce. Rękawiczki należy zmieniać pomiędzy kolejnymi próbkami.

Aby przygotować izolaty kliniczne, należy za pomocą pętli do szczepienia wysiać od 10 do 100 mg klinicznych próbek kału na agar z cefoksytyną, cykloseryną i fruktozą (CCFA), a następnie inkubować próbki w ścisłych warunkach beztlenowych przez 48 do 72 godzin. Wyizolowane kolonie szczepu C.Difficile należy przechowywać w krio probówkach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz. Próbki z wymazów środowiskowych należy wzbogacić w bulion BHI (brain heart infusion) z dodatkiem 0,5% taurocholanu sodu i umieścić w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C na pięć dni.

Odwiruj jeden mililitr hodowli przy 10 000 ×g, a następnie użyj 100 µL etanolu, aby resuspender osad. Wysej 50 µL resuspenderowanych komórek na płytki CCFA i inkubuj hodowle w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 40 do 48 godzin. Wyizolowane kolonie zapasowe C.difficile przechowuj w krio probówkach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.

Do przetestowania podejrzewanych kolonii C.difficile należy użyć odczynnika do aglutynacji lateksowej lub metody PCR. Oczyszczone szczepy środowiskowe lub kliniczne C.difficile należy hodować na płytkach z agarem krwawym w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Za pomocą pętli do szczepienia należy pobrać jedną odizolowaną kolonię i przenieść ją do 5 mL pożywki BHI w probówce o pojemności 15 mL.

Następnie inkubuj kulturę w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wykorzystaj świeże, uprzednio zredukowane podłoże BHIS uzupełnione taurocholanem sodu i odpowiednim stężeniem antybiotyku, aby rozcieńczyć prekultury w stosunku 1:100 do stężenia około 10⁶ CFU/ml. Za pomocą pipety pobierz próbkę o objętości 1 ml w każdym punkcie czasowym, a następnie wysej lub rozetrzyj niewielką alikwot na płytce z agarem krwawym.

Inkubuj płytkę przez 48 godzin w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C i oblicz powstałą liczbę kolonii, aby wyznaczyć CFU. Pobierz jeden mililitr komórek z każdego punktu czasowego do probówek do mikrocentryfugi i wiruj przy 10 000 ×g przez 10 minut. Odlej nadsącz i przemyj komórki za pomocą PBS.

Ponownie odwiruj próbki i odlej nadsącz. Następnie użyj 1 mL 4% paraformaldehydu do ponownego rozcieńczenia komórek i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po ponownym odwirowaniu próbek i usunięciu nadsączu, przemyj komórki dwukrotnie wodą destylowaną, a następnie ponownie rozcieńcz komórki w 100 µL wody destylowanej.

Dostosować objętość w zależności od mętności roztworu. Po oznakowaniu szkiełek podstawkowych, nanieść na nie 40 µL próbki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza inkubować szkiełka przez 15 minut, aby odparować ciecz i umożliwić adhezję komórek do szkła.

Jeśli ciecz nadal jest obecna, należy ją usunąć za pomocą dmuchawy. Umieść szkiełka nakrywkowe w stacjonarnej maszynie do napylania i przymocuj je taśmą. Zamocuj czyste złoto w maszynie do napylania.

Następnie włącz urządzenie i rozpocznij napylanie przy niskim ciśnieniu. Powlekaj komórki przez 30 sekund przy natężeniu 80 microamperes, co odpowiada warstwie złota o grubości 20 nanometers. Aby rozpocząć obrazowanie, najpierw odpowiednio odpowietrz SEM w oprogramowaniu komputerowym, naciskając przycisk Vent.

Po pokryciu komórek prószkami, przenieś je do skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Za pomocą taśmy węglowej przymocuj pokryte szkiełka nakrywkowe do metalowego stolika. Po odpowietrzeniu komory SEM drzwi powinny łatwo się otworzyć.

Zablokuj metalowy stolik w komorze SEM, przykręcając go. Następnie kliknij przycisk Pump w oprogramowaniu. Gdy system potwierdzi poprawność parametrów, SEM będzie gotowy do użycia.

W karcie Detector kliknij detektor SE. Włącz wiązkę, klikając przycisk wyświetlający napięcie. Rozpocznij obrazowanie przy niższym napięciu, a dopiero potem je zwiększ.

Po włączeniu wiązki pojawi się obraz. Korzystając z funkcji śledzenia, znajdź na pokrywkach szkiełek obszar do obrazowania. Powiększ ten region i odszukaj struktury w kształcie pałeczek, które reprezentują Clostridium difficile.

Aby skalibrować system, należy powiększyć obraz, przeprowadzić wstępne ustawienie ostrości i powiązać oś Z z wolną odległością roboczą. Czynność tę należy wykonać dla kilku odległości roboczych, np. 15, 9 i 5 mm. Następnie należy przełączyć urządzenie w tryb obrazowania o ultrawysokiej rozdzielczości.

Użyj pokręteł ostrości wstępnej i precyzyjnej, aby rozpocząć ustawianie ostrości przy dużym powiększeniu. Dostosuj pokrętła astygmatyzmu w celu uzyskania wyraźniejszego obrazu, a następnie sprawdź jego ostrość, korzystając z oprogramowania komputerowego do cyfrowego powiększenia obrazu. Użyj powolnego skanowania, aby zarejestrować obraz wysokiej jakości.

Zapisz zebrany obraz jako plik tiff do późniejszej analizy, upewniając się, że pasek danych jest zaznaczony, jeśli podczas analizy będą wykonywane pomiary. Wykonaj zdjęcia pod różnymi kątami, aby uzyskać więcej informacji o głębokości, przechylając stolik w SEM. Zoptymalizuj ostrość i astygmatyzm przed wykonaniem obrazu z powolnym skanowaniem.

Po zakończeniu obrazowania wyłączyć wiązkę i zwiększyć odległość roboczą do 20 mm. Następnie odbarczyć komorę i wyjąć stolik. Przetworzyć obrazy, otwierając pliki obrazów w programie Fiji.

Używając funkcji linii, precyzyjnie obrysuj pasek skali. Kliknij kartę Analiza, a następnie wybierz funkcję Wybierz skalę. Pojawi się okno, w którym należy ustawić znaną odległość na podstawie paska skali.

Zmień również jednostkę długości i kliknij Okay. Na koniec, aby zmierzyć długość komórki, użyj funkcji linii, aby obrysować komórkę w całości. Ponownie wybierz kartę Analyze, a następnie kliknij measure.

Długość powinna być podana w jednostkach określonych wcześniej. Na obrazach przedstawiono komórki wegetatywne C.difficile uchwycone w fazie wykładniczej krzywej wzrostu, a także komórki przetrwalnikowe. Komórki wegetatywne to długie, gładkie struktury w kształcie pałeczek, natomiast przetrwalniki to małe, owalne struktury o chropowatej powierzchni zewnętrznej.

Jak pokazano na tej rycinie, komórki kontrolne rosną i osiągają plateau; natomiast w przypadku komórek traktowanych antybiotykami takimi jak wankomycyna i metronidazol, całkowita liczba CFU spada do granicy wykrywalności, co wskazuje na efekt bakteriobójczy. Wykazano, że wankomycyna i metronidazol są skuteczne w zabijaniu C.difficile przy stężeniach powyżej MIC. Aby zademonstrować przydatność SEM w obrazowaniu C.difficile, wykonano zdjęcia komórek przed i po zastosowaniu leków w celu ustalenia, jak zmieniła się ich morfologia.

W przypadku wankomycyny część ścian komórkowych została uszkodzona, a niektóre komórki traktowane metronidazolem miały mniejszy rozmiar. Aby sprawdzić, czy rozmiar komórek uległ zmianie, przeanalizowano ich długość za pomocą programu Fiji. Jak pokazano na tym obrazie, rozmiar komórek wegetatywnych w grupie kontrolnej może się nieznacznie różnić, lecz większość z nich ma długość około 6 micrometers.

Jak jednak pokazano na tym wykresie, długość komórek uległa zmianie w przypadku komórek traktowanych metronidazolem, ale nie w komórkach traktowanych wankomycyną. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż dwa dni. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, aby próbka była utrwalona i całkowicie sucha przed nakładaniem powłoki i obrazowaniem.

Po przeprowadzeniu tej procedury możemy zastosować dodatkowe metody w celu udzielenia odpowiedzi na kolejne pytania, na przykład dotyczące tego, jak bakterie reagują na leczenie antybiotykami; może to dostarczyć nam pogłębionej wiedzy na temat mechanizmów działania antybiotyków. Technika ta ma ogromny potencjał i może utorować drogę badaczom w dziedzinie mikrobiologii do dalszego zgłębiania fizjologii i farmakologii Clostridium difficile. Mam nadzieję, że dzisiejszy materiał wideo był dla Państwa interesujący.

Mam nadzieję, że dzięki temu dowiedzieli się Państwo, jak hodować i charakteryzować komórki C.difficile, jak analizować kinetykę zabijania przez antybiotyki w odniesieniu do C.Difficile, a następnie jak oceniać zmiany morfologiczne związane z tymi wzorcami zabijania przy użyciu zaawansowanej mikroskopii. Pracując z Clostridium difficile, musimy zachować szczególne środki ostrożności i stosować wszystkie środki ochronne