Name: Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii elektronowej do obserwacji zmian morfologicznych Clostridium difficile pod wpływem antybiotyków. Technika łączy wysoką rozdzielczość obrazowania z hodowlą in vitro, dostarczając szczegółowych informacji o mechanizmie działania leków przeciwbakteryjnych i wspierając rozwój skuteczniejszych terapii zakażeń CDI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te eksperymenty były wspierane przez granty badawcze od Merck and Co. i Summit, PLC.

1. Izolowanie C. difficile z różnych źródeł środowiskowych lub klinicznych
<ol>
	<li>Izolaty środowiskowe: Za pomocą wstępnie wysterylizowanego bawełnianego miernika (lekko zwilżonego 0,85% NaCl), przetrzyj powierzchnię dowolnego obszaru zainteresowania (podłoga, drzwi, klamka, półka itp.). 8 Upewnij się, że nosisz sterylne rękawiczki i umieść wacik w wysterylizowanej probówce po zakończeniu.</li>
	<li>Izolaty kliniczne (kał): Umieścić 10 do 100 mg klinicznych próbek kału na agarze cefcytyna-cykloseryna-fruktoza (CCFA) za pomocą pętli inokulacyjnej i inkubować w ścisłych warunkach beztlenowych przez 48 - 72 godzin. Przechowywać izolowane kolonie C. difficile w kriowialach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz. 7,9,10</li>
	<li>Wzbogać próbki wymazów środowiskowych w bulionie do infuzji mózgu i serca (BHI) 0,05% taurocholanu sodu i umieścić w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C na 5 dni. Odwirować 1 ml kultury przy 10 000 x g i ponownie zawiesić osad w 100 μl etanolu.</li>
	<li>Zawiesinę komórek (50 μl) należy umieścić na płytkach z agatorem fruktozowo-cykloserynowym (CCFA) i inkubować w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 40-48 godzin. Izolowane kolonie C. difficile należy przechowywać w kriowiach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.</li>
	<li>Zbadać podejrzane kolonie C. difficile za pomocą odczynnika do aglutynacji lateksowej lub PCR.</li>
</ol>
2. Hodowla C. difficile i procedury kinetyki zabijania
<ol>
	<li>Hodować oczyszczone, środowiskowe lub kliniczne szczepy C. difficile na płytkach z agarem z krwią w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Pobrać jedną izolowaną kolonię z pętlą inokulacyjną, przenieść ją do 5 ml pożywki BHI w probówce o pojemności 15 ml i rosnąć przez 24 godziny w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć kultury wstępne w stosunku 1:100 do około 106 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w świeżym, wstępnie zredukowanym BHIS (BHI plus 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 1% L-cysteiny) uzupełnionym 0,1% taurocholanu sodu i odpowiednim stężeniem antybiotyku (T0).</li>
	<li>Pobrać 1 ml próbki za pomocą pipety w każdym punkcie czasowym (T0, T6, T24, T48) i rozprowadzić małą porcję (100 μl w rozcieńczeniach seryjnych) na płytce z agarem z krwią. Pozwól komórkom rosnąć na płytce z agarem z krwią przez 48 godzin w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C i policz otrzymaną liczbę kolonii w celu określenia CFU.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej
<ol>
	<li>Zebrać 1 ml komórek z każdego punktu czasowego w probówkach do mikrowirówek i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i przepłukać komórki w PBS.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie rozcieńczyć komórki w 1 ml 4% paraformaldehydu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbki przez 10 minut przy 10 000 x g i odrzucić supernatant. Umyć komórki dwukrotnie wodą destylowaną i ponownie rozcieńczyć w 100 μl wody destylowanej. Dostosuj objętość w zależności od zmętnienia roztworu. 
	UWAGA: Dobrym pomysłem jest wielokrotne seryjne rozcieńczenia.</li>
	<li>Oznaczyć szkiełka nakrywkowe i dodać na nie 40 μl próbki. Inkubować przez 15 minut w okapie przepływowym, aby odparować ciecz i pozwolić komórkom przylgnąć do szkiełka nakrywkowego. Jeśli płyn jest nadal obecny, użyj dmuchawy, aby usunąć płyn.</li>
	<li>Umieść oznaczone szkiełka nakrywkowe z komórkami w maszynie do napylania biurkowego i zaklej taśmą. Zabezpiecz czyste złoto w maszynie do napylania. Włącz maszynę i rozpocznij rozpylanie pod niskim ciśnieniem (50 mTorr). Powlekaj ogniwa przez 30 s przy 80 mA, co przekłada się na 20 nm złotej powłoki.</li>
	<li>Przenieś powlekane komórki do skaningowego mikroskopu elektronowego.</li>
</ol>
4. Obrazowanie komórek C. difficile w skaningowym mikroskopie elektronowym
<ol>
	<li>Prawidłowo odpowietrzyć skaningowy mikroskop elektronowy (SEM), naciskając przycisk odpowietrzania w oprogramowaniu komputerowym.</li>
	<li>Za pomocą taśmy węglowej przymocuj powlekane szkiełka nakrywkowe do metalowej sceny. Po odpowietrzeniu SEM drzwi powinny się łatwo otworzyć. Zablokuj metalowy stolik w komorze SEM, przykręcając go.</li>
	<li>Kliknij przycisk POMPA w oprogramowaniu komputerowym. SEM będzie można użyć, gdy system odczyta "Vac OK".</li>
	<li>Kliknij detektor SE w zakładce detektory. Włącz wiązkę, klikając przycisk wyświetlający napięcie. Rozpocznij obrazowanie przy niższym napięciu (5 kV) przed zwiększeniem napięcia (do 15 kV). Po włączeniu wiązki pojawi się obraz.</li>
	<li>Korzystając z funkcji śledzenia, znajdź obszar na powlekanych szkiełkach nakrywkowych, aby wykonać zdjęcie. Powiększ region i znajdź struktury w kształcie prętów; Są to Clostridium difficile.</li>
	<li>Powiększ i ustaw ostrość obrazu, aby skalibrować system. Należy to zrobić w różnych odległościach roboczych: 15, 9 i 5 mm. Obraz w odległości roboczej 5 mm.</li>
	<li>Włącz tryb obrazowania o ultrawysokiej rozdzielczości i zacznij ustawiać ostrość i optymalizować astygmatyzm.</li>
	<li>Zacznij ustawiać ostrość przy dużym powiększeniu. Użyj do tego przełączników zgrubnej i precyzyjnej ostrości. Dostosuj również astygmatyzm, aby uzyskać wyraźniejszy obraz.
	<ol>
		<li>Dostosuj astygmatyzm przy dużym powiększeniu. Aby to zrobić, wyreguluj przełączniki astygmatyzmu (wyglądają podobnie do przełączników ostrości drobnej/zgrubnej) i sprawdź klarowność obrazu, powiększając cyfrowo oprogramowanie komputerowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz funkcję powolnego skanowania, aby uzyskać obraz wysokiej jakości. Zapisz zebrany obraz jako plik . Plik TIFF, który będzie używany do analizy. Upewnij się, że pasek danych jest zaznaczony, jeśli pomiary będą wykonywane podczas analizy.</li>
	<li>Zbieraj obrazy pod różnymi kątami (do 52°), ręcznie obracając kąt bezpośrednio na SEM. Obrazy ustawione pod kątem zwykle ujawniają więcej informacji o głębi</li>.
	<li>Zmień napięcie wiązki w zależności od komórek, które są obrazowane. Utrzymuj go głównie w zakresie 5 - 15 kV dla wszystkich eksperymentów.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania wyłącz wiązkę i zwiększ odległość roboczą do 20 mm. Komora może być następnie odpowietrzona, a stolik może zostać usunięty. Skopiuj wszystkie obrazy na dysk w celu dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj na komputerze bezpłatnie dostępne oprogramowanie FIJI (http://fiji.sc).</li>
	<li>Otwórz plik obrazu na FIDŻI.</li>
	<li>Korzystając z funkcji linii, precyzyjnie prześledź podziałkę liniową.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Analizuj w programie FIJI i na koniec wybierz funkcję Select Scale. Pojawi się okno, które będzie wymagało ustawienia znanej odległości na podstawie podziałki. Zmień również jednostkę długości i kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Teraz, gdy program jest skalibrowany pod kątem odległości, użyj funkcji linii, aby zmierzyć długość komórki. Aby uzyskać długość, użyj funkcji linii, aby prześledzić komórkę w całości. Wybierz ponownie kartę Analizuj, a następnie kliknij pozycję Zmierz. Długość powinna pojawić się w jednostkach oznaczonych wcześniej.</li>
</ol>

<ol><li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li>
<li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ridinilazole%3A+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob+Agents%22%5BJournal%5D)">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anti+Infect+Ther%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li>
<li>Bassères, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production%2C+Immune+Response%2C+and+Morphological+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li>
<li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li>
<li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+the+Endemic+Setting%2C+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li>
<li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+%28SMT19969%29%2C+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li>
<li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapse+of+antibiotic+associated+colitis%3A+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination%2C+outgrowth+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li>
<li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+a+review+of+current+and+emerging+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li>
<li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidemic%2C+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li>
</ol>

Firma KWG otrzymała wcześniejsze i obecne wsparcie badawcze od firm Merck & Co. i Summit, PLC.

Celem obecnego badania było stworzenie wysokoprzepustowej metody izolowania C. difficile i badanie wrażliwości na antybiotyki przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) jako środka do dokładniejszej charakterystyki działania farmakologicznego antybiotyku. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, wykazaliśmy, że obrazowanie fenotypowej odpowiedzi komórki na antybiotykoterapię może ujawnić wgląd w farmakologiczne działanie leku. W sumie obrazowanie w tym protokole trwa około 2 godzin po pobraniu...

Clostridium difficile jest bakterią Gram-dodatnią, tworzącą przetrwalniki, powodującą około 500 000 infekcji rocznie w USA i jest uważana przez Centers for Disease Control and Prevention (CDC) za pilny patogen na poziomie zagrożenia, najwyższy poziom ryzyka. 1 W ciągu ostatniej dekady nastąpił znaczny rozwój leków przeciwdrobnoustrojowych o działaniu przeciwko C. difficile. 2,3 Badania in vitro są niezbędnym elementem procesu opracowywania leków. 4 Tradycyjnie, badania in vitro nad podatnością i zabijaniem czasu są wykorzystywane do walidacji przyszłych badań na zwierzętach i innych badaniach in vivo.
Chociaż te metody pełnią ważną rolę w ocenie działania zabijającego, nie rejestrują fenotypowej odpowiedzi komórek na leczenie farmakologiczne. Dzięki połączeniu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) ze standardowymi badaniami kinetycznymi zabijania, możliwa jest dokładniejsza charakterystyka bezpośrednich skutków działania antybiotyku. 5,6,7 Tutaj przedstawiamy metodę, w której SEM jest używany jako środek do profilowania skuteczności leczenia antybiotykami.

<table><tbody><tr><td>gaza bawełniana&nbsp;</td><td>Opiekuńczy</td><td>PRM21408C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macron</td><td>7532</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Napar z serca do mózgu (BHI)&nbsp;</td><td>Criterion</td><td>C5141</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10389</td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>Criterion</td><td>C741</td><td></td></tr><tr><td>taurocholan sodu</td><td>Alfa</td><td>Aesar A18346</td><td></td></tr><tr><td>komora beztlenowa</td><td>Coy</td><td></td><td>winylowa komora beztlenowa</td></tr> płytki <tr><td>agarowe fruktozowe (CCFA) Systemy</td><td>beztlenowe</td><td>AS-213</td><td></td></tr><tr><td>płytki agarowe z krwią Diagnostyka</td><td>Hardy</td> Odczynnik do aglutynacji lateksowej <td>A-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Oxoid</td><td>DR1107A</td><td>C. zestaw testowy diff</td></tr><tr><td>probówki mikrowirówkowe</td><td>Eppendorf</td><td>222363204</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Szkiełka</td> mikroskopowe Fisher Scientific <td>50-259-98</td><td></td></tr><tr><td></td><td>J. Melvin uwolniony od marki</td><td>7525M</td><td>75 x 25mm</td></tr><tr><td>okap przepływowy</td><td>Labconco</td><td>klasa II typ A2&nbsp;</td><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>maszyna do napylania biurka</td><td>Taśma Denton Vacuum</td><td>Desk II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Plastikowy rdzeń</td><td>05072-AB</td><td>SPI Dwustronna taśma samoprzylepna</td></tr><tr><td>węglowa złota</td><td>Denton Vacuum</td><td>TAR001-0158</td><td>2.375" Średnica x .002" </td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td> z <td>grubą złotą folią FEI</td><td>XL-30</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Ocena działania antybiotyku przy opracowywaniu nowych leków skierowanych przeciwko bakteriom beztlenowym jest trudna i wymagająca technicznie. Aby uzyskać wgląd w możliwe MOA, zmiany morfologiczne związane z ekspozycją na antybiotyki można uwidocznić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Integracja obrazowania SEM z tradycyjnymi krzywymi zabijania może poprawić nasz wgląd w działanie leków i przyspieszyć proces ich opracowywania. Aby przetestować tę przesłankę, przeprowadzono krzywe zabijania i badania SEM przy użyciu leków o znanym, ale różnym MOA (wankomycyna i metronidazol). Komórki C. difficile (R20291) hodowano z lub bez obecności antybiotyku przez okres do 48 godzin. W ciągu 48 godzin komórki pobierano w wielu punktach czasowych w celu określenia skuteczności antybiotyku i obrazowania na SEM. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, wankomycyna i metronidazol wykazywały znaczącą aktywność bakteriobójczą po 24 godzinach leczenia, mierzoną za pomocą zliczania jednostek tworzących kolonie (CFU). Korzystając z obrazowania SEM, ustaliliśmy, że metronidazol miał znaczący wpływ na długość komórek (> 50% zmniejszenie długości komórek dla każdego antybiotyku; P< 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną i wankomycyną. Chociaż odpowiedź fenotypowa na leczenie farmakologiczne nie została wcześniej udokumentowana w ten sposób, są one zgodne z MOA leku, co dowodzi wszechstronności i wiarygodności obrazowania i pomiarów oraz zastosowania tej techniki do innych związków eksperymentalnych.

Clostridium difficile jest bakterią tworzącą przetrwalniki, dlatego przed przystąpieniem do jakichkolwiek analiz funkcjonalnych niezbędne jest określenie różnic morfologicznych między komórkami wegetatywnymi a przetrwalnikami. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne obrazy komórek wegetatywnych uchwyconych podczas fazy wykładniczej krzywej wzrostu oraz przetrwalników. Jak pokazano, komórki wegetatywne są długimi, gładkimi strukturami w kształcie pałeczek, natomiast...

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Ogólnym celem tej metody obrazowania mikrobiologicznego jest zapewnienie bardziej opisowego sposobu rozróżniania efektów fenotypowych leczenia farmakologicznego. Z tego względu metoda ta może być bardzo pomocna w dziedzinie chorób zakaźnych. W szczególności pozwala ona na analizę efektów morfologicznych niektórych antybiotyków oraz mechanizmów, w jaki sposób zabijają one C.Difficile.Główną zaletą tej techniki jest połączenie obrazowania o wysokiej rozdzielczości z technikami hodowli komórkowych in vitro, co pozwala na szczegółową analizę mechanizmu działania leków w procesie niszczenia komórek. Zastosowanie tej metody może rozciągać się na terapię zakażeń Clostridium difficile, w skrócie CDI. Wynika to z faktu, że technika ta może stanowić narzędzie do identyfikacji sposobu, w jaki dany antybiotyk może być skuteczny w leczeniu CDI.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat działania farmakologicznego, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak modele kultur mieszanych lub badania in vivo na zwierzętach. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą nową metodą napotykają trudności, ponieważ hodowla C.difficile oraz obsługa skaningowego mikroskopu elektronowego są wymagające. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas prób rozróżnienia mechanizmów działania różnych antybiotyków.Chciałbym przedstawić Państwu zespół badawczy, z którym dziś się zapoznacie. Jahangir Alam jest profesorem i mikrobiologiem. Koordynuje on wszystkie działania laboratoryjne, które zobaczycie dzisiaj.Tasnuva Rashid jest doktorantką w laboratorium. Zajmuje się ona większością codziennych prac mikrobiologicznych. Eugenie Bassere jest stypendystką podoktorską.Nauczyła ona Tasnuvę wielu umiejętności i pomaga również w laboratorium. Brad Endres jest kolejnym stażystą podoktorskim w laboratorium. Będzie on przeprowadzać wiele badań mikroskopowych z pomocą Long Chang.Aby przygotować izolaty środowiskowe, należy w sterylnych rękawiczkach przetrzeć wstępnie wysterylizowaną gazą bawełnianą powierzchnię wybranego obszaru, takiego jak podłoga, drzwi, klamka lub półka. Następnie wymaz z gazy należy umieścić w wysterylizowanej probówce. Rękawiczki należy zmieniać pomiędzy kolejnymi próbkami.Aby przygotować izolaty kliniczne, należy za pomocą pętli do szczepienia wysiać od 10 do 100 mg klinicznych próbek kału na agar z cefoksytyną, cykloseryną i fruktozą (CCFA), a następnie inkubować próbki w ścisłych warunkach beztlenowych przez 48 do 72 godzin. Wyizolowane kolonie szczepu C.Difficile należy przechowywać w krio probówkach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz. Próbki z wymazów środowiskowych należy wzbogacić w bulion BHI (brain heart infusion) z dodatkiem 0,5% taurocholanu sodu i umieścić w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C na pięć dni.Odwiruj jeden mililitr hodowli przy 10 000 ×g, a następnie użyj 100 µL etanolu, aby resuspender osad. Wysej 50 µL resuspenderowanych komórek na płytki CCFA i inkubuj hodowle w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 40 do 48 godzin. Wyizolowane kolonie zapasowe C.difficile przechowuj w krio probówkach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.Do przetestowania podejrzewanych kolonii C.difficile należy użyć odczynnika do aglutynacji lateksowej lub metody PCR. Oczyszczone szczepy środowiskowe lub kliniczne C.difficile należy hodować na płytkach z agarem krwawym w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Za pomocą pętli do szczepienia należy pobrać jedną odizolowaną kolonię i przenieść ją do 5 mL pożywki BHI w probówce o pojemności 15 mL.Następnie inkubuj kulturę w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Wykorzystaj świeże, uprzednio zredukowane podłoże BHIS uzupełnione taurocholanem sodu i odpowiednim stężeniem antybiotyku, aby rozcieńczyć prekultury w stosunku 1:100 do stężenia około 10⁶ CFU/ml. Za pomocą pipety pobierz próbkę o objętości 1 ml w każdym punkcie czasowym, a następnie wysej lub rozetrzyj niewielką alikwot na płytce z agarem krwawym.Inkubuj płytkę przez 48 godzin w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C i oblicz powstałą liczbę kolonii, aby wyznaczyć CFU. Pobierz jeden mililitr komórek z każdego punktu czasowego do probówek do mikrocentryfugi i wiruj przy 10 000 ×g przez 10 minut. Odlej nadsącz i przemyj komórki za pomocą PBS.Ponownie odwiruj próbki i odlej nadsącz. Następnie użyj 1 mL 4% paraformaldehydu do ponownego rozcieńczenia komórek i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po ponownym odwirowaniu próbek i usunięciu nadsączu, przemyj komórki dwukrotnie wodą destylowaną, a następnie ponownie rozcieńcz komórki w 100 µL wody destylowanej.Dostosować objętość w zależności od mętności roztworu. Po oznakowaniu szkiełek podstawkowych, nanieść na nie 40 µL próbki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza inkubować szkiełka przez 15 minut, aby odparować ciecz i umożliwić adhezję komórek do szkła.Jeśli ciecz nadal jest obecna, należy ją usunąć za pomocą dmuchawy. Umieść szkiełka nakrywkowe w stacjonarnej maszynie do napylania i przymocuj je taśmą. Zamocuj czyste złoto w maszynie do napylania.Następnie włącz urządzenie i rozpocznij napylanie przy niskim ciśnieniu. Powlekaj komórki przez 30 sekund przy natężeniu 80 microamperes, co odpowiada warstwie złota o grubości 20 nanometers. Aby rozpocząć obrazowanie, najpierw odpowiednio odpowietrz SEM w oprogramowaniu komputerowym, naciskając przycisk Vent.Po pokryciu komórek prószkami, przenieś je do skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Za pomocą taśmy węglowej przymocuj pokryte szkiełka nakrywkowe do metalowego stolika. Po odpowietrzeniu komory SEM drzwi powinny łatwo się otworzyć.Zablokuj metalowy stolik w komorze SEM, przykręcając go. Następnie kliknij przycisk Pump w oprogramowaniu. Gdy system potwierdzi poprawność parametrów, SEM będzie gotowy do użycia.W karcie Detector kliknij detektor SE. Włącz wiązkę, klikając przycisk wyświetlający napięcie. Rozpocznij obrazowanie przy niższym napięciu, a dopiero potem je zwiększ.Po włączeniu wiązki pojawi się obraz. Korzystając z funkcji śledzenia, znajdź na pokrywkach szkiełek obszar do obrazowania. Powiększ ten region i odszukaj struktury w kształcie pałeczek, które reprezentują Clostridium difficile.Aby skalibrować system, należy powiększyć obraz, przeprowadzić wstępne ustawienie ostrości i powiązać oś Z z wolną odległością roboczą. Czynność tę należy wykonać dla kilku odległości roboczych, np. 15, 9 i 5 mm. Następnie należy przełączyć urządzenie w tryb obrazowania o ultrawysokiej rozdzielczości.Użyj pokręteł ostrości wstępnej i precyzyjnej, aby rozpocząć ustawianie ostrości przy dużym powiększeniu. Dostosuj pokrętła astygmatyzmu w celu uzyskania wyraźniejszego obrazu, a następnie sprawdź jego ostrość, korzystając z oprogramowania komputerowego do cyfrowego powiększenia obrazu. Użyj powolnego skanowania, aby zarejestrować obraz wysokiej jakości.Zapisz zebrany obraz jako plik tiff do późniejszej analizy, upewniając się, że pasek danych jest zaznaczony, jeśli podczas analizy będą wykonywane pomiary. Wykonaj zdjęcia pod różnymi kątami, aby uzyskać więcej informacji o głębokości, przechylając stolik w SEM. Zoptymalizuj ostrość i astygmatyzm przed wykonaniem obrazu z powolnym skanowaniem.Po zakończeniu obrazowania wyłączyć wiązkę i zwiększyć odległość roboczą do 20 mm. Następnie odbarczyć komorę i wyjąć stolik. Przetworzyć obrazy, otwierając pliki obrazów w programie Fiji.Używając funkcji linii, precyzyjnie obrysuj pasek skali. Kliknij kartę Analiza, a następnie wybierz funkcję Wybierz skalę. Pojawi się okno, w którym należy ustawić znaną odległość na podstawie paska skali.Zmień również jednostkę długości i kliknij Okay. Na koniec, aby zmierzyć długość komórki, użyj funkcji linii, aby obrysować komórkę w całości. Ponownie wybierz kartę Analyze, a następnie kliknij measure.Długość powinna być podana w jednostkach określonych wcześniej. Na obrazach przedstawiono komórki wegetatywne C.difficile uchwycone w fazie wykładniczej krzywej wzrostu, a także komórki przetrwalnikowe. Komórki wegetatywne to długie, gładkie struktury w kształcie pałeczek, natomiast przetrwalniki to małe, owalne struktury o chropowatej powierzchni zewnętrznej.Jak pokazano na tej rycinie, komórki kontrolne rosną i osiągają plateau; natomiast w przypadku komórek traktowanych antybiotykami takimi jak wankomycyna i metronidazol, całkowita liczba CFU spada do granicy wykrywalności, co wskazuje na efekt bakteriobójczy. Wykazano, że wankomycyna i metronidazol są skuteczne w zabijaniu C.difficile przy stężeniach powyżej MIC. Aby zademonstrować przydatność SEM w obrazowaniu C.difficile, wykonano zdjęcia komórek przed i po zastosowaniu leków w celu ustalenia, jak zmieniła się ich morfologia.W przypadku wankomycyny część ścian komórkowych została uszkodzona, a niektóre komórki traktowane metronidazolem miały mniejszy rozmiar. Aby sprawdzić, czy rozmiar komórek uległ zmianie, przeanalizowano ich długość za pomocą programu Fiji. Jak pokazano na tym obrazie, rozmiar komórek wegetatywnych w grupie kontrolnej może się nieznacznie różnić, lecz większość z nich ma długość około 6 micrometers.Jak jednak pokazano na tym wykresie, długość komórek uległa zmianie w przypadku komórek traktowanych metronidazolem, ale nie w komórkach traktowanych wankomycyną. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż dwa dni. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, aby próbka była utrwalona i całkowicie sucha przed nakładaniem powłoki i obrazowaniem.Po przeprowadzeniu tej procedury możemy zastosować dodatkowe metody w celu udzielenia odpowiedzi na kolejne pytania, na przykład dotyczące tego, jak bakterie reagują na leczenie antybiotykami; może to dostarczyć nam pogłębionej wiedzy na temat mechanizmów działania antybiotyków. Technika ta ma ogromny potencjał i może utorować drogę badaczom w dziedzinie mikrobiologii do dalszego zgłębiania fizjologii i farmakologii Clostridium difficile. Mam nadzieję, że dzisiejszy materiał wideo był dla Państwa interesujący.Mam nadzieję, że dzięki temu dowiedzieli się Państwo, jak hodować i charakteryzować komórki C.difficile, jak analizować kinetykę zabijania przez antybiotyki w odniesieniu do C.Difficile, a następnie jak oceniać zmiany morfologiczne związane z tymi wzorcami zabijania przy użyciu zaawansowanej mikroskopii. Pracując z Clostridium difficile, musimy zachować szczególne środki ostrożności i stosować wszystkie środki ochronne

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Winston, J. A. i in. Model myszy leczonem cefoperazonu klinicznie istotnego szczepu Clostridium difficile R20291. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje ilościową identyfikację Clostridium difficile w próbkach kału z modelu zakażonej myszy za pomocą technik selektywnej hodowli. Określa procedury pobierania próbek, przetwarzania beztlenowego, rozcieńczania seryjnego oraz wyliczania kolonii w celu oceny kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz-patogen.

Ilościowa identyfikacja Clostridium difficile w próbkach kału z modelu zakażonego myszy

Ten film demonstruje test do pomiaru akumulacji fluorescencyjnego czujnika antybiotykowego w komórkach bakteryjnych. Narażenie na inhibitor pompy wypływowej zaburza transbłonowy gradient protonów w komórkach bakteryjnych, do których dodaje się antybiotyk sprzężony z fluoroforem. Hamowanie pomp wypływowych z powodu zaburzonego gradientu protonów powoduje akumulację antybiotyku wewnątrz bakterii. Komórki bakteryjne są poddawane lizie, a intensywność fluorescencji jest mierzona w celu...

Test do pomiaru akumulacji fluorescencyjnej sondy antybiotykowej w komórkach bakteryjnych

Clostridium difficile to bakteria chorobologiczna, która jest ściśle beztlenowca i powoduje biegunkę związaną z antybiotykami (AAD). Opisano tu metody izolacji, hodowli i utrzymania komórek wegetatywnych i zarodników C. difficile. Techniki te wymagają komory beztlenowej, która wymaga regularnej konserwacji w celu zapewnienia odpowiednich warunków do optymalnej uprawy C. difficile.

Hodowla i utrzymanie Clostridium difficile w środowisku beztlenowym

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Ten artykuł opisuje prostą metodę mikromacierzy białkowej do profilowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na 7-pleksowy panel wysoce oczyszczonych antygenów Clostridium difficile w surowicach ludzkich. Protokół może zostać rozszerzony w celu określenia swoistych odpowiedzi przeciwciał w preparatach poliklonalnej immunoglobuliny dożylnej.

Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Trwałość antybiotyku opisuje zdolność małych subpopulacji we wrażliwej populacji izogenicznej do przejściowego tolerowania wysokich dawek antybiotyków bakteriobójczych. Niniejszy protokół łączy podejścia do scharakteryzowania fenotypu trwałości antybiotyku na poziomie molekularnym i komórkowym po wystawieniu Escherichia coli na działanie śmiertelnych dawek ofloksacyny.

Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Ten artykuł skupia się na identyfikacji wysoce pewnych zestawów danych interakcji między białkami gospodarza i patogenu przy użyciu kombinacji dwóch ortogonalnych metod: drożdży dwuhybrydowych, a następnie wysokoprzepustowego testu interakcji w komórkach ssaków o nazwie HT-GPCA.

Podejście porównawcze do scharakteryzowania krajobrazu interakcji białko-białko gospodarz-patogen

Poznaj metodę mikroskopii elektronowej do obserwacji zmian morfologicznych Clostridium difficile pod wpływem antybiotyków. Technika łączy wysoką rozdzielczość obrazowania z hodowlą in vitro, dostarczając szczegółowych informacji o mechanizmie działania leków przeciwbakteryjnych i wspierając rozwój skuteczniejszych terapii zakażeń CDI.

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Przeglądaj więcej filmów