Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Ogólnym celem tej metody obrazowania mikrobiologicznego jest zapewnienie bardziej opisowych środków do rozróżnienia fenotypowych efektów leczenia farmakologicznego. Tak więc ta metoda może naprawdę pomóc w obszarze chorób zakaźnych. W szczególności przyglądamy się morfologicznym skutkom niektórych antybiotyków i temu, jak zabijają one C.Difficile.

Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy ona obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z technikami hodowli komórkowych in vitro, aby zapewnić szczegółowy obraz działania uśmiercania farmaceutycznego. Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na terapię zakażenia Clostridium difficile, w skrócie CDI. Powodem jest to, że technika ta może stanowić środek do określenia, w jaki sposób antybiotyk może być korzystny w leczeniu CDI.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w działanie farmakologiczne, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak model hodowli mieszanej lub badania na zwierzętach in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie zmagają się z tą nową metodą, ponieważ hodowla C. difficile i obsługa skaningowego mikroskopu elektronowego jest wyzwaniem. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy rozróżnić różne sposoby działania antybiotyków.

Chciałbym przedstawić Wam zespół badawczy, z którym się dzisiaj spotkacie. Jahangir Alam jest profesorem i mikrobiologiem. Koordynuje wszystkie działania laboratoryjne, które zobaczysz dzisiaj.

Tasnuva Rashid jest doktorantką w laboratorium. Na co dzień zajmuje się głównie mikrobiologią. Eugenie Bassere jest adiunktem na stażu podoktorskim.

Naprawdę nauczyła Tasnuvę wielu umiejętności, a także pomaga w laboratorium. Brad Endres to kolejny doktor habilitowany w laboratorium. Wykona wiele badań mikroskopowych z pomocą Long Changa.

Aby przygotować izolaty środowiskowe podczas noszenia sterylnych rękawiczek, użyj wstępnie wysterylizowanej bawełnianej gazy, aby przetrzeć powierzchnię dowolnego obszaru zainteresowania, takiego jak podłoga, drzwi, uchwyt lub półka. Następnie umieść wacik w wysterylizowanej probówce. Zmieniaj rękawiczki między próbkami.

Aby przygotować izolaty kliniczne, użyj pętli inokulacyjnej, aby umieścić od 10 do 100 miligramów klinicznych próbek kału na agarze z cyklosyną fruktozą cefoksytyny lub CCFA i intubować próbki w ścisłych warunkach beztlenowych przez 48 do 72 godzin. Izolowane kolonie C.Difficile należy przechowywać w fiolkach kriogenicznych w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do dalszych analiz. Wzbogać próbki wymazów środowiskowych w naparze z mózgiem, sercem lub bulionie BHI 05% taurocholanu sodu i umieść próbki w komorze beztlenowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć dni.

Odwirować jeden mililitr kultury przy 10 000 razy G i użyć 100 mikrolitrów etanolu do ponownego zawieszenia osadu. Umieść 50 mikrolitrów ponownie zawieszonych komórek na płytkach CCFA i inkubuj kultury w komorze beztlenowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin. Izolowane kolonie C. difficile należy przechowywać w fiolkach kriogenicznych w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do dalszych analiz.

Użyj odczynnika do aglutynacji lateksowej lub PCR, aby przetestować podejrzane kolonie C.difficile. Hoduj oczyszczone, środowiskowe lub kliniczne szczepy C.difficile na płytkach z agarem z krwią w komorze beztlenowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Użyj pętli inokulacyjnej, aby pobrać jedną izolowaną kolonię i przenieść ją do pięciu mililitrów pożywki BHI w 15-mililitrowej probówce.

Następnie hoduj kulturę w komorze beztlenowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Stosując świeży, wstępnie zredukowany BHIS uzupełniony taurocholanem sodu i odpowiednim stężeniem antybiotyku w celu rozcieńczenia kultur wstępnych od 1 do 100 do około 10 do szóstej CFU na mililitr. Za pomocą pipety pobrać jednomililitrową próbkę w każdym punkcie czasowym i na każdej płytce lub rozprowadzić małą porcję na płytce z agarem z krwią.

Inkubować płytkę przez 48 godzin w komorze beztlenowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i policzyć otrzymaną liczbę kolonii, aby określić jtk. Zbierz jeden mililitr komórek z każdego punktu czasowego w probówkach do mikrowirówek i wiruj przy 10 000 razy G przez 10 minut. Odrzucić supernatant i użyć PBS do przemycia komórek.

Ponownie odwirować próbki i wyrzucić supernatant. Następnie użyj jednego mililitra 4% paraformaldehydu, aby ponownie rozcieńczyć komórki i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po ponownym odwirowaniu próbek i odrzuceniu supernatantu, należy użyć wody destylowanej do dwukrotnego umycia komórek przed ponownym rozcieńczeniem komórek w 100 mikrolitrach wody destylowanej.

Dostosuj objętość w zależności od zmętnienia roztworu. Po oznaczeniu szkiełek nakrywkowych dodaj na nie 40 mikrolitrów próbki. Pod okapem przepływowym inkubować szkiełka nakrywkowe przez 15 minut, aby odparować płyn i pozwolić komórkom przylgnąć do szkła.

Jeśli płyn jest nadal obecny, użyj dmuchawy, aby go usunąć. Umieść szkiełka nakrywkowe w maszynie do napylania biurkowego i przyklej je taśmą. Zabezpiecz czyste złoto w maszynie do napylania.

Następnie włącz maszynę i rozpocznij rozpylanie pod niskim ciśnieniem. Pokryj komórki przez 30 sekund przy 80 mikroamperach, co przekłada się na 20 nanometrów złotej powłoki. Aby rozpocząć obrazowanie, najpierw należy prawidłowo odpowietrzyć SEM w oprogramowaniu komputerowym, naciskając przycisk Vent.

Po pokryciu ogniw przenieś je do skaningowego mikroskopu elektronowego lub SEM. Za pomocą taśmy węglowej przymocuj powlekane szkiełka pokrywy do metalowego stolika. Po odpowietrzeniu SEM drzwi powinny się łatwo otworzyć.

Zablokuj metalowy stolik w komorze SEM, przykręcając go. Następnie kliknij przycisk Pompa w oprogramowaniu. Gdy system odczyta się prawidłowo, SEM będzie gotowy do użycia.

W zakładce Detektor kliknij detektor SE. Włącz wiązkę, klikając przycisk, który wyświetla napięcie. Rozpocznij obrazowanie przy niższym napięciu przed zwiększeniem napięcia.

Po włączeniu wiązki pojawi się obraz. Korzystając z funkcji śledzenia, znajdź obszar na powlekanych szkiełkach okładkowych do obrazu. Powiększ region i znajdź struktury w kształcie prętów, które reprezentują Clostridium difficile.

Aby skalibrować system, powiększ obraz, zgrubnie ustaw ostrość obrazu i połącz Z ze swobodną odległością roboczą. Należy to zrobić w wielu odległościach roboczych, na przykład na 15, 9 i 5 milimetrach. Następnie przełącz się na tryb obrazowania o ultrawysokiej rozdzielczości.

Użyj przełączników zgrubnej i precyzyjnej ostrości, aby rozpocząć ustawianie ostrości przy dużym powiększeniu. Dostosuj przełączniki astygmatyzmu, aby uzyskać wyraźniejszy obraz, i sprawdź obraz pod kątem klarowności, używając oprogramowania komputerowego do cyfrowego powiększenia obrazu. Użyj powolnego skanowania, aby zebrać obraz wysokiej jakości.

Zapisz zebrany obraz jako plik TIFF do późniejszej analizy, upewniając się, że pasek danych jest zaznaczony, jeśli pomiary będą wykonywane podczas analizy. Zbieraj obrazy pod różnymi kątami, aby odsłonić więcej informacji o głębi, przechylając stolik na SEM. Zoptymalizuj ostrość i astygmatyzm przed zebraniem obrazu z powolnego skanowania.

Po zakończeniu obrazowania wyłącz wiązkę i zwiększ odległość roboczą do 20 milimetrów. Następnie odpowietrz komorę i zdejmij stopień. Przetwórz obrazy, otwórz pliki obrazów na Fidżi.

Korzystając z funkcji linii, precyzyjnie prześledź podziałkę liniową. Kliknij kartę Analizuj; a następnie wybierz funkcję Wybierz skalę. Pojawi się okno, które będzie wymagało ustawienia znanej odległości na podstawie podziałki liniowej.

Zmień również jednostkę długości i kliknij przycisk OK. Na koniec, aby zmierzyć długość komórki, użyj funkcji linii, aby prześledzić komórkę w całości. Ponownie wybierz kartę Analizuj, a następnie kliknij miarę.

Długość powinna pojawić się w jednostkach oznaczonych wcześniej. Obrazy te pokazują komórki wegetatywne C.difficile, które zostały przechwycone podczas wykładniczej fazy krzywej wzrostu, a także komórki przetrwalnikowe. Komórki wegetatywne to długie, gładkie struktury w kształcie pręcików; Natomiast zarodniki to małe owalne struktury, które mają szorstką powierzchnię zewnętrzną.

Jak pokazano na tym rysunku, komórki kontrolne rosną i osiągają plateau; podczas gdy komórki leczone antybiotykami wankomycyną i metronidazolem zmniejszają całkowitą liczbę CFU do granicy wykrywalności, co wskazuje na działanie bakteriobójcze. Jak wykazano, wankomycyna i metronidazol są skuteczne w zabijaniu C. difficile w stężeniach super MIC. Aby zademonstrować użyteczność stosowania SEM do obrazowania C.difficile, komórki zobrazowano przed i po leczeniu farmakologicznym, aby określić, jak zmieniła się morfologia.

W przypadku wankomycyny niektóre ściany komórek były uszkodzone, a niektóre komórki leczone metronidazolem były mniejsze. Aby sprawdzić, czy rozmiar komórki został zmieniony, długość komórki przeanalizowano za pomocą programu Fiji. Jak pokazano na tym obrazie, rozmiar komórki wegetatywnej może się nieco różnić w przypadku kontrolnym; ale większość z nich ma około 6 mikrometrów długości.

Jednak, jak pokazano na tym wykresie, długość komórki miała wpływ w komórkach leczonych metronidazolem, ale nie w komórkach leczonych wankomycyną. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwa dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że próbka jest utrwalona i całkowicie sucha przed nałożeniem powłoki i obrazowaniem.

Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy wykonać dodatkowe metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak bakterie zareagują na leczenie antybiotykami; A to może dać nam nieco więcej wglądu w zrozumienie mechaniki działania na przykład antybiotyków. Technika ta ma ogromny potencjał i może utorować drogę naukowcom w dziedzinie mikrobiologii do dalszego badania fizjologii i farmakologii Clostridium difficile. Mam nadzieję, że podobał Ci się dzisiejszy film.

Mam nadzieję, że to, co dzięki temu zyskałeś, to jak hodować i charakteryzować komórki C.difficile, jak patrzeć na kinetykę zabijania antybiotyków przeciwko C. Difficile, a następnie jak ocenić zmiany morfologiczne związane z tymi wzorcami zabijania za pomocą mikroskopii wysokiego poziomu. Podczas pracy z Clostridium difficile musimy podjąć dodatkowe środki ostrożności i stosować wszelkie środki ochronne