Name: Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę oceny łagodzącego działania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej u myszy. Protokół wykorzystuje model kolitry indukowanej DSS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były przynajmniej częściowo wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (K.S., grant nr 32000081), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Anhui (K.S., grant nr 1908085QC120), Program Projektów Otwartych Państwowego Kluczowego Laboratorium Nauk i Technologii Żywności, Uniwersytet Jiangnan (K.S., grant nr SKLF-KF-201920), Fundację Nauk Przyrodniczych Chińskich Instytucji Szkolnictwa Wyższego Anhui (K.S., Nr dotacji KJ2019A0040), Doktorancka Fundacja Badań Naukowych Uniwersytetu Anhui (K.S., grant nr J01003316 ), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (Y.W., grant nr 31770066, 31470218), Otwarty Fundusz Budowy Dyscypliny, Instytut Nauk Fizycznych i Technologii Informacyjnych Uniwersytetu Anhui (Y.W.) oraz Program Wybitnych Talentów Uniwersytetu Anhui w Chinach (Y.W.).

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Anhui w Chinach, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Anhui w Chinach (nr 1). IACUC(AHU)-2020-014).
1. Podawanie antybiotyków
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl antybiotyków, rozpuszczając ampicylinę (1 g/l), siarczan neomycyny (1 g/l), metronidazol (0,5 g/l) i wankomycynę (0,5 g/l) w 1 l wody pitnej5.</li>
	<li>Po całkowitym rozpuszczeniu roztwory przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wlej roztwory koktajli antybiotykowych do butelki z wodą. Umieść butelkę na klatce na mysz. UWAGA: Upewnij się, że używasz brązowych butelek lub owiń butelki folią aluminiową, aby chronić roztwory antybiotyków przed światłem.</li>
	<li>Zastąp koktajl antybiotykowy świeżymi roztworami 2 razy w tygodniu.</li>
	<li>Pozwól myszom swobodnie pić roztwory koktajli antybiotykowych przez 4 tygodnie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie wody pitnej DSS i indukcja zapalenia jelita grubego
<ol>
	<li>Aby przygotować 2,5% roztwór siarczanu dekstranu sodu (DSS), rozpuść 2,5 g DSS w 100 ml wody destylowanej11.</li>
	<li>Zastąp wodę pitną 2,5% roztworem DSS w grupie myszy z zapaleniem jelita grubego. Upewnij się, że myszy z grupy zapalenia jelita grubego nie mają dostępu do innej wody pitnej. W międzyczasie potraktuj myszy kontrolne wodą destylowaną bez DSS.</li>
	<li>Trzymanie w pomieszczeniach domowych samców myszy C57BL/6J (średnia masa ciała, 20 g ± 2 g; w wieku 7 tygodni) w warunkach wolnych od patogenów ze swobodnym dostępem do standardowego pożywienia i wody. UWAGA: Trzymaj w sumie pięć myszy w klatce w warunkach wolnych od patogenów.</li>
	<li>Projekt eksperymentalny UWAGA: Eksperymenty na zwierzętach zostały zaprojektowane w dwóch etapach. Do każdej grupy dołączono pięć myszy.<ol>
		<li>Pierwszy etap: Aby ocenić pozytywny wpływ B. cereus na łagodzenie zapalenia jelita grubego, losowo przypisz myszy do następujących trzech grup: grupa kontrolna (kontrolna), model zapalenia jelita grubego wywołanego DSS (DSS), suplementacja probiotykiem B. cereus dla myszy indukowanych DSS (B. cereus).</li>
		<li>Drugi etap: Aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w regulacji probiotycznego działania B. cereus na zapalenie jelita grubego wywołane DSS, losowo przypisz myszy do następujących trzech grup: ABX (kontrola), ABX (DSS) i ABX (B. cereus + DSS).<ol>
			<li>Potraktuj myszy w grupie ABX (kontrolnej) solą fizjologiczną.</li>
			<li>Po leczeniu roztworami koktajli antybiotykowych przez 4 tygodnie, pozwól myszom z grupy ABX (DSS) otrzymywać wodę zawierającą 2,5% DSS przez 1 tydzień i normalną sól fizjologiczną przez 2 tygodnie.</li>
			<li>Po leczeniu roztworami koktajli antybiotykowych i wodą DSS, myszy z grupy ABX (B. cereus + DSS) należy codziennie traktować B. cereus (2 x 108 komórek) w 200 μl soli fizjologicznej za pomocą kaniuli dożołądkowej przez 2 tygodnie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po podaniu koktajlu antybiotykowego należy natychmiast potraktować samce myszy C57BL/6 2,5% roztworem DSS w wodzie pitnej przez 7 dni.</li>
	<li>Zapisz masę ciała myszy przed interwencją DSS jako masę wyjściową.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja B. cereus 
<ol>
	<li>Przygotuj osiem probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wypełnionych 900 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl logarytmicznego wzrostu B. cereus i rozpuścić w 900 μl sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć B. cereus za pomocą probówek.</li>
	<li>Umieścić 40 μl każdego rozcieńczenia na odpowiedniej płytce agarowej LB oznaczonej stosunkiem rozcieńczenia. Powtórzyć 3 razy dla każdego stosunku rozcieńczenia.</li>
	<li>Hodować płytki w inkubatorze o stałej temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Wybierz płytki z ~20-70 koloniami do zliczenia. Obliczyć średnie stężenie bakterii na podstawie wielokrotności rozcieńczenia wybranych płytek.</li>
</ol>
4. Przygotowanie B. cereus do głębnika
<ol>
	<li>Po ilościowym określeniu B. cereus zebrać 1 ml pożywki B. cereus zawierającej 1 x 109 jtk i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut. Następnie przemyć komórki bakteryjne 2x sterylną wodą przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Rozcieńczyć zagęszczony B. cereus sterylnym roztworem soli fizjologicznej do końcowego stężenia 2 x 108 CFU/200 μL4.</li>
	<li>Kilkakrotnie pipetować rozcieńczenie w górę i w dół, aby uzyskać rozproszoną zawiesinę B. cereus .</li>
	<li>Przeprowadzić ilościowe określenie stężenia B. cereus za pomocą techniki liczenia płytek przed zakończeniem metody zgłębnika.</li>
</ol>
5. Stosowanie suplementów B. cereus przez zgłębnik
<ol>
	<li>Podawaj interwencje (2 x 10 probiotyków8 CFU w 200 μl soli fizjologicznej) myszom przez zgłębnik doustny o określonej porze.</li>
	<li>Aby podać B. cereus, podłącz igłębnik (rozmiar igły do karmienia: 20 G, 38 mm) do strzykawki o pojemności 1 ml. Przetrzyj zewnętrzną część igły do zgłębnika 70% etanolem między myszami i utrzymuj prawidłowe stosowanie dawki.</li>
	<li>Aby powstrzymać myszy, podnieś je za ogon i mocno chwyć luźną skórę grzbietu, tak aby koniec ogona był przymocowany między dwoma ostatnimi palcami przewodnika.</li>
	<li>Trzymaj myszy w pozycji pionowej. Następnie ostrożnie i delikatnie włóż igłębkę przez usta do przełyku. Jeśli na tym etapie nie napotkasz oporu, delikatnie wepchnij igłę do żołądka. UWAGA: Potwierdź regularne i niezakłócone oddychanie myszy przed podaniem leku.</li>
	<li>Powoli przesuwać igłę i podawać roztwór B. cereus . Delikatnie wyjąć igłę po zakończeniu wbijania. Zwolnij mysz i umieść ją z powrotem w klatce.</li>
</ol>
6. Określenie wskaźnika aktywności choroby
UWAGA: Wskaźnik aktywności choroby (DAI) był obliczany codziennie na podstawie utraty masy ciała myszy, krwi utajonej w kale i konsystencji stolca.
<ol>
	<li>Codziennie mierz masę ciała myszy. Przypisz każdej myszy wynik 0-4 na podstawie procentowej utraty masy ciała (0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-10%, 3: 11%-18% i 4: >18%).</li>
	<li>Zbierz świeże próbki kału od każdej myszy. Użyj bawełnianego wacika, aby stymulować skurcz odbytu, aby ułatwić wypróżnianie. Następnie natychmiast po wypróżnieniu należy pobrać próbki kału do wysterylizowanej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Określ krew utajoną w kale za pomocą papieru testowego na krew utajoną w kale. Pobrać 10 mg próbki kału na patyczek z aplikatorem.</li>
	<li>Umieść próbkę na karcie testowej i nałóż cienki rozmaz na kartę. Otwórz tylną klapkę i nałóż wywoływacz na rozmaz.</li>
	<li>Następnie oceń krew utajoną za pomocą papieru testowego na krew utajoną w stolcu w ciągu 120 sekund. UWAGA: Każdy ślad koloru niebieskiego na lub na krawędzi rozmazu jest pozytywny dla krwi utajonej. Wyniki okultyzmu kału były następujące: 0: brak, 1: hemokultyzm dodatni, 2: niewielki, 3: ślady krwi w stolcu i 4: duże krwawienie.</li>
	<li>Zidentyfikuj konsystencję kału, wykrywając próbkę kału11. Przypisz wynik od 0 do 4 (0: normalny, 1: luźne stolce, 2: częściowo uformowane stolce, 3: płynne stolce i 4: biegunka).</li>
</ol>
7. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 10% hydratu chloralu (10 mg / kg) na koniec pierwszego i drugiego etapu eksperymentu. Oceń głębokość znieczulenia u myszy za pomocą odruchu wycofania szczypania.</li>
	<li>Następnie poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Zamocuj myszy na wznak na stole operacyjnym i otwórz jamę otrzewnej.</li>
	<li>Oddziel chirurgicznie całą okrężnicę i zmierz długość linijką.</li>
	<li>Następnie delikatnie umyj okrężnicę strzykawką o pojemności 5 ml wypełnioną wstępnie schłodzonym PBS.</li>
</ol>
8. Ocena uszkodzeń histologicznych
<ol>
	<li>Pokrój tkankę jelita grubego na małe fragmenty, utrwal je w 4% paraformaldehydzie i zanurz w parafinie za pomocą maszyny do zatapiania tkanek.</li>
	<li>Następnie należy przeciąć tkanki zatopione w parafinie za pomocą mikrotomu, aby przygotować skrawki tkanki okrężnicy o grubości 4 μm. Odwoskować i odwodnić odcinki jelita grubego. Następnie wybarwić odcinki jelita grubego hematoksyliną i eozyną (H&E). UWAGA: Barwione próbki jelita grubego są oceniane przez badacza za pomocą systemu dla następujących pomiarów: stopień naciekania komórek zapalnych (brak: 0, łagodny: 1, umiarkowany: 2, ciężki: 3), uszkodzenie błony śluzowej (brak: 0, warstwa śluzowa: 1, błona podśluzowa: 2, mięśnie i błona surowicza: 3), uszkodzenie krypty (brak: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, całe: 3, utrata całego + nabłonka: 4), zakres zmian (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). Całkowita ocena uszkodzeń histologicznych jest obliczana dla każdego indywidualnego wyniku powyższych pomiarów5.</li>
	<li>Niech dwóch niezależnych eksperymentatorów oceni (zaślepi) wyniki histologiczne próbki pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>

<ol><li>Pittayanon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gut+microbiota+in+patients+with+vs+without+inflammatory+bowel+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differences in gut microbiota in patients with vs without inflammatory bowel diseases: A systematic review.</a> Gastroenterology. 158 (4), 960-946 (2020).</li>
<li>Kuehn, F., Hodin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+modern+drug+therapy+on+surgery%3A+Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of modern drug therapy on surgery: Ulcerative colitis.</a> Visceral Medicine. 34 (6), 426-431 (2018).</li>
<li>Harmand, P. -O., Solassol, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiopurine+drugs+in+the+treatment+of+ulcerative+colitis%3A+Identification+of+a+novel+deleterious+mutation+in+TPMT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Thiopurine drugs in the treatment of ulcerative colitis: Identification of a novel deleterious mutation in TPMT.</a> Genes. 11 (10), 1212(2020).</li>
<li>Sheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synbiotic+supplementation+containing+Bifidobacterium+infantis+and+xylooligosaccharides+alleviates+dextran+sulfate+sodium-induced+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Synbiotic supplementation containing Bifidobacterium infantis and xylooligosaccharides alleviates dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis.</a> Food & Function. 11 (5), 3964-3974 (2020).</li>
<li>Sheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+Bacillus+cereus+alleviates+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+in+mice+through+improvement+of+the+intestinal+barrier+function%2C+anti-inflammation%2C+and+gut+microbiota+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probiotic Bacillus cereus alleviates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice through improvement of the intestinal barrier function, anti-inflammation, and gut microbiota modulation.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (49), 14810-14823 (2021).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRKAR2A+deficiency+protects+mice+from+experimental+colitis+by+increasing+IFN-stimulated+gene+expression+and+modulating+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">PRKAR2A deficiency protects mice from experimental colitis by increasing IFN-stimulated gene expression and modulating the intestinal microbiota.</a> Mucosal Immunology. 14 (6), 1282-1294 (2021).</li>
<li>Souza, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+resulting+from+oral+administration+of+Escherichia+coli+Nissle+1917+on+a+chronic+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Beneficial+Microbes%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects resulting from oral administration of Escherichia coli Nissle 1917 on a chronic colitis model.</a> Beneficial Microbes. 11 (8), 779-790 (2020).</li>
<li>Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+high-throughput+model+for+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a high-throughput model for host-microbiota interactions.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 751(2017).</li>
<li>Liang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+potential+to+reconstitute+a+microbe+community+in+pseudo+germ-free+mice+after+fecal+microbe+transplant+from+equol+producer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Colonization potential to reconstitute a microbe community in pseudo germ-free mice after fecal microbe transplant from equol producer.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 1221(2020).</li>
<li>Hernandez-Chirlaque, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-free+and+antibiotic-treated+mice+are+highly+susceptible+to+epithelial+injury+in+DSS+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohns+%26+Colitis%22%5BJournal%5D)">Germ-free and antibiotic-treated mice are highly susceptible to epithelial injury in DSS colitis.</a> Journal of Crohns & Colitis. 10 (11), 1324-1335 (2016).</li>
<li>Sheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grape+seed+proanthocyanidin+extract+ameliorates+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis+through+intestinal+barrier+improvement%2C+oxidative+stress+reduction%2C+and+inflammatory+cytokines+and+gut+microbiota+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Grape seed proanthocyanidin extract ameliorates dextran sulfate sodium-induced colitis through intestinal barrier improvement, oxidative stress reduction, and inflammatory cytokines and gut microbiota modulation.</a> Food & Function. 11 (9), 7817-7829 (2020).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+ultrastructural+changes+of+the+colon+in+dextran+sodium+sulfate-induced+mouse+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Histological and ultrastructural changes of the colon in dextran sodium sulfate-induced mouse colitis.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 20 (3), 1987-1994 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jianpi+Qingchang+decoction+alleviates+ulcerative+colitis+by+inhibiting+nuclear+factor-kappa+B+activation%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Jianpi Qingchang decoction alleviates ulcerative colitis by inhibiting nuclear factor-kappa B activation.</a> World Journal of Gastroenterology. 23 (7), 1180-1188 (2017).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptoms+of+anxiety%2Fdepression+is+associated+with+more+aggressive+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Symptoms of anxiety/depression is associated with more aggressive inflammatory bowel disease.</a> Scientific Reports. 11, 1440(2021).</li>
<li>Thippeswamy, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+embelin+against+acetic+acid+induced+ulcerative+colitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Protective effect of embelin against acetic acid induced ulcerative colitis in rats.</a> European Journal of Pharmacology. 654 (1), 100-105 (2011).</li>
<li>Sakai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astaxanthin%2C+a+xanthophyll+carotenoid%2C+prevents+development+of+dextran+sulphate+sodium-induced+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Biochemistry+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Astaxanthin, a xanthophyll carotenoid, prevents development of dextran sulphate sodium-induced murine colitis.</a> Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. 64 (1), 66-72 (2019).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gut+microbiota+in+the+anti-colitic+effects+of+anthocyanin-containing+potatoes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+%26+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Role of gut microbiota in the anti-colitic effects of anthocyanin-containing potatoes.</a> Molecular Nutrition & Food Research. 65 (24), 2100152(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby zastosować probiotyki w badaniach klinicznych, konieczna jest ocena skuteczności i bezpieczeństwa probiotyków na modelach zwierzęcych. Dostarczone protokoły zostały wcześniej zoptymalizowane pod kątem oceny ciężkości zapalenia jelita grubego. Myszy leczone DSS to model zapalenia jelit, który naśladuje cechy kliniczne i histologiczne charakterystyczne dla wrzodziejącego zapalenia jelita grubego12. Myszy modelowe z ostrym zapaleniem jelita grubego charakteryzują się utratą masy ciała, biegunką, ...

Nieswoiste zapalenia jelit (IBD) są częstymi przewlekłymi zaburzeniami zapalnymi przewodu pokarmowego, w tym chorobą Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (WZJ)1. Obecne drogi terapeutyczne zapalenia jelita grubego to 5-aminosalicylany, kortykosteroidy, azatiopryna i antybiotyki2. Co więcej, leki te mają znaczne skutki uboczne3. Dlatego powinniśmy zwrócić większą uwagę na wpływ probiotyków na leczenie zapalenia jelita grubego.
Alternatywne podejścia terapeutyczne obejmują podawanie probiotyków, które były stosowane w modelach zwierzęcych i badaniach klinicznych. Wcześniejsze badania wykazały, że różne rodzaje podawania probiotyków, takich jak Bacillus cereus lub Bifidobacterium infantis, mogą złagodzić zapalenie jelita grubego 4,5. W badaniach przedklinicznych skuteczność i bezpieczeństwo probiotyków muszą być badane na modelach zwierzęcych.
Mysie modele zapalenia jelita grubego z siarczanem sodu dekstranu (DSS) mogą pomóc w zbadaniu mechanizmów zapalenia jelita grubego i ocenie pozytywnych skutków probiotyków. Indukcja DSS powoduje nadżerki błony śluzowej jelit, dysfunkcję bariery jelitowej i zwiększenie przepuszczalności nabłonka jelitowego6. Większość mysich modeli probiotyków podkreślała głównie efekty biologiczne. Jednak mechanizm stojący za podawaniem tego probiotyku jest trudny do zbadania, biorąc pod uwagę ograniczenia w dalszej weryfikacji związku przyczynowego między probiotykami a łagodzeniem zapalenia jelita grubego. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania ustandaryzowanej metody badania mechanizmu działania probiotyków.
Tradycyjnie, badania te wymagają zaszczepienia pewnych probiotyków myszom wolnym od zarazków7. Istnieją jednak pewne ograniczenia laboratoryjne w stosowaniu myszy wolnych od zarazków jako receptorów dla probiotyków, takie jak niska zdolność immunologiczna i drogie urządzenia wolne od zarazków8. Aby uniknąć tych ograniczeń, stworzono alternatywny model zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS przy użyciu myszy wolnych od pseudozarazków. Model myszy wolny od pseudo-zarazków został ustalony przez zastosowanie antybiotyków, jak opisano wcześniej 9,10.
W tym artykule ustalamy myszy wolne od pseudozarazków za pomocą koktajlu antybiotykowego. Szczegółowo opisujemy również metodologię tworzenia i oceny modeli zapalenia jelita grubego u myszy oraz badamy wpływ probiotyków na łagodzenie objawów zapalenia jelita grubego. Poniższy protokół podaje również metody dostarczania probiotyków przez zgłębnik.

<table><tbody><tr><td>0,01 M PBS (proszek, pH 7,2 i ndash; 7.4)</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>Zobacz materiał P1010-2L</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy bezwodny</td><td>Cicho</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do różnicowania kwasowego alkoholu fsat</td><td>Beyotime</td><td>Nr C0163S</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotechnologia</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Ampicyliny</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>69-53-4</td><td>Przechowuj pod adresem 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Inkubator beztlenowy</td><td>Długa Yue</td><td>Zobacz materiał LA1-3T</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu, sól sodowa, stopień zapalenia jelita grubego</td><td>MP Biomedycyna</td><td>160110</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator elektrotermiczny</td><td>SANFA (Organizacja Zdrowia)</td><td>HP-050A</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizator tkankowy ogólnego przeznaczenia</td><td>Ostrze biologiczne</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>Gliceryna</td><td>Cicho</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny</td><td>Beyotime</td><td>Nr C0105</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy Kissera</td><td>Beyotime</td><td>Nr C0181</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>443-48-1</td><td>Przechowuj pod adresem 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Siarczan neomieliny</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>1405-10-3</td><td>Przechowuj pod adresem 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Inkubator oscylacyjny</td><td>Szanghaj Zhichu</td><td>ZQLY-180S</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sangon Biotechnologia</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Papier testowy na krew utajoną stolca</td><td>Baso (Wieża)</td><td>BA2020B</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID (OXOID)</td><td>2285856</td><td></td></tr><tr><td>Wankomycyna</td><td>Solarbio (Słoneczna Biologia)</td><td>1404-93-9</td><td>Przechowuj pod adresem 2&ndash; 8 & stopnie; C</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Cicho</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sangon Biotechnologia</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie łagodzącego wpływu podawania bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Investigating the Alleviating Effects of Bacillus cereus Administration on Colitis through Gut Microbiota Modulation

Uważa się, że dysbioza mikrobioty jelitowej odgrywa rolę w postępie zapalenia jelita grubego. Jednak dokładne standardy podawania probiotyków w łagodzeniu zapalenia jelita grubego pozostają nieokreślone. Większość metod analizy opiera się na ograniczonej różnorodności i obfitości mikroorganizmów jelitowych. Dlatego badania obserwacyjne nie mogą ustalić związku przyczynowego. W tym badaniu zastosowaliśmy wywołane antybiotykami myszy wolne od pseudozarazków, aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w regulacji probiotycznego działania Bacillus cereus (B. cereus) na zapalenie jelita grubego wywołane siarczanem dekstranu sodu (DSS) u myszy. Proces ten pozwala na ocenę dwukierunkowego wpływu regulacyjnego suplementacji B. cereus na zdrowie i zapewnia stabilne i powtarzalne wyniki. Tutaj znajdują się szczegółowe protokoły hodowli B. cereus , operacji przez zgłębnik, pobierania kału i leczenia antybiotykami u myszy z zapaleniem jelita grubego. Metody optymalizacyjne mają również zastosowanie w przypadku innych przewlekłych zaburzeń związanych ze stanem zapalnym. Wyniki wykazały, że podawanie B. cereus zmniejszyło utratę masy ciała, skrócenie długości jelita grubego, wskaźnik aktywności choroby i wyniki histopatologiczne. Jednak leczenie antybiotykami stłumiło pozytywny wpływ B. cereus na zapalenie jelita grubego. Wyniki te wskazują, że mikrobiota jelitowa jest potrzebna do łagodzenia wpływu B. cereus na zapalenie jelita grubego. Dlatego badanie korzystnego wpływu probiotyków w tym badaniu jest obiecującym podejściem do opracowywania nowych strategii leczenia w celu złagodzenia objawów przewlekłych zaburzeń związanych ze stanem zapalnym.

B. suplementacja cereus i zapalenie jelita grubego Eksperymentalny model ostrego zapalenia jelita grubego został wywołany przez interwencję DSS w wodzie pitnej. Rycina 1A przedstawia eksperymentalny protokół podawania B. cereus mysiemu modelowi zapalenia jelita grubego. Indukcja DSS oczywiście zmniejszyła masę ciała (ryc. 1B) i długość okrężnicy. Łagodzące działanie B. cereus poprzez zgłębnik doustny badano na model...

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Gut microbiota dysbiosis is thought to exert a role in the progression of colitis. However, the precise standards for probiotic administration in ...

Protokół ten pozwala na ocenę dwukierunkowego wpływu regulacyjnego suplementacji probiotykami na zdrowie oraz stabilne i powtarzalne wyniki. Alternatywny model zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS został opracowany przy użyciu myszy wolnych od pseudozarazków, aby uniknąć pewnych ograniczeń laboratoryjnych w stosowaniu myszy wolnych od zarazków jako receptorów dla probiotyków. Aby zbadać korzystne działanie probiotyków w tej technice, jest to obiecujące podejście do opracowywania nowych strategii leczenia w celu złagodzenia objawów przewlekłych zaburzeń związanych ze stanem zapalnym.Na początek przygotuj koktajl antybiotyków, rozpuszczając ampicylinę, siarczan neomycyny, metronidazol i wankomycynę w wodzie pitnej. Po całkowitym rozpuszczeniu roztwory przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wlej roztwory koktajli antybiotykowych do butelki z wodą.Upewnij się, że używasz brązowych butelek lub owiń butelki folią aluminiową, aby chronić roztwory antybiotyków przed światłem. Umieść butelkę na klatce na mysz. Aby uzyskać 2,5% roztwór siarczanu sodu dekstranu, rozpuść 2,5 grama DSS w 100 mililitrach wody destylowanej.Zastąp wodę pitną 2,5% roztworem DSS w grupie myszy z zapaleniem jelita grubego. Aby ocenić pozytywny wpływ B cereus na łagodzenie zapalenia jelita grubego, losowo przypisz myszy do następujących trzech grup: grupy kontrolnej, modelu zapalenia jelita grubego wywołanego DSS i suplementacji probiotyku B cereus dla myszy indukowanych DSS. Aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w regulacji probiotycznego wpływu B cereus na zapalenie jelita grubego wywołane DSS, losowo przypisz myszy do następujących trzech grup: ABX/kontrola, ABX/DSS i ABX/B cereus plus DSS.Zapisz masę ciała myszy jako masę wyjściową po podaniu koktajlu antybiotykowego. Natychmiast potraktuj samca sześciu myszy C 57 BL 2,5% roztworem DSS w wodzie pitnej przez siedem dni. Przygotuj osiem 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych wypełnionych 900 mikrolitrami sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej.Odpipetować 100 mikrolitrów logarytmicznego wzrostu B cereus i rozpuścić w 900 mikrolitrach sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej. Seryjnie rozcieńczyć B cereus za pomocą probówek. Umieścić 40 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na odpowiedniej płytce agarowej LB oznaczonej stosunkiem rozcieńczenia.Powtórzyć trzy razy dla każdego stosunku rozcieńczenia. Hoduj płytki w inkubatorze o stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Wybierz płytki z około 20 do 70 koloniami do zliczenia.Po ilościowym określeniu B cereus zebrać jeden mililitr pożywki B cereus zawierającej jeden razy 10 do dziewiątej CFU i odwirować przy 8 000 G przez 10 minut. Następnie przemyć komórki bakteryjne dwa razy sterylną wodą, odwirowując do 8 000 G przez 10 minut i usunąć supernatant. Rozcieńczyć skoncentrowany zbożowy B sterylnym roztworem soli fizjologicznej do końcowego stężenia dwa razy 10 do ósmego CFU na 200 mikrolitrów.Kilkakrotnie pipetować rozcieńczenie w górę i w dół, aby uzyskać rozproszoną zawiesinę B cereus. Przetrzeć zewnętrzną część igły do zgłębnika 70% etanolem i utrzymać prawidłowe stosowanie dawki. Aby powstrzymać myszy, podnieś je za ogon i mocno chwyć luźną skórę grzbietu, tak aby koniec ogona znajdował się między dwoma ostatnimi palcami przewodnika.Trzymaj myszy w pozycji pionowej. Następnie ostrożnie i delikatnie wbij igłębkę przez usta do przełyku. Podaj roztwór B cereus, delikatnie wyjmij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce.Codziennie mierz masę ciała myszy i natychmiast zbieraj próbki kału do wysterylizowanej probówki wirówkowej. Określ krew utajoną w kale za pomocą papieru testowego na krew utajoną w kale. Zbierz 10 miligramów próbki kału na patyczek z aplikatorem.Umieść próbkę na karcie testowej i nałóż cienki rozmaz na kartę. Otwórz tylną klapkę i nałóż wywoływacz na rozmaz. Zamocuj myszy na wznak na stole operacyjnym i otwórz jamę otrzewnej.Oddziel chirurgicznie całą okrężnicę i zmierz długość linijką. Następnie delikatnie umyj okrężnicę pięciomililitrową strzykawką wypełnioną wstępnie schłodzonym PBS. Usuń wosk i nawilż odcinki jelita grubego.Następnie wybarwić odcinki okrężnicy hematoksyliną i eozyną. Niech dwóch niezależnych eksperymentatorów oceni wyniki histologiczne próbki pod mikroskopem świetlnym, barwienie hematoksyliną i eozyną ujawniło, że tkanka okrężnicy myszy modelowych z zapaleniem jelita grubego wykazywała utratę krypty, uszkodzenie komórek kubkowych, naciek komórek zapalnych i utratę nabłonka. Leczenie B cereus poprawiło uszkodzenia histopatologiczne wywołane przez DSS.Wyniki histopatologiczne myszy z zapaleniem jelita grubego były istotnie wyższe niż w grupie kontrolnej. Jednak wyniki histopatologiczne w grupie B cereus były znacznie niższe niż u myszy z zapaleniem jelita grubego. Myszy zostały losowo przydzielone do trzech grup, utrata masy ciała, wyniki DAI i wyniki histopatologiczne były wyższe, a długość okrężnicy była krótsza w grupie ABX / DSS w porównaniu z myszami w grupie ABX / kontrolnej.Utrata masy ciała, długość jelita grubego, wyniki DAI i wyniki histopatologiczne nie różniły się statystycznie między grupami ABX/DSS i ABX/B cereus plus DSS. Obecne wyniki pośrednio sugerują, że mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w pozytywnym wpływie B cereus na zapalenie jelita grubego. Jednym z najważniejszych kroków jest wykorzystanie Bacillus cereus metodą zgłębnika do skonstruowania modelowania zapalenia jelita grubego u myszy.Leczenie Bacillus cereus wyeliminowało zapalenie jelita grubego wywołane przez DSS, co stworzyło podstawy do dalszych badań nad probiotykami w leczeniu zapalenia jelita grubego.

investigating-alleviating-effects-bacillus-cereus-administration-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Sorokulova, I., et al. Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia szczury wstępnie potraktowane pożytecznymi bakteriami lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i wystawione na stres cieplny w celu oceny integralności bariery jelitowej. Mniej kolonii bakteryjnych pochodzenia jelitowego z wątroby leczonych szczurów, w przeciwieństwie do licznych kolonii u szczurów kontrolnych, wskazuje...

Ocena wpływu pożytecznych bakterii na translokację mikrobiologiczną jelit u szczurów narażonych na stres cieplny

Ten film pokazuje procedurę przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10 z zapaleniem jelita grubego. Skolonizowane drobnoustroje kałowe w jelitach uwalniają metabolity wtórne, wywołując uwalnianie cytokin przeciwzapalnych i zmniejszając stan zapalny jelita grubego.

Ocena skutków przeszczepu mikrobioty kałowej u myszy z niedoborem interleukiny-10

Przeszczep mikrobioty kałowej za pomocą kolonoskopii jest bezpiecznym i skutecznym sposobem leczenia nawracających i opornych na leczenie infekcji C.difficile. Systematyczne podejście do badań przesiewowych pacjenta i dawcy, przygotowania stolca i dostarczania stolca podczas kolonoskopii zmaksymalizuje sukces terapeutyczny.

Przeszczep mikrobioty kałowej za pomocą kolonoskopii w przypadku nawrotu zakażenia C. difficile

Wzbogacenie środowiska (EE) to środowisko przetrzymywania zwierząt, które służy do ujawniania mechanizmów leżących u podstaw powiązań między stylem życia, stresem i chorobami. Protokół ten opisuje procedurę, która wykorzystuje mysi model nowotworzenia jelita grubego i EE w celu szczegółowego zdefiniowania zmian w różnorodności biologicznej mikrobioty, które mogą mieć wpływ na śmiertelność zwierząt.

Metoda określania wpływu wzbogacania środowiska na bioróżnorodność biomu mikrobiomu jelita grubego w mysim modelu guza jelita grubego

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Interakcja genetycznej podatności, odporności błony śluzowej i mikroekologicznego środowiska jelitowego jest zaangażowana w patogenezę nieswoistego zapalenia jelit (IBD). W tym badaniu zastosowaliśmy przeszczep mikrobioty kałowej myszom z niedoborem IL-10 i zbadaliśmy jej wpływ na zapalenie okrężnicy i czynność serca.

Ocena terapeutyczna przeszczepu mikrobioty kałowej w mysim modelu z niedoborem interleukiny 10

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Niniejszy film przedstawia technikę izolacji DNA z gatunków mikroorganizmów zasiedlających jelito tylne termitów. Zaprezentowano również przygotowanie preparatu świeżego, który jest przydatny do wizualizacji mikrobioty jelitowej, a także przeprowadzono przegląd bogatego gatunkowo środowiska jelita.

Izolacja DNA z mikroorganizmów jelitowych termita (Zootermopsis angusticollis) oraz wizualizacja mikroorganizmów jelitowych

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Poznaj metodę oceny łagodzącego działania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej u myszy. Protokół wykorzystuje model kolitry indukowanej DSS.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Przeglądaj więcej filmów