Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Protokół ten pozwala na ocenę dwukierunkowego wpływu regulacyjnego suplementacji probiotykami na zdrowie oraz stabilne i powtarzalne wyniki. Alternatywny model zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS został opracowany przy użyciu myszy wolnych od pseudozarazków, aby uniknąć pewnych ograniczeń laboratoryjnych w stosowaniu myszy wolnych od zarazków jako receptorów dla probiotyków. Aby zbadać korzystne działanie probiotyków w tej technice, jest to obiecujące podejście do opracowywania nowych strategii leczenia w celu złagodzenia objawów przewlekłych zaburzeń związanych ze stanem zapalnym.

Na początek przygotuj koktajl antybiotyków, rozpuszczając ampicylinę, siarczan neomycyny, metronidazol i wankomycynę w wodzie pitnej. Po całkowitym rozpuszczeniu roztwory przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wlej roztwory koktajli antybiotykowych do butelki z wodą.

Upewnij się, że używasz brązowych butelek lub owiń butelki folią aluminiową, aby chronić roztwory antybiotyków przed światłem. Umieść butelkę na klatce na mysz. Aby uzyskać 2,5% roztwór siarczanu sodu dekstranu, rozpuść 2,5 grama DSS w 100 mililitrach wody destylowanej.

Zastąp wodę pitną 2,5% roztworem DSS w grupie myszy z zapaleniem jelita grubego. Aby ocenić pozytywny wpływ B cereus na łagodzenie zapalenia jelita grubego, losowo przypisz myszy do następujących trzech grup: grupy kontrolnej, modelu zapalenia jelita grubego wywołanego DSS i suplementacji probiotyku B cereus dla myszy indukowanych DSS. Aby zbadać rolę mikrobioty jelitowej w regulacji probiotycznego wpływu B cereus na zapalenie jelita grubego wywołane DSS, losowo przypisz myszy do następujących trzech grup: ABX/kontrola, ABX/DSS i ABX/B cereus plus DSS.

Zapisz masę ciała myszy jako masę wyjściową po podaniu koktajlu antybiotykowego. Natychmiast potraktuj samca sześciu myszy C 57 BL 2,5% roztworem DSS w wodzie pitnej przez siedem dni. Przygotuj osiem 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych wypełnionych 900 mikrolitrami sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej.

Odpipetować 100 mikrolitrów logarytmicznego wzrostu B cereus i rozpuścić w 900 mikrolitrach sterylnego normalnego roztworu soli fizjologicznej. Seryjnie rozcieńczyć B cereus za pomocą probówek. Umieścić 40 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na odpowiedniej płytce agarowej LB oznaczonej stosunkiem rozcieńczenia.

Powtórzyć trzy razy dla każdego stosunku rozcieńczenia. Hoduj płytki w inkubatorze o stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Wybierz płytki z około 20 do 70 koloniami do zliczenia.

Po ilościowym określeniu B cereus zebrać jeden mililitr pożywki B cereus zawierającej jeden razy 10 do dziewiątej CFU i odwirować przy 8 000 G przez 10 minut. Następnie przemyć komórki bakteryjne dwa razy sterylną wodą, odwirowując do 8 000 G przez 10 minut i usunąć supernatant. Rozcieńczyć skoncentrowany zbożowy B sterylnym roztworem soli fizjologicznej do końcowego stężenia dwa razy 10 do ósmego CFU na 200 mikrolitrów.

Kilkakrotnie pipetować rozcieńczenie w górę i w dół, aby uzyskać rozproszoną zawiesinę B cereus. Przetrzeć zewnętrzną część igły do zgłębnika 70% etanolem i utrzymać prawidłowe stosowanie dawki. Aby powstrzymać myszy, podnieś je za ogon i mocno chwyć luźną skórę grzbietu, tak aby koniec ogona znajdował się między dwoma ostatnimi palcami przewodnika.

Trzymaj myszy w pozycji pionowej. Następnie ostrożnie i delikatnie wbij igłębkę przez usta do przełyku. Podaj roztwór B cereus, delikatnie wyjmij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce.

Codziennie mierz masę ciała myszy i natychmiast zbieraj próbki kału do wysterylizowanej probówki wirówkowej. Określ krew utajoną w kale za pomocą papieru testowego na krew utajoną w kale. Zbierz 10 miligramów próbki kału na patyczek z aplikatorem.

Umieść próbkę na karcie testowej i nałóż cienki rozmaz na kartę. Otwórz tylną klapkę i nałóż wywoływacz na rozmaz. Zamocuj myszy na wznak na stole operacyjnym i otwórz jamę otrzewnej.

Oddziel chirurgicznie całą okrężnicę i zmierz długość linijką. Następnie delikatnie umyj okrężnicę pięciomililitrową strzykawką wypełnioną wstępnie schłodzonym PBS. Usuń wosk i nawilż odcinki jelita grubego.

Następnie wybarwić odcinki okrężnicy hematoksyliną i eozyną. Niech dwóch niezależnych eksperymentatorów oceni wyniki histologiczne próbki pod mikroskopem świetlnym, barwienie hematoksyliną i eozyną ujawniło, że tkanka okrężnicy myszy modelowych z zapaleniem jelita grubego wykazywała utratę krypty, uszkodzenie komórek kubkowych, naciek komórek zapalnych i utratę nabłonka. Leczenie B cereus poprawiło uszkodzenia histopatologiczne wywołane przez DSS.

Wyniki histopatologiczne myszy z zapaleniem jelita grubego były istotnie wyższe niż w grupie kontrolnej. Jednak wyniki histopatologiczne w grupie B cereus były znacznie niższe niż u myszy z zapaleniem jelita grubego. Myszy zostały losowo przydzielone do trzech grup, utrata masy ciała, wyniki DAI i wyniki histopatologiczne były wyższe, a długość okrężnicy była krótsza w grupie ABX / DSS w porównaniu z myszami w grupie ABX / kontrolnej.

Utrata masy ciała, długość jelita grubego, wyniki DAI i wyniki histopatologiczne nie różniły się statystycznie między grupami ABX/DSS i ABX/B cereus plus DSS. Obecne wyniki pośrednio sugerują, że mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w pozytywnym wpływie B cereus na zapalenie jelita grubego. Jednym z najważniejszych kroków jest wykorzystanie Bacillus cereus metodą zgłębnika do skonstruowania modelowania zapalenia jelita grubego u myszy.

Leczenie Bacillus cereus wyeliminowało zapalenie jelita grubego wywołane przez DSS, co stworzyło podstawy do dalszych badań nad probiotykami w leczeniu zapalenia jelita grubego.