Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Ogólnym celem tego eksperymentu jest stworzenie specjalistycznego urządzenia mikroprzepływowego i wykorzystanie go do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczej komórki drożdży. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie starzenia drożdży, takich jak dlaczego komórki macierzyste starzeją się i umierają oraz jakie są wcześniejsze zdarzenia molekularne, które prowadzą do utraty homeostazy komórkowej, a ostatecznie do starzenia się i śmierci komórek? Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy śledzić komórki macierzyste, śledzić ich długość życia i różne markery molekularne w tym samym czasie, dzięki czemu możemy szukać zdarzeń molekularnych, które korelują z długością życia.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat starzenia się drożdży, można ją również zastosować w innych obszarach, takich jak monitorowanie wtórnych reakcji na uczestnictwo, które wymaga sprawdzania komórek przez wiele pokoleń. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ produkcja urządzeń mikroprzepływowych, ładowanie komórek, konfiguracja mikroskopu wymagają dużo praktyki, aby działać pomyślnie. Wcześniejsze zademonstrowanie tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest prawidłowo załadować urządzenie mikroprzepływowe drożdżami.

Aby rozpocząć wytwarzanie formy do wafla krzemowego dla urządzenia, przy użyciu standardowych technik, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Umieść go stroną do góry na 15-centymetrowej szalce Petriego. Zabezpiecz formę na szalce Petriego taśmami.

Następnie umieść czystą łódkę wagową na wadze i rozerwij wagę. Wlej 50 gramów bazy PDMS do łodzi wagowej, a następnie dodaj pięć gramów utwardzacza PDMS. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz za pomocą jednorazowej pipety.

Zacznij od krawędzi łodzi wagowej i powoli przesuwaj się do środka. Dokładnie mieszaj mieszaninę przez kilka minut, aż w całej mieszance utworzą się małe bąbelki. Powoli wlej mieszaninę na szalkę Petriego, tak aby całkowicie pokryła formę wafla krzemowego.

Następnie umieść szalkę Petriego w próżni na 10 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z mieszaniny PDMS. Jeśli pęcherzyki pozostaną na powierzchni mieszaniny po wyjęciu z próżni, użyj pipety, aby je wydmuchać. Następnie piecz urządzenie w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Po schłodzeniu z powrotem do temperatury pokojowej ostrożnie przeciąć PDMS wokół formy, a następnie delikatnie oderwać warstwę spolimeryzowanego PDMS od formy wafla krzemowego, unikając uszkodzenia konstrukcji formy waflowej. Umieść warstwę PDMS na stole stroną ze wzorem skierowaną do góry. Ostrożnie wytnij pojedynczy wiór za pomocą przemysłowej żyletki z pojedynczą krawędzią, zachowując odpowiedni margines od krawędzi każdego pojedynczego wióra, aby uniknąć uszkodzenia konstrukcji.

Stroną z wzorem skierowaną do góry użyj pisaka, aby wybić otwory prosto w dół przez okręgi wlotowe i wylotowe po obu stronach kanałów. Sprawdź każdy otwór, ponownie wkładając igłę do dziurkacza do otworu. Upewnij się, że igła może wyjść z drugiej strony, wskazując, że nie ma żadnych zatorów.

Następnie użyj taśmy, aby usunąć cząsteczki kurzu i zanieczyszczenia z górnej powierzchni. Powtórz ten krok co najmniej trzy razy i pozostaw czysty kawałek taśmy klejącej na PDMS, aby utrzymać powierzchnię wolną od kurzu. Następnie odwróć urządzenie i powtórz tę procedurę po przeciwnej stronie PDMS.

Zostaw również ostatni kawałek taśmy po tej stronie. Teraz przygotuj szklaną powierzchnię na podstawę urządzenia. Wybierz kawałek szkła nakrywkowego o wymiarach 24 milimetry na 30 milimetrów o grubości od 13 do 17 milimetrów.

Rozpyl 70% etanolu na szkło i osusz je środkiem do usuwania kurzu, aby wysterylizować powierzchnię. Następnie przenieś szkło nakrywkowe i PDMS na plastikową płytkę. Usuń taśmę klejącą z PDMS i umieść wzór stroną skierowaną do góry w płycie, nie dotykając górnej powierzchni.

Następnie przenieś płytkę do komory plazmowej. Zastosuj plazmę tlenową do PDMS i szkła nakrywkowego, aby nadać powierzchniom hydrofilowość. Następnie wyjmij płytkę z komory plazmowej i ostrożnie połącz plazmowe powierzchnie PDMS w szkle nakrywkowym.

Upewnij się, że między PDMS a szkłem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. Na koniec przenieś urządzenie do piekarnika i piecz w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Zanurz rurki wejściowe i wyjściowe w 70% roztworze etanolu na dzień przed przygotowaniem chipa PDMS.

Następnego dnia napełnij pięciomililitrową strzykawkę wodą w autoklawie i umyj każdą probówkę, umieszczając probówkę na strzykawce i przepłukując probówkę wodą. Powtórz etap mycia co najmniej trzy razy, aby usunąć resztki etanolu. Następnie zbadaj kanały PDMS pod mikroskopem optycznym.

Korzystając z obiektywu 10 X, upewnij się, że struktury są spójne i nienaruszone. Ustabilizuj nienaruszony chip PDMS na platformie mikroskopu za pomocą taśmy klejącej. Przymocuj pięciomililitrową strzykawkę wypełnioną sterylną wodą do pompy strzykawkowej i włóż odpowiednie rurki wejściowe i wyjściowe do urządzenia.

Ustaw natężenie przepływu na 750 mikrolitrów na godzinę i płucz chip przez około 10 minut. Obserwuj kanały, aby upewnić się, że wszelkie pęcherzyki powietrza zostały zmyte. Jeśli po 10-minutowym płukaniu pozostaną jakiekolwiek bąbelki, ręcznie dostosuj prędkość, aby wyeliminować bąbelki.

Przenieś jeden mililitr przygotowanej próbki drożdży do dwóch 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek i odwiruj próbki przez pięć minut w temperaturze 3 000 razy G. Usuń większość supernatantu z każdej probówki i połącz pozostałą część, aby utworzyć próbkę o pojemności 5 mililitrów. Gdy próbka drożdży jest już gotowa, wyjmij rurki wejściowe z chipa PDMS. Ręcznie odwróć pompę strzykawkową, aby zassać mały pęcherzyk powietrza o długości od jednego do dwóch centymetrów, każdą rurkę wejściową, a następnie zassać kultury komórkowe.

Następnie włóż rurkę wejściową z powrotem do układu PDMS i uruchom ponownie pompę, aby załadować ogniwa z prędkością 750 mikrolitrów na godzinę. Pozostawić pompę strzykawkową włączoną na 10 minut, a następnie zbadać postęp ładowania komórek pod mikroskopem. Pomyślne ładowanie uwięzi komórki pod ponad 60% filaru zawieszenia.

Aby utrzymać komórki drożdży, zamień roztwór w strzykawce na roztwór odżywczy i dostosuj prędkość do 400 mikrolitrów na godzinę. Fenotyp długości życia drożdży można uzyskać, licząc liczbę pąków wytwarzanych przez każdą uwięzioną komórkę macierzystą i szacując estymator Kaplana-Meiera. Korzystając z tego protokołu, urządzenie często wyłapuje świeże komórki potomne, które wyrosły z już uwięzionych komórek.

Komórki te następnie przekształcają się w świeże komórki macierzyste, które można zidentyfikować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Te świeże komórki macierzyste zapewniają dokładniejszy pomiar długości życia. W tym eksperymencie średnia długość życia świeżych komórek macierzystych była nieco dłuższa o około dwa pokolenia.

Oprócz liczby pąków, z danych obrazowych można wyodrębnić odstęp czasu między dwoma kolejnymi zdarzeniami pączkowania. Pączkowanie dramatycznie zwalnia pod koniec ich życia, co wskazuje na niezdrowy stan tych starzejących się komórek. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby zarówno używać świeżo przygotowanego chipsa, aby uniknąć pęcherzyków, jak i zwiększyć stężenie komórek, aby w razie potrzeby poprawić wydajność ładowania komórek.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się starzeniem drożdży do zbadania wczesnych zmian molekularnych, które są przyczyną fenotypu starzenia. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zrobić to urządzenie mikroprzepływowe i jak go używać do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych komórkach.