Name: Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do pomiaru długości życia i fenotypów komórek drożdży. Ta technika umożliwia śledzenie komórek matek oraz markerów molekularnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NIH Grant AG043080 oraz National Natural Science Foundation of China (NSFC), nr 11434001. Dziękujemy Lucasowi Waldburgerowi za korektę manuskryptu.

1. Produkcja form wafli krzemowych
UWAGA: Fotomaska została zaprojektowana w oprogramowaniu AutoCAD i wyprodukowana przez firmę komercyjną. Ten projekt zawiera trzy warstwy różnych wzorów (<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Plik uzupełniający 1</a>). Wysokości pierwszej, drugiej i trzeciej warstwy wynoszą odpowiednio około 4 μm, 10 μm i 50 μm. Forma wafla krzemowego została utworzona z fotomaski przy użyciu miękkiej litografii9,10.
<ol>
	<li>Piecz wafel silikonowy w temperaturze 200 °C przez 10 minut, aby odparować parę wodną. Spin coat ujemny fotorezystor SU-8 na płytce krzemowej. 
	UWAGA: Wiruj SU-8 3005 przy 5,000 obr./min przez 30 s, aby wytworzyć pierwszą warstwę, SU-8 2010 przy 3,000 obr./min przez 30 s, aby wygenerować drugą warstwę i SU-8 3025 przy 2,000 obr./min przez 30 s, aby wygenerować trzecią warstwę.</li>
	<li>Miękki wyprasz powlekaną płytkę przed przeniesieniem wzoru. Wyrównaj i naświetl płytkę w trybie "bezpośredniego kontaktu" za pomocą wyrównywacza maski. 
	UWAGA: Wafel piec na miękko przez 2 minuty w temperaturze 95 °C dla pierwszej warstwy, 3 minuty w temperaturze 95 °C dla drugiej warstwy i 15 minut w temperaturze 95 °C dla trzeciej warstwy. Dawkę ekspozycyjną należy stosować przy 100 mJ/cm2 dla pierwszej warstwy, 130 mJ/cm2 dla drugiej warstwy i 200 mJ/cm2 dla trzeciej warstwy.</li>
	<li>Po naświetleniu upiecz wafel i wywołaj go za pomocą wywoływacza SU-8. Osuszyć wafel za pomocą pistoletu N2 i wypiekać go na twardo w temperaturze 200 °C przez 30 minut 
	UWAGA: Silikonowa forma waflowa jest przymocowana do plastikowej szalki Petriego o średnicy 15 cm za pomocą taśmy klejącej, stroną ze wzorem skierowaną do góry. Zazwyczaj umieszczamy kilka identycznych struktur chipów na tej samej formie, co pozwala na wytwarzanie wielu chipów mikroprzepływowych w tym samym czasie. Każda forma może być wielokrotnie wykorzystywana do wytwarzania chipów mikroprzepływowych.</li>
</ol>
2. Produkcja mikroprzepływowych układów scalonych
<ol>
	<li>Umieść czystą łódkę wagową na wadze i wytaruj wagę. Wlej 50 g bazy PDMS do łódki wagowej.</li>
	<li>Dodać 5 g utwardzacza PDMS do łodzi wagowej (stosunek w/w 1:10 do podstawy PDMS). 
	UWAGA: Ta objętość jest oparta na szalce Petriego o średnicy 15 cm z formą. Dostosuj ilość odczynnika, jeśli używasz szalki Petriego o innym rozmiarze.</li>
	<li>Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz za pomocą jednorazowej pipety. Zacznij od krawędzi łodzi ważącej i powoli przesuwaj się do środka. Mieszaj dokładnie przez kilka minut, aż w całej mieszance utworzą się małe bąbelki; dokładne wymieszanie jest niezbędne do polimeryzacji PDMS.</li>
	<li>Powoli wlewać mieszaninę na szalkę Petriego; mieszanina musi całkowicie pokryć formę wafla krzemowego.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego w próżni na 10 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z mieszaniny PDMS. Jeśli na powierzchni mieszaniny pozostaną bąbelki, użyj pipety, aby je wydmuchać.</li>
	<li>Formę waflową krzemową inkubować za pomocą PDMS w piecu w temperaturze 75 °C przez około 2 godziny.</li>
	<li>Delikatnie oderwij warstwę spolimeryzowanego PDMS od formy wafla krzemowego, unikając uszkodzenia konstrukcji formy waflowej. Alternatywnie, wytnij PDMS bezpośrednio z formy wafla krzemowego z minimalnym marginesem 5 mm wokół wzoru za pomocą jednoostrzowej przemysłowej żyletki; delikatnie oderwij warstwę PDMS od formy waflowej.</li>
	<li>Umieść warstwę PDMS na stole stroną ze wzorem skierowaną do góry. Ostrożnie wytnij pojedynczy wiór za pomocą przemysłowej żyletki z pojedynczą krawędzią, zachowując odpowiedni margines od krawędzi każdego pojedynczego wióra, aby uniknąć uszkodzenia konstrukcji.</li>
	<li>Stroną ze wzorem skierowaną do góry, użyj pisaka (średnica wewnętrzna 0,75 mm), aby wybić otwory prosto w dół przez okręgi wlotowe i wylotowe po obu stronach kanałów. 
	UWAGA: Otwory te tworzą ścieżkę przepływu medium. Dlatego ważne jest, aby przejść przez koła i przebić się przez całą warstwę PDMS. Upewnij się, że kolumny PDMS zostały wyjęte z otworu.</li>
	<li>Sprawdź każdy wybity otwór, ponownie wkładając igłę do dziurkacza do otworu. Upewnij się, że igła może wyjść z drugiej strony, wskazując, że nie ma blokady. Przyłóż taśmę do powierzchni wzoru, a następnie delikatnie odklej taśmę, aby usunąć cząsteczki kurzu. Powtórz ten krok co najmniej trzy razy. Pozostaw czysty kawałek taśmy klejącej na PDMS, aby utrzymać sterylizację.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę po przeciwnej stronie PDMS i pozostaw również ostatni kawałek taśmy.</li>
	<li>Przygotuj szklankę nakrywkową o wymiarach 24 mm x 30 mm i grubości 0,13-0,17 mm. Spryskaj szkło 70% etanolem i osusz odpylaczem, aby wysterylizować powierzchnię; Dodatkowo szkło można umyć wodą z autoklawem i wysuszyć odpylaczem.</li>
	<li>Przenieś szkło nakrywkowe i PDMS na plastikową płytkę. Usuń taśmę klejącą z PDMS i umieść wzór stroną skierowaną do góry. Unikaj kontaktu z powierzchnią wzoru podczas przenoszenia.</li>
	<li>Umieść plastikową płytkę w maszynie plazmowej. Zastosować plazmę tlenową do PDMS i szkła nakrywkowego, aby nadać powierzchniom hydrofilowość o następujących parametrach pracy: ekspozycja, 75 s; stabilizacja gazu, 20 cc/min; ciśnienie, 200; i moc, 100 W.</li>
	<li>Ostrożnie umieść PDMS na szkle nakrywkowym, łącząc obie powierzchnie hydrofilowe (powierzchnie, które były skierowane do góry podczas obróbki plazmowej). Upewnij się, że między PDMS a szkłem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Inkubować chip PDMS w piecu w temperaturze 75 °C przez co najmniej 2 godziny 
	UWAGA: Wadliwe mikroprzepływy mogą powodować wyciek cieczy na mikroskop podczas eksperymentu. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić połączenie między PDMS a szkłem nakrywkowym, lekko podnosząc PDMS z krawędzi za pomocą pęsety. Delikatne uniesienie PDMS nie powinno oddzielać go od szkła nakrywkowego, co wskazuje na udane połączenie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotowanie probówki.
	<ol>
		<li>Zanurz rurki wejściowe i wyjściowe w 70% roztworze etanolu oddzielnie 1 dzień przed przygotowaniem chipa PDMS.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wodą w autoklawie, aby umyć probówki. Umyć każdą probówkę, podłączając rurkę do strzykawki i przepłukując ją wodą.</li>
		<li>Powtórz etap mycia co najmniej 3 razy, aby usunąć pozostałości etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbadaj kanały PDMS pod mikroskopem optycznym z obiektywem 10X, aby upewnić się, że struktura jest spójna i nienaruszona. Ustabilizuj chip PDMS na platformie mikroskopu za pomocą taśmy klejącej. 
	UWAGA: W kroku 2 wykonaj wiele chipów jednocześnie, aby upewnić się, że istnieją chipy zapasowe, zwłaszcza jeśli tworzysz urządzenie po raz pierwszy.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wodą z autoklawy. Przymocować strzykawkę do pompy strzykawkowej i włożyć odpowiednie rurki wejściowe i wyjściowe. Ustaw prędkość prania na 750 μl/h, aby płukać wióry przez około 10 minut. W tym okresie pęcherzyki powietrza na kanałach odgałęzień należy zmyć; Jeśli pozostały bąbelki, ręcznie dostosuj prędkość, aby je wyeliminować.</li>
	<li>Przygotowanie próbki drożdży.
	<ol>
		<li>Przenieść 1 ml przygotowanej próbki drożdży (OD600 0,6-0,8) do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 3,000 x g.</li>
		<li>Usunąć większość supernatantu z każdej probówki i połączyć pozostałą część, tworząc próbkę o pojemności 0,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzymaj pompę strzykawkową i wyjmij rurki wejściowe z chipa PDMS.</li>
	<li>Ręcznie odwróć pompę strzykawkową, aby zassać mały pęcherzyk powietrza (o długości od 1 do 2 cm) do każdej rurki wejściowej. Przejdź do zasysania próbki drożdży; Pęcherzyk powietrza pokaże granicę próbki i wskaże, ile próbki zostało pobrane. 
	UWAGA: Należy unikać zasysania próbki do strzykawki.</li>
	<li>Włóż rurkę wejściową z powrotem do układu PDMS i uruchom ponownie pompę, aby załadować ogniwa z prędkością 750 μL/h.</li>
	<li>Pozostaw pompę strzykawkową włączoną na 10 minut, a następnie zbadaj postęp ładowania komórek pod mikroskopem; udane ładowanie uwięzi komórki pod ponad 60% filarem zawieszenia.</li>
	<li>Przełącz się na roztwór odżywczy i dostosuj prędkość do 400 μl/h do hodowli komórek.</li>
	<li>Wybierz pozycje obserwacyjne dla mikroskopu. 
	UWAGA: W przypadku pomiarów żywotności obrazy były wykonywane raz na 15 minut za pomocą mikroskopu optycznego z obiektywem 40x. W przypadku fluorescencyjnej analizy reporterowej obrazy były wykonywane raz na 15 minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem olejowym 60X.</li>
</ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Urządzenie PDMS musi być świeżo wykonane. W przeciwnym razie pęcherzyki powietrza spowodowane włożeniem rurek do urządzenia będą trudne do usunięcia. Krok 3.4 jest ważny, aby poprawić wydajność ładowania ogniw poprzez koncentrację ogniw. Aby zwiększyć przepustowość eksperymentu, 4 do 6 modułów na tym samym chipie PDMS podłączonych do niezależnie działających pomp jest zwykle używanych do jednoczesnego wykonywania od 4 do 6 różnych eksperymentów (różnych szczepów lub kompozycji pożyw).
W porówn...

Pączkujące drożdże to potężny organizm modelowy w badaniach nad starzeniem. Jednak konwencjonalny test żywotności drożdży opiera się na mikrodysekcji, która jest nie tylko pracochłonna, ale także ma niską przepustowość1,2. Ponadto tradycyjne podejście oparte na mikrodysekcji nie zapewnia szczegółowego obrazu różnych cech komórkowych i molekularnych w pojedynczych komórkach macierzystych w miarę ich starzenia się. Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych umożliwiło zautomatyzowaną procedurę pomiaru długości życia drożdży, a także śledzenie markerów molekularnych i różnych fenotypów komórkowych przez cały okres życia komórek macierzystych3,4,5,6,7,8. Po załadowaniu komórek drożdży do urządzenia mikroprzepływowego, można je śledzić pod mikroskopem za pomocą automatycznego obrazowania poklatkowego. Za pomocą narzędzi do przetwarzania obrazowania można wyodrębnić różne fenotypy komórkowe i molekularne3,6,8, w tym długość życia, rozmiar, reporter fluorescencyjny, morfologia komórki, dynamika cyklu komórkowego itp., z których wiele jest trudnych lub niemożliwych do uzyskania przy użyciu tradycyjnej metody mikrodysekcji. Urządzenia mikroprzepływowe zyskały na znaczeniu w badaniach nad starzeniem drożdży od czasu ich pomyślnego opracowania kilka lat temu3,4,6,7. Kilka grup opublikowało następnie różne warianty wcześniejszych projektów5, a wiele laboratoriów drożdży wykorzystało do swoich badań urządzenia mikroprzepływowe.
W hodowli komórkowej podlegającej wykładniczemu wzrostowi, liczba starych komórek macierzystych, które są dostępne do obserwacji, jest znikoma. Dlatego ogólną zasadą konstrukcyjną urządzenia mikroprzepływowego do pomiarów długości życia jest zachowanie komórek macierzystych i usunięcie komórek potomnych. Jedna z takich konstrukcji wykorzystuje fakt, że drożdże ulegają asymetrycznemu podziałowi komórek. Struktury w urządzeniu będą zatrzymywać większe komórki macierzyste i umożliwiać wypłukiwanie mniejszych komórek potomnych. Chip mikroprzepływowy opisany w tym artykule wykorzystuje miękką podkładkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) (pionowe kolumny penisa) do uwięzienia komórek macierzystych (ryc. 1). Urządzenia o podobnej konstrukcji zostały wcześniej zgłoszone3,4,6,7. Protokół ten wykorzystuje prostszą procedurę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych i prostą metodę ładowania komórek, która jest zoptymalizowana pod kątem eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym. Jednym z kluczowych parametrów w urządzeniu mikroprzepływowym jest szerokość elektrod PDMS używanych do wychwytywania komórek macierzystych. Nasze urządzenie wykorzystuje szersze elektrodki, które mogą utrzymać więcej komórek macierzystych pod każdą elektrodą, w tym znaczną część świeżych komórek macierzystych, które można śledzić przez cały okres ich życia. Oprócz pomiarów długości życia, protokół ten jest przydatny w eksperymentach z obrazowaniem poklatkowym pojedynczych komórek, gdy komórki muszą być śledzone przez wiele pokoleń lub gdy konieczna jest obserwacja przez cały okres życia.

<table><tbody><tr><td>3'' < 111> wafel krzemowy</td><td>Addison Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Seria 2000 i 3000</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>Zawiera bazę z elastomeru silikonowego Sylgard i reg; utwardzacz</td></tr><tr><td>Petriego</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade stempel (ID 0,75 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&reg; szkło osłonowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca 3M</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster&trade;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka BD 5 ml (Luer-Lock&handel; Wskazówka)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe rurki ścienne PTFE (100 stóp, rozmiar AWG: 22, identyfikator nominalny: 0,028)</td> <td>Firma dostarczająca komponenty</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr><td>Asortyment igieł</td><td>Firma dostarczająca komponenty</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik laboratoryjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon TE2000 z obiektywem 40X i 60X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 z obiektywem 40X i 60X</td><td>Pompka</td> strzykawkowa Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae to ważny organizm modelowy w badaniach nad starzeniem się. Badania genetyczne ujawniły wiele genów o zachowanym wpływie na długość życia różnych gatunków. Jednak molekularne przyczyny starzenia się i śmierci pozostają nieuchwytne. Aby uzyskać systematyczne zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw starzenia się drożdży, potrzebujemy wysokoprzepustowych metod pomiaru długości życia i ilościowego określania różnych fenotypów komórkowych i molekularnych w pojedynczych komórkach. Wcześniej opracowaliśmy urządzenia mikroprzepływowe do śledzenia pączkujących komórek macierzystych drożdży przez cały okres ich życia, jednocześnie wypłukując nowo narodzone komórki potomne. W artykule przedstawiono metodę przygotowania chipów mikroprzepływowych oraz przeprowadzania eksperymentów mikroprzepływowych. Wiele kanałów może być używanych do jednoczesnego śledzenia komórek w różnych warunkach lub z różnych szczepów drożdży. Typowa konfiguracja może śledzić setki komórek na kanał i pozwala na obrazowanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości przez cały okres życia komórek. Nasza metoda pozwala również na szczegółową charakterystykę długości życia, markerów molekularnych, morfologii komórek i dynamiki cyklu komórkowego pojedynczych komórek. Ponadto nasze urządzenie mikroprzepływowe jest w stanie wychwycić znaczną ilość świeżych komórek macierzystych, które można zidentyfikować za pomocą dalszej analizy obrazu, co umożliwia pomiar długości życia z większą dokładnością.

Po zakończeniu eksperymentów z zarejestrowanych obrazów time-lapse można wyodrębnić czas życia komórek oraz wiele fenotypów komórkowych i molekularnych. Ponieważ z każdej komórki można wyodrębnić szereg różnych cech, pierwszym krokiem analizy jest adnotacja komórek i zdarzeń, w tym wyznaczenie pozycji i granic komórek oraz czasu wystąpienia monitorowanych zdarzeń, takich jak procesy pączkowania. Adnotacje te ułatwią powrót do tego samego zestawu komórek i analizę różnych cech w przyszłośc...

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykonanie specjalistycznego urządzenia mikroprzepływowego i wykorzystanie go do pomiaru długości życia oraz fenotypów komórkowych pojedynczej komórki drożdży. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się drożdży, takie jak: dlaczego komórki macierzyste starzeją się i giną oraz jakie są wczesne zdarzenia molekularne prowadzące do utraty homeostazy komórkowej, a w konsekwencji do starzenia i śmierci komórki? Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego śledzenia komórek macierzystych, pomiaru długości ich życia oraz monitorowania różnych markerów molekularnych, co pozwala na poszukiwanie zdarzeń molekularnych korelujących z długością życia.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat starzenia się drożdży, można ją również zastosować w innych obszarach, takich jak monitorowanie odpowiedzi wtórnych na uczestnictwo, które wymaga sprawdzania komórek przez wiele generacji. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych, ładowanie komórek oraz konfiguracja mikroskopu wymagają dużej praktyki, aby wykonać je pomyślnie. Wcześniejsza demonstracja tej metody jest kluczowa, gdyż prawidłowe napełnienie urządzenia mikroprzepływowego drożdżami jest trudne.Aby rozpocząć, należy wykonać formę z wafla krzemowego dla urządzenia, stosując standardowe techniki opisane w towarzyszącym protokole tekstowym. Umieść ją stroną z elementami do góry w 15 centymetrowej szalce Petriego. Przymocuj formę do szalki Petriego za pomocą taśm.Następnie umieść czystą łódkę ważką na wadze i przeprowadź tarystację. Wlej 50 g bazy PDMS do łódki ważkiej, a następnie dodaj 5 g utwardzacza PDMS. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz za pomocą jednorazowej pipety.Zacznij od krawędzi łódeczki wagowej i powoli przesuwaj się do wewnątrz. Dokładnie mieszaj mieszaninę przez kilka minut, aż w całej masie pojawią się małe pęcherzyki powietrza. Powoli wlej mieszaninę do szalki Petriego tak, aby całkowicie pokryła formę z wafla krzemowego.Następnie umieść szalkę Petriego w próżni na 10 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z mieszaniny PDMS. Jeśli po wyjęciu z próżni na powierzchni mieszaniny nadal znajdują się pęcherzyki, wydmuchaj je za pomocą pipety. Następnie wypal urządzenie w temperaturze 75 °C przez dwie godziny.Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej ostrożnie przetnij PDMS wokół formy, a następnie delikatnie odklej warstwę spolimeryzowanego PDMS od formy z wafla krzemowego, unikając uszkodzenia konstrukcji formy. Połóż warstwę PDMS na blacie stroną z wzorem do góry. Ostrożnie wytnij poszczególne chipy za pomocą jednostronnej przemysłowej żyletki, zachowując odpowiedni margines od krawędzi każdego chipa, aby uniknąć uszkodzeń konstrukcyjnych.Kładąc stronę z wzorem do góry, należy użyć wbijaka, aby wykonać otwory prostopadle przez okręgi wlotowe i wylotowe po obu stronach kanałów. Każdy otwór należy sprawdzić, ponownie wkładając w niego igłę wbijaka. Należy upewnić się, że igła przechodzi na drugą stronę, co wskazuje na brak zatorów.Następnie użyj taśmy, aby usunąć cząsteczki kurzu i zanieczyszczenia z górnej powierzchni. Powtórz ten krok co najmniej trzy razy, a na PDMS pozostaw czysty fragment taśmy Scotch, aby utrzymać powierzchnię wolną od kurzu. Następnie obróć urządzenie i powtórz tę procedurę po przeciwnej stronie PDMS.Pozostaw ostatni fragment taśmy po tej stronie. Teraz przygotuj szklaną powierzchnię na podstawę urządzenia. Wybierz kawałek szkiełka cover glass o wymiarach 24 mm na 30 mm i grubości od 13 do 17 mm.Spryskaj szkło 70% ethanolem, a następnie osusz je za pomocą usuwacza kurzu, aby wysterylizować powierzchnię. Następnie przenieś szkiełko nakrywki i PDMS na plastikową płytkę. Usuń taśmę Scotch z PDMS i połóż go w płytce stroną z wzorem do góry, tak aby nie stykała się ona z górną powierzchnią.Następnie przenieś płytkę do komory plazmowej. Poddaj PDMS oraz szkiełko nakrywką działaniu plazmy tlenowej, aby nadać powierzchniom właściwości hydrofilowe. Następnie wyjmij płytkę z komory plazmowej i ostrożnie połącz potraktowane plazmą powierzchnie PDMS i szkiełka nakrywki.Należy upewnić się, że między PDMS a szkiełkiem podstawowym nie ma pęcherzyków powietrza. Na koniec przenieść urządzenie do piekarnika i wygrzewać w temperaturze 75 °C przez co najmniej dwie godziny. Rurki wlotowe i wylotowe należy zanurzyć w 70% roztworze etanolu na jeden dzień przed przygotowaniem chipa PDMS.Następnego dnia należy napełnić strzykawkę o pojemności 5 ml wodą autoklawowaną i przemyć każdą probówkę, umieszczając ją na strzykawce i przepłukując wodą. Krok płukania należy powtórzyć co najmniej trzykrotnie, aby usunąć resztki etanolu. Następnie należy zbadać kanały PDMS pod mikroskopem optycznym.Używając obiektywu 10X, upewnij się, że struktury są spójne i nienaruszone. Unieruchom nienaruszony chip PDMS na platformie mikroskopu za pomocą taśmy klejącej. Przymocuj strzykawkę o pojemności 5 ml wypełnioną sterylną wodą do pompy strzykawkowej i wprowadź odpowiednie rurki doprowadzające i odprowadzające do urządzenia.Ustaw przepływ na 750 µL/h i płucz chip przez około 10 minut. Obserwuj kanały, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte. Jeśli po 10-minutowym płukaniu nadal występują pęcherzyki, ręcznie dostosuj prędkość w celu ich wyeliminowania.Przenieś jeden mililitr przygotowanej próbki drożdży do dwóch probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra i wiruj próbki przez pięć minut przy 3 000 ×g. Usuń większość supernatantu z każdej probówki i połącz pozostałą zawartość, aby otrzymać próbkę o objętości 5 mililitrów. Po przygotowaniu próbki drożdży wyjmij probówki wlotowe z układu PDMS. Ręcznie cofnięcie pompę strzykawkową, aby zassać mały pęcherzyk powietrza o długości od jednego do dwóch centymetrów do każdej probówki wlotowej, a następnie zassać kultury komórkowe.Następnie włóż probówkę wejściową z powrotem do chipa PDMS i ponownie uruchom pompę, aby załadować komórki z prędkością 750 µL/h. Pozostaw włączoną pompę strzykawkową na 10 minut, a następnie sprawdź postęp ładowania komórek pod mikroskopem. Prawidłowe ładowanie polega na uwięzieniu komórek pod ponad 60% zawieszonych filarów.Aby utrzymać komórki drożdżowe przy życiu, należy zmienić roztwór w strzykawce na roztwór odżywczy i ustawić prędkość przepływu na 400 microliters per hour. Fenotyp długości życia drożdży można uzyskać poprzez policzenie liczby pączków wytworzonych przez każdą uwięzioną komórkę macierzystą i obliczenie estymatora Kaplana-Meiera. Stosując ten protokół, urządzenie często wyłapuje świeże komórki potomne, które wypączkowały z komórek już uwięzionych.Komórki te przekształcają się następnie w świeże komórki macierzyste, które można zidentyfikować za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Świeże komórki macierzyste zapewniają dokładniejszy pomiar długości życia. W tym eksperymencie średnia długość życia świeżych komórek macierzystych była nieco dłuższa, o około dwa pokolenia.Oprócz liczby pączków, z danych obrazowania można wyodrębnić odstęp czasu między dwoma kolejnymi zdarzeniami pączkowania. Pączkowanie gwałtownie zwalnia pod koniec cyklu życia komórek, co wskazuje na ich niezdrowy stan wraz z wiekiem. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o użyciu świeżo przygotowanego chipa, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, oraz o zwiększeniu stężenia komórek w celu poprawy wydajności ich załadunku, jeśli jest to konieczne.Po opracowaniu technika ten utorował badaczom w dziedzinie starzenia się drożdży drogę do analizy wczesnych zmian molekularnych, które warunkują fenotyp starzenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre pojęcie o tym, jak wykonać to urządzenie mikroprzepływowe oraz jak wykorzystać je do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych komórkach.

using-microfluidic-devices-to-measure-lifespan-cellular-phenotypes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę mikroprzepływową do pomiaru długości życia i fenotypów komórek drożdży. Ta technika umożliwia śledzenie komórek matek oraz markerów molekularnych w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Przeglądaj więcej filmów