Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie pojedynczych haploidalnych komórek drożdży podczas całego ich cyklu życia replikacyjnego. Pierwszym krokiem jest wykonanie chipu mikroprzepływowego zawierającego matrycę mikrodołków. Następnie komórki drożdży są wprowadzane do chipu mikroprzepływowego; ponieważ obszar pod mikrodołkami ma wysokość zbliżoną do średnicy komórki drożdży, komórki osiadają w tym miejscu.

Następnie nad uwięzionymi komórkami drożdży stosuje się ciągły przepływ świeżej pożywki, a powstające komórki potomne są wypłukiwane przez ten przepływ. Wykorzystuje się mikroskopię w polu jasnym oraz fluorescencyjną do wizualizacji zmian w morfologii komórek lub organelli, ekspresji białek oraz lokalizacji białek, które mogą wystąpić w starzejących się komórkach drożdży. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z klasyczną metodą mikrodyssekcji jest mniejsza pracochłonność oraz możliwość uzyskania długoterminowych, ciągłych obrazów mikroskopowych z całego cyklu życia pojedynczych komórek drożdży.

Choć metoda ta pozwala na zgłębienie kwestii starzenia replikacyjnego, może być również wykorzystywana w badaniach wymagających ciągłej obserwacji mikroskopowej przez dłuższy czas. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ na poszczególnych etapach produkcji chipu micro feic należy zachować szczególną ostrożność. Ponadto wprowadzanie komórek do chipu micro feic może wymagać pewnego doświadczenia.

Forma z wafla krzemowego jest wytwarzana metodą miękkiej litografii. Szczegóły procesu produkcji znajdują się w towarzyszącym protokole. Potnij kawałek wytrzymałej etykiety na cienkie paski o wymiarach około 0,5 mm na 3 mm.

Za pomocą skalpela ostrożnie umieść paski na formie z wafla krzemowego, lekko powyżej struktury kanału pomiędzy kanałami wlotowymi a mikro-padrem. Następnie przykryj szklaną szalkę Petriego podwójną warstwą folii aluminiowej i włóż wafel do szalki. Folia aluminiowa zapobiegnie wyciekaniu PDMS pomiędzy wafel a szalkę Petriego podczas produkcji chipów mikrofluidycznych.

Aby rozpocząć procedurę wykonania chipów mikrofluidycznych, należy postawić pusty plastikowy kubek na wadze i wytarować wagę. Do plastikowego kubka wlać 40 g bazy PDMS. Dodać utwardzacz PDMS w stosunku wagowym 1:10, co w tym przypadku odpowiada około 4 ml.

Mieszaninę należy dokładnie mieszać przez kilka minut za pomocą jednorazowej pipety plastikowej; jest to istotne, aby zapewnić prawidłową polimeryzację PDMS w późniejszym etapie. Wlej PDMS na wafer w szklanej szalce Petriego. Mieszanina PDMS w szalce Petriego będzie zawierać wiele pęcherzyków powietrza, które należy odgazować.

Umieść płytkę Petri z PDMS w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej na około 30 minut, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Spolimeryzuj PDMS, kładąc płytkę Petri z waflami na płycie grzewczej w temperaturze 120 °C przez jedną godzinę, a następnie w 65 °C przez kolejną godzinę. Po upływie dwóch godzin usuń wafla z folii aluminiowej oraz spolimeryzowany PDMS ze szklanej płytki Petri.

Odklej folię aluminiową z PDMS od spodu wafla. Następnie ostrożnie zdejmij warstwę PDMS z górnej powierzchni wafla. Połóż warstwę PDMS do góry dnem, tak aby kanały były skierowane ku górze na blacie, i za pomocą skalpela ostrożnie wytnij pojedyncze projekty chipów odciśnięte w PDMS.

Należy pozostawić około 3 mm PDMS wokół krawędzi kanałów. Kolejnym krokiem jest wykonanie otworów w PDMS na końcach wlotu, wylotu oraz kanału bocznego, zgodnie z ilustracją na tym schemacie. Aby wykonać otwór, należy wcisnąć kaniulę 20 G całkowicie przez PDMS w linii prostej.

Usuń kolumnę PDMS z wypustki przynęty przed wyciągnięciem wypustki. Ponownie, zapobiega to zablokowaniu nowo wykonanego otworu przez kolumnę PDMS. Po wykonaniu wszystkich otworów oczyść powierzchnie chipa z cząsteczek kurzu i pozostałości PDMS, przyklejając do niego taśmę klejącą i natychmiast ją odrywając.

W podobny sposób należy oczyścić szkiełko podstawowe, do którego zostanie przymocowany chip. Umieść chip oraz szkiełko pod lampą UV laboratoryjnego urządzenia do czyszczenia ozonem UV, stronami przeznaczonymi do połączenia skierowanymi w stronę lampy; naświetlaj je przez sześć do ośmiu minut, a następnie przyłóż naświetlone powierzchnie do siebie. Delikatnie opukaj boki chipu, aby wspomóc przyleganie PDMS do szkiełka i usunąć pęcherzyki powietrza.

Nie należy uderzać w górną część struktury kanału, ponieważ może to spowodować przyklejenie się mikropodkładek do przykrywy. Dotyczy to również szkła. Nowo przygotowany układ mikrofluidyczny należy umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C na jedną godzinę.

Następnie, delikatnie podnosząc krawędzie chipa PDMS, sprawdź szczelność połączenia szkiełka przykrywkowego z chipem. Jeśli nie jest to możliwe, oznacza to, że połączenie przebiegło pomyślnie i chip jest gotowy do użycia. Aby przygotować chip mikrofluidyczny do załadunku komórek, umieść go w metalowym uchwycie, stosując żel silikonowy pomiędzy szkłem chipa a metalowymi elementami uchwytu.

Aby stworzyć wodoszczelne uszczelnienie, delikatnie dokręć nakrętki, aby uniknąć pęknięcia szkła. Podłącz cienkie rurki do kanału bocznego oraz kanału wylotowego układu. Użycie pęsety ułatwia włożenie rurek w przebite otwory.

Napełnij strzykawkę 50 ml z końcówką Luer Lock pożywką hodowlaną. Usuń powietrze ze strzykawki i podłącz ją sekwencyjnie do strzykawki. Przefiltruj kikut Luer o rozmiarze 20 G, krótką grubą rurkę oraz cienką rurkę.

Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i przyspiesz pracę pompy, aż cienka rurka zostanie całkowicie wypełniona pożywką. Wsuń cienką rurkę podłączoną do strzykawki do kanału wlotowego i pozwól pożywce przepływać przez chip z prędkością 10 µL na minutę. Zbieraj pożywkę wypływającą z chipa do szalki Petriego.

Medium będzie wypływać przez kanał boczny. Wynika to z różnicy oporów między kanałem bocznym wykonanym z dużego, wytrzymałego tagu a kanałem wylotowym. Należy umieścić chip na stole mikroskopu i ustawić ostrość mikroskopu na podkładkach.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy połączyć strzykawkę z końcówką typu Luer o pojemności 5 ml z adapterem Luer o rozmiarze 20 G i grubą rurką. Napełnij strzykawkę około 1 ml zawiesiny komórkowej, która ma zostać wprowadzona do chipa. Preferowana liczba komórek podczas ładowania wynosi od 1 do 5 × 10⁶ komórek/ml.

Zmniejsz szybkość przepływu pompy strzykawkowej do 0.5 µL/min. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest załadowanie komórek do chipa mikroprzepływowego. Zazwyczaj wymaga to pewnej wprawy.

Podłączyć strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek do rurki kanału wylotowego. Załadować komórki, naciskając tłok strzykawki. Ostrożnie obserwować wprowadzanie się komórek i ich osadzanie pod mikropodkładkami za pomocą okularu lub ekranu komputera.

Należy utrzymywać nacisk na tłok, aż pod podkładkami osiądzie odpowiednia liczba komórek. Optymalne obciążenie wynosi od jednej do trzech komórek na podkładkę. Odłączyć strzykawkę używaną do załadunku komórek i przemyć kanał boczny przez kilka minut przy wyższych przepływach, aby usunąć pęcherzyki powietrza oraz komórki, które nie opuściły jeszcze układu.

Ponownie zmniejsz przepływ pompy strzykawkowej do 0,5 µL/min i zamknij kanał boczny, podłączając go do grubej rurki z korkiem do cewnika na jej końcu. Zwiększ przepływ pompy strzykawkowej do końcowej wartości od 1 do 5 µL/min. Szybkość przepływu może się różnić w zależności od pożywki i szczepu drożdży.

Rozpocznij nagrywanie filmu, konfigurując mikroskop i kamerę w sposób odpowiedni dla celu eksperymentu. Jest to przykładowy film poklatkowy przedstawiający wzrost pojedynczej komórki typu dzikiego E na podłożu YPD. Obrazy podłoża były rejestrowane co 10 minut, a wyświetlony pasek skali reprezentuje pięć mikrometrów.

Komórka wytwarza łącznie 30 pączków przed śmiercią. Długość życia replikacyjnego można określić, licząc liczbę pączków wytworzonych przez pojedynczą komórkę macierzystą. Dane te przekształca się w krzywą przeżywalności, wykreślając procent żywych komórek w zależności od liczby wytworzonych pączków lub liczby pokoleń.

Rysunek przedstawia przykład krzywych przeżywalności uzyskanych dla szczepu drożdży typu dzikiego oraz dwóch szczepów mutantów. Delecja genu SER2 prowadzi do skrócenia czasu życia, natomiast delecja genu FOB1 skutkuje jego wydłużeniem. Morfologię mitochondriów w funkcji wieku można badać przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego.

Przeprowadzono eksperyment starzenia z wykorzystaniem dzikich komórek drożdży BY 7 42 wykazujących ekspresję ILV 3G FP, który jest kierowany do mitochondriów. Na tej rycinie białą strzałką wskazano reprezentatywny przykład zmian w morfologii mitochondriów związanych ze starzeniem się w pojedynczej komórce. Wszystkie obrazy mają tę samą skalę, a pasek skali reprezentuje pięć mikrometrów.

Drugi film z przyspieszonym czasem przedstawia pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję ILV 3G FP z eksperymentu, w którym obserwowano morfologię mitochondriów w funkcji wieku. Obrazy były rejestrowane co 30 minut, a pasek skali reprezentuje pięć micrometers. Ta końcowa rycina pokazuje morfologie mitochondriów zaobserwowane w tym samym zestawie komórek w różnych wiekach replikacyjnych: przed utworzeniem pierwszego pączka, po 10 pączkach oraz przed śmiercią.

Dołączono przykładowy obraz dla każdej klasy morfologicznej: rurkowatej, rurkowatej pofragmentowanej oraz plamek i dużych plamek. Zmiany morfologiczne zaobserwowane w komórkach w średnim wieku przypominają te opisane wcześniej dzięki ciągłemu monitorowaniu komórek podczas podziałów. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące starzenia replikacyjnego drożdży, takie jak: dlaczego komórka drożdży się starzeje, jakie zmiany fenotypowe zachodzą i w jaki sposób wpływają one na długość życia replikacyjnego drożdży?

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak stworzyć własne mikroczipy i badać starzenie replikacyjne w komórkach, korzystając z niemal każdego mikroskopu fluorescencyjnego.