Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie pojedynczych komórek drożdży haplo podczas całego ich replikacyjnego okresu życia. Pierwszym krokiem jest wykonanie chipa mikroprzepływowego zawierającego układ mikropadów. Następnie komórki drożdży są ładowane do chipa mikroprzepływowego, a ponieważ obszar pod mikro podkładkami ma wysokość podobną do średnicy komórki drożdży, komórki osiądą tam.

Następnie na uwięzione komórki drożdży nakłada się ciągły przepływ świeżej pożywki, a pojawiające się komórki potomne są wypłukiwane przez przepływ jasnego pola pożywki i fluorescencji. Mikroskopia służy do wizualizacji zmian w morfologii komórek lub organelli, ekspresji białek i lokalizacji białek, które mogą wystąpić w starzejących się komórkach drożdży. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z klasyczną metodą mikrodysekcji jest to, że jest mniej pracochłonna i umożliwia długotrwałe, ciągłe obrazy mikroskopowe całej długości życia pojedynczych komórek drożdży.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat starzenia replikacyjnego, może być również stosowana w badaniach wymagających ciągłej obserwacji mikroskopowej przez dłuższy czas. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ należy zachować ostrożność na poszczególnych etapach produkcji chipa mikrokałowego. Ponadto ładowanie komórek do chipa mikrokałowego może wymagać pewnego doświadczenia.

Forma wafla krzemowego jest wytwarzana metodą miękkiej litografii. Szczegółowe informacje na temat jego produkcji można znaleźć w dołączonym protokole. Tekst pociął kawałek twardego tagu na cienkie paski o wymiarach około 0,5 milimetra na trzy milimetry.

Za pomocą skalpela ostrożnie umieść paski na formie do wafli krzemowych, lekko na strukturze kanału między kanałami wlotowymi a mikropadre. Następnie przykryj szklaną szalkę Petriego podwójną warstwą folii aluminiowej i włóż wafel do szalki Petriego. Folia aluminiowa zapobiegnie przedostawaniu się PDMS między płytką a szalką Petriego podczas produkcji chipów mikroprzepływowych.

Aby rozpocząć procedurę wytwarzania chipów mikroprzepływowych, umieść pusty plastikowy kubek na wadze i rozerwij wagę. Wlej 40 gramów bazy PDMS do plastikowego kubka. Dodaj utwardzacz PDMS w stosunku wagowym od jednego do 10, czyli w tym przypadku około czterech mililitrów.

Używając jednorazowej plastikowej pipety dokładnie mieszanej przez kilka minut, ważne jest, aby mieszanina była dobrze wymieszana, aby zapewnić późniejszą prawidłową polimeryzację PDMS. Wylej PDMS na wierzch wafla w szklanej szalce Petriego. Mieszanina PDMS na szalce Petriego będzie zawierała dużo bąbelków dla Degasa.

PDMS umieszcza szalkę Petriego w wysuszaczu podłączonym do pompy próżniowej na około 30 minut, gdy wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte. Polimeryzuj PDMS, umieszczając szalkę Petriego z waflem na wierzchu gorącej płyty w temperaturze 120 stopni Celsjusza na jedną godzinę, a następnie w 65 stopniach Celsjusza przez kolejną godzinę. Po dwóch godzinach usuń wafel z folii aluminiowej i spolimeryzowany PDMS ze szklanej szalki Petriego.

Oderwij folię aluminiową do PDMS z tyłu wafla. Następnie ostrożnie podnieś warstwę PDMS z górnej części płytki. Umieść warstwę PDMS do góry nogami, tak aby kanały były skierowane do góry na stole i ostrożnie wytnij skalpelem wzory pojedynczych chipów odciśnięte na PDMS.

Staraj się zachować około trzech milimetrów PDMS wokół krawędzi kanałów. Następnym krokiem jest wybicie otworów w PDMS na końcach wylotu wlotowego i kanału bocznego, jak pokazano na tym schemacie. Aby wybić dziurę, przepchnij kętek przynęty o rozmiarze 20 do końca przez PDMS w prosty sposób.

Usuń kolumnę PDMS w króćcu przynęty przed wyciągnięciem króćca. Również w tym przypadku zapobiega to blokowaniu nowo wybitego otworu przez kolumnę PDMS. Po wybiciu wszystkich otworów oczyść powierzchnie chipa z cząstek kurzu i resztek PDMS, umieszczając na nim taśmę klejącą i natychmiast usuwając taśmę.

Podobnie wyczyść szkło nakrywkowe, do którego zostanie przymocowany chip. Umieść chip i szkło nakrywkowe pod lampą UV stołowego środka do czyszczenia ozonem UV bokami, które należy ze sobą połączyć, przodem do lampy wystawionej na działanie światła UV przez sześć do ośmiu minut i połóż odsłonięte powierzchnie jedna na drugiej. Delikatnie postukaj w boki chipa, aby ułatwić przymocowanie PDMS do szkła nakrywkowego i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Nie stukaj w strukturę kanału, ponieważ może to spowodować przymocowanie mikropadów do pokrywy. Szkło również. Umieść nowo przygotowany zestaw mikroprzepływowy na płycie grzejnej w temperaturze 100 stopni Celsjusza na godzinę.

Następnie sprawdź połączenie szkła nakrywkowego z chipem PDMS, lekko podnosząc krawędzie chipa PDMS. Jeśli nie jest to możliwe, klejenie się powiedzie i chip jest gotowy do użycia. Aby przygotować chip mikroprzepływowy do ładowania ogniwa, umieść chip w metalowym uchwycie z żelem silikonowym między szkłem chipa a metalowymi częściami uchwytu.

Aby uzyskać wodoodporne uszczelnienie, delikatnie dokręć nakrętki, aby uniknąć stłuczenia szkła. Podłącz cienkie rurki do kanału bocznego i kanału wylotowego chipa. Zastosowanie pęsety ułatwia włożenie rurki w wybite otwory.

Napełnij 50-mililitrową strzykawkę z blokadą przynęty pożywką hodowlaną. Usunąć powietrze ze strzykawki i podłączyć ją kolejno do strzykawki. Przefiltruj króciec przynęty o rozmiarze 20, krótką, grubą rurkę i cienką rurkę.

Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i szybko przesuwać pompkę do przodu, aż cienka rurka zostanie całkowicie wypełniona medium. Wepchnij cienką rurkę podłączoną do strzykawki do kanału wlotowego i pozwól, aby medium przepływało przez chip z szybkością 10 mikrolitrów na minutę. Zbierz podłoże, pozostawiając wiór na szalce Petriego.

Medium wyczerpie się przez kanał boczny. Ze względu na różnicę rezystancji między dużym, twardym kanałem bocznym a kanałem wylotowym. Umieść chip na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość mikroskopu na podkładkach.

Aby rozpocząć tę procedurę, podłącz pięciomililitrową strzykawkę z końcówką przynęty do klocka przynęty o rozmiarze 20 i grubej tuby. Załadować do strzykawki około jednego mililitra zawiesiny komórek, która ma zostać załadowana do chipa. Preferowana liczba komórek do załadunku wynosi od jednej do pięciu razy 10 z sześciu komórek na mililitr.

Zmniejsz natężenie przepływu pompy strzykawkowej do 0,5 mikrolitra na minutę. Najtrudniejszą częścią tej procedury jest załadowanie komórek do chipa mikromowego. Zwykle wymaga to pewnej wprawy.

Podłączyć strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek do rurki kanału wylotowego. Naładować komórki, naciskając tłok strzykawki. Delikatnie obserwuj komórki wchodzące i osiadające pod mikroelektrodami za pomocą okularu lub ekranu komputera.

Utrzymywać nacisk na tłok do momentu, gdy wystarczająca ilość komórek osiądzie pod elektrodami. Optymalne obciążenie to od jednej do trzech komórek na podkładkę. Odłącz strzykawkę używaną do ładowania komórek i przepłukuj kanał boczny przez kilka minut przy wyższych natężeniach przepływu, aby usunąć pęcherzyki powietrza i/lub komórki, które jeszcze nie opuściły chipa.

Ponownie zmniejsz przepływ pompy strzykawkowej do 0,5 mikrolitra na minutę i zamknij boczny kanał, podłączając go do grubej rurki zawierającej na końcu zatyczkę cewnika. Zwiększyć przepływ pompy strzykawkowej do końcowego natężenia przepływu od jednego do pięciu mikrolitrów na minutę. Natężenie przepływu może się różnić w zależności od pożywki i szczepu drożdży.

Rozpocznij film z ustawieniem mikroskopu i kamery odpowiednim do celu eksperymentu. To jest przykładowy film poklatkowy przedstawiający pojedynczą dziką komórkę typu E rosnącą na YPD. Średnie obrazy były wykonywane co 10 minut, a pokazany przed chwilą pasek skali reprezentuje pięć mikrometrów.

Komórka wytwarza w sumie 30 pąków, zanim umrze. Replikacyjną długość życia można określić, licząc liczbę pąków wytwarzanych przez pojedynczą komórkę macierzystą. Dane te są przekształcane w krzywą długości życia poprzez wykreślenie procentu żywotnych komórek w stosunku do liczby wyprodukowanych pąków lub liczby pokoleń.

Rysunek ten przedstawia przykład krzywych długości życia uzyskanych dla dzikiego szczepu drożdży i dwóch zmutowanych szczepów. Delecja genu SER two powoduje krótszą długość życia, podczas gdy delecja genu FOB 1 skutkuje dłuższą długością życia. Morfologię mitochondriów w funkcji wieku można badać za pomocą urządzenia mikroprzepływowego.

Eksperyment starzenia przeprowadzono na BY 7 42 komórkach drożdży typu dzikiego eksprymujących ILV 3G FP, który jest ukierunkowany na mitochondria. Na tym rysunku reprezentatywny przykład związanych z wiekiem zmian w morfologii mitochondriów w pojedynczej komórce jest wskazany przez białą strzałkę. Wszystkie obrazy są skalowane identycznie, a pasek skali reprezentuje pięć mikrometrów.

Drugi film poklatkowy przedstawia pojedynczą komórkę wyrażającą ILV 3G FP z eksperymentu, w którym zaobserwowano morfologię mitochondriów w funkcji wieku. Zdjęcia były wykonywane co 30 minut, a podziałka reprezentuje pięć mikrometrów. Ten ostatni rysunek pokazuje morfologie mitochondriów obserwowane w tym samym zestawie komórek w różnym wieku replikacyjnym przed wytworzeniem pierwszego pąka po 10 pąkach i przed śmiercią.

Przykładowy obraz każdej klasy morfologii obejmuje rurkowe, fragmentaryczne rurkowe oraz plamy i duże plamy. Zmiany morfologiczne obserwowane w komórkach w średnim wieku przypominają te zgłoszone wcześniej Dzięki ciągłemu monitorowaniu komórek podczas ich podziału. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące starzenia replikacyjnego drożdży, takie jak dlaczego komórki drożdży starzeją się, jakie zmiany fenotypowe zachodzą i jak wpływają one na replikacyjną długość życia drożdży?

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak tworzyć własne mikrochipy i badać starzenie się replikacyjne w komórkach za pomocą praktycznie każdego mikroskopu fluorescencyjnego.