Name: Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj metodę mikrofluidyczną do ciągłej obserwacji starzenia replikacyjnego u drożdży pączkujących. Technika umożliwia śledzenie pojedynczych komórek przez cały cykl życiowy z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Laurze Schippers za napisanie pierwszych wersji protokołu ładowania komórek oraz Marcusowi de Goffau i Guille Zamparowi za ocenę morfologii mitochondriów.

1. Produkcja i przygotowanie formy do wafli krzemowych
Mikroprzepływowe układy scalone są tworzone z formy wafla krzemowego wyprodukowanej metodą miękkiej litografii. Wafle te mogą być wielokrotnie wykorzystywane do produkcji chipów mikroprzepływowych. Wskazane jest, aby produkcja odpowiedniej płytki była wykonywana przez grupę specjalizującą się w mikrofluidyce6.
Wafel jest wykonany w dwuetapowym procesie fotolitografii przy użyciu dwóch różnych warstw negatywnego fotorezystu, SU-87. Dolna warstwa służy do generowania obszaru pułapki komórek (SU-8 2002; wysokość 3-4 μm), natomiast kanały są wykonane z górnej warstwy (SU-8 2010; wysokość 10 μm). Wyobrażenie o procesie produkcji wafli można znaleźć w pracy Huang i wsp. 8. Rysunki chipów mikroprzepływowych można uzyskać od autorów, a także porady, jak uzyskać odpowiednią płytkę.
<ol>
	<li>Po uzyskaniu płytki pokrój jeden kawałek Tough-Tag na cienkie paski o wymiarach około 0,5 mm na 3 mm za pomocą skalpela i ostrożnie umieść je na płytce lekko na strukturze kanału między kanałami wlotowymi a układem mikropadów (Rysunek 2A). Spowoduje to powstanie dużego dodatkowego kanału w każdym chipie, który nie tylko będzie wykorzystywany podczas ładowania ogniw, ale jest również ważny dla stabilnej pracy urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	<li>Przykryj szklaną szalkę Petriego podwójną warstwą folii aluminiowej i włóż wafel do szalki Petriego. Folia aluminiowa zapobiegnie przedostawaniu się PDMS między waflem a szalką Petriego. Jeśli PDMS wkradnie się między płytkę a szklaną szalkę Petriego, płytka zostanie trwale utrwalona w szalce Petriego. Chociaż wafel jest nadal użyteczny, nie będzie można wymienić szklanej szalki Petriego, jeśli pęknie, a PDMS będzie musiał zostać następnie wycięty.</li>
</ol>
2. Produkcja chipów mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Umieść pusty plastikowy kubek na wadze i wytaruj wagę. Wlej 40 g bazy PDMS do plastikowego kubka (na szklaną szalkę Petriego o średnicy 12 cm). Dodać utwardzacz PDMS za pomocą jednorazowej pipety w proporcji w/m 1:10, czyli około 4 ml.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj PDMS i utwardzacz przez kilka minut. Można to zrobić za pomocą jednorazowej plastikowej pipety, która była używana do pipetowania utwardzacza. Ważne jest, aby mieszanina była dobrze wymieszana przed wylaniem jej na wierzch wafla. Złe wymieszanie spowoduje, że część PDMS nie ulegnie polimeryzacji.</li>
	<li>Wylej PDMS na wierzch wafla w szklanej szalce Petriego.</li>
	<li>Zmieszanie PDMS z utwardzaczem doprowadzi do powstania pęcherzyków w mieszaninie PDMS. Pęcherzyki te muszą zostać usunięte przed polimeryzacją PDMS. PDMS można odgazować po wylaniu go na płytkę, umieszczając szalkę Petriego w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Przy tej konfiguracji usunięcie wszystkich pęcherzyków z mieszanki zajmuje około 30 minut.</li>
	<li>Polimeryzować PDMS, umieszczając szalkę Petriego z płytką na płycie grzejnej w temperaturze 120 °C na 1 godzinę, a następnie w temperaturze 65 °C na kolejną godzinę.</li>
	<li>Usuń folię aluminiową wraz z waflem i spolimeryzowanym PDMS ze szklanej szalki Petriego. Oderwij folię aluminiową i cienką warstwę resztkową spolimeryzowanego PDMS z tyłu płytki. Warstwę PDMS na wierzchu płytki można następnie oddzielić od płytki, ostrożnie ją podnosząc</li>.
	<li>Umieść warstwę PDMS do góry nogami (kanałami skierowanymi do góry) na stole i ostrożnie wytnij skalpelem projekty pojedynczych chipów nadrukowane na PDMS. Staraj się zachować około 3 mm PDMS wokół krawędzi kanałów, aby później poprawić mocowanie chipa do szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Przebij otwory w PDMS na końcach wlotu, wylotu i kanału bocznego (Rysunek 2A), wciskając króciec Luer 20 Gauge do końca przez PDMS w prosty sposób.</li>
</ol>
Upewnij się, że chip PDMS nadal leży do góry nogami na stole podczas wybijania otworów. Zapobiega to przywieraniu PDMS do wnętrza kanału, co mogłoby spowodować zablokowanie kanału.
<ol start="9">
	<li>Po wybiciu każdego otworu usuń pęsetą kolumnę PDMS w króćcu Luer przed ponownym wyciągnięciem króćca. W przeciwnym razie kolumna PDMS mogłaby pozostać z tyłu i zablokować właśnie wybity otwór.</li>
	<li>Oczyść powierzchnie chipa z cząstek kurzu i resztek PDMS, umieszczając na nim taśmę klejącą i natychmiast usuwając taśmę. Podobnie wyczyść szkło nakrywkowe, do którego zostanie przymocowany chip.</li>
	<li>Umieść oczyszczony chip i szkło nakrywkowe pod lampą UV stołowego środka do czyszczenia ozonem UV. Boki, które należy ze sobą skleić, muszą być skierowane w stronę lampy.</li>
	<li>Wystaw PDMS i szkło nakrywkowe na działanie światła UV przez 6-8 minut, a bezpośrednio po tym umieść chip na szkle nakrywkowym, umieszczając odsłonięte powierzchnie jedna na drugiej.</li>
	<li>Delikatnie postukaj w boki chipa, aby ułatwić przymocowanie PDMS do szkła nakrywkowego i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Nie stukaj w strukturę kanału, ponieważ może to również spowodować przyklejenie mikropadów do szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Umieść nowo przygotowany zestaw mikroprzepływowy na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C na 60 minut. Sprawdź siłę połączenia między szkłem nakrywkowym a chipem PDMS, próbując lekko podnieść krawędzie chipa PDMS. Gdy bloku PDMS nie można podnieść z powierzchni szkła, klejenie się powiodło i chip jest gotowy do użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie chipa do ładowania komórki
Awaria urządzenia mikroprzepływowego może potencjalnie spowodować wyciek medium do mikroskopu. Aby tego uniknąć, zaleca się użycie metalowego uchwytu i/lub uszczelnienie boków chipa w miejscu, w którym PDMS styka się ze szkłem, lakierem do paznokci lub klejem epoksydowym. Zapobiega to wyciekom medium w przypadku, gdy chip PDMS nie jest wystarczająco dobrze połączony ze szkłem nakrywkowym. Również połączenia przewodów mogą być zabezpieczone wokół punktów wprowadzania w podobny sposób, aby uniknąć wycieku medium. Domowy czujnik wody, który wyłącza pompę strzykawkową w przypadku wycieku, może być używany jako dodatkowy środek ostrożności. Rysunki metalowego uchwytu specjalnie zaprojektowanego dla chipa mikroprzepływowego można uzyskać od autorów.
<ol>
	<li>Umieść chip mikroprzepływowy w metalowym uchwycie z żelem silikonowym między szkłem chipa a metalowymi częściami uchwytu, aby uzyskać wodoodporne uszczelnienie. Delikatnie dokręć nakrętki, aby nie rozbić szkła.</li>
	<li>Podłącz cienkie rurki (o długości ok. 5-15 cm) do kanału bocznego i kanału wylotowego chipa. Zastosowanie pęsety ułatwia włożenie rurki w wybite otwory.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę Luer-Lok o pojemności 50 ml pożywką hodowlaną, usunąć powietrze ze strzykawki i podłączyć ją kolejno do filtra strzykawkowego, klocka Luer 20 G, krótkiej grubej rurki (o długości ok. 2 cm) i cienkiej probówki. Upewnij się, że cienka rurka jest wystarczająco długa, aby objąć odległość między pompą strzykawkową a stolikiem mikroskopu.</li>
	<li>Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej, szybko przewinąć pompę do przodu, aż cienka rurka zostanie całkowicie wypełniona medium.</li>
	<li>Wciśnij cienką rurkę podłączoną do strzykawki do kanału wlotowego chipa i pozwól, aby medium przepływało przez chip z prędkością 10 μl/min (Rysunek 2B). Zebrać podłoże opuszczające wióry (np. na szalce Petriego). Medium wyczerpie się przez kanał boczny ze względu na różnicę rezystancji między dużym kanałem bocznym wykonanym przez Tough-Tag a kanałem wylotowym.</li>
	<li>Umieść chip w stoliku mikroskopu i ustaw ostrość mikroskopu na podkładkach.</li>
</ol>
Użycie celów immersyjnych jest preferowane niż celów zanurzenia w wodzie, ponieważ olej nie wyschnie w trakcie trwania eksperymentu.
W zależności od mikroskopu mogą wystąpić problemy z utrzymaniem ostrości podczas pierwszych godzin eksperymentu. Dlatego zaleca się pozostawienie chipa na jedną do dwóch godzin w stadium mikroskopu, aby mógł się uspokoić przed załadowaniem komórek i rozpoczęciem eksperymentu.
4. Ładowanie komórek drożdży do chipa mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Podłącz strzykawkę z końcówką Luer o pojemności 5 ml do króćca Luer 20 Gauge i grubej rurki (ok. 3 cm).</li>
	<li>Pobrać próbkę kultury komórkowej, która ma zostać załadowana do chipa.</li>
</ol>
Preferowana liczba komórek do ładowania wynosi od 1 do 5 x 106 komórek na ml. Kultury o większej liczbie komórek muszą zostać rozcieńczone przed załadowaniem. Podczas hodowli komórek na YPD, wydajność ładowania komórek może być wielokrotnie poprawiona, jeśli komórki zostaną najpierw umyte i ponownie zawieszone w minimalnej pożywce zawierającej podobny procent glukozy przed załadowaniem. Podczas pracy chipa podłoże YPD może być ponownie bezpiecznie używane.
<ol start="3">
	<li>Umieścić około 1 ml zawiesiny komórek w strzykawce i usunąć całe powietrze ze strzykawki.</li>
	<li>Zmniejszyć natężenie przepływu pompy strzykawkowej do 0,5 μl/min. Niski i ciągły przepływ wymuszony przez pompę strzykawkową podczas ładowania (w kroku 4.5) wypchnie nieprzyłączone ogniwa przez kanał boczny (rysunek 2C).</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek do rurki kanału wylotowego. Naładować komórki, delikatnie naciskając tłok strzykawki. Obserwuj, jak komórki wchodzą i osiadają pod mikroelektrodami za pomocą okularu lub ekranu komputera.</li>
	<li>Utrzymywać nacisk na tłok do momentu, gdy wystarczająca ilość komórek osiądzie pod elektrodami. Optymalne obciążenie to 1-3 ogniwa na podkładkę. Ponieważ komórki losowo osadzają się pod elektrodami, dość często zdarza się, że kilka elektrod nie zawiera żadnych komórek, a inne elektrody są całkowicie wypełnione komórkami.</li>
	<li>Odłącz strzykawkę używaną do ładowania ogniw i podłączoną do niej grubą rurkę od cienkiej rurki kanału wylotowego, przepłucz kanał boczny przez kilka minut przy wyższych natężeniach przepływu (10 μl/min), aby usunąć pęcherzyki powietrza i/lub komórki, które jeszcze nie opuściły chipa (rysunek 2B). Jeśli komórki nie zostaną usunięte z kanału bocznego, mogą zacząć rosnąć w kanale bocznym i zakłócać eksperyment później.</li>
	<li>Zmniejszyć przepływ pompy strzykawkowej z powrotem do 0,5 μl/min i zamknąć kanał boczny, podłączając go do grubej rurki (o długości ok. 5 cm) zawierającej na końcu zatyczkę cewnika (rysunek 2D).</li>
	<li>Zwiększyć przepływ do końcowego natężenia przepływu 1-5 μl/min. Natężenie przepływu może się różnić w zależności od pożywki i szczepu drożdży.</li>
	<li>Rozpocznij film z ustawieniami mikroskopu i kamery odpowiednimi do celu eksperymentu. Upewnij się, że prędkość stolika mikroskopu jest ustawiona na tak niską prędkość, aby olej mógł podążać za nią. W celu określenia żywotności replikacyjnej, obrazuj komórki co 10 minut. Aby chronić komórki przed niewielkimi ilościami światła UV emitowanego przez lampę halogenową, która jest wykorzystywana podczas akwizycji DIC, zaleca się umieszczenie dodatkowego filtra UV na ścieżce światła. W przypadku korzystania z mikroskopii fluorescencyjnej preferowane jest rzadziej obrazowanie komórek (np. co 20 minut), aby uniknąć efektów fototoksycznych. Eksperyment jest zakończony, gdy wszystkie komórki załadowane na początku eksperymentu są martwe, co w normalnych warunkach trwa do 5 dni. Zaleca się regularne sprawdzanie ostrości obrazów podczas eksperymentu i w razie potrzeby jej korektę.</li>
</ol>

<ol><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li>
<li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li>
<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIR2%2F3%2F4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li>
<li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li>
<li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda mikroprzepływowa jest ważnym, nowatorskim narzędziem w badaniach nad starzeniem się, ponieważ umożliwia proste i zautomatyzowane generowanie danych dotyczących żywotności replikacji drożdży w połączeniu z ciągłym obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości. Atrybuty te stanowią znaczne ulepszenie w stosunku do możliwości eksperymentalnych klasycznej metody preparacji, jednak istnieje kilka ograniczeń tej metody, które należy wziąć pod uwagę.
Należy zauważyć, że na wyznaczoną dł...

Pączkujące drożdże są ważnym organizmem modelowym do badań nad starzeniemsię 1. Do niedawna badanie starzenia replikacyjnego w komórkach drożdży było pracochłonnym procesem wymagającym metody preparacji, w której każdy pączek był ręcznie usuwany z komórki macierzystej2,3. Aby rozwiązać ten problem, niedawno zaprezentowaliśmy nowatorską konfigurację mikroprzepływową, która jest w stanie śledzić poszczególne komórki macierzyste przez cały okres ich życia4.
W naszym chipie mikroprzepływowym, komórki drożdży są uwięzione pod miękkimi mikropadami na bazie elastomeru (patrz Rysunek 1). Ciągły przepływ pożywki wypłukuje nowo powstałe komórki potomne i dostarcza komórkom świeżych składników odżywczych. W jednym eksperymencie można monitorować do 50 komórek macierzystych w sposób w pełni zautomatyzowany przez cały okres ich replikacji. Ze względu na doskonałe właściwości optyczne chipa mikroprzepływowego możliwe jest jednoczesne monitorowanie różnych aspektów biologii komórek drożdży (np. za pomocą białek fluorescencyjnych).
 
W porównaniu do klasycznej metody preparacji, konfiguracja mikroprzepływowa zapewnia znaczne korzyści. Zapewnia określone i stałe środowisko podczas całego eksperymentu starzenia. Nie wymaga drogiego specjalistycznego sprzętu i może być uruchamiany na dowolnym mikroskopie wyposażonym w automatyczne ustawianie ostrości i funkcję poklatkową, a także kontrolę temperatury do hodowli komórek. Produkcji i obsługi chipów mikroprzepływowych można się nauczyć w ciągu kilku dni. Ponadto komórki mogą być bezpośrednio ładowane z wykładniczo rosnącej hodowli, co stanowi przewagę nad inną niedawno opublikowaną metodą mikroprzepływową5, która wymaga biotynylacji komórek macierzystych. a W połączeniu z obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości opisana tu metoda może być stosowana do pomiaru stopniowych zmian w morfologii komórek, ekspresji i lokalizacji białek podczas starzenia się drożdży w niespotykany dotąd sposób. Możliwość długoterminowego monitorowania pojedynczych komórek daje również unikalne możliwości w badaniach cyklu komórkowego drożdży.
aTa metoda została ostatnio zoptymalizowana w celu usunięcia biotynylacji z protokołu16, który został opublikowany podczas recenzowania tego manuskryptu.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>DC Sylgard 184 elastomer </td><td>Mavom bv</td><td>1060040</td><td>Ten pakiet zawiera bazę PDMS i utwardzacz PDMS.</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego 120/20 mm </td><td>VWR International</td><td>391-2850</td><td></td></tr><tr><td>Szkła nakrywkowe 22x40 mm </td><td>CBN Labsuppliers BV</td><td>190002240</td><td></td></tr><tr><td>Tough-Tags </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359106</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy kubek </td><td></td><td></td><td></td>jednorazowy</tr> <tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml </td><td>VWR International</td><td>612-1245</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca </td><td>VWR International</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Pasta Baysilone (silikony GE Bayer) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85403-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z mikrootworem PTFE, 0,012"ID x 0,030"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06417-11</td><td>Określana jako cienka rurka </td></tr><tr><td>Tygon Microbore, 0,030"ID x 0,090"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06418-03</td><td>Określany jako grube rurki </td></tr><tr><td>Skalpel </td><td>VWR International</td><td>233-5334</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Luer-Lok 50 ml </td><td>Strzykawki BD</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>5 ml, końcówka Luer </td><td>VWR International</td><td>613-1599</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta </td><td>VWR International</td><td>232-2132</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki Luer o rozmiarze 20 </td><td>Instech Solomon</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe (wielkość porów 0,20 &mu; m) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczka cewnika ze stali nierdzewnej, 20 ga x12 mm </td><td>Instech Solomon</td><td>SP20/12</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego </td><td>VWR International</td><td>391-0892</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <WYPOSAŻENIE></td></tr><tr><td>Stacjonarny środek do czyszczenia ozonu UV </td><td>NOVA Scan</td><td>PSD-UVT</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Harvard 11 Elitarny </td><td>aparat Harvard</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 silikonowa forma wzorcowa (wafel) </td><td></td><td></td><td>Własnej roboty; W celu uzyskania szczegółowych informacji skontaktuj się z autorem korespondencyjnym </td></tr><tr><td>Balance </td><td>Sartorius corporation</td><td>ED4202S</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa </td><td>KNF Neuberger</td><td>N022 AN.18</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator </td><td>VWR International</td><td>467-2115</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna </td><td>VWR International</td><td>460-3267</td><td></td></tr><tr><td>Opcjonalnie: Metalowy uchwyt na szkło nakrywkowe (22x40 mm) </td><td></td><td></td><td>Wykonane samodzielnie; W celu uzyskania szczegółowych informacji skontaktuj się z autorem korespondencyjnym </td></tr><tr><td>(fluorescencja) Mikroskop z obiektywem 60x, autofokusem, możliwością nagrywania poklatkowego i najlepiej zautomatyzowanym (zmotoryzowanym sterowaniem XY) stolikiem </td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr></tbody></table>

ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Pokazujemy użycie prostego układu mikroprzepływowego, w którym pojedyncze kiełkujące komórki drożdży mogą być śledzone przez cały okres ich życia. Chip mikroprzepływowy wykorzystuje różnicę wielkości między komórkami macierzystymi i potomnymi za pomocą szeregu mikropadów. Po załadowaniu komórki są uwięzione pod tymi mikropadami, ponieważ odległość między mikropodkładką a szkłem nakrywkowym jest podobna do średnicy komórki drożdży (3-4 μm). Po procedurze ładowania, pożywka hodowlana jest w sposób ciągły przepłukiwana przez chip, co nie tylko tworzy stałe i zdefiniowane środowisko przez cały eksperyment, ale także wypłukuje pojawiające się komórki potomne, które nie są zatrzymywane pod elektrodami ze względu na ich mniejszy rozmiar. Układ utrzymuje komórki macierzyste tak skutecznie, że w jednym eksperymencie można monitorować do 50 pojedynczych komórek w sposób w pełni zautomatyzowany przez 5 dni lub, jeśli to konieczne, dłużej. Ponadto doskonałe właściwości optyczne chipa pozwalają na obrazowanie komórek w wysokiej rozdzielczości podczas całego procesu starzenia.

W niniejszym protokole komórki są wprowadzane do chipa mikroprzepływowego bezpośrednio z kultury w fazie średnio-eksponencjalnej. Aby ustalić, czy rozkład wieku komórek uwięzionych w chipie mikroprzepływowym jest podobny do rozkładu w kulturze przed załadunkiem, komórki zabarwiono aglutyniną pszeniczną sprzężoną z FITC (WGA-FITC) w celu wizualizacji blizn po pączkowaniu. Jak pokazano na Rysunku 3, uwięzienie komórek pod mikropodkładkami chipa mikroprzepływowego nie jest faworyzowane dla komórek w określo...

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie pojedynczych haploidalnych komórek drożdży podczas całego ich cyklu życia replikacyjnego. Pierwszym krokiem jest wykonanie chipu mikroprzepływowego zawierającego matrycę mikrodołków. Następnie komórki drożdży są wprowadzane do chipu mikroprzepływowego; ponieważ obszar pod mikrodołkami ma wysokość zbliżoną do średnicy komórki drożdży, komórki osiadają w tym miejscu.Następnie nad uwięzionymi komórkami drożdży stosuje się ciągły przepływ świeżej pożywki, a powstające komórki potomne są wypłukiwane przez ten przepływ. Wykorzystuje się mikroskopię w polu jasnym oraz fluorescencyjną do wizualizacji zmian w morfologii komórek lub organelli, ekspresji białek oraz lokalizacji białek, które mogą wystąpić w starzejących się komórkach drożdży. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z klasyczną metodą mikrodyssekcji jest mniejsza pracochłonność oraz możliwość uzyskania długoterminowych, ciągłych obrazów mikroskopowych z całego cyklu życia pojedynczych komórek drożdży.Choć metoda ta pozwala na zgłębienie kwestii starzenia replikacyjnego, może być również wykorzystywana w badaniach wymagających ciągłej obserwacji mikroskopowej przez dłuższy czas. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ na poszczególnych etapach produkcji chipu micro feic należy zachować szczególną ostrożność. Ponadto wprowadzanie komórek do chipu micro feic może wymagać pewnego doświadczenia.Forma z wafla krzemowego jest wytwarzana metodą miękkiej litografii. Szczegóły procesu produkcji znajdują się w towarzyszącym protokole. Potnij kawałek wytrzymałej etykiety na cienkie paski o wymiarach około 0,5 mm na 3 mm.Za pomocą skalpela ostrożnie umieść paski na formie z wafla krzemowego, lekko powyżej struktury kanału pomiędzy kanałami wlotowymi a mikro-padrem. Następnie przykryj szklaną szalkę Petriego podwójną warstwą folii aluminiowej i włóż wafel do szalki. Folia aluminiowa zapobiegnie wyciekaniu PDMS pomiędzy wafel a szalkę Petriego podczas produkcji chipów mikrofluidycznych.Aby rozpocząć procedurę wykonania chipów mikrofluidycznych, należy postawić pusty plastikowy kubek na wadze i wytarować wagę. Do plastikowego kubka wlać 40 g bazy PDMS. Dodać utwardzacz PDMS w stosunku wagowym 1:10, co w tym przypadku odpowiada około 4 ml.Mieszaninę należy dokładnie mieszać przez kilka minut za pomocą jednorazowej pipety plastikowej; jest to istotne, aby zapewnić prawidłową polimeryzację PDMS w późniejszym etapie. Wlej PDMS na wafer w szklanej szalce Petriego. Mieszanina PDMS w szalce Petriego będzie zawierać wiele pęcherzyków powietrza, które należy odgazować.Umieść płytkę Petri z PDMS w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej na około 30 minut, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Spolimeryzuj PDMS, kładąc płytkę Petri z waflami na płycie grzewczej w temperaturze 120 °C przez jedną godzinę, a następnie w 65 °C przez kolejną godzinę. Po upływie dwóch godzin usuń wafla z folii aluminiowej oraz spolimeryzowany PDMS ze szklanej płytki Petri.Odklej folię aluminiową z PDMS od spodu wafla. Następnie ostrożnie zdejmij warstwę PDMS z górnej powierzchni wafla. Połóż warstwę PDMS do góry dnem, tak aby kanały były skierowane ku górze na blacie, i za pomocą skalpela ostrożnie wytnij pojedyncze projekty chipów odciśnięte w PDMS.Należy pozostawić około 3 mm PDMS wokół krawędzi kanałów. Kolejnym krokiem jest wykonanie otworów w PDMS na końcach wlotu, wylotu oraz kanału bocznego, zgodnie z ilustracją na tym schemacie. Aby wykonać otwór, należy wcisnąć kaniulę 20 G całkowicie przez PDMS w linii prostej.Usuń kolumnę PDMS z wypustki przynęty przed wyciągnięciem wypustki. Ponownie, zapobiega to zablokowaniu nowo wykonanego otworu przez kolumnę PDMS. Po wykonaniu wszystkich otworów oczyść powierzchnie chipa z cząsteczek kurzu i pozostałości PDMS, przyklejając do niego taśmę klejącą i natychmiast ją odrywając.W podobny sposób należy oczyścić szkiełko podstawowe, do którego zostanie przymocowany chip. Umieść chip oraz szkiełko pod lampą UV laboratoryjnego urządzenia do czyszczenia ozonem UV, stronami przeznaczonymi do połączenia skierowanymi w stronę lampy; naświetlaj je przez sześć do ośmiu minut, a następnie przyłóż naświetlone powierzchnie do siebie. Delikatnie opukaj boki chipu, aby wspomóc przyleganie PDMS do szkiełka i usunąć pęcherzyki powietrza.Nie należy uderzać w górną część struktury kanału, ponieważ może to spowodować przyklejenie się mikropodkładek do przykrywy. Dotyczy to również szkła. Nowo przygotowany układ mikrofluidyczny należy umieścić na płycie grzejnej w temperaturze 100 °C na jedną godzinę.Następnie, delikatnie podnosząc krawędzie chipa PDMS, sprawdź szczelność połączenia szkiełka przykrywkowego z chipem. Jeśli nie jest to możliwe, oznacza to, że połączenie przebiegło pomyślnie i chip jest gotowy do użycia. Aby przygotować chip mikrofluidyczny do załadunku komórek, umieść go w metalowym uchwycie, stosując żel silikonowy pomiędzy szkłem chipa a metalowymi elementami uchwytu.Aby stworzyć wodoszczelne uszczelnienie, delikatnie dokręć nakrętki, aby uniknąć pęknięcia szkła. Podłącz cienkie rurki do kanału bocznego oraz kanału wylotowego układu. Użycie pęsety ułatwia włożenie rurek w przebite otwory.Napełnij strzykawkę 50 ml z końcówką Luer Lock pożywką hodowlaną. Usuń powietrze ze strzykawki i podłącz ją sekwencyjnie do strzykawki. Przefiltruj kikut Luer o rozmiarze 20 G, krótką grubą rurkę oraz cienką rurkę.Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i przyspiesz pracę pompy, aż cienka rurka zostanie całkowicie wypełniona pożywką. Wsuń cienką rurkę podłączoną do strzykawki do kanału wlotowego i pozwól pożywce przepływać przez chip z prędkością 10 µL na minutę. Zbieraj pożywkę wypływającą z chipa do szalki Petriego.Medium będzie wypływać przez kanał boczny. Wynika to z różnicy oporów między kanałem bocznym wykonanym z dużego, wytrzymałego tagu a kanałem wylotowym. Należy umieścić chip na stole mikroskopu i ustawić ostrość mikroskopu na podkładkach.Aby rozpocząć tę procedurę, należy połączyć strzykawkę z końcówką typu Luer o pojemności 5 ml z adapterem Luer o rozmiarze 20 G i grubą rurką. Napełnij strzykawkę około 1 ml zawiesiny komórkowej, która ma zostać wprowadzona do chipa. Preferowana liczba komórek podczas ładowania wynosi od 1 do 5 × 10⁶ komórek/ml.Zmniejsz szybkość przepływu pompy strzykawkowej do 0.5 µL/min. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest załadowanie komórek do chipa mikroprzepływowego. Zazwyczaj wymaga to pewnej wprawy.Podłączyć strzykawkę zawierającą zawiesinę komórek do rurki kanału wylotowego. Załadować komórki, naciskając tłok strzykawki. Ostrożnie obserwować wprowadzanie się komórek i ich osadzanie pod mikropodkładkami za pomocą okularu lub ekranu komputera.Należy utrzymywać nacisk na tłok, aż pod podkładkami osiądzie odpowiednia liczba komórek. Optymalne obciążenie wynosi od jednej do trzech komórek na podkładkę. Odłączyć strzykawkę używaną do załadunku komórek i przemyć kanał boczny przez kilka minut przy wyższych przepływach, aby usunąć pęcherzyki powietrza oraz komórki, które nie opuściły jeszcze układu.Ponownie zmniejsz przepływ pompy strzykawkowej do 0,5 µL/min i zamknij kanał boczny, podłączając go do grubej rurki z korkiem do cewnika na jej końcu. Zwiększ przepływ pompy strzykawkowej do końcowej wartości od 1 do 5 µL/min. Szybkość przepływu może się różnić w zależności od pożywki i szczepu drożdży.Rozpocznij nagrywanie filmu, konfigurując mikroskop i kamerę w sposób odpowiedni dla celu eksperymentu. Jest to przykładowy film poklatkowy przedstawiający wzrost pojedynczej komórki typu dzikiego E na podłożu YPD. Obrazy podłoża były rejestrowane co 10 minut, a wyświetlony pasek skali reprezentuje pięć mikrometrów.Komórka wytwarza łącznie 30 pączków przed śmiercią. Długość życia replikacyjnego można określić, licząc liczbę pączków wytworzonych przez pojedynczą komórkę macierzystą. Dane te przekształca się w krzywą przeżywalności, wykreślając procent żywych komórek w zależności od liczby wytworzonych pączków lub liczby pokoleń.Rysunek przedstawia przykład krzywych przeżywalności uzyskanych dla szczepu drożdży typu dzikiego oraz dwóch szczepów mutantów. Delecja genu SER2 prowadzi do skrócenia czasu życia, natomiast delecja genu FOB1 skutkuje jego wydłużeniem. Morfologię mitochondriów w funkcji wieku można badać przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego.Przeprowadzono eksperyment starzenia z wykorzystaniem dzikich komórek drożdży BY 7 42 wykazujących ekspresję ILV 3G FP, który jest kierowany do mitochondriów. Na tej rycinie białą strzałką wskazano reprezentatywny przykład zmian w morfologii mitochondriów związanych ze starzeniem się w pojedynczej komórce. Wszystkie obrazy mają tę samą skalę, a pasek skali reprezentuje pięć mikrometrów.Drugi film z przyspieszonym czasem przedstawia pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję ILV 3G FP z eksperymentu, w którym obserwowano morfologię mitochondriów w funkcji wieku. Obrazy były rejestrowane co 30 minut, a pasek skali reprezentuje pięć micrometers. Ta końcowa rycina pokazuje morfologie mitochondriów zaobserwowane w tym samym zestawie komórek w różnych wiekach replikacyjnych: przed utworzeniem pierwszego pączka, po 10 pączkach oraz przed śmiercią.Dołączono przykładowy obraz dla każdej klasy morfologicznej: rurkowatej, rurkowatej pofragmentowanej oraz plamek i dużych plamek. Zmiany morfologiczne zaobserwowane w komórkach w średnim wieku przypominają te opisane wcześniej dzięki ciągłemu monitorowaniu komórek podczas podziałów. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące starzenia replikacyjnego drożdży, takie jak: dlaczego komórka drożdży się starzeje, jakie zmiany fenotypowe zachodzą i w jaki sposób wpływają one na długość życia replikacyjnego drożdży?Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak stworzyć własne mikroczipy i badać starzenie replikacyjne w komórkach, korzystając z niemal każdego mikroskopu fluorescencyjnego.

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ciągła mikroskopiczna obserwacja wysokiej rozdzielczości procesu starzenia się replikacyjnego u drożdży pączkujących

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.

Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę mikrofluidyczną do ciągłej obserwacji starzenia replikacyjnego u drożdży pączkujących. Technika umożliwia śledzenie pojedynczych komórek przez cały cykl życiowy z wysoką rozdzielczością.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Przeglądaj więcej filmów