Name: ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę ODELAY do wielkoskalowej kwantyfikacji fenotypów wzrostu drożdży na podłożu stałym. Technika ta umożliwia obserwację i pomiar heterogeniczności populacyjnej wśród komórek drożdży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za wsparcie dla tej pracy poprzez granty U54 RR022220 i P50 GM076547 dla J.D.A z U.S. National Institutes of Health. F.D.M. jest doktorem habilitowanym w Kanadyjskim Instytucie Badań nad Zdrowiem. Dziękujemy również Luksemburskiemu Centrum Biomedycyny Systemowej oraz Uniwersytetowi Luksemburskiemu za wsparcie.

<ol><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li>
<li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li>
<li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mass%2C+density%2C+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li>
<li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scan-o-matic%3A+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li>
<li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+%27omics%27%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177(2014).</li>
<li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous%2C+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325(2012).</li>
<li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22ODELAY%21+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li>
<li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25225336">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li>
<li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4297649/">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test ODELAY ma kilka krytycznych punktów zapewniających powtarzalne i wiarygodne pomiary fenotypowe. Pierwszym krytycznym punktem jest konsekwentne przygotowywanie kultur drożdży. Należy zachować ostrożność, aby zebrać komórki drożdży ze wzrostu logarytmicznego. Jeśli kultury uległy nasyceniu, to ich niejednorodność populacji wzrośnie, co może zaciemnić heterogeniczność spowodowaną czynnikami genetycznymi lub środowiskowymi (np . źródło węgla)11. Drugim krytycznym punktem jest konsekwentne przygotowywanie pożywki. Ogólnie rzecz biorąc, należy wygenerować dużą ilość roztworu podłoża podstawowego 10X, a następnie używać go z czasem, aby zminimalizować efekty wsadowe. Formułowanie pożywek wagowo, o ile to możliwe, pomaga z czasem poprawić konsystencję pożywki, zapewniając ścisłe monitorowanie gęstości agaru i ogólnej zawartości wody w agarozie. Trzecim krytycznym punktem jest zminimalizowanie lub wyeliminowanie wszelkich odkształceń mechanicznych podłoża agarozowego. Do mechanicznego odkształcenia podłoża najczęściej dochodzi podczas oddzielania agarozy od szkiełek szkiełkowych. Podobnie jak w przypadku wielu technik laboratoryjnych, opanowanie tego kroku wymaga praktyki.
Zmienność czasu opóźnienia, jak pokazano na rysunku 4, jest często związana z jednym z trzech czynników: mechanicznym odkształceniem podłoża agarozowego, zmianą grubości formowanego agaru lub niestabilnym źródłem światła. Jeśli podłoże agarozowe zmienia się pod względem wysokości Z w poprzek matrycy plamek, zmiana wysokości może przytłoczyć zakres procedury autofokusa, powodując, że początkowe obrazy będą nieco nieostre. Z tego powodu sprawdź wysokość ostrości w wielu miejscach pośrodku i wzdłuż krawędzi matrycy plamek, aby upewnić się, że procedura autofokusa ma wystarczający zakres Z, aby znaleźć ostrość. W razie potrzeby użyj panelu Autofokus, aby zwiększyć zakres ostrości i liczbę kroków ustawiania ostrości.
Trzecim możliwym warunkiem, który może prowadzić do słabej ostrości, jest niestabilne lub migoczące źródło światła, które może zakłócić obliczony wynik ostrości dla określonej wysokości Z. Wolframowe żarówki halogenowe mają tendencję do migotania na długo przed przepaleniem się żarówek. Efekt słabej ostrości zaobserwowano w jednym z przykładów, w którym krzywe wzrostu zanurzają się między pierwszym a drugim punktem czasowym (rysunek 5A), podczas gdy sąsiedni punkt nie ma takiego samego spadku (rysunek 5B). W tym przypadku zły stan ostrości został złagodzony poprzez wymianę wolframowo-halogenowego źródła światła.
W praktyce autorzy odkryli, że aby zmniejszyć migotanie żarówek halogenowych wolframowych o mocy 100 W, żarówki należy wymieniać co 500 godzin lub mniej więcej co 2 miesiące, gdy mikroskopy są intensywnie eksploatowane. Aby uniknąć problemów ze słabą ostrością spowodowanych migoczącą żarówką, często wymieniaj wolframowe halogenowe źródło światła lub wymień żarówkę halogenową na diodowe źródło światła. Przykład zestawu danych, który pokazuje małą zmienność czasów podwajania, a także bardziej jednolite czasy opóźnienia, przedstawiono na rysunku 6. Ten zestaw danych został wykonany za pomocą iluminatora diodowego, który zapewnia bardziej stabilne oświetlenie w czasie podczas wykonywania autofokusa.
Chociaż wiele z wymienionych tutaj punktów dotyczących optymalizacji przygotowania mediów może wydawać się oczywistych, w literaturze większość ekranów na dużą skalę nie replikuje się dobrze ze sobą 8,11. Dlatego dokładnie opisaliśmy przygotowanie kultur i pożywek agarozowych, aby można było wygenerować bardziej powtarzalne badania fenotypowe.
Test ODELAY ma obecnie ograniczoną przepustowość w porównaniu z testami opartymi na pinpingu, takimi jak syntetyczne macierze genetyczne lub test Scan-O-Matic. Chociaż metody te zwiększają liczbę mierzonych szczepów, brakuje im zdolności do rozpoznawania pojedynczych komórek, a zatem nie mogą mierzyć heterogeniczności populacji, którą obserwujemy w klonalnych szczepach drożdży. Pochodzenie tej heterogeniczności populacji nie jest obecnie zrozumiałe, ale połączenie technologii i obliczeń, jak pokazano tutaj, daje możliwość obiektywnego zajęcia się podstawowymi mechanizmami komórkowymi12.
Autorzy pragną zauważyć, że ODELAY jest obecnie zoptymalizowany tylko dla określonej marki mikroskopu i typu korpusu. Modyfikacja ODELAY dla innych systemów mikroskopowych jest prosta, ale będzie wymagała znajomości interfejsu API13 o otwartym kodzie źródłowym. Jednak zarówno API, jak i skrypty ODELAY są napisane tak, aby można je było łatwo dostosować do różnych systemów i testów eksperymentalnych.
Chociaż ODELAY został pierwotnie opracowany dla drożdży, byliśmy w stanie wykorzystać go bez modyfikacji do obserwacji wzrostu Mycobacterium smegmatis. Obserwacja innych mikroorganizmów tworzących kolonie jest możliwa po wprowadzeniu zmian w dostarczonym kodzie źródłowym11. Ogólnie rzecz biorąc, ODELAY jest potężnym i elastycznym narzędziem do porównywania mikroorganizmów hodowanych w różnych warunkach środowiskowych i perturbacjach genetycznych.

Fenotypy wzrostu mikroorganizmów są silnym wskaźnikiem ich genetycznego dopasowania do danego stanu środowiska. Wzrost jest klasycznie podzielony na 3 różne reżimy wzrostu: faza opóźnienia, faza logarytmiczna i faza stacjonarna wzrostu1. Każda faza wzrostu może ujawnić różne aspekty sprawności, które są zależne od różnych warunków środowiskowych i genetycznych. Na przykład czas opóźnienia, czyli czas, jaki organizm spędza w fazie opóźnienia przed rozpoczęciem wykładniczego wzrostu, może wskazywać na zdolność organizmu do reagowania na zmienione warunki środowiskowe2. Podwojenie czasu podczas wzrostu w fazie logarytmicznej, najczęstszy wskaźnik sprawności komórkowej, ujawnia ogólną wydajność zdolności organizmu do podziału poprzez metabolizowanie i wykorzystywanie materiałów środowiskowych do replikacji. Faza stacjonarna, w której wzrost po fazie logarytmicznej jest szybko zmniejszony, jest kolejnym wskaźnikiem dopasowania, który jest regularnie stosowany jako punkt końcowy wzrostu w punktowych testach wzrostu drożdży.
Obecnie dostępnych jest kilka testów wzrostu drożdży, które są uważane za standardowe metody oceny fenotypów wzrostu drożdży3,4,5. Testy te opierają się przede wszystkim na metodach hodowli drożdży na podłożach stałych lub płynnych. Na pożywkach stałych, testy przypinania kolonii przenoszą niewielką liczbę komórek na stały agar za pomocą szpilki, a komórki drożdży mogą rosnąć przez określony czas. Kolonie są następnie obrazowane, a ich rozmiary są porównywane w końcowym punkcie końcowym6. Te testy przypinania kolonii okazały się solidne i skalowalne w celu generowania badań przesiewowych całego genomu. Ostatnio do tych testów włączono okresowe obrazowanie za pomocą skanerów płaskich i lustrzanek jednoobiektywowych (SLR) w celu rejestrowania wzrostu kolonii w czasie7,8,9. Jednak rozdzielczość tych urządzeń uniemożliwia im wykrywanie pojedynczych komórek, a zatem te testy przypinania kolonii nie obserwują bezpośrednio czasu opóźnienia i nie mogą obserwować zmian między poszczególnymi komórkami, które rosną w kolonie.
Testy wzrostu na bazie płynów zostały również wykorzystane do przeprowadzenia badań przesiewowych całego genomu3. Sprzężenie płynnego testu wzrostu z mikroskopią poklatkową ujawniło niejednorodność populacji w czasie podwajania genetycznie identycznych pojedynczych komórek, co daje ważną perspektywę dla zrozumienia regulacji genetycznej i adaptacji środowiskowej. Jednak ten test nie mierzy innych aspektów wzrostu, takich jak czas opóźnienia i nośność10. Poniżej przedstawiamy metodę charakterystyki wszystkich trzech faz wzrostu mikroorganizmów tworzących kolonie na pożywkach stałych za pomocą testu, który nazywamy ODELAY11. ODELAY polega na wykorzystaniu wysokoprzepustowej mikroskopii poklatkowej do rejestrowania obrazów pojedynczych komórek rosnących w kolonie na pożywkach stałych. Ta populacja pojedynczych komórek rosnących w kolonie ujawnia leżącą u podstaw heterogeniczność populacji, która nie jest wykrywana przez inne, mniej czułe pomiary, takie jak ocena końcowego punktu końcowego. Demonstrujemy metodę na drożdżach, ale ODELAY może być stosowany do każdego organizmu, który wykazuje kontrast w mikroskopii jasnego pola.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Moc żelu (1%) 1,2 g/cm²</td></tr> Ekstrakt drożdżowy <tr><td>Pepton (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna mieszanka suplementów (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 3350 (śr. mol. 3000-3700)</td>Szczep drożdży <td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td> BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Szczep drożdży BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki Falcon</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1</td></tr><tr><td>skrzynka 15 ml Probówki Falcon</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 cale o grubości 1,0 mm 1/2 brutto</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka płaska z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Robot do obsługi płynów</td><td>Hydra Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Robot do obsługi płynów Końcówki</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL Wydłużona długość DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Czytnik płytek</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B</td><td>Mikroskop Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw Leica 10X/0.3NA</td><td>Aparat Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB z zestawem narzędzi do przetwarzania obrazu</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>ODELAY Microscope Control (skrypty MATLAB i GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY dla skryptów i oprogramowania Matlab</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> mikroskopowa ODELAY <td>www.aitchisonlab.com\ODELAY dla rysunków mechanicznych</td></tr><tr><td>ODELAY Formy</td><td></td><td></td> agarowe <td>www.aitchisonlab.com\ODELAY do rysunków form</td></tr></tbody></table>

odelay: wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Fenotypy wzrostu mikroorganizmów są silnym wskaźnikiem ich podstawowej genetycznej sprawności i można je podzielić na 3 reżimy wzrostu: fazę opóźnioną, fazę logarytmiczną i fazę stacjonarną. Każda faza wzrostu może ujawnić różne aspekty sprawności, które są związane z różnymi warunkami środowiskowymi i genetycznymi. Pomiary ilościowe o wysokiej rozdzielczości dla wszystkich 3 faz wzrostu są na ogół trudne do uzyskania. Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę charakteryzowania wszystkich 3 faz wzrostu na pożywkach stałych za pomocą testu o nazwie One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY określa ilościowo fenotypy wzrostu pojedynczych komórek rosnących w kolonie na pożywkach stałych za pomocą mikroskopii poklatkowej. Metoda ta pozwala bezpośrednio obserwować niejednorodność populacji przy każdym parametrze wzrostu w genetycznie identycznych komórkach wyrastających na kolonie. Ta heterogeniczność populacji oferuje unikalną perspektywę dla zrozumienia regulacji genetycznej i epigenetycznej oraz reakcji na perturbacje genetyczne i środowiskowe. Chociaż metoda ODELAY została zademonstrowana przy użyciu drożdży, można ją zastosować na dowolnym mikroorganizmie tworzącym kolonię, który jest widoczny pod mikroskopią w jasnym polu.

Przykładowe obrazy drożdży rosnących w mikroskopii poklatkowej przedstawiono na Rysunku 3B. Po przetworzeniu obrazów poklatkowych, reprezentatywny zestaw danych porównujący szczepy drożdży BY4741 i BY4742 przedstawiono na Rysunku 4. W tym przykładowym zestawie danych występuje bardzo niewielka zmienność czasu podwojenia pomiędzy różnymi pozycjami na płytce. Jeśli podłoże agarozowe zostanie przygotowane niewłaściwie, w pozycjach plamek pokrywających się z zdeformowanym obszarem żelu agarozowego widoczne będzie wyraźne odchylenie zarówno czasu podwojenia, jak i czasu adaptacji. Chociaż czasy podwojenia wydają się być stosunkowo jednolite, przykład ten pokazuje różnice w pomiarach czasu adaptacji. Bardziej spójny zestaw danych przedstawiono na Rysunku 6. W tym zestawie danych zarówno czas adaptacji, jak i czas podwojenia są jednolite.
<img alt="Montaż i obsługa urządzenia mikrofluidycznego z przezroczystych części akrylowych; zawiera schemat i etapy demonstracji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Montaż formy do agaru. 
Komponenty formy do agaru przedstawiono na (A). Zmontować podstawę zgodnie z rysunkiem (B), a następnie zacisnąć ją za pomocą małych żabek biurowych. Umieścić dłuższe elementy pionowe w wgłębieniu podstawy (C), a następnie przymocować szkiełka do formy, jak pokazano na (D). Widok z boku przedstawiający kąt formy oraz orientację nacięcia formy, niezbędną do spójnego oddzielenia agaru od szkiełka przedmiotowego (E). Zwrócić uwagę na położenie kciuka i palca wskazującego, a także na linię prostą agaru oddzielającego się od szkiełka (F) oraz na strzałkę poziomą. Linia oddzielania powinna przesuwać się równomiernie w kierunku strzałek pionowych. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Konfiguracja laboratorium z podgrzewaniem mikropłytek, automatycznym dozownikiem cieczy i blokami chłodzącymi do PCR w celu analizy cząsteczek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Metoda sonikacji i nanoszenia próbek. 
Poddaj płytkę sonikacji w wodzie z lodem, używając uchwytu do koszyka wirówki w celu stabilizacji płytki (A). Rozłóż płytki z kroków 3.8.1, aby nanieść próbki na płytkę z agaroza (B). Następnie ułóż końcówki w taki sposób, aby w najbardziej lewym pudełku z końcówkami jedna znajdowała się w pozycji C10, a cztery pozostałe miały odcięte końce, aby nie uderzały o uchwyt płytki (C). Pozostałe końcówki umieść w czterech pudełkach tak, aby zajęte były wewnętrzne 24 pozycje końcówek (D). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Śledzenie agregacji komórek, obrazy mikroskopowe, interfejs MATLAB, analiza time-lapse, wyświetlanie oprogramowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Graficzny interfejs użytkownika ODELAY. 
Zrzut ekranu graficznego interfejsu użytkownika dla "ODELAY_Microscopecontrol.m" (A). Interfejs ten umożliwia monitorowanie kamery oraz regulację ustawień oświetlenia mikroskopu dla trybów epifluorescencyjnego i pola jasnego. Czerwone strzałki wskazują przyciski Focus i Transmitted, które odpowiednio aktywują kamerę do szybkiego pozyskiwania obrazów oraz otwierają migawkę światła przechodzącego. Niebieskie strzałki służą do przesuwania stolika do punktu początkowego, a następnie ustawienia punktu początkowego za pomocą przycisków „Go Origin” i „Set”. Zielone strzałki wskazują przyciski „Reset” i „ODELAY!!!”, które resetują tryby obrazowania ODELAY do aktualnych warunków i inicjują zbieranie obrazów ODELAY. Obrazy time-lapse drożdży rosnących na medium stałym w 0, 3, 6 i 9 h po naniesieniu (B). Zrzut ekranu graficznego interfejsu użytkownika dla "ODELAY_IPT.m" lub narzędzia do przetwarzania obrazu ODELAY (ODELAY Image Processing Tool) (C). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres danych wzrostu drożdży przedstawiający wyniki analizy log2 powierzchni pikseli, czasu podwojenia i czasu lagu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład wyniku z programu ODELAY. 
Ten zestaw danych porównuje szczepy BY4741 i BY4742 na podłożu YPD. Rycina ta jest przykładem dobrze przygotowanego slajdu agarowego; jednak ustawienia autofokusu nie są optymalne. Dane przedstawione w każdej kolumnie, od lewej do prawej, to: pojemność środowiska w Log2 powierzchni kolonii; czas podwojenia podany w min; oraz czas lagu podany w min. W tym przykładzie czasy podwojenia wszystkich plamek na slajdzie agarowym są spójne, z niewielkim wzrostem czasu podwojenia w stronę krawędzi kolumny. Jednak czasy lagu w tym zestawie danych znacznie się różnią. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywe wzrostu komórek z log2[Area] w funkcji czasu, dane statystyczne; analiza wykresów eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykłady krzywych wzrostu. 
Niniejszy przykład pokazuje, jak słaba początkowa ostrość może spowodować wydłużenie szacowanego czasu adaptacji (tlag) (A), podczas gdy sąsiednia pozycja wykazuje krótszy czas adaptacji (B). td to czas podwojenia w min, a tlag to czas adaptacji w min. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wzrostu komórek, wykres słupkowy; log2 obszaru w pikselach, czas podwojenia i czas opóźnienia w minutach; wizualizacja danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przykład prawidłowo przeprowadzonego eksperymentu testowego. 
Przykład szczepu BY4742 przebadanego po zastąpieniu żarówki wolframowo-halogenowej iluminatorem diodowym i upewnieniu się, że autofokus jest ustawiony prawidłowo. Wszystkie czasy podwojenia wydają się dobrze nakładać, a czasy opóźnienia wydają się być spójne. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Ogólnym celem metody ODELAY jest wysokoprzepustowy pomiar fenotypów wzrostu pojedynczych komórek rozwijających się w kolonie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, genetyki i biologii systemowej, takie jak wpływ perturbacji genetycznych i interakcji leków na fenotypy wzrostu dowolnego mikroorganizmu zdolnego do tworzenia kolonii. Główną zaletą ODELAY jest to, że umożliwia ona badaczowi bezpośrednią obserwację i kwantyfikację heterogeniczności populacji wśród dużej liczby osobników.Przed montażem formy do agaru należy oczyścić formy akrylowe 70% etanolem i osuszyć je strumieniem powietrza. Zestaw składa się z trzech elementów dolnych i dwóch elementów pionowych. Aby rozpocząć montaż formy do agaru, należy wziąć trzy elementy dolne i połączyć je w taki sposób, aby dwa identyczne elementy zaciskały trzeci element.Użyj dwóch małych żabek biurowych, aby zacisnąć elementy podstawy po każdej stronie. Umieść wsporniki w formie, upewniając się, że krzywizna laserowa jest prawidłowo ustawiona. Połóż oczyszczone i osuszone szkiełko podstawowe na formie i przytrzymaj je, umieszczając drugie szkiełko podstawowe z drugiej strony.Zaciśnij zespół za pomocą większego klipsa biurowego. Zaciśnij oba szkiełka większymi klipsami biurowymi, upewniając się, że każdy górny klips styka się ze szkiełkiem przedmiotowym i nachodzi na akryl. Przed wypełnieniem zmontowanej formy roztopionym agarem należy upewnić się, że krawędzie są uszczelnione, pipetując około 70 µl roztopionej pożywki agarowej wzdłuż wewnętrznej strony formy.Wypełnij formę, powoli pipetując roztopioną agarzę wzdłuż jej krawędzi, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza wewnątrz. Po wypełnieniu formy pozostaw ją do ostygnięcia w temperaturze otoczenia około 23°C przez 40-60 minut. Następnym krokiem jest rozdzielenie formy.Zacznij od zdjęcia dolnego klipsa zaciskowego. Następnie zdejmij dolną część formy, która składa się z trzech warstwowych elementów. Przytrzymaj szkiełka, ściskając je, a następnie ostrożnie zdejmij klipsy zaciskowe.Umieść formę na krawędzi blatu tak, aby strona z niebieską kropką była skierowana do góry. Umieść oba kciuki pod akrylem, a palce wskazujące na górze w stronę wewnętrznej krawędzi formy, a następnie powoli i ostrożnie pchaj kciukami w górę, jakbyś obracał dystans formy wokół jego dolnej krawędzi. Wywieraj stały, lecz powoli zwiększany nacisk.Wzdłuż linii, w której górna szybka przykrywa dystans formy, powinno pojawić się pęknięcie i pęcherzyk powietrza. Po zauważeniu początkowej linii pęknięcia należy kontynuować naciskanie oboma kciukami, wywierając stały nacisk. Agar powinien zacząć odrywać się od szkła.Kontynuuj obracanie formy w górę. Gdy szkło całkowicie się odłączy, chwyć je i całkowicie wyjmij z formy. Następnie usuń drugą część formy, stosując podobny ruch, aby podnieść element bez przesuwania agaru.Umieść szkiełka w sterylnym pudełku na końcówki, w którego dnie znajduje się niewielka ilość sterylnej wody o wysokiej czystości. Zamknij pudełko i przechowuj w temperaturze 4°C przez noc w celu wykorzystania następnego dnia. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania szczepów na płytce 96-dołkowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przy użyciu czytnika płytek należy zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach dla każdej kultury. Następnie, stosując zautomatyzowany protokół rozcieńczania, należy rozcieńczyć kultury na płytce do gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej około 0.1. Po skonfigurowaniu programu rozcieńczania należy umieścić płytki, probówki i końcówki na pokładzie robota do obsługi cieczy zgodnie z układem pokładu.Kliknij przycisk odtwarzania, aby uruchomić program rozcieńczania. Wybierz odpowiednią liczbę końcówek 50 µL oraz odpowiednią liczbę końcówek 300 µL. Po zakończeniu rozcieńczania wyjmij płytkę z robota i inkubuj ją w temperaturze 30 °C przez pięć do sześciu godzin, utrzymując wilgotność, aby zapobiec wysychaniu płytki.Na około jedną do dwóch godzin przed zakończeniem inkubacji płytki z kulturą włącz komory inkubacyjne mikroskopu i pozwól im ustabilizować się w temperaturze 30 °C. Rozcieńcz kulturę po raz drugi do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej od 0,01 do 0,02, stosując ten sam zautomatyzowany protokół rozcieńczania. Przykryj płytkę z rozcieńczeniem metalową uszczelką do zamrażarki i poddaj sonikacji w kąpieli lodowej przez 30 s, tak aby płytka pływała w lodowatej wodzie.Oznacz cztery płytki 96-dołkowe o płaskim dnie jako jedna, dwie, trzy i cztery. Przenieś 150 µL każdej sonikowanej kultury z płytki z rozcieńczeniami do płytek o płaskim dnie zgodnie z następującym schematem. Dołki od A1 do D6 przenieś do dołków od C4 do F9 Płytki Pierwszej.Dołki A7–D12 do dołków C4–F9 na Płycie Dwie. Dołki E1–H6 do dołków C4–F9 na Płycie Trzy. Oraz dołki E7–H12 do dołków C4–F9 na Płycie Cztery.Aby rozpocząć tę procedurę, należy prawidłowo umieścić szkiełko agarowe w komorze na szkiełka. Następnie ustaw na stole płytki 96-dołkowe z płaskim dnem zgodnie z ich kwadrantem. Płytki jedna, druga, trzecia i czwarta od lewej do prawej.Rozmieść końcówki w czterech pustych pudełkach w taki sposób, aby zajęły one wewnętrzne 24 dołki w każdym pudełku. W piątym pudełku umieść końcówkę w pozycji C10 oraz końcówki z odciętymi końcami w pozycjach A1, A12, H1 i H12. Te cztery odcięte końcówki zapewnią stabilność zacisku płyty z końcówkami.Wprowadź pierwszą końcówkę do punktu startowego programu robotycznego nanoszenia próbek, aby wykonać otwór w agarozie, który zostanie wykorzystany później do wyrównania współrzędnych początku układu. Umieść Płytkę Jeden w robocie do obsługi cieczy w celu naniesienia próbek w pierwszym kwadrancie. Zdejmij pokrywkę i kontynuuj program nanoszenia.Upewnij się, że wszystkie plamki są obecne. Wyrzuć zużyte końcówki do pojemnika na odpady biologiczne i załóż na robota nowe końcówki. Odczekaj około 30 sekund, aż plamki wyschną do średnicy około jednego milimetra, a następnie kontynuuj program.Zastąp płytkę pierwszą płytką drugą i kontynuuj program nanoszenia próbek. Gdy wszystkie cztery kwadranty zostaną naniesione, a plamki wyschną, załóż ponownie pokrywę komory na preparat i odwróć urządzenie. Umieść szkiełko przedmiotowe na górnej ściance komory na preparat.Najpierw umieść szkiełko w komorze mikroskopu. Mikroskopia poklatkowa (time-lapse) jest wykonywana za pomocą specjalnie zaprojektowanego skryptu. Kliknij migawkę, aby otworzyć migawkę światła przechodzącego, a następnie przycisk ostrzenia, aby uruchomić wysoką częstotliwość próbkowania kamery.Kliknij „Go Origin” i przesuń stolik, aby odnaleźć znak początku układu współrzędnych wybity w agarozie, a następnie przesuń się lekko w prawo, aby ustawić ostrość na komórkach naniesionych w obszarze E7. Wróć do znaku początku i wyśrodkuj go w polu widzenia. Ustaw tę wartość jako punkt początkowy, naciskając przycisk „Set”. Przesuń się do pozycji H18 i ustaw ostrość za pomocą śruby imbusowej znajdującej się najbliżej tej lokalizacji.Następnie przejdź do pozycji L7 i ustaw ostrość za pomocą śruby imbusowej znajdującej się najbliżej tej lokalizacji. Na koniec przejdź do pozycji E7 i ustaw ostrość za pomocą śruby imbusowej najbliższej tej lokalizacji. Sprawdź ostrość w centrum oraz na krawędziach w punktach E12, H12 i L12; dostosuj zakres autofokusu, jeśli wartości z wskazujące na ostrość przekraczają plus lub minus zakres autofokusu.Naciśnij przycisk „Reset”, a następnie naciśnij ODELAY. Wybierz katalog do zapisu danych. Mikroskop będzie gromadzić dane przez 48 godzin lub do momentu zamknięcia programu.Te reprezentatywne obrazy z lapse-time przedstawiają komórki drożdży rosnące na podłożu stałym w godzinie zero oraz po trzech, sześciu i dziewięciu godzinach od naniesienia. Przedstawiony tutaj reprezentatywny zestaw danych porównuje dwa szczepy drożdży po przetworzeniu obrazów timelapse. Stosunkowo jednorodne czasy podwajania odzwierciedlają prawidłowo przygotowany preparat agarozowy, jednak czasy lag różnią się znacząco ze względu na nieoptymalne ustawienia autofokusa.Przedstawiono tutaj bardziej spójny zestaw danych, w którym wszystkie czasy podwojenia wydają się dobrze pokrywać, a czasy lagowania wydają się być stałe. Po opanowaniu techniki konfiguracja ODELAY może zostać wykonana w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Najbardziej krytycznymi krokami dla powtarzalnych pomiarów ODELAY są spójne przygotowanie pożywek oraz unikanie mechanicznego odkształcania pożywek podczas rozdzielania slajdów.ODELAY jest bardzo czułym testem. Przykładowo, pozwala on na obserwację wad wzrostu w temperaturozależnych szczepach drożdży w temperaturze pokojowej, podczas gdy powszechnie stosowane testy typu „spot assay” wymagają hodowli drożdży w temperaturze 37 °C, aby wykryć defekt wzrostu. Choć metoda ODELAY została opracowana dla drożdży, ma ona zastosowanie do każdego organizmu tworzącego kolonie, w tym do patogenów, umożliwiając badanie szerokiego zakresu warunków środowiskowych i genetycznych w celu zrozumienia zachowania mikroorganizmów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania metody ODELAY w celu pomiaru fenotypów wzrostu jednokomórkowych mikroorganizmów tworzących kolonie na podłożach stałych. Należy pamiętać, że praca z mikroorganizmami może być niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej odpowiednich dla badanych organizmów.

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

Ilościowa Analiza Przystosowania (QFA) to komplementarna seria metod eksperymentalnych i obliczeniowych służąca do szacowania przystosowania kultur mikrobiologicznych. QFA pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych, leków lub innych zastosowanych zabiegów na wzrost drobnoustrojów. Możliwe jest zaprojektowanie eksperymentów o skali od ukierunkowanej analizy pojedynczych kultur po tysiące kultur prowadzonych równolegle.

Schemat ilościowej analizy sprawności fizycznej

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy protokół do oszacowania metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego poprzez dopasowanie wykładniczego wzrostu Saccharomyces cerevisiae do równania wzrostu wykładniczego. Obliczanie parametrów kinetycznych pozwala na badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na fermentację lub oddychanie mitochondrialne.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Fenotypy wzrostu drożdży są precyzyjnie mierzone za pomocą wysoce równoległego obrazowania poklatkowego unieruchomionych komórek rosnących w mikrokolonie. Jednocześnie można monitorować tolerancję na stres, ekspresję białek i lokalizację białek, generując zintegrowane zestawy danych w celu zbadania, w jaki sposób różnice środowiskowe i genetyczne, a także niejednorodność ekspresji genów wśród komórek izogenicznych, modulują wzrost.

Wysokoprzepustowe obrazowanie mikrokolonii na żywo w celu pomiaru niejednorodności wzrostu i ekspresji genów

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Poznaj metodę ODELAY do wielkoskalowej kwantyfikacji fenotypów wzrostu drożdży na podłożu stałym. Technika ta umożliwia obserwację i pomiar heterogeniczności populacyjnej wśród komórek drożdży.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Przeglądaj więcej filmów