ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Ogólnym celem projektu ODELAY jest pomiar fenotypów wzrostu pojedynczych komórek rozrastających się w kolonie w sposób wysokoprzepustowy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, genetyki i biologii systemowej, takie jak wpływ zaburzeń genetycznych i interakcji leków na fenotypy wzrostu dowolnego mikroorganizmu tworzącego kolonię. Główną zaletą ODELAY jest to, że umożliwia badaczowi bezpośrednią obserwację i ilościowe określenie niejednorodności populacji wśród dużej liczby osobników.

Przed montażem formy agarowej wyczyść formy akrylowe 70% etanolem i wysusz je wymuszonym powietrzem. Są trzy dolne części i dwie pionowe. Aby rozpocząć montaż formy agarowej, weź trzy dolne części i złóż je tak, aby dwa identyczne kawałki ułożyły się na trzecim kawałku.

Użyj dwóch małych klipsów do segregatora, aby zacisnąć elementy podstawy z każdej strony. Umieść słupki w formie, upewniając się, że krzywa lasera jest prawidłowo ustawiona. Umieść oczyszczone i wysuszone szkiełko na formie i przytrzymaj je na miejscu, umieszczając drugie szkiełko po drugiej stronie.

Zacisnąć zespół za pomocą większego klipsa do segregatora. Zaciśnij oba szkiełka za pomocą większych klipsów do segregatora, upewniając się, że każdy górny klips do segregatora styka się ze szklanym szkiełkiem zachodzącym na akryl. Przed napełnieniem zmontowanej formy stopionym agarem upewnij się, że krawędzie są uszczelnione, pipetując około 70 mikrolitrów stopionego podłoża agarowego wzdłuż wewnętrznej strony formy.

Napełnij formę bez zatrzymywania pęcherzyków powietrza w środku, powoli pipetując stopiony agar wzdłuż krawędzi formy. Po napełnieniu formy pozwól jej ostygnąć w temperaturze otoczenia około 23 stopni Celsjusza przez 40-60 minut. Następnym krokiem jest separacja pleśni.

Zacznij od wyjęcia dolnego klipsa do segregatora. Następnie usuń dolną część formy, która składa się z trzech ułożonych kawałków. Przytrzymaj szkiełka, ściskając je, a następnie ostrożnie wyjmij spinki do segregatora.

Umieść formę na krawędzi blatu tak, aby strona formy z niebieską kropką była skierowana do góry. Umieść oba kciuki pod akrylem, a pierwsze palce na górze w kierunku wewnętrznej krawędzi formy i powoli i ostrożnie dociśnij kciukami do formy, tak jakby obracając przekładkę formy wokół jej dolnej krawędzi. Stosuj stały, ale powoli zwiększający się nacisk.

Pęknięcie i pęcherzyk powietrza powinny pojawić się wzdłuż linii, w której górna szyba zakrywa przekładkę formy. Po zobaczeniu początkowej linii przerwania kontynuuj wypychanie się w górę oboma kciukami i wywieraj stały nacisk. Agar powinien zacząć odrywać się od szklanki.

Kontynuuj obracanie formy do góry. Ponieważ szkło jest całkowicie wolne, chwyć je i całkowicie wyjmij z formy. Następnie usuń drugi kawałek formy, wykonując podobny ruch, aby podnieść kawałek bez przesuwania agaru.

Umieść szkiełka w sterylnym pudełku z końcówkami z odrobiną sterylnej wody o wysokiej czystości na dnie. Zamknij pudełko i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc do wykorzystania następnego dnia. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania szczepów na płytce 96-dołkowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Za pomocą czytnika płytek do pomiaru gęstości optycznej każdej kultury w odległości 600 nanometrów. Następnie użyj automatycznego protokołu rozcieńczania, aby rozcieńczyć kultury na płytce do gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej około 0,1. Po skonfigurowaniu programu rozcieńczania umieść płytki obciążeniowe, rurki i końcówki na pokładzie robota do obsługi cieczy, zgodnie z układem pokładu.

Kliknij przycisk odtwarzania, aby uruchomić program rozcieńczania. Wybierz odpowiednią liczbę końcówek o pojemności 50 mikrolitrów i odpowiednią liczbę końcówek o pojemności 300 mikrolitrów. Po zakończeniu rozcieńczania wyjmij płytkę rozcieńczającą z robota i hoduj płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, utrzymując wilgotność, aby zapobiec wysychaniu płytki przez pięć do sześciu godzin.

Na około jedną do dwóch godzin przed zakończeniem inkubacji płytki hodowlanej włącz komory inkubacyjne mikroskopu i pozwól im zrównoważyć się w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć kulturę po raz drugi do gęstości optycznej 0,01 do 0,02 w odległości 600 nanometrów, stosując ten sam protokół automatycznego rozcieńczania. Przykryj płytkę rozcieńczającą metalową uszczelką zamrażarki i poddaj sonikacji w łaźni lodowej przez 30 sekund z płytką unoszącą się w lodowatej wodzie.

Oznacz cztery 96-dołkowe płytki z płaskim dnem jako jedną, dwie, trzy i cztery. Przenieść 150 mikrolitrów każdej kultury poddanej sonikacji z płytki rozcieńczającej na płytki o płaskim dnie, postępując zgodnie z tym wzorem. Studzienki od A1 do D6 do studzienek od C4 do F9 na płycie pierwszej.

Studzienki od A7 do D12 do studzienek od C4 do F9 na płycie drugiej. Studzienki od E1 do H6 do studzienek od C4 do F9 na płycie trzeciej. I studzienki od E7 do H12 do studzienek od C4 do F9 płyty czwartej.

Aby rozpocząć tę procedurę, umieść szkiełko agarozowe prawidłowo w komorze szkiełka. Następnie umieść na stole 96-dołkowe płytki z płaskim dnem w kolejności ich kwadrantu. Tablice Jeden, Dwa, Trzy i Cztery od lewej do prawej.

Ułóż końcówki w czterech pustych pudełkach na końcówki, tak aby wewnętrzne 24 dołki każdego pudełka na końcówki były zajęte końcówkami. W piątym pudełku umieść końcówkę w pozycji C10, a końcówki z odciętym końcem w pozycjach A1, A12, H1 i H12. Te cztery odcięte końcówki zapewnią stabilność zacisku płytki końcówki.

Umieść pierwszy stempel końcówki w miejscu startowym programu wykrywania sterowania robotem, aby wybić otwór w agarozie, który zostanie później wykorzystany do wyrównania współrzędnych początku. Umieść płytkę pierwszą na robocie do obsługi cieczy, aby dostrzec pierwszą ćwiartkę. Zdejmij pokrywkę i kontynuuj program plamienia.

Sprawdź, czy wszystkie plamy są obecne. Opróżnij zużyte końcówki do pojemnika na zagrożenie biologiczne i umieść świeże końcówki na robocie. Odczekaj około 30 sekund, aż plamy wyschną do średnicy około jednego milimetra, a następnie kontynuuj program.

Zamień płytę pierwszą na płytę drugą i kontynuuj program wykrywania. Gdy wszystkie cztery ćwiartki zostaną zauważone, a plamki wyschną, załóż pokrywę komory suwaka i odwróć aparat. Umieść szkiełko podstawowe w górnej części komory szkiełka.

Najpierw załaduj komorę szkiełka do mikroskopu. Mikroskopia poklatkowa jest wykonywana poprzez uruchomienie specjalnie zaprojektowanego skryptu. Kliknij migawkę, aby otworzyć migawkę światła przechodzącego, a następnie przycisk ostrości, aby zainicjować wysoką szybkość aparatu.

Kliknij Go Origin" i przesuń scenę, aby znaleźć znak początku, który został wybity w agarze a następnie przesuń się lekko w prawo, aby skupić się na komórkach zauważonych w obszarze E7. Wróć do punktu początkowego otworu przebijanego i wyśrodkuj go w polu widzenia. Ustaw początek układu współrzędnych na tę wartość, naciskając przycisk Ustaw". Przesuń się do pozycji H18 i ustaw ostrość za pomocą sześciokątnej znajdującej się najbliżej tego miejsca.

Następnie przejdź do pozycji L7 i ustaw ostrość za pomocą sześciokątnej znajdującej się najbliżej tego miejsca. Na koniec przejdź do pozycji E7 i ustaw ostrość za pomocą sześciokątnej znajdującej się najbliżej tego miejsca. Sprawdź ostrość w środku i na krawędziach w miejscach E12, H12 i L12 Dostosuj zakres autofokusa, jeśli wartości ostrości z wskazywane przez wartość z są większe niż plus lub minus zakres autofokusa.

Naciśnij przycisk Reset", a następnie naciśnij ODELAY. Wybierz katalog, w którym chcesz zapisać dane. Mikroskop będzie zbierał dane przez 48 godzin lub do momentu zamknięcia programu.

Te reprezentatywne zdjęcia poklatkowe pokazują komórki drożdży rosnące na stałym podłożu jako godzina zero, trzy godziny, sześć godzin i dziewięć godzin po zauważeniu. Pokazany tutaj jest reprezentatywny zestaw danych porównujących dwa szczepy drożdży po przetworzeniu obrazów poklatkowych. Stosunkowo jednolite czasy podwajania odzwierciedlają dobrze przygotowany szkiełko agarozowe, jednak czasy opóźnień różnią się znacznie ze względu na ustawienia autofokusa, które nie są optymalne.

W tym miejscu pokazano bardziej spójny zestaw danych, w którym wszystkie czasy podwojenia wydają się dobrze nakładać na siebie, a czasy opóźnień wydają się być spójne. Po opanowaniu konfiguracji ODELAY można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Najważniejszymi etapami powtarzalnych pomiarów ODELAY jest konsekwentne przygotowanie mediów i unikanie mechanicznego odkształcania mediów podczas oddzielania szkiełek.

ODELAY jest bardzo czułym testem. Na przykład może obserwować defekty wzrostu w wrażliwych na temperaturę szczepach drożdży w temperaturze pokojowej, podczas gdy powszechnie stosowane testy punktowe wymagają hodowli drożdży w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby ujawnić wadę wzrostu. Chociaż metoda ODELAY została opracowana na drożdżach, ma ona zastosowanie do każdego organizmu tworzącego kolonie, w tym patogenów, w celu zbadania szerokiego zakresu warunków środowiskowych i genetycznych w celu zrozumienia zachowania mikroorganizmów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać ODELAY w celu pomiaru fenotypów wzrostu jednokomórkowych mikroorganizmów tworzących kolonie na pożywkach stałych. Nie zapominaj, że praca z mikroorganizmami może być niebezpieczna i zawsze należy podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej odpowiednich dla badanych organizmów.