ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Ogólnym celem metody ODELAY jest wysokoprzepustowy pomiar fenotypów wzrostu pojedynczych komórek rozwijających się w kolonie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, genetyki i biologii systemowej, takie jak wpływ perturbacji genetycznych i interakcji leków na fenotypy wzrostu dowolnego mikroorganizmu zdolnego do tworzenia kolonii. Główną zaletą ODELAY jest to, że umożliwia ona badaczowi bezpośrednią obserwację i kwantyfikację heterogeniczności populacji wśród dużej liczby osobników.

Przed montażem formy do agaru należy oczyścić formy akrylowe 70% etanolem i osuszyć je strumieniem powietrza. Zestaw składa się z trzech elementów dolnych i dwóch elementów pionowych. Aby rozpocząć montaż formy do agaru, należy wziąć trzy elementy dolne i połączyć je w taki sposób, aby dwa identyczne elementy zaciskały trzeci element.

Użyj dwóch małych żabek biurowych, aby zacisnąć elementy podstawy po każdej stronie. Umieść wsporniki w formie, upewniając się, że krzywizna laserowa jest prawidłowo ustawiona. Połóż oczyszczone i osuszone szkiełko podstawowe na formie i przytrzymaj je, umieszczając drugie szkiełko podstawowe z drugiej strony.

Zaciśnij zespół za pomocą większego klipsa biurowego. Zaciśnij oba szkiełka większymi klipsami biurowymi, upewniając się, że każdy górny klips styka się ze szkiełkiem przedmiotowym i nachodzi na akryl. Przed wypełnieniem zmontowanej formy roztopionym agarem należy upewnić się, że krawędzie są uszczelnione, pipetując około 70 µl roztopionej pożywki agarowej wzdłuż wewnętrznej strony formy.

Wypełnij formę, powoli pipetując roztopioną agarzę wzdłuż jej krawędzi, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza wewnątrz. Po wypełnieniu formy pozostaw ją do ostygnięcia w temperaturze otoczenia około 23°C przez 40-60 minut. Następnym krokiem jest rozdzielenie formy.

Zacznij od zdjęcia dolnego klipsa zaciskowego. Następnie zdejmij dolną część formy, która składa się z trzech warstwowych elementów. Przytrzymaj szkiełka, ściskając je, a następnie ostrożnie zdejmij klipsy zaciskowe.

Umieść formę na krawędzi blatu tak, aby strona z niebieską kropką była skierowana do góry. Umieść oba kciuki pod akrylem, a palce wskazujące na górze w stronę wewnętrznej krawędzi formy, a następnie powoli i ostrożnie pchaj kciukami w górę, jakbyś obracał dystans formy wokół jego dolnej krawędzi. Wywieraj stały, lecz powoli zwiększany nacisk.

Wzdłuż linii, w której górna szybka przykrywa dystans formy, powinno pojawić się pęknięcie i pęcherzyk powietrza. Po zauważeniu początkowej linii pęknięcia należy kontynuować naciskanie oboma kciukami, wywierając stały nacisk. Agar powinien zacząć odrywać się od szkła.

Kontynuuj obracanie formy w górę. Gdy szkło całkowicie się odłączy, chwyć je i całkowicie wyjmij z formy. Następnie usuń drugą część formy, stosując podobny ruch, aby podnieść element bez przesuwania agaru.

Umieść szkiełka w sterylnym pudełku na końcówki, w którego dnie znajduje się niewielka ilość sterylnej wody o wysokiej czystości. Zamknij pudełko i przechowuj w temperaturze 4°C przez noc w celu wykorzystania następnego dnia. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania szczepów na płytce 96-dołkowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przy użyciu czytnika płytek należy zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nanometrach dla każdej kultury. Następnie, stosując zautomatyzowany protokół rozcieńczania, należy rozcieńczyć kultury na płytce do gęstości optycznej przy 600 nanometrach wynoszącej około 0.1. Po skonfigurowaniu programu rozcieńczania należy umieścić płytki, probówki i końcówki na pokładzie robota do obsługi cieczy zgodnie z układem pokładu.

Kliknij przycisk odtwarzania, aby uruchomić program rozcieńczania. Wybierz odpowiednią liczbę końcówek 50 µL oraz odpowiednią liczbę końcówek 300 µL. Po zakończeniu rozcieńczania wyjmij płytkę z robota i inkubuj ją w temperaturze 30 °C przez pięć do sześciu godzin, utrzymując wilgotność, aby zapobiec wysychaniu płytki.

Na około jedną do dwóch godzin przed zakończeniem inkubacji płytki z kulturą włącz komory inkubacyjne mikroskopu i pozwól im ustabilizować się w temperaturze 30 °C. Rozcieńcz kulturę po raz drugi do gęstości optycznej przy 600 nm wynoszącej od 0,01 do 0,02, stosując ten sam zautomatyzowany protokół rozcieńczania. Przykryj płytkę z rozcieńczeniem metalową uszczelką do zamrażarki i poddaj sonikacji w kąpieli lodowej przez 30 s, tak aby płytka pływała w lodowatej wodzie.

Oznacz cztery płytki 96-dołkowe o płaskim dnie jako jedna, dwie, trzy i cztery. Przenieś 150 µL każdej sonikowanej kultury z płytki z rozcieńczeniami do płytek o płaskim dnie zgodnie z następującym schematem. Dołki od A1 do D6 przenieś do dołków od C4 do F9 Płytki Pierwszej.

Dołki A7–D12 do dołków C4–F9 na Płycie Dwie. Dołki E1–H6 do dołków C4–F9 na Płycie Trzy. Oraz dołki E7–H12 do dołków C4–F9 na Płycie Cztery.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy prawidłowo umieścić szkiełko agarowe w komorze na szkiełka. Następnie ustaw na stole płytki 96-dołkowe z płaskim dnem zgodnie z ich kwadrantem. Płytki jedna, druga, trzecia i czwarta od lewej do prawej.

Rozmieść końcówki w czterech pustych pudełkach w taki sposób, aby zajęły one wewnętrzne 24 dołki w każdym pudełku. W piątym pudełku umieść końcówkę w pozycji C10 oraz końcówki z odciętymi końcami w pozycjach A1, A12, H1 i H12. Te cztery odcięte końcówki zapewnią stabilność zacisku płyty z końcówkami.

Wprowadź pierwszą końcówkę do punktu startowego programu robotycznego nanoszenia próbek, aby wykonać otwór w agarozie, który zostanie wykorzystany później do wyrównania współrzędnych początku układu. Umieść Płytkę Jeden w robocie do obsługi cieczy w celu naniesienia próbek w pierwszym kwadrancie. Zdejmij pokrywkę i kontynuuj program nanoszenia.

Upewnij się, że wszystkie plamki są obecne. Wyrzuć zużyte końcówki do pojemnika na odpady biologiczne i załóż na robota nowe końcówki. Odczekaj około 30 sekund, aż plamki wyschną do średnicy około jednego milimetra, a następnie kontynuuj program.

Zastąp płytkę pierwszą płytką drugą i kontynuuj program nanoszenia próbek. Gdy wszystkie cztery kwadranty zostaną naniesione, a plamki wyschną, załóż ponownie pokrywę komory na preparat i odwróć urządzenie. Umieść szkiełko przedmiotowe na górnej ściance komory na preparat.

Najpierw umieść szkiełko w komorze mikroskopu. Mikroskopia poklatkowa (time-lapse) jest wykonywana za pomocą specjalnie zaprojektowanego skryptu. Kliknij migawkę, aby otworzyć migawkę światła przechodzącego, a następnie przycisk ostrzenia, aby uruchomić wysoką częstotliwość próbkowania kamery.

Kliknij „Go Origin” i przesuń stolik, aby odnaleźć znak początku układu współrzędnych wybity w agarozie, a następnie przesuń się lekko w prawo, aby ustawić ostrość na komórkach naniesionych w obszarze E7. Wróć do znaku początku i wyśrodkuj go w polu widzenia. Ustaw tę wartość jako punkt początkowy, naciskając przycisk „Set”. Przesuń się do pozycji H18 i ustaw ostrość za pomocą śruby imbusowej znajdującej się najbliżej tej lokalizacji.

Następnie przejdź do pozycji L7 i ustaw ostrość za pomocą śruby imbusowej znajdującej się najbliżej tej lokalizacji. Na koniec przejdź do pozycji E7 i ustaw ostrość za pomocą śruby imbusowej najbliższej tej lokalizacji. Sprawdź ostrość w centrum oraz na krawędziach w punktach E12, H12 i L12; dostosuj zakres autofokusu, jeśli wartości z wskazujące na ostrość przekraczają plus lub minus zakres autofokusu.

Naciśnij przycisk „Reset”, a następnie naciśnij ODELAY. Wybierz katalog do zapisu danych. Mikroskop będzie gromadzić dane przez 48 godzin lub do momentu zamknięcia programu.

Te reprezentatywne obrazy z lapse-time przedstawiają komórki drożdży rosnące na podłożu stałym w godzinie zero oraz po trzech, sześciu i dziewięciu godzinach od naniesienia. Przedstawiony tutaj reprezentatywny zestaw danych porównuje dwa szczepy drożdży po przetworzeniu obrazów timelapse. Stosunkowo jednorodne czasy podwajania odzwierciedlają prawidłowo przygotowany preparat agarozowy, jednak czasy lag różnią się znacząco ze względu na nieoptymalne ustawienia autofokusa.

Przedstawiono tutaj bardziej spójny zestaw danych, w którym wszystkie czasy podwojenia wydają się dobrze pokrywać, a czasy lagowania wydają się być stałe. Po opanowaniu techniki konfiguracja ODELAY może zostać wykonana w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Najbardziej krytycznymi krokami dla powtarzalnych pomiarów ODELAY są spójne przygotowanie pożywek oraz unikanie mechanicznego odkształcania pożywek podczas rozdzielania slajdów.

ODELAY jest bardzo czułym testem. Przykładowo, pozwala on na obserwację wad wzrostu w temperaturozależnych szczepach drożdży w temperaturze pokojowej, podczas gdy powszechnie stosowane testy typu „spot assay” wymagają hodowli drożdży w temperaturze 37 °C, aby wykryć defekt wzrostu. Choć metoda ODELAY została opracowana dla drożdży, ma ona zastosowanie do każdego organizmu tworzącego kolonie, w tym do patogenów, umożliwiając badanie szerokiego zakresu warunków środowiskowych i genetycznych w celu zrozumienia zachowania mikroorganizmów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania metody ODELAY w celu pomiaru fenotypów wzrostu jednokomórkowych mikroorganizmów tworzących kolonie na podłożach stałych. Należy pamiętać, że praca z mikroorganizmami może być niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej odpowiednich dla badanych organizmów.