Analiza pojedynczych cząstek typu open source do mikroskopii superrozdzielczej za pomocą VirusMapper

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wysoce precyzyjnych modeli molekularnych wirusów lub kompleksów makromolekularnych poprzez zastosowanie analizy pojedynczej cząstki do obrazów o wysokiej rozdzielczości struktur ze składnikami znakowanymi fluorescencyjnie. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, w tym architekturę białek złożonych wirusów oraz to, jak zmienia się ona w trakcie infekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zebraniu wielu obrazów tej samej struktury możliwe staje się wygenerowanie bardzo precyzyjnej mapy jej składników.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w strukturę wirusów, może być również stosowana do innych systemów, takich jak inne patogeny i kompleksy makromolekularne w komórkach ssaków. Najpierw zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Uzyskuj obrazy kilku pól widzenia zawierających setki do tysięcy dobrze oddzielonych cząstek bez niepożądanych struktur fluorescencyjnych.

Po uzyskaniu i przetworzeniu obrazów zaimportuj je i połącz w stos z interkalowanymi kanałami. W razie potrzeby przekonwertuj połączony obraz z hiperstosu na stos. Następnie wybierz opcję Wyodrębnij struktury wirusowe" w podmenu VirusMapper i ustaw ścieżkę pliku dla wyodrębnionych cząstek.

Uzupełnij liczbę obrazowanych kanałów fluorescencyjnych. Ustaw kanał odniesienia na kanał fluorescencji, w którym cząstki mają najbardziej spójny wygląd. Jeśli te cząstki nie mają centralnego maksimum, zastosuj rozmycie gaussowskie przed detekcją, aby wywołać jego pojawienie się.

Następnie oszacuj średnicę w pikselach największych cząstek. Ustaw promień ROI na nieco ponad połowę tej wartości. Oszacuj liczbę potrzebnych zwrotów z inwestycji na klatkę.

Początkowo używaj nie więcej niż stu ROI. Ustaw maksymalne nakładanie się ROI na podstawie separacji cząstek. Wyświetl podgląd ROI dla tej klatki.

Dostosuj promień, liczbę ROI i maksymalne nakładanie się, aby każda cząstka w ramce była zamknięta w jednym ROI. Upewnij się, że ROI są co najmniej o kilka pikseli szersze niż największe cząstki. Następnie kliknij OK", aby uruchomić segmentację.

Zamknij przykładowy obraz w menedżerze ROI po wyodrębnieniu. Nie zmieniaj nazw wyekstrahowanych zestawów cząstek. Wybierz opcję Generuj nasiona" i otwórz folder zawierający wyodrębnione dane o cząstkach.

Ustaw kanał referencyjny i wybierz wszystkie kanały, dla których ma zostać wygenerowane ziarno. Jeśli to konieczne, aby dopasować poprzednie modele, obróć nasiona o dziewięćdziesiąt stopni. W przypadku kanałów, w których cząstki nie mają centralnego maksimum, zwiększ wartość rozmycia gaussowskiego przed wyrównaniem, tak jak poprzednio.

Jeśli kanały nie są ściśle wyrównane, włącz korekcję przesunięcia dla kanałów niereferencyjnych. Przeszukaj sekwencję cząstek w poszukiwaniu spójnie pojawiającej się struktury. Zidentyfikuj reprezentatywną cząstkę i wprowadź odpowiedni numer klatki w polu Ramki do użycia.

Przejrzyj powstałe nasiona. Selekcja nasion jest krytycznym etapem tej procedury. Uważnie przeglądaj nieprzetworzone dane, aby zidentyfikować jedną lub wiele struktur do modelowania.

Jakość modelu w dużym stopniu zależy od wyboru nasion, które dokładnie odzwierciedlają te struktury. Dostosuj kanał odniesienia, promień rozmycia gaussowskiego i korekcję przesunięcia zgodnie z potrzebami, aby zoptymalizować identyfikację dodatkowych klatek z podobnymi ziarnami. Kontynuuj dodawanie ramek i dostosowywanie parametrów generowania, aż średnia struktura najlepiej odzwierciedli obserwowaną strukturę w danych.

Wprowadź nazwę folderu i prefiks pliku dla nasion. Kliknij OK", aby zapisać obrazy źródłowe do późniejszego modelowania. Wybierz opcję Generuj modele na podstawie nasion" i otwórz folder wyodrębnionych cząstek.

Załaduj średnie początkowe dla każdego kanału. W przypadku odnajdywania struktury opartej na odniesieniach należy wybrać kanał odniesienia do wyrównania. Znana struktura cząstek w jednym kanale może być użyta jako odniesienie do wyrównania drugiego, nieznanego kanału.

Pozwala to na bezstronne odwzorowanie nieznanej struktury. Należy pamiętać, że przesunięcie chromatyczne między kanałami musi być wcześniej skorygowane. Jeśli analiza szuka niewielkich różnic lub subtelnych cech w modelu, wybierz opcję Kwadratowa intensywność obrazu podczas dopasowywania szablonu.

Ustaw minimalne podobieństwo na od sześćdziesięciu do osiemdziesięciu procent, a liczbę iteracji na jeden. Wybierz modele i cząstki, które mają być wyświetlane podczas obliczeń, a następnie wygeneruj podgląd modeli. Sprawdź modele w wersji zapoznawczej.

Zwiększ minimalne podobieństwo, aby uwzględnić tylko cząstki o pożądanej morfologii. W razie potrzeby zoptymalizuj inne parametry obliczeń modelu i wybierz dodatkowe elementy w procesie generowania modelu, które zostaną wyświetlone w razie potrzeby. Gdy modele w wersji zapoznawczej będą zadowalające, zwiększ liczbę iteracji do dziesięciu.

Ustaw nazwę folderu i prefiks pliku. Kliknij przycisk OK", aby zapisać stosy ewolucji modelu zawierające wszystkie iteracje końcowego modelu. Rekombinowany wirus krowianki z dwoma białkami oznaczonymi zielonymi i czerwonymi białkami fluorescencyjnymi został zobrazowany za pomocą strukturalnej mikroskopii świetlnej i modelowany za pomocą wtyczki VirusMapper.

Nasiona zostały wygenerowane oddzielnie dla orientacji czołowej i strzałkowej, z których każda została uśredniona z pięciu reprezentatywnych cząstek. W zależności od orientacji wirusa można wyróżnić jeden lub dwa ciała boczne. W związku z tym można wygenerować oddzielne modele dla obu orientacji.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że jakość modeli w dużej mierze zależy od jakości pozyskanych surowych danych. Chociaż analiza pojedynczych cząstek może zwiększyć precyzję, nie może zrekompensować obrazów o niskiej jakości. Po tej procedurze można przeprowadzić dalszą kwantyfikację lub dopasowanie modelu na tych modelach.

Może to pomóc w znalezieniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, dotyczące na przykład zmian w architekturze wirusa w skali nano podczas infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać oprogramowania do analizy pojedynczych cząstek VirusMapper do generowania modeli architektury molekularnej na podstawie obrazów o wysokiej rozdzielczości.