Analiza pojedynczych cząstek typu open source do mikroskopii superrozdzielczej za pomocą VirusMapper

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie wysokoprecyzyjnych modeli molekularnych wirusów lub kompleksów makromolekularnych poprzez zastosowanie analizy pojedynczych cząstek do obrazów o superrozdzielczości struktur z komponentami znakowanymi fluorescencyjnie. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, w tym dotyczące architektury białek złożonych wirusów oraz tego, jak zmienia się ona w przebiegu infekcji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wygenerowania wysokoprecyzyjnej mapy komponentów struktury poprzez gromadzenie wielu obrazów tej samej próbki.

Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w strukturę wirusów, można ją zastosować również do innych układów, takich jak inne patogeny i kompleksy makromolekularne w komórkach ssaków. W pierwszej kolejności należy obrazować próbkę za pomocą superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej. Należy pozyskać obrazy z kilku pól widzenia zawierających od setek do tysięcy dobrze odseparowanych cząstek, pozbawionych niepożądanych struktur fluorescencyjnych.

Po uzyskaniu i przetworzeniu obrazów, zaimportuj i połącz je w stos z przeplatającymi się kanałami. W razie potrzeby przekonwertuj połączony obraz z hyper-stack na zwykły stos. Następnie w podmenu VirusMapper wybierz opcję „Extract Viral Structures” i ustaw ścieżkę pliku dla wyekstrahowanych cząsteczek.

Wprowadź liczbę obrazowanych kanałów fluorescencji. Ustaw kanał referencyjny na taki kanał fluorescencji, w którym cząstki mają najbardziej spójny wygląd. Jeśli cząstki te nie posiadają centralnego maksimum, zastosuj rozmycie Gaussa przed detekcją, aby wywołać efekt jego obecności.

Następnie oszacuj średnicę największych cząstek w pikselach. Ustaw promień ROI na wartość nieco większą niż połowa tej wartości. Oszacuj liczbę ROI potrzebnych na jedną klatkę.

Na początku użyj nie więcej niż stu ROI. Ustaw maksymalne nakładanie się ROI w zależności od separacji cząstek. Przejrzyj podgląd ROI dla tej klatki.

Dostosuj promień, liczbę ROI oraz maksymalne nakładanie się, tak aby każda cząstka w klatce była zamknięta w pojedynczym ROI. Upewnij się, że ROI są o co najmniej kilka pikseli szersze od największych cząstek. Następnie kliknij OK, aby uruchomić segmentację.

Po ekstrakcji zamknij obraz próbki w menedżerze ROI. Nie zmieniaj nazw wyekstrahowanych zestawów cząstek. Wybierz „Generate Seeds” i otwórz folder zawierający dane o wyekstrahowanych cząstkach.

Ustaw kanał referencyjny i wybierz wszystkie kanały, dla których należy wygenerować ziarno. Jeśli jest to konieczne dla zgodności z poprzednimi modelami, obróć ziarna o dziewięćdziesiąt stopni. W przypadku kanałów, w których cząstki nie posiadają maksimum centralnego, zwiększ wartość rozmycia gaussowskiego przed wyrównaniem, tak jak wcześniej.

Jeśli kanały nie są ściśle wyrównane, należy włączyć korekcję przesunięcia dla kanałów niebędących referencyjnymi. W sekwencji cząsteczek należy wyszukać strukturę pojawiającą się w sposób powtarzalny. Należy zidentyfikować reprezentatywną cząsteczkę i wprowadzić odpowiadający jej numer klatki w polu „Frames to use”.

Przejrzyj uzyskane ziarna. Wybór ziaren jest krytycznym etapem tej procedury. Dokładnie przeanalizuj surowe dane, aby zidentyfikować jedną lub więcej struktur do modelowania.

Jakość modelu w dużym stopniu zależy od wyboru nasion, które precyzyjnie odzwierciedlają te struktury. W razie potrzeby dostosuj kanał referencyjny, promień rozmycia Gaussa oraz korekcję przesunięcia, aby zoptymalizować identyfikację dodatkowych klatek z podobnymi nasionami. Kontynuuj dodawanie klatek i dostosowywanie parametrów generowania do momentu, aż średnia struktura najlepiej będzie reprezentować strukturę zaobserwowaną w danych.

Wprowadź nazwę folderu i prefiks pliku dla ziarn (seeds). Kliknij OK, aby zapisać obrazy ziaren do późniejszego modelowania. Wybierz Generate Models Based On Seeds i otwórz folder z wyekstrahowanymi cząstkami.

Wczytaj średnie wartości ziarna (seed averages) dla każdego kanału. W przypadku odkrywania struktury w oparciu o referencję, wybierz kanał referencyjny do wyrównania. Znana struktura cząsteczki w jednym kanale może służyć jako referencja do wyrównania drugiego, nieznanego kanału.

Pozwala to na bezstronne mapowanie nieznanej struktury. Należy pamiętać, że przesunięcie chromatyczne między kanałami musi zostać wcześniej skorygowane. Jeśli analiza ma na celu wykrycie niewielkich różnic lub subtelnych cech w modelu, podczas dopasowywania szablonu należy wybrać opcję Square image intensity.

Ustaw minimalne podobieństwo w zakresie od sześćdziesięciu do osiemdziesięciu procent oraz liczbę iteracji na jeden. Wybierz modele i cząsteczki, które mają być wyświetlane podczas obliczeń, a następnie wygeneruj modele podglądu. Przejrzyj modele podglądu.

Zwiększ minimalną wartość podobieństwa, aby uwzględnić tylko cząstki o pożądanej morfologii. W razie potrzeby zoptymalizuj inne parametry obliczeniowe modelu i, jeśli chcesz, wybierz w procesie generowania modelu dodatkowe elementy do wyświetlenia. Po uzyskaniu satysfakcjonujących modeli podglądu zwiększ liczbę iteracji do dziesięciu.

Ustaw nazwę folderu oraz prefiks pliku. Kliknij OK, aby zapisać stosy ewolucji modelu zawierające wszystkie iteracje końcowego modelu. Rekombinowany wirus Vaccinia z dwiema białkami znakowanymi zielonym i czerwonym białkiem fluorescencyjnym został zobrazowany za pomocą mikroskopii z iluminacją strukturalną i zamodelowany przy użyciu wtyczki VirusMapper.

Ziarna generowano osobno dla orientacji frontalnej i strzałkowej, a wyniki z pięciu reprezentatywnych cząsteczek poddano uśrednieniu dla każdej z nich. W zależności od orientacji wirusa można rozróżnić jedno lub dwa ciała boczne. W związku z tym możliwe jest wygenerowanie oddzielnych modeli dla obu orientacji.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jakość modeli w dużej mierze zależy od jakości pozyskanych danych surowych. Chociaż analiza pojedynczych cząsteczek może zwiększyć precyzję, nie jest ona w stanie zrekompensować niskiej jakości obrazów. Po przeprowadzeniu tej procedury możliwe jest dalsze ilościowe określenie parametrów lub dopasowanie modelu do uzyskanych struktur.

Może to pomóc w odpowiedzi na dodatkowe pytania, dotyczące na przykład zmian w skali nano w architekturze wirusa podczas infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak używać oprogramowania do analizy pojedynczych cząstek VirusMapper w celu generowania modeli architektury molekularnej z obrazów o superrozdzielczości.