Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion
31 stycznia 2022
Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.
Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek to metoda ustrukturyzowanego oznaczania makrocząsteczek w rozdzielczości bliskiej atomowej. Dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów i obliczeń strukturalnych, jednak wyniki na mapach 3D często różnią się jakością i rozdzielczością ze względu na różnice w algorytmach stosowanych podczas obliczeń. Dlatego korzystanie z kombinacji różnych programów jest często korzystne dla osiągnięcia optymalnych wyników.
Protokół ten prowadzi użytkowników do poruszania się po przepływie pracy na trzech różnych platformach przetwarzania cryo-EM: CryoSPARC, REION i Scipion. Pokażemy, jak wykorzystać ten potok do uzyskania wysokiej rozdzielczości struktury wirusa związanego z adenowirusem, który jest szeroko stosowanym wektorem terapii genowej. Po otwarciu CryoSPARC v3 w przeglądarce internetowej i utworzeniu przestrzeni roboczej dla projektu, przejdź do nowego obszaru roboczego i otwórz kreator zadań w prawym panelu.
Kliknij importuj filmy i podaj ścieżkę filmów i uzyskaj ścieżkę do pliku referencyjnego. Następnie ustaw parametry akwizycji. Następnie kliknij kolejkę, wybierz tor, aby uruchomić zadanie i obszar roboczy, a następnie kliknij przycisk Utwórz.
Otwórz opcję Łatka korekcji ruchu i kartę zadania importowania filmów. Następnie przeciągnij dane wyjściowe imported_movies do symbolu zastępczego filmów w nowym zadaniu i umieść zadanie w kolejce. Aby wykonać funkcję transferu kontrastu lub oszacowanie CTF, otwórz estymację CTF z łatą.
Wprowadź wygenerowane mikrofotografie i umieść zadanie w kolejce. Aby sprawdzić uśrednione i skorygowane mikrofotografie CTF i wybrać podzbiór do dalszego przetwarzania, otwórz ekspozycje, wprowadź ekspozycje uzyskane w poprzednim kroku i umieść zadanie w kolejce. Gdy zadanie przejdzie w tryb oczekiwania, kliknij kartę interaktywną na karcie zadania.
Dostosuj progi parametrów i zaakceptuj lub odrzuć poszczególne mikrofotografie do dalszej obróbki. Przetwarzając bieżące dane, ustaw górny próg astygmatyzmu na 400 angstremów, rozdzielczość dopasowania CTF na pięć angstremów, a względną grubość lodu na dwa. Następnie kliknij gotowe, aby wybrać mikrografie do dalszego przetwarzania.
W przypadku pobierania ręcznego otwórz selektor ręczny. Wprowadź zaakceptowane ekspozycje i umieść zadanie w kolejce. Następnie kliknij zakładkę interaktywną, ustaw rozmiar pola na 300 pikseli i kliknij kilkaset cząstek na wielu mikrofotografiach, unikając nakładania się cząstek.
Po zakończeniu wyboru kliknij Zakończono wybieranie cząstek ekstraktu. Następnie, aby wygenerować szablony do automatycznego wybierania cząstek, kliknij Klasyfikacja 2D i wprowadź wygenerowane pobrane cząstki. Następnie zmień liczbę klas 2D na 10 i umieść zadanie w kolejce.
Następnie otwórz wybrane klasy 2D i wprowadź cząstki i średnie klas uzyskane w poprzednim kroku. Następnie kliknij na zakładkę interaktywną, wybierz reprezentatywne klasy 2D z dobrym stosunkiem sygnału do szumu i kliknij na gotowe. W przypadku wybierania cząstek na podstawie szablonu, otwórz próbnik szablonów i wprowadź wybrane klasy 2D i mikrofotografie.
Następnie ustaw średnicę cząstek na 220 angstremów i ustaw zadanie w kolejce. Na koniec otwórz wyciąg z mikrofotografii i wprowadź mikrofotografie i cząstki uzyskane podczas sprawdzania próbek cząstek. Następnie ustaw rozmiar wyodrębnionego pola na 300 pikseli i umieść zadanie w kolejce.
Aby uzyskać klasyfikację 2D, kliknij Klasyfikacja 2D i wprowadź wyekstrahowane cząstki. Następnie ustaw liczbę klas 2D na 50 i umieść zadanie w kolejce. Następnie otwórz wybrane klasy 2D i wprowadź uzyskane cząstki oraz średnie klasowe.
Kliknij zakładkę interaktywną. Wybierz klasy 2D na podstawie rozdzielczości i liczby cząstek w klasie, a następnie kliknij na gotowe. Aby wygenerować początkową objętość 3D, otwórz rekonstrukcję ab-initio i wprowadź cząstki z końcowej klasyfikacji 2D.
Następnie dostosuj symetrię do dwudziestościanu i ustaw zadanie w kolejce. Następnie otwórz jednorodne zagęszczenie, wprowadź objętość z poprzedniego kroku i cząstki z końcowej klasyfikacji 2D. Następnie zmień symetrię i umieść zadanie w kolejce.
Po zakończeniu zadania sprawdź korelację powłoki Fouriera lub krzywą FSC i pobierz wolumin do zbadania w UCSF Chimera. W CryoSPARC v3 otwórz kartę zadania wybranej klasy 2D z końcowej klasyfikacji 2D. Następnie na karcie szczegółów kliknij opcję eksportuj zadanie.
Za pomocą PyEM przekonwertuj plik particles_exported. cs na format gwiazdy, wykonując wskazane polecenie. Po kliknięciu na ekstrakcję cząstek, w zakładce I/O wprowadź poprawione mikrografie i współrzędne CTF.
Następnie kliknij kartę wyodrębniania, zmień rozmiar pudełka cząstek na 300 pikseli i uruchom zadanie. W celu udoskonalenia 3D należy użyć mapy wygenerowanej w CryoSPARC v3 jako początkowego modelu w RELION-3. Wybierz metodę importu i ustaw wskazane parametry w zakładce I/O.
Następnie na karcie Inne wybierz mapę CryoSPARC v3 jako plik wejściowy, zmień typ węzła na odniesienie 3D i uruchom zadanie. Następnie wybierz automatyczne udoskonalanie 3D i na karcie I/O ustaw obrazy wejściowe jako cząstki. Plik gwiazdki z ostatniego zadania selekcji.
Użyj rekonstrukcji CryoSPARC v3 jako mapy referencyjnej, kliknij na zakładkę referencji i zmień początkowy filtr dolnoprzepustowy na 50 angstremów i symetrię na ikosahedral. Następnie na karcie optymalizacji zmień średnicę maski na 280 angstremów i uruchom zadanie. Aby uzyskać przetwarzanie końcowe, kliknij przetwarzanie końcowe.
Na karcie I/O wprowadź utworzone półmapy i maskę, a następnie ustaw skalibrowany rozmiar piksela na 1,045 angstremów. Następnie na karcie wyostrzania, aby automatycznie oszacować współczynnik B, wprowadź tak. Aby uzyskać najniższą rozdzielczość dla automatycznego dopasowania B, wprowadź 10.
A do użycia własnego współczynnika B, numer wejściowy. Na koniec na karcie filtru ustaw opcję Pomiń ważenie FSC na nie i uruchom zadanie. Do treningu polerowania otwarte polerowanie bayesowskie.
Na karcie I/O wprowadź mikrofotografie z korekcją ruchu, cząstki i PostProcess. plik gwiazdy, który został uzyskany wcześniej. Kliknij kartę trenowania i ustaw optymalne parametry trenowania na tak, ułamek pikseli Fouriera do testowania na 0,5 i użyj tej liczby cząstek na 5 000.
Następnie uruchom zadanie. Po zakończeniu zadania szkoleniowego kliknij polerowanie bayesowskie. Następnie w zakładce trening ustaw optymalne parametry trenowania na no.
Wybierz zakładkę polish i w zoptymalizowanym pliku parametrów określ ścieżkę do pliku opt_params_all_groups. txt z poprzedniego kroku i kliknij uruchom. Aby oszacować aberracje wyższego rzędu, otwórz uściślanie CTF.
Na karcie I/O w obszarze Cząstki wybierz ścieżkę do pliku gwiazdy zawierającego wypolerowane cząstki z ostatniego udoskonalonego zadania 3D. Następnie w pliku STAR przetwarzania końcowego ustaw ścieżkę do danych wyjściowych z najnowszego zadania przetwarzania końcowego. Następnie wybierz zakładkę dopasowania i ustaw szacuj powiększenie anizotropowe na nie.
Wykonaj dopasowanie parametru CTF do nr. Oszacuj nachylenie wiązki na tak. Oszacuj również koniczynę na tak.
I oszacuj aberracje czwartego rzędu na tak. Następnie uruchom zadanie. Aby jeszcze bardziej udoskonalić i zweryfikować mapę RELION-3, uruchom Scipion 3 i utwórz nowy projekt.
W lewym panelu protokołów wybierz menu rozwijane importu i kliknij importuj cząstki. Zmień import parametrów z do RELION-3 i plik star na postprocess.star. Następnie określ parametry akwizycji, jak pokazano wcześniej, i kliknij wykonaj.
Następnie kliknij listę rozwijaną importu i wybierz woluminy importu. W obszarze importuj z podaj ścieżkę do mapy RELION-3, zmień częstotliwość próbkowania rozmiaru piksela na 1,045 angstrema na piksel i wykonaj. Aby wykonać globalne wyrównanie, wybierz menu rozwijane uściślania z panelu protokołów i kliknij xmipp3-highres.
Wprowadź zaimportowane cząstki i objętości z poprzednich kroków odpowiednio jako pełnowymiarowe obrazy i objętości początkowe, a następnie ustaw grupę symetrii na ikozaedryczną. Następnie na karcie Wyrównanie obrazu w obszarze przypisania kątowego wybierz pozycję globalną, ustaw maksymalną rozdzielczość docelową na trzy angstremy i uruchom zadanie. Aby wykonać wyrównanie lokalne, wybierz pozycję xmipp3-highres global, zmień pozycję kontynuuj z poprzedniego przebiegu na tak i wybierz poprzednie zadanie.
Następnie na karcie przypisania kątowego zmień wyrównanie obrazu na lokalne i ustaw maksymalną rozdzielczość docelową na 2,1 angstrema. Po zakończeniu, w oknie wyników xmipp3-highres, kliknij na wyświetl wykresy rozdzielczości, aby zobaczyć, jak zmienił się FSC po udoskonaleniu i kliknij histogram wykresu ze zmianami kątowymi, aby sprawdzić, czy zmieniły się przypisania kąta Eulera. Sprawdź wolumin w UCSF Chimera.
Powiększ i poszukaj funkcji w wysokiej rozdzielczości. Mikrofotografie z dobrym dopasowaniem do CTF i niskim astygmatyzmem zostały wybrane do dalszej obróbki, podczas gdy te z wysokim astygmatyzmem i walkowerem zostały odrzucone. Wybrano średnie klas 2D zawierające dobrze zdefiniowane klasy, a te z niską rozdzielczością, szumem i cząstkami cząstkowymi zostały odrzucone.
Pokazano tutaj obszary mapy mikroskopii krioelektronowej wyposażone we współrzędne atomowe wirusa związanego z adeno. Dobrze zdefiniowane gęstości EM pozwalają na dopasowanie łańcuchów bocznych poszczególnych aminokwasów, cząsteczek wody i jonów magnezu. Krzywe FSC obliczone przy użyciu CryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion wskazują na rosnącą rozdzielczość w całym procesie pracy, oszacowania rozdzielczości w czterech różnych przekrojach struktur, a histogramy rozdzielczości pokazują przyrostową poprawę rozdzielczości lokalnej między mapami w całym procesie pracy.
Połączenie algorytmów przetwarzania cryo-EM CryoSPARC, RELION-3, Scipion i Phoenix zaowocowało zwiększeniem rozdzielczości struktur wirusa związanych z adenowirusem z 2,9 do 2,3 angstremów w całym procesie przetwarzania. Należy pamiętać, że parametry określone na każdym etapie zależą od próbki i mikroskopu. Ponadto zdolność do osiągnięcia wysokiej rozdzielczości w dużej mierze zależy od jakości próbki i surowych danych.
W tym filmie przedstawiamy solidny przepływ pracy SP do przetwarzania danych krio-EM na różnych platformach oprogramowania. Korzystając z tego podejścia, można zaimplementować algorytmy dla wielu programów w celu udoskonalenia i walidacji struktur kriogenicznych. Ten proces roboczy można zastosować do obliczeń struktury szerokiej gamy zespołów makromolekularnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł dostarcza protokołu wykorzystywania trzech platform przetwarzania krio-EM—cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3—aby stworzyć solidny przepływ pracy dla wysokiej rozdzielczości określania struktury makrocząsteczek. Koncentracja skupia się na osiągnięciu optymalnych wyników poprzez kombinację różnych pakietów oprogramowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krio-mikroskopia elektronowa
- Biologia strukturalna
- Wizualizacja makrocząsteczek
Tło
- Krio-mikroskopia elektronowa pojedynczych cząstek umożliwia określanie struktury w rozdzielczości niemal atomowej.
- Różne pakiety oprogramowania dają różną jakość i rozdzielczość w mapach 3D.
- Łączenie wielu programów może poprawić wyniki.
- Ten protokół koncentruje się na adeno-związanym wirusie, wektorze terapii genowej.
Cel badania
- Aby przewodzić użytkownikom w nawigacji przez przepływy pracy na wielu platformach krio-EM.
- Aby pokazać użycie połączonego przepływu dla wysokiej rozdzielczości określania struktury.
- Aby zoptymalizować przetwarzanie zestawów danych pojedynczych cząstek.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie cryoSPARC v3 do początkowego konfigurowania projektu.
- Integracja RELION-3 do obliczeń strukturalnych.
- Zastosowanie Scipion 3 do zarządzania przepływem pracy.
- Demonstracja przepływu za pomocą danych adeno-związanego wirusa.
Główne wyniki
- Udane nawigowanie przez przepływy pracy na trzech platformach.
- Uzyskano wysoką rozdzielczość struktury adeno-związanego wirusa.
- Zdemonstrowano poprawę jakości mapy 3D poprzez połączone użycie oprogramowania.
- Protokół dostarcza kompleksowego przewodnika dla badaczy.
Wnioski
- Połączone użycie platform krio-EM poprawia określanie struktury.
- Ten protokół służy jako cenne źródło dla badaczy w dziedzinie biologii strukturalnej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne makrocząsteczki i zestawy danych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating cryoSPARC, RELION, and Scipion into a unified cryo-EM processing workflow enables biopharma R&D teams to achieve near-atomic resolution structures of macromolecular assemblies, such as gene therapy vectors. This cross-platform approach enhances predictive confidence in structural data, supporting critical inflection points in target validation and lead optimization. The workflow's adaptability and reproducibility position it as a reusable enterprise capability for structure-based drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution interrogation of therapeutic targets and vector systems.
- Supports biological de-risking by clarifying macromolecular architecture and assembly.
- Improves predictive confidence for downstream functional and mechanistic studies.
- Facilitates portfolio triage by providing robust structural benchmarks.
Screening & Assay Development
- Prepares validated structural models for rational assay design and compound screening.
- Standardizes image processing and reconstruction outputs for reproducibility.
- Delivers quantitative 3D maps suitable for comparative analysis across candidates.
- Enables scalable workflows for high-throughput structure determination.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant systems, such as viral vectors for gene therapy.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting iterative refinement.
- Reduces translational risk by providing validated atomic models for functional studies.
- Supports biomarker alignment when structural features inform mechanism-of-action hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, reproducible structure determination across platforms.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution structural insights.
- Screening: Provides standardized, reproducible 3D maps for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs, such as FSC curves and resolution histograms, for cross-condition comparison.
- Translational Research: Maintains preclinical continuity by supporting iterative refinement and validation of therapeutic vectors.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, cross-platform workflow adaptable to diverse macromolecular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology pipelines.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cryo-EM processing across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of structural targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structure-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM data acquisition and multi-platform image processing.
- Demands access to high-performance computing and specialized analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of data formats and processing parameters.
- Must adapt workflow parameters to sample and microscope-specific characteristics.
- Resolution outcomes are contingent on raw data quality and sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Creating a New CryoSPARC v3 Project and Importing Data
1:34
CryoSPARC v3: Movie Alignment and Contrast Transfer Function (CTF) Estimation
2:52
CryoSPARC v3: Manual and Template-Based Particle Picking
4:21
CryoSPARC v3: 2D Classification
4:52
CryoSPARC v3: Ab-initio Reconstruction and Homogeneous Refinement
5:31
Exporting Particle Coordinates from CryoSPARC v3 and Importing Them to RELION-3 Using PyEM
5:56
RELION-3: Particle Extraction and 2D Classification, 3D Refinement, Mask Creation, and Post-Processing
7:41
RELION-3: Polishing Training, Particle Polishing, CTF, and Per-Particle Refinements
9:15
Transferring RELION-3 Particle Coordinates and 3D Map to Scipion 3
10:05
Scipion 3: High-Resolution Refinement
11:21
Results: Using cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to Obtain a High-Resolution 3D Reconstruction of the Adeno-Associated Virus
12:52
Conclusion
