Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion
January 31st, 2022
Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.
Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek to metoda ustrukturyzowanego oznaczania makrocząsteczek w rozdzielczości bliskiej atomowej. Dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów i obliczeń strukturalnych, jednak wyniki na mapach 3D często różnią się jakością i rozdzielczością ze względu na różnice w algorytmach stosowanych podczas obliczeń. Dlatego korzystanie z kombinacji różnych programów jest często korzystne dla osiągnięcia optymalnych wyników.
Protokół ten prowadzi użytkowników do poruszania się po przepływie pracy na trzech różnych platformach przetwarzania cryo-EM: CryoSPARC, REION i Scipion. Pokażemy, jak wykorzystać ten potok do uzyskania wysokiej rozdzielczości struktury wirusa związanego z adenowirusem, który jest szeroko stosowanym wektorem terapii genowej. Po otwarciu CryoSPARC v3 w przeglądarce internetowej i utworzeniu przestrzeni roboczej dla projektu, przejdź do nowego obszaru roboczego i otwórz kreator zadań w prawym panelu.
Kliknij importuj filmy i podaj ścieżkę filmów i uzyskaj ścieżkę do pliku referencyjnego. Następnie ustaw parametry akwizycji. Następnie kliknij kolejkę, wybierz tor, aby uruchomić zadanie i obszar roboczy, a następnie kliknij przycisk Utwórz.
Otwórz opcję Łatka korekcji ruchu i kartę zadania importowania filmów. Następnie przeciągnij dane wyjściowe imported_movies do symbolu zastępczego filmów w nowym zadaniu i umieść zadanie w kolejce. Aby wykonać funkcję transferu kontrastu lub oszacowanie CTF, otwórz estymację CTF z łatą.
Wprowadź wygenerowane mikrofotografie i umieść zadanie w kolejce. Aby sprawdzić uśrednione i skorygowane mikrofotografie CTF i wybrać podzbiór do dalszego przetwarzania, otwórz ekspozycje, wprowadź ekspozycje uzyskane w poprzednim kroku i umieść zadanie w kolejce. Gdy zadanie przejdzie w tryb oczekiwania, kliknij kartę interaktywną na karcie zadania.
Dostosuj progi parametrów i zaakceptuj lub odrzuć poszczególne mikrofotografie do dalszej obróbki. Przetwarzając bieżące dane, ustaw górny próg astygmatyzmu na 400 angstremów, rozdzielczość dopasowania CTF na pięć angstremów, a względną grubość lodu na dwa. Następnie kliknij gotowe, aby wybrać mikrografie do dalszego przetwarzania.
W przypadku pobierania ręcznego otwórz selektor ręczny. Wprowadź zaakceptowane ekspozycje i umieść zadanie w kolejce. Następnie kliknij zakładkę interaktywną, ustaw rozmiar pola na 300 pikseli i kliknij kilkaset cząstek na wielu mikrofotografiach, unikając nakładania się cząstek.
Po zakończeniu wyboru kliknij Zakończono wybieranie cząstek ekstraktu. Następnie, aby wygenerować szablony do automatycznego wybierania cząstek, kliknij Klasyfikacja 2D i wprowadź wygenerowane pobrane cząstki. Następnie zmień liczbę klas 2D na 10 i umieść zadanie w kolejce.
Następnie otwórz wybrane klasy 2D i wprowadź cząstki i średnie klas uzyskane w poprzednim kroku. Następnie kliknij na zakładkę interaktywną, wybierz reprezentatywne klasy 2D z dobrym stosunkiem sygnału do szumu i kliknij na gotowe. W przypadku wybierania cząstek na podstawie szablonu, otwórz próbnik szablonów i wprowadź wybrane klasy 2D i mikrofotografie.
Następnie ustaw średnicę cząstek na 220 angstremów i ustaw zadanie w kolejce. Na koniec otwórz wyciąg z mikrofotografii i wprowadź mikrofotografie i cząstki uzyskane podczas sprawdzania próbek cząstek. Następnie ustaw rozmiar wyodrębnionego pola na 300 pikseli i umieść zadanie w kolejce.
Aby uzyskać klasyfikację 2D, kliknij Klasyfikacja 2D i wprowadź wyekstrahowane cząstki. Następnie ustaw liczbę klas 2D na 50 i umieść zadanie w kolejce. Następnie otwórz wybrane klasy 2D i wprowadź uzyskane cząstki oraz średnie klasowe.
Kliknij zakładkę interaktywną. Wybierz klasy 2D na podstawie rozdzielczości i liczby cząstek w klasie, a następnie kliknij na gotowe. Aby wygenerować początkową objętość 3D, otwórz rekonstrukcję ab-initio i wprowadź cząstki z końcowej klasyfikacji 2D.
Następnie dostosuj symetrię do dwudziestościanu i ustaw zadanie w kolejce. Następnie otwórz jednorodne zagęszczenie, wprowadź objętość z poprzedniego kroku i cząstki z końcowej klasyfikacji 2D. Następnie zmień symetrię i umieść zadanie w kolejce.
Po zakończeniu zadania sprawdź korelację powłoki Fouriera lub krzywą FSC i pobierz wolumin do zbadania w UCSF Chimera. W CryoSPARC v3 otwórz kartę zadania wybranej klasy 2D z końcowej klasyfikacji 2D. Następnie na karcie szczegółów kliknij opcję eksportuj zadanie.
Za pomocą PyEM przekonwertuj plik particles_exported. cs na format gwiazdy, wykonując wskazane polecenie. Po kliknięciu na ekstrakcję cząstek, w zakładce I/O wprowadź poprawione mikrografie i współrzędne CTF.
Następnie kliknij kartę wyodrębniania, zmień rozmiar pudełka cząstek na 300 pikseli i uruchom zadanie. W celu udoskonalenia 3D należy użyć mapy wygenerowanej w CryoSPARC v3 jako początkowego modelu w RELION-3. Wybierz metodę importu i ustaw wskazane parametry w zakładce I/O.
Następnie na karcie Inne wybierz mapę CryoSPARC v3 jako plik wejściowy, zmień typ węzła na odniesienie 3D i uruchom zadanie. Następnie wybierz automatyczne udoskonalanie 3D i na karcie I/O ustaw obrazy wejściowe jako cząstki. Plik gwiazdki z ostatniego zadania selekcji.
Użyj rekonstrukcji CryoSPARC v3 jako mapy referencyjnej, kliknij na zakładkę referencji i zmień początkowy filtr dolnoprzepustowy na 50 angstremów i symetrię na ikosahedral. Następnie na karcie optymalizacji zmień średnicę maski na 280 angstremów i uruchom zadanie. Aby uzyskać przetwarzanie końcowe, kliknij przetwarzanie końcowe.
Na karcie I/O wprowadź utworzone półmapy i maskę, a następnie ustaw skalibrowany rozmiar piksela na 1,045 angstremów. Następnie na karcie wyostrzania, aby automatycznie oszacować współczynnik B, wprowadź tak. Aby uzyskać najniższą rozdzielczość dla automatycznego dopasowania B, wprowadź 10.
A do użycia własnego współczynnika B, numer wejściowy. Na koniec na karcie filtru ustaw opcję Pomiń ważenie FSC na nie i uruchom zadanie. Do treningu polerowania otwarte polerowanie bayesowskie.
Na karcie I/O wprowadź mikrofotografie z korekcją ruchu, cząstki i PostProcess. plik gwiazdy, który został uzyskany wcześniej. Kliknij kartę trenowania i ustaw optymalne parametry trenowania na tak, ułamek pikseli Fouriera do testowania na 0,5 i użyj tej liczby cząstek na 5 000.
Następnie uruchom zadanie. Po zakończeniu zadania szkoleniowego kliknij polerowanie bayesowskie. Następnie w zakładce trening ustaw optymalne parametry trenowania na no.
Wybierz zakładkę polish i w zoptymalizowanym pliku parametrów określ ścieżkę do pliku opt_params_all_groups. txt z poprzedniego kroku i kliknij uruchom. Aby oszacować aberracje wyższego rzędu, otwórz uściślanie CTF.
Na karcie I/O w obszarze Cząstki wybierz ścieżkę do pliku gwiazdy zawierającego wypolerowane cząstki z ostatniego udoskonalonego zadania 3D. Następnie w pliku STAR przetwarzania końcowego ustaw ścieżkę do danych wyjściowych z najnowszego zadania przetwarzania końcowego. Następnie wybierz zakładkę dopasowania i ustaw szacuj powiększenie anizotropowe na nie.
Wykonaj dopasowanie parametru CTF do nr. Oszacuj nachylenie wiązki na tak. Oszacuj również koniczynę na tak.
I oszacuj aberracje czwartego rzędu na tak. Następnie uruchom zadanie. Aby jeszcze bardziej udoskonalić i zweryfikować mapę RELION-3, uruchom Scipion 3 i utwórz nowy projekt.
W lewym panelu protokołów wybierz menu rozwijane importu i kliknij importuj cząstki. Zmień import parametrów z do RELION-3 i plik star na postprocess.star. Następnie określ parametry akwizycji, jak pokazano wcześniej, i kliknij wykonaj.
Następnie kliknij listę rozwijaną importu i wybierz woluminy importu. W obszarze importuj z podaj ścieżkę do mapy RELION-3, zmień częstotliwość próbkowania rozmiaru piksela na 1,045 angstrema na piksel i wykonaj. Aby wykonać globalne wyrównanie, wybierz menu rozwijane uściślania z panelu protokołów i kliknij xmipp3-highres.
Wprowadź zaimportowane cząstki i objętości z poprzednich kroków odpowiednio jako pełnowymiarowe obrazy i objętości początkowe, a następnie ustaw grupę symetrii na ikozaedryczną. Następnie na karcie Wyrównanie obrazu w obszarze przypisania kątowego wybierz pozycję globalną, ustaw maksymalną rozdzielczość docelową na trzy angstremy i uruchom zadanie. Aby wykonać wyrównanie lokalne, wybierz pozycję xmipp3-highres global, zmień pozycję kontynuuj z poprzedniego przebiegu na tak i wybierz poprzednie zadanie.
Następnie na karcie przypisania kątowego zmień wyrównanie obrazu na lokalne i ustaw maksymalną rozdzielczość docelową na 2,1 angstrema. Po zakończeniu, w oknie wyników xmipp3-highres, kliknij na wyświetl wykresy rozdzielczości, aby zobaczyć, jak zmienił się FSC po udoskonaleniu i kliknij histogram wykresu ze zmianami kątowymi, aby sprawdzić, czy zmieniły się przypisania kąta Eulera. Sprawdź wolumin w UCSF Chimera.
Powiększ i poszukaj funkcji w wysokiej rozdzielczości. Mikrofotografie z dobrym dopasowaniem do CTF i niskim astygmatyzmem zostały wybrane do dalszej obróbki, podczas gdy te z wysokim astygmatyzmem i walkowerem zostały odrzucone. Wybrano średnie klas 2D zawierające dobrze zdefiniowane klasy, a te z niską rozdzielczością, szumem i cząstkami cząstkowymi zostały odrzucone.
Pokazano tutaj obszary mapy mikroskopii krioelektronowej wyposażone we współrzędne atomowe wirusa związanego z adeno. Dobrze zdefiniowane gęstości EM pozwalają na dopasowanie łańcuchów bocznych poszczególnych aminokwasów, cząsteczek wody i jonów magnezu. Krzywe FSC obliczone przy użyciu CryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion wskazują na rosnącą rozdzielczość w całym procesie pracy, oszacowania rozdzielczości w czterech różnych przekrojach struktur, a histogramy rozdzielczości pokazują przyrostową poprawę rozdzielczości lokalnej między mapami w całym procesie pracy.
Połączenie algorytmów przetwarzania cryo-EM CryoSPARC, RELION-3, Scipion i Phoenix zaowocowało zwiększeniem rozdzielczości struktur wirusa związanych z adenowirusem z 2,9 do 2,3 angstremów w całym procesie przetwarzania. Należy pamiętać, że parametry określone na każdym etapie zależą od próbki i mikroskopu. Ponadto zdolność do osiągnięcia wysokiej rozdzielczości w dużej mierze zależy od jakości próbki i surowych danych.
W tym filmie przedstawiamy solidny przepływ pracy SP do przetwarzania danych krio-EM na różnych platformach oprogramowania. Korzystając z tego podejścia, można zaimplementować algorytmy dla wielu programów w celu udoskonalenia i walidacji struktur kriogenicznych. Ten proces roboczy można zastosować do obliczeń struktury szerokiej gamy zespołów makromolekularnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł dostarcza protokołu wykorzystywania trzech platform przetwarzania krio-EM—cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3—aby stworzyć solidny przepływ pracy dla wysokiej rozdzielczości określania struktury makrocząsteczek. Koncentracja skupia się na osiągnięciu optymalnych wyników poprzez kombinację różnych pakietów oprogramowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krio-mikroskopia elektronowa
- Biologia strukturalna
- Wizualizacja makrocząsteczek
Tło
- Krio-mikroskopia elektronowa pojedynczych cząstek umożliwia określanie struktury w rozdzielczości niemal atomowej.
- Różne pakiety oprogramowania dają różną jakość i rozdzielczość w mapach 3D.
- Łączenie wielu programów może poprawić wyniki.
- Ten protokół koncentruje się na adeno-związanym wirusie, wektorze terapii genowej.
Cel badania
- Aby przewodzić użytkownikom w nawigacji przez przepływy pracy na wielu platformach krio-EM.
- Aby pokazać użycie połączonego przepływu dla wysokiej rozdzielczości określania struktury.
- Aby zoptymalizować przetwarzanie zestawów danych pojedynczych cząstek.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie cryoSPARC v3 do początkowego konfigurowania projektu.
- Integracja RELION-3 do obliczeń strukturalnych.
- Zastosowanie Scipion 3 do zarządzania przepływem pracy.
- Demonstracja przepływu za pomocą danych adeno-związanego wirusa.
Główne wyniki
- Udane nawigowanie przez przepływy pracy na trzech platformach.
- Uzyskano wysoką rozdzielczość struktury adeno-związanego wirusa.
- Zdemonstrowano poprawę jakości mapy 3D poprzez połączone użycie oprogramowania.
- Protokół dostarcza kompleksowego przewodnika dla badaczy.
Wnioski
- Połączone użycie platform krio-EM poprawia określanie struktury.
- Ten protokół służy jako cenne źródło dla badaczy w dziedzinie biologii strukturalnej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne makrocząsteczki i zestawy danych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating cryoSPARC, RELION, and Scipion into a unified cryo-EM processing workflow enables biopharma R&D teams to achieve near-atomic resolution structures of macromolecular assemblies, such as gene therapy vectors. This cross-platform approach enhances predictive confidence in structural data, supporting critical inflection points in target validation and lead optimization. The workflow's adaptability and reproducibility position it as a reusable enterprise capability for structure-based drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution interrogation of therapeutic targets and vector systems.
- Supports biological de-risking by clarifying macromolecular architecture and assembly.
- Improves predictive confidence for downstream functional and mechanistic studies.
- Facilitates portfolio triage by providing robust structural benchmarks.
Screening & Assay Development
- Prepares validated structural models for rational assay design and compound screening.
- Standardizes image processing and reconstruction outputs for reproducibility.
- Delivers quantitative 3D maps suitable for comparative analysis across candidates.
- Enables scalable workflows for high-throughput structure determination.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant systems, such as viral vectors for gene therapy.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting iterative refinement.
- Reduces translational risk by providing validated atomic models for functional studies.
- Supports biomarker alignment when structural features inform mechanism-of-action hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, reproducible structure determination across platforms.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution structural insights.
- Screening: Provides standardized, reproducible 3D maps for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs, such as FSC curves and resolution histograms, for cross-condition comparison.
- Translational Research: Maintains preclinical continuity by supporting iterative refinement and validation of therapeutic vectors.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, cross-platform workflow adaptable to diverse macromolecular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology pipelines.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cryo-EM processing across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of structural targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structure-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM data acquisition and multi-platform image processing.
- Demands access to high-performance computing and specialized analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of data formats and processing parameters.
- Must adapt workflow parameters to sample and microscope-specific characteristics.
- Resolution outcomes are contingent on raw data quality and sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Creating a New CryoSPARC v3 Project and Importing Data
1:34
CryoSPARC v3: Movie Alignment and Contrast Transfer Function (CTF) Estimation
2:52
CryoSPARC v3: Manual and Template-Based Particle Picking
4:21
CryoSPARC v3: 2D Classification
4:52
CryoSPARC v3: Ab-initio Reconstruction and Homogeneous Refinement
5:31
Exporting Particle Coordinates from CryoSPARC v3 and Importing Them to RELION-3 Using PyEM
5:56
RELION-3: Particle Extraction and 2D Classification, 3D Refinement, Mask Creation, and Post-Processing
7:41
RELION-3: Polishing Training, Particle Polishing, CTF, and Per-Particle Refinements
9:15
Transferring RELION-3 Particle Coordinates and 3D Map to Scipion 3
10:05
Scipion 3: High-Resolution Refinement
11:21
Results: Using cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to Obtain a High-Resolution 3D Reconstruction of the Adeno-Associated Virus
12:52
Conclusion
