Name: Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Poznaj solidny przepływ przetwarzania danych cryo-EM wykorzystujący cryoSPARC, RELION i Scipion do wyznaczania struktur makrocząsteczek z rozdzielczością zbliżoną do atomowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Carlosowi Oscarowi Sorzano za pomoc przy instalacji Scipion3 oraz Kilianowi Schnelle i Arne Moellerowi za pomoc w przenoszeniu danych między różnymi platformami przetwarzania. Część tych badań była wspierana przez U24GM129547 grantowe NIH i przeprowadzona w PNCC w OHSU i dostępna za pośrednictwem EMSL (grid.436923.9), DOE Office of Science User Facility sponsorowanego przez Office of Biological and Environmental Research. Badanie to zostało wsparte grantem start-upowym z Rutgers University dla Arka Kulczyka.

<ol><li>Bartesaghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+Cryo-EM+structure+of+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase.</a> Structure. 26 (6), 848-856 (2018).</li>
<li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Cryo-EM+resolution+barriers+to+facilitate+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li>
<li>Wardell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+human+methemalbumin+at+1.9+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).</li>
<li>PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em">https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em</a> (2021).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+an+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>de la Rosa-Trevin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XMIPP%3A+a+new+generation+of+an+open-source+image+processing+package+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).</li>
<li>Lawson, C. L., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cryo-EM+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparing cryo-EM structures.</a> Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).</li>
<li>Dawood, S., Punjani, S., Arulthasan, S. Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial">https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial</a> (2020).</li>
<li>Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topaz-Denoise%3A+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nature Communications. 11 (5208), (2020).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera-a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Scheres, S. Single-particle processing in RELION-3.1. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf</a> (2019).</li>
<li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Zheng, S. MotionCor2 User Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf">https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf</a> (2018).</li>
<li>Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTFFIND4%3A+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).</li>
<li>Asarnow, D., Palovacak, E., Cheng, Y. UCSF PyEM v0.5. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/asarnow/pyem">https://github.com/asarnow/pyem</a> (2019).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).</li>
<li>Jimenez-Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+and+single-particle+analysis+with+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MonoRes%3A+Automatic+and+accurate+estimation+of+local+resolution+for+electron+microscopy+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps.</a> Structure. 26 (2), 337-344 (2018).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).</li>
<li>Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+measures+in+molecular+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Resolution measures in molecular electron microscopy.</a> Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).</li>
<li>Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV-DJ%29-Cryo-EM+structure+at+1.56+A+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution.</a> Viruses. 12 (10), 1194(2020).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> Elife. 7, 42166(2018).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+replisome+reveals+multiple+interaction+coordinating+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiamy solidny przepływ pracy SPA do przetwarzania danych krio-EM na różnych platformach oprogramowania w celu uzyskania rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości (ilustracja 1). Ten przepływ pracy ma zastosowanie do szerokiej gamy makrocząsteczek biologicznych. Kolejne etapy protokołu przedstawiono na rysunku 4, w tym wstępne przetwarzanie filmu, wybieranie i klasyfikację cząstek oraz wiele metod udoskonalania struktury (tabela </...

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) i analiza pojedynczych cząstek (SPA) umożliwiają określanie struktury szerokiej gamy zespołów biomolekularnych w stanie uwodnionym, pomagając wyjaśnić rolę tych makrocząsteczek w szczegółach atomowych. Udoskonalenia w optyce mikroskopowej, sprzęcie komputerowym i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów umożliwiły określenie struktur biomolekuł w rozdzielczości wykraczającej poza 2 Å1,2,3. W 2020 r. w Banku Danych o Białkach (PDB) zdeponowano ponad 2 300 struktur krio-EM, w porównaniu do 192 struktur w 2014 r. 4, co wskazuje, że krio-EM stał się metodą z wyboru dla wielu biologów strukturalnych. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy łączący trzy różne programy SPA do określania struktury w wysokiej rozdzielczości (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
Celem SPA jest rekonstrukcja objętości 3D próbki docelowej z zaszumionych obrazów 2D zarejestrowanych przez detektor mikroskopowy. Detektory zbierają obrazy w postaci filmów z pojedynczymi klatkami o tym samym polu widzenia. W celu zachowania próbki, ramki są zbierane z niską dawką elektronów, a tym samym mają słaby stosunek sygnału do szumu (SNR). Dodatkowo, ekspozycja elektronów może indukować ruch w zeszklonych siatkach krio-EM, powodując rozmycie obrazu. Aby przezwyciężyć te problemy, klatki są wyrównywane w celu skorygowania ruchu wywołanego wiązką i uśredniane, aby uzyskać mikrofotografię o zwiększonym SNR. Mikrofotografie te są następnie poddawane estymacji funkcji transferu kontrastu (CTF) w celu uwzględnienia skutków rozmycia i aberracji narzuconych przez mikroskop. Z mikrofotografii skorygowanych przez CTF poszczególne cząstki są wybierane, ekstrahowane i sortowane w średnie klasy 2D reprezentujące różne orientacje przyjęte przez próbkę w lodzie szklistym. Powstały w ten sposób jednorodny zestaw cząstek jest wykorzystywany jako dane wejściowe do rekonstrukcji 3D ab initio w celu wygenerowania zgrubnego modelu lub modeli, które są następnie iteracyjnie udoskonalane w celu wytworzenia jednej lub więcej struktur o wysokiej rozdzielczości. Po rekonstrukcji przeprowadzane są udoskonalenia strukturalne w celu dalszej poprawy jakości i rozdzielczości mapy cryo-EM. Wreszcie, albo model atomowy jest bezpośrednio wyprowadzany z mapy, albo mapa jest wyposażona w współrzędne atomowe uzyskane gdzie indziej.
Dostępne są różne pakiety oprogramowania do realizacji zadań opisanych powyżej, w tym Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13i inne. Chociaż programy te wykonują podobne etapy przetwarzania, wykorzystują różne algorytmy, na przykład do wybierania cząstek, generowania początkowych modeli i udoskonalania rekonstrukcji. Ponadto programy te wymagają różnego poziomu wiedzy i interwencji użytkownika do działania, ponieważ niektóre zależą od dostrojenia parametrów, które mogą stanowić przeszkodę dla nowych użytkowników. Te rozbieżności często skutkują niespójną jakością i rozdzielczością map na różnych platformach14, co skłania wielu badaczy do korzystania z wielu pakietów oprogramowania w celu udoskonalenia i walidacji wyników. W tym artykule zwracamy uwagę na wykorzystanie cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3 do uzyskania rekonstrukcji 3D AAV w wysokiej rozdzielczości, powszechnie stosowanego wektora terapii genowej15. Wyżej wymienione pakiety oprogramowania są bezpłatne dla użytkowników akademickich; cryoSPARC v3 i Scipion 3 wymagają licencji.

<table><tbody><tr><td>CryoSPARC</td><td>Structura Biotechnology Inc.</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr> <tr><td>CTFFIND 4</td><td>Instytut Medyczny Howarda Hughesa, Szkoła Medyczna UMass Chan</td><td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td><td></td></tr><tr><td>Grupa Struktury Makromolekularnej</td><td>MotionCorr2</td> UCSF <td>https://msg.ucsf.edu/software</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia obliczeniowe Phenix do makromolekularnej krystalografii neutronów (MNC)</td><td>http://www.phenix-online.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uniwersytet PyEM</td><td>w Kalifornii, San Francisco</td><td>https://github.com/asarnow/pyem</td><td></td></tr><tr><td>RELION</td><td>MRC Laboratorium Biologii Strukturalnej</td><td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page</td><td></td></tr><tr>Centrum Przetwarzania Obrazów<td>Scipion</td><td>(I2PC), SciLifeLab</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td></tr> <tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF Zasób do bioinformatyki, Wizualizacja i</td><td>informatyka https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td><td></td></tr></tbody></table>

solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-em) z cryosparc, relion, i scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ostatnie postępy zarówno w oprzyrządowaniu, jak i oprogramowaniu do przetwarzania obrazów sprawiły, że mikroskopia krioelektronowa jednocząsteczkowa (cryo-EM) stała się preferowaną metodą dla biologów strukturalnych do określania struktur o wysokiej rozdzielczości dla szerokiej gamy makrocząsteczek. Dla nowych i doświadczonych użytkowników dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów i obliczania struktury, które usprawniają ten sam podstawowy przepływ pracy: filmy zarejestrowane przez detektory mikroskopowe są poddawane korekcji w celu oszacowania ruchu wywołanego wiązką i funkcji transferu kontrastu (CTF). Następnie obrazy cząstek są wybierane i wyodrębniane z uśrednionych klatek filmu w celu iteracyjnej klasyfikacji 2D i 3D, a następnie rekonstrukcji, udoskonalania i walidacji 3D. Ponieważ różne pakiety oprogramowania wykorzystują różne algorytmy i wymagają różnych poziomów wiedzy specjalistycznej do działania, generowane przez nie mapy 3D często różnią się jakością i rozdzielczością. W ten sposób użytkownicy regularnie przesyłają dane między różnymi programami w celu uzyskania optymalnych wyników. Niniejszy dokument zawiera przewodnik dla użytkowników, który pomaga poruszać się po przepływie pracy w popularnych pakietach oprogramowania: cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3 w celu uzyskania struktury rozdzielczości zbliżonej do atomowej wirusa związanego z adenowirusem (AAV). Najpierw szczegółowo opisujemy proces przetwarzania obrazu za pomocą cryoSPARC v3, ponieważ jego wydajne algorytmy i łatwy w użyciu graficzny interfejs użytkownika pozwalają użytkownikom szybko dotrzeć do mapy 3D. W kolejnym kroku wykorzystujemy PyEM i autorskie skrypty do konwersji i transferu współrzędnych cząstek z najlepszej jakości rekonstrukcji 3D uzyskanej w cryoSPARC v3 do RELION-3 i Scipion 3 oraz przeliczamy mapy 3D. Na koniec nakreślamy kroki w celu dalszego udoskonalenia i walidacji powstałych struktur poprzez integrację algorytmów z RELION-3 i Scipion 3. W tym artykule opisujemy, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania w celu stworzenia jednego i niezawodnego przepływu pracy mającego zastosowanie do różnych zestawów danych w celu określenia struktury w wysokiej rozdzielczości.

Przedstawiliśmy kompleksowy potok przetwarzania danych SPA w celu uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości, wykorzystując trzy różne platformy przetwarzania: cryoSPARC v3, RELION-3 oraz Scipion 3. Rysunek 1 i Rycina 4 podsumuj ogólny przebieg procesu przetwarzania oraz Tabela 1 szczegóły protokołów udoskonalania. Protokoły te zostały zastosowane podczas udoskonalania struktury AAV o rozdzielczości 2,3 Å, co pozwoliło na osiągnięcie rozdziel...

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek to metoda ustrukturyzowanego oznaczania makrocząsteczek w rozdzielczości bliskiej atomowej. Dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania do przetwarzania obrazów i obliczeń strukturalnych, jednak wyniki na mapach 3D często różnią się jakością i rozdzielczością ze względu na różnice w algorytmach stosowanych podczas obliczeń. Dlatego korzystanie z kombinacji różnych programów jest często korzystne dla osiągnięcia optymalnych wyników.Protokół ten prowadzi użytkowników do poruszania się po przepływie pracy na trzech różnych platformach przetwarzania cryo-EM: CryoSPARC, REION i Scipion. Pokażemy, jak wykorzystać ten potok do uzyskania wysokiej rozdzielczości struktury wirusa związanego z adenowirusem, który jest szeroko stosowanym wektorem terapii genowej. Po otwarciu CryoSPARC v3 w przeglądarce internetowej i utworzeniu przestrzeni roboczej dla projektu, przejdź do nowego obszaru roboczego i otwórz kreator zadań w prawym panelu.Kliknij importuj filmy i podaj ścieżkę filmów i uzyskaj ścieżkę do pliku referencyjnego. Następnie ustaw parametry akwizycji. Następnie kliknij kolejkę, wybierz tor, aby uruchomić zadanie i obszar roboczy, a nas

a-robust-single-particle-cryo-electron-microscopy-cryo-em-processing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Zaawansowana metoda selekcji cząstek dla cryo-EM, a mianowicie CryoSieve, poprawia rozdzielczość mapy gęstości, usuwając większość cząstek z końcowych stosów, co zostało zademonstrowane poprzez jej zastosowanie na rzeczywistym zestawie danych.

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół korzystania z urządzenia do szybkiego tworzenia siatki, zarówno do szybkiego tworzenia siatki, jak i do szybkiego mieszania i zamrażania w celu przeprowadzania eksperymentów z rozdzielczością czasową.

Szybkie przygotowanie siatki do czasowo-rozdzielczej mikroskopii krioelektronowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Poznaj solidny przepływ przetwarzania danych cryo-EM wykorzystujący cryoSPARC, RELION i Scipion do wyznaczania struktur makrocząsteczek z rozdzielczością zbliżoną do atomowej.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Przeglądaj więcej filmów