Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy
April 8th, 2017
Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.
Ogólnym celem tego protokołu jest pomoc badaczom C.elegans bez wiedzy bioinformatycznej w przeprowadzeniu eksperymentu sekwencjonowania RNA i analizie danych za pomocą otwartej platformy Galaxy. Metoda ta może pomóc w analizie złożonych danych sekwencjonowania na wysokim poziomie, aby zapewnić wgląd w sygnatury transkryptomiczne stojące za fenotypami u C. elegans. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona naukowcom bez wcześniejszego wykształcenia bioinformatycznego analizowanie surowych danych sekwencjonowania i tworzenie listy genów o zróżnicowanej ekspresji, wraz z powiązanymi z nimi terminami ontologii genów.
Chociaż metoda ta jest specjalnie ukierunkowana na niuanse danych sekwencjonowania C. elegans, może być również stosowana do innych organizmów i kontekstu biologicznego, w którym należy zbadać kluczowe zmiany transkrypcji genomów. Ten film dotyczy korzystania z potoku Galaxy w Internecie. Jeśli to możliwe, uruchom przepływ pracy lokalnie.
Pobierz i zainstaluj Galaxy zgodnie z instrukcjami na stronie wiki. Po skorzystaniu z samouczka Start Here znajdującego się na stronie głównej Galaxy, postępuj zgodnie z tym filmem. Bardzo ważne jest, aby użytkownik zapoznał się i zorientował w interfejsie użytkownika Galaxy oraz narzędziach używanych w przepływie pracy.
Aby rozpocząć, kliknij przycisk Analizuj dane w panelu nagłówka, aby uzyskać dostęp do widoku głównego analizy. Pasek postępu w prawym górnym rogu monitoruje, ile miejsca na dysku zostało wykorzystane. Następnie przejdź do menu narzędzi w lewym panelu i kliknij analizę RNA NGS.
Daje to możliwość wykorzystania wszystkich narzędzi wymaganych do analizy danych sekwencji RNA. Teraz rozpocznij nową historię analizy. Przejdź do panelu historii po prawej stronie.
Kliknij ikonę koła zębatego i wybierz opcję utwórz nowy z menu podręcznego. Następnie podaj nazwę w obszarze historia, aby zidentyfikować analizę. Aby kontynuować, przejdź do menu narzędzi i w obszarze Pobierz dane kliknij funkcję przesyłania pliku, aby przesłać nieprzetworzone pliki szybkiej kolejki.
Po otwarciu zadania w interfejsie analizy kliknij wybierz plik lokalny lub wybierz plik FTP, aby przejść do odpowiednich danych sekwencji i wybrać je. Domyślnie Galaxy automatycznie wykryje typ pliku. Następnie wybierz organizm z rozwijanego menu, którym w tym przypadku jest C.elegans.
Następnie kliknij Start, aby rozpocząć przesyłanie danych. Po przesłaniu pliku operacja jest zapisywana w panelu historii, z którego można wybrać dane i uzyskać do nich dostęp. Teraz konwertuj pliki z formatu szybkiej kolejki pojedynczo na format szybkiej kolejki, uzyskując dostęp do menu NGS QC i manipulacji, wybierając szybki groomer kolejki, wybierając plik w obszarze plik do pielęgnacji.
Wybierz odpowiedni typ szybkich wyników równości danych wejściowych i uruchom narzędzie przy użyciu parametrów domyślnych. Plik danych można teraz analizować. Zwróć szczególną uwagę na formaty plików i parametry testowe używane w całym protokole.
Ta wiedza jest cenna przy rozwiązywaniu problemów z nieudanymi testami i innymi problemami. Przed kontynuowaniem można przeprowadzić testy kontroli jakości. Szczegóły na temat ich uruchamiania znajdują się w protokole tekstowym.
Gdy plik jest gotowy do analizy, zmapuj dane sekwencjonowania, najpierw otwierając sekcję analizy RNA NGS, a następnie klikając narzędzie do kapelusza. Z rozwijanego menu wpisz odpowiedź na pytanie, czy są to pojedyncze czy sparowane dane końcowe? Następnie wybierz odpowiedni plik szybkiej kolejki.
Wybierz opcję użyj wbudowanego genomu w następnym menu rozwijanym i wybierz referencyjne dane genomu C.elegans. Wybierz opcję domyślne dla wszystkich innych opcji parametrów, a następnie kliknij przycisk Wykonaj. Aby oszacować względną obfitość transkryptów w zbiorze danych, wybierz narzędzie spinki do mankietów w sekcji analizy RNA NGS i z pierwszego menu rozwijanego wybierz zmapowany plik w formacie bam zaakceptowanych trafień uzyskany z analizy cylindra.
Z drugiego menu rozwijanego ustaw adnotację referencyjną na plik GTF zawierający bieżące dane genomu. Po wyświetleniu opcji Wykonaj korekcję odchylenia wybierz opcję tak i uruchom zadanie przy użyciu ustawień domyślnych. Następnie z menu analizy RNA NGS otwórz narzędzie do scalania mankietów, aby scalić zmontowane transkrypty wytworzone dla wszystkich próbek sekwencji RNA.
Pierwsze pole w narzędziu ładuje wszystkie pliki GTF utworzone przy użyciu spinek do mankietów w poprzednim kroku. Teraz wybierz zmontowany plik z transkryptami dla każdego z badanych szczepów lub warunków, w tym biologicznych powtórzeń tego samego stanu szczepu. Wybierz tak dla adnotacji odwołania do użytkownika, a następnie wybierz plik danych genomu referencyjnego.
Następnie wybierz tak dla opcji Użyj danych sekwencji. To automatycznie wykryje i wybierze odpowiedni genom referencyjny. Pozostaw wszystkie inne parametry w ustawieniach domyślnych i kliknij przycisk Execute (Wykonaj).
Zostanie utworzony pojedynczy plik GTF. Aby porównać wiele szczepów lub warunków, wróć do sekcji analizy RNA NGS i wybierz narzędzie do div mankietu. Następnie z menu transkrypcji w narzędziu div mankietu wybierz scalony plik wyjściowy ze scalania mankietów.
Następnie wprowadź etykiety dla tych dwóch warunków. Dla każdego warunku przejdź do sekcji replikacje i wybierz poszczególne zaakceptowane pliki wyjściowe trafień z cylindra, które odpowiadają różnym replikom biologicznym tego warunku. Aby wybrać wiele plików jednocześnie, przytrzymaj polecenia lub sterowania.
Po wybraniu plików użyj domyślnych ustawień parametrów i kliknij przycisk Wykonaj, aby uruchomić zadanie. Pobierz dane o ekspresji różnicowej, klikając ikonę zapisywania w polu badania różnicowego genów wygenerowanym w panelu historii. Aby rozpocząć, uzyskaj dostęp do Davida ze strony internetowej.
W nagłówku strony internetowej wybierz opcję Rozpocznij analizę. Skopiuj listę genów uzyskanych z Galaxy do pola A i w tym przykładzie wybierz identyfikator genu jako identyfikator genu podstawy robaka. Następnie w polu typ listy w pytaniu trzecim wybierz listę genów i kliknij ikonę przesyłania listy. Teraz otworzy się strona główna kreatora analizy, z której można wybrać zadania Davida.
W tym segmencie filmu opisano kilka z tych opcji. Najpierw wybierz grupowanie adnotacji funkcjonalnych, aby przejść do strony podsumowania. Pozostaw kategorie adnotacji w ich ustawieniach domyślnych i kliknij funkcjonalne grupowanie adnotacji.
Ta opcja generuje klastry podobnych terminów adnotacji uszeregowanych według ich wyniku wzbogacenia. Teraz wróć do kreatora analizy i wybierz opcję wykresu adnotacji funkcjonalnej, aby zidentyfikować znacznie nadreprezentowane terminy biologiczne związane z listą genów. Cenną funkcją Davida jest możliwość stworzenia funkcjonalnej tabeli adnotacji.
Zawiera listę wszystkich adnotacji związanych z genami, nie pokazując żadnych obliczeń statystycznych. Może to być przydatne do analizy genów po genach i do znajdowania konkretnych genów będących przedmiotem zainteresowania. Innym przydatnym narzędziem Davida do przejrzenia jest klasyfikacja funkcjonalna genów.
Ta opcja segreguje geny w listę funkcjonalnie powiązanych grup uszeregowanych według ich wyniku wzbogacenia. Opisany protokół wykorzystano do identyfikacji genów, których ekspresja jest modulowana przez tcer-1 po utracie linii zarodkowej. Transkryptom długożyciowych mutantów glp-1 z listy linii zarodkowych porównano z podwójnymi mutantami glp-1 tcer-1, które znajdują się na naszej liście linii zarodkowej, ale nie wykazują wydłużenia żywotności.
Kontrola jakości sekwencji nie wykazała żadnej złej jakości odczytów, zawartości od 48 do 49% GC i stałej długości odczytu sekwencji wynoszącej 51 par zasad. Pokrycie genomu próbek oszacowano na od siedmiokrotnego do 11-krotnego. Firma Galaxy umożliwiła połączenie danych NGS z dwóch powtórzeń każdego szczepu i przeprowadzenie analizy różnicowej w celu wygenerowania list genów podkreślających profil ekspresji całego genomu.
Ogólnie rzecz biorąc, 835 genów uległo zróżnicowanej ekspresji między dwoma szczepami przy użyciu wartości granicznej P wynoszącej 0,05. Funkcjonalna analiza adnotacji genów regulowanych w górę ujawniła cztery klastry adnotacji z wysokimi wynikami wzbogacenia. Najwyższy obejmuje cytochrom P450 i geny odpowiedzi ksenobiotycznej, a następnie geny zaangażowane w modyfikacje lipidów.
Funkcjonalne grupowanie adnotacji celów regulowanych w dół również zidentyfikowało różne klastry adnotacji. Obejmowały one klastry wzbogacone o funkcję cytoszkieletu, pozytywną regulację wzrostu, reprodukcji i starzenia się. Rurociąg Galaxy utorował drogę naukowcom z wielu dyscyplin biologicznych do szybkiej i efektywnej analizy zmian ekspresji genów na dużą skalę.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić eksperyment z poszukiwaniem RNA i przeanalizować surowe dane z sekwencjonowania za pomocą rurociągu Galaxy. Powinieneś również być w stanie wydobyć biologicznie istotne informacje z danych Galaxy za pomocą platformy David.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół pomaga badaczom C.elegans w przeprowadzaniu eksperymentów sekwencjonowania RNA i analizowaniu danych za pomocą platformy Galaxy. Umożliwia osobom bez wykształcenia bioinformatycznego skuteczną interpretację złożonych danych sekwencjonowania.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Genomika
- Bioinformatyka
Tło
- RNA-Seq to potężne narzędzie do analizy ekspresji genów.
- Galaxy zapewnia przystępną platformę do analizy danych.
- Analiza różnicowej ekspresji genów jest kluczowa dla zrozumienia procesów biologicznych.
- C.elegans służy jako organizm modelowy do badań genetycznych.
Cel badania
- Aby umożliwić badaczom C.elegans analizę danych RNA-Seq.
- Aby zapewnić wgląd w sygnatury transkryptomowe związane z fenotypami.
- Aby ułatwić zrozumienie ekspresji genów bez konieczności posiadania wiedzy bioinformatycznej.
Zastosowane metody
- Sekwencjonowanie RNA próbek C.elegans.
- Przetwarzanie danych za pomocą platformy Galaxy.
- Identyfikacja genów o zróżnicowanej ekspresji.
- Analiza ontologii genów za pomocą DAVID.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja genów o zróżnicowanej ekspresji.
- Wgląd w termy ontologii genów związane z listami genów.
- Demonstracja użyteczności platformy Galaxy dla osób niebędących ekspertami.
- Potencjalne zastosowanie metody dla innych organizmów.
Konkluzje
- Protokół umożliwia badaczom skuteczną analizę danych RNA-Seq.
- Galaxy i DAVID są cennym narzędziem do interpretacji biologicznej.
- To podejście można dostosować do różnych kontekstów biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accessible transcriptomic analysis platforms like Galaxy enable discovery teams to interrogate gene expression changes without requiring deep bioinformatics expertise, accelerating early-stage target validation and mechanistic de-risking. By streamlining RNA-Seq data processing and functional annotation, this workflow supports rapid hypothesis testing and portfolio triage in model systems such as C. elegans. The approach enhances reproducibility and scalability for both novice and experienced R&D teams handling small-scale transcriptomic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid identification of differentially expressed genes linked to phenotypic changes.
- Supports functional annotation clustering to clarify biological pathways and mechanisms.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene function in disease-relevant models.
- Reduces reliance on specialized bioinformatics personnel for initial data analysis.
Screening & Assay Development
- Provides standardized workflows for RNA-Seq data quality control and alignment.
- Generates reproducible gene lists for downstream screening or validation assays.
- Ensures quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Prepares data for enrichment and gene ontology analysis to inform assay design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic signatures with functional annotation to inform biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in model organisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust gene expression data.
- Facilitates cross-study comparisons by leveraging standardized analysis pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow positions RNA-Seq analysis from raw data through differential expression and functional annotation within the early discovery to preclinical continuum, supporting both target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Empowers teams to test hypotheses and clarify gene function using accessible transcriptomic data analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression outputs for reliable condition comparison.
- Analytics: Integrates statistical thresholds (e.g., p-value cutoffs) and enrichment scores for robust data interpretation.
- Translational Research: Connects gene expression changes to biological processes relevant for preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, user-friendly pipeline adaptable to various organisms and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes RNA-Seq analysis, improving reproducibility and reducing training barriers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by democratizing data analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires basic familiarity with the Galaxy user interface and workflow modules.
- Needs access to computational infrastructure for data upload and processing.
- Demands attention to file formats, parameter settings, and quality control steps.
- Adaptable to other organisms with available reference genomes and annotation files.
- Dependent on accurate statistical analysis and functional annotation for actionable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:39
Conclusion
3:28
Data Analysis with Tuxedo Suite
0:56
Getting Started with Galaxy
6:19
Gene Ontology (GO) Term Analyses Using DAVID
7:56
Results: Transcriptome Dictated by the Transcription Elongation Factor TCER-1, that Extends Lifespan of Germline-less C. elegans
