Name: Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj analizę RNA-Seq w C. elegans przy użyciu platformy Galaxy i narzędzi Tuxedo Suite. Ta metoda umożliwia badaczom bez doświadczenia bioinformatycznego identyfikację różnicowo ekspresowanych genów i interpretację danych transkryptomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby wyrazić swoją wdzięczność laboratoriom, grupom i osobom, które rozwinęły Galaxy i DAVID, a tym samym uczyniły NGS szeroko dostępnym dla społeczności naukowej. Dziękujemy za pomoc i rady udzielone przez kolegów z Uniwersytetu w Pittsburghu podczas naszego szkolenia z bioinformatyki. Praca ta była wspierana przez nagrodę Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging (AG-NS-0879-12) oraz grant z National Institutes of Health (R01AG051659) dla AG.

<ol><li>Venter, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The sequence of the human genome.</a> Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25 (9), 1105-1111 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Roberts, A., Trapnell, C., Donaghey, J., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+RNA-Seq+expression+estimates+by+correcting+for+fragment+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving RNA-Seq expression estimates by correcting for fragment bias.</a> Genome Biol. 12 (3), R22(2011).</li>
<li>Roberts, A., Pimentel, H., Trapnell, C., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+transcripts+in+annotated+genomes+using+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2325-2329 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+analysis+of+gene+regulation+at+transcript+resolution+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Differential analysis of gene regulation at transcript resolution with RNA-seq.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 46-53 (2013).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Applications+of+RNA+Sequencing+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform+Biol+Insights%22%5BJournal%5D)">Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges.</a> Bioinform Biol Insights. 9 (1), 29-46 (2015).</li>
<li>Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem+%28Palo+Alto+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing platforms.</a> Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 6, 287-303 (2013).</li>
<li>Yang, I. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Whole+Transcriptome+Sequencing+Data%3A+Workflow+and+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Inform%22%5BJournal%5D)">Analysis of Whole Transcriptome Sequencing Data: Workflow and Software.</a> Genomics Inform. 13 (4), 119-125 (2015).</li>
<li>Khatri, P., Draghici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontological+analysis+of+gene+expression+data%3A+current+tools%2C+limitations%2C+and+open+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ontological analysis of gene expression data: current tools, limitations, and open problems.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3587-3595 (2005).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Shaye, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrthoList%3A+a+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), e20085(2011).</li>
<li>Consortium, C. eS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC Genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Mortazavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+a+Caenorhabditis+nematode+genome+with+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Scaffolding a Caenorhabditis nematode genome with RNA-seq.</a> Genome Res. 20 (12), 1740-1747 (2010).</li>
<li>Bohnert, R., Ratsch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rQuant.web%3A+a+tool+for+RNA-Seq-based+transcript+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">rQuant.web: a tool for RNA-Seq-based transcript quantitation.</a> Nucleic Acids Res. 38, Web Server issue W348-W351 (2010).</li>
<li>Lamm, A. T., Stadler, M. R., Zhang, H., Gent, J. I., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+RNA-seq+using+single-strand%2C+double-strand%2C+and+CircLigase-based+capture+yields+a+refined+and+extended+description+of+the+C.+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Multimodal RNA-seq using single-strand, double-strand, and CircLigase-based capture yields a refined and extended description of the C. elegans transcriptome.</a> Genome Res. 21 (2), 265-275 (2011).</li>
<li>Amrit, F. R., Ratnappan, R., Keith, S. A., Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+lifespan+assay+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The C. elegans lifespan assay toolkit.</a> Methods. 68 (3), 465-475 (2014).</li>
<li>Hsin, H., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+reproductive+system+regulate+the+lifespan+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signals from the reproductive system regulate the lifespan of C. elegans.</a> Nature. 399 (6734), 362-366 (1999).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+germ+line+regulates+distinct+signaling+pathways+to+control+lifespan+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans germ line regulates distinct signaling pathways to control lifespan and innate immunity.</a> J Biol Chem. 285 (3), 1822-1828 (2010).</li>
<li>Steinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-mediated+regulation+of+SKN-1%2FNrf+in+response+to+germ+cell+absence%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Lapierre, L. R., Gelino, S., Melendez, A., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+lipid+metabolism+coordinately+modulate+life+span+in+germline-less%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy and lipid metabolism coordinately modulate life span in germline-less.</a> C. elegans. Curr Biol. 21 (18), 1507-1514 (2011).</li>
<li>Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
<li>Ghazi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+networks+that+mediate+signals+from+reproductive+tissues+to+influence+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional networks that mediate signals from reproductive tissues to influence lifespan.</a> Genesis. 51 (1), 1-15 (2013).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 5 (9), e1000639(2009).</li>
<li>Amrit, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAF-16+and+TCER-1+Facilitate+Adaptation+to+Germline+Loss+by+Restoring+Lipid+Homeostasis+and+Repressing+Reproductive+Physiology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">DAF-16 and TCER-1 Facilitate Adaptation to Germline Loss by Restoring Lipid Homeostasis and Repressing Reproductive Physiology in C. elegans.</a> PLoS Genet. 12 (2), e1005788(2016).</li>
<li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322 (5903), 957-960 (2008).</li>
<li>McCormick, M., Chen, K., Ramaswamy, P., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+that+extend+Caenorhabditis+elegans%27+lifespan+in+response+to+reproductive+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">New genes that extend Caenorhabditis elegans' lifespan in response to reproductive signals.</a> Aging Cell. 11 (2), 192-202 (2012).</li>
<li>Kartashov, A. V., Barski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioWardrobe%3A+an+integrated+platform+for+analysis+of+epigenomics+and+transcriptomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BioWardrobe: an integrated platform for analysis of epigenomics and transcriptomics data.</a> Genome Biol. 16, 158(2015).</li>
<li>Goncalves, A., Tikhonov, A., Brazma, A., Kapushesky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+RNA-seq+data+processing+and+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A pipeline for RNA-seq data processing and quality assessment.</a> Bioinformatics. 27 (6), 867-869 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie platformy sekwencjonowania galaktyk we współczesnej biologii
Projekt Galaxy odegrał kluczową rolę w pomaganiu biologom bez wykształcenia bioinformatycznego w szybkim i wydajnym przetwarzaniu i analizowaniu danych sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ta publicznie dostępna platforma, niegdyś uważana za herkulesowe zadanie, sprawiła, że uruchamianie złożonych algorytmów bioinformatycznych w celu analizy danych NGS jest prostym, niezawodnym i łatwym procesem. Oprócz szerokiej gamy n...

Pierwsze sekwencjonowanie genomu ludzkiego, przeprowadzone przy użyciu metody sekwencjonowania dideoksynukleotydowego Freda Sangera, trwało 10 lat i kosztowało szacunkowo 3 miliardy USD1,2. Jednak w nieco ponad dekadę od swojego powstania technologia sekwencjonowania następnej generacji (Next-Generation Sequencing, NGS) umożliwiła zsekwencjonowanie całego ludzkiego genomu w ciągu dwóch tygodni za kwotę 1 000 USD. Nowe instrumenty NGS, które pozwalają na coraz szybsze gromadzenie danych sekwencyjnych z niesamowitą wydajnością, wraz z gwałtownym spadkiem kosztów, rewolucjonizują współczesną biologię w niebywały sposób, ponieważ projekty sekwencjonowania genomu stają się powszechne. Ponadto rozwój ten zdynamizował postępy w wielu innych obszarach, takich jak analiza ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-Seq), badanie epigenetycznych modyfikacji w całym genomie, oddziaływania białko-DNA oraz badanie różnorodności mikrobiologicznej u gospodarzy ludzkich. W szczególności RNA-Seq oparty na NGS umożliwił kompleksową identyfikację i mapowanie transkryptomów z wysoką dokładnością i czułością, zastępując technologię mikromacierzy jako preferowaną metodę profilowania ekspresji. Choć technologia mikromacierzy była szeroko stosowana, jej ograniczeniem jest zależność od istniejących macierzy z znanymi informacjami genomicznymi oraz inne wady, takie jak hybrydyzacja krzyżowa i ograniczony zakres zmian ekspresji, które można wiarygodnie zmierzyć. Z drugiej strony RNA-seq może być wykorzystywany do wykrywania transkryptów znanych i nieznanych, generując przy tym niski szum tła dzięki jednoznacznemu mapowaniu DNA. RNA-Seq, wraz z licznymi narzędziami genetycznymi oferowanymi przez organizmy modelowe, takie jak drożdże, muszki, nicienie, ryby i myszy, stał się fundamentem wielu ważnych, niedawnych odkryć biomedycznych. Niemniej jednak nadal istnieją znaczące wyzwania, które sprawiają, że NGS pozostaje niedostępny dla szerszej społeczności naukowej, w tym ograniczenia w zakresie przechowywania, przetwarzania, a przede wszystkim sensownej analizy bioinformatycznej dużych wolumenów danych sekwencyjnych.
Szybki postęp w technologiach sekwencjonowania oraz wykładniczy przyrost danych stworzyły ogromne zapotrzebowanie na platformy obliczeniowe, które umożliwiłyby badaczom dostęp do tych informacji, ich analizę i zrozumienie. Wczesne systemy były w dużym stopniu uzależnione od znajomości programowania, natomiast przeglądarki genomów, takie jak NCBI, które pozwalały osobom niebędącym programistami na dostęp do danych i ich wizualizację, nie umożliwiały przeprowadzania zaawansowanych analiz. Webowa platforma o otwartym dostępie, Galaxy (<a href="https://galaxyproject.org/" target="_blank">https://galaxyproject.org/</a>), wypełniła tę lukę i okazała się wartościowym narzędziem (pipeline), które umożliwia badaczom przetwarzanie danych NGS oraz wykonywanie szerokiego spektrum bioinformatycznych analiz o różnym stopniu złożoności. Galaxy zostało początkowo utworzone i jest utrzymywane przez laboratoria Antona Nekrutenko (Penn State University) oraz Jamesa Taylora (Johns Hopkins University)3. Galaxy oferuje szeroki zakres zadań obliczeniowych, co czyni go kompleksowym rozwiązaniem dla niezliczonych potrzeb bioinformatycznych, w tym wszystkich etapów badania RNA-Seq. Pozwala użytkownikom na przetwarzanie danych zarówno na własnych serwerach, jak i lokalnie na ich maszynach. Dane i przepływy pracy (workflows) mogą być reprodukowane i udostępniane. Stałe wsparcie zapewniają tutoriale online, sekcja pomocy oraz strona wiki (<a href="https://wiki.galaxyproject.org/Support" target="_blank">https://wiki.galaxyproject.org/Support</a>) dedykowana projektowi Galaxy. Jednak dla nowych użytkowników, szczególnie tych bez przeszkolenia z zakresu bioinformatyki, obsługa platformy może wydawać się przytłaczająca, a proces samodzielnej nauki i zapoznawania się z narzędziem może być czasochłonny. Ponadto, badany system biologiczny oraz specyfika eksperymentu i zastosowanych metod wpływają na decyzje analityczne na kilku etapach, co bez odpowiednich instrukcji może być trudne do opanowania.
Ogólny schemat pracy RNA-Seq w Galaxy składa się z przesyłania danych i kontroli jakości, po których następuje analiza z wykorzystaniem pakietu Tuxedo Suite4,5,6,7,8,9, który stanowi zbiór różnych narzędzi niezbędnych na poszczególnych etapach analizy danych RNA-Seq10,11,12,13,14. Typowy eksperyment RNA-Seq składa się z części eksperymentalnej (przygotowanie próbek, izolacja mRNA i przygotowanie biblioteki cDNA), sekwencjonowania NGS oraz bioinformatycznej analizy danych. Przegląd tych sekcji oraz etapów zawartych w potoku Galaxy przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/55473/55473fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Przegląd procesu RNA-Seq. Ilustracja etapów eksperymentalnych i obliczeniowych zaangażowanych w eksperyment RNA-Seq w celu porównania profili ekspresji genów dwóch szczepów nicieni (A i B, odpowiednio pomarańczowe i zielone linie oraz strzałki). Wykorzystane moduły Galaxy przedstawiono w ramkach, a odpowiadający im etap w naszym protokole zaznaczono na czerwono. Wyniki poszczególnych operacji zapisano na szaro, a formaty plików wyświetlono na niebiesko. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55473/55473fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Pierwszym narzędziem w pakiecie Tuxedo Suite jest program do wyrównywania sekwencji o nazwie 'Tophat'. Rozbija on odczyty wejściowe NGS na mniejsze fragmenty, a następnie mapuje je do genomu referencyjnego. Ten dwuetapowy proces zapewnia uwzględnienie i zmapowanie odczytów obejmujących regiony intronowe, których wyrównanie mogłoby zostać w inny sposób zakłócone lub pominięte. Zwiększa to pokrycie i ułatwia identyfikację nowych miejsc splicingowych. Wynik działania Tophat jest raportowany w dwóch plikach: pliku BED (zawierającym informacje o miejscach splicingowych, w tym lokalizację genomiczną) oraz pliku BAM (z detalami mapowania każdego odczytu). Następnie plik BAM jest wyrównywany do genomu referencyjnego w celu oszacowania obfitości poszczególnych transkryptów w każdej próbce przy użyciu kolejnego narzędzia z pakietu Tuxedo Suite o nazwie 'Cufflinks'. Cufflinks działa poprzez skanowanie wyrównania w celu raportowania pełnowymiarowych fragmentów transkryptów lub „transfragów”, które obejmują wszystkie możliwe warianty splicingu w danych wejściowych dla każdego genu. Na tej podstawie generuje on „transkryptom” (zespół wszystkich transkryptów wygenerowanych na gen dla każdego genu) dla każdej sekwencjonowanej próbki. Zespoły Cufflinks są następnie łączone lub scalane wraz z genomem referencyjnym, aby stworzyć jeden plik adnotacji do późniejszej analizy różnicowej przy użyciu następnego narzędzia, 'Cuffmerge'. Na koniec narzędzie 'Cuffdiff' mierzy różnicową ekspresję genów między próbkami, porównując wyniki TopHat dla każdej z próbek z końcowym plikiem wynikowym Cuffmerge (Rycina 1). Cufflinks wykorzystuje wartości FPKM/RPKM (Fragments/Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) do raportowania obfitości transkryptów. Wartości te odzwierciedlają normalizację surowych danych NGS pod kątem głębokości (średnia liczba odczytów z próbki, które wyrównują się do genomu referencyjnego) oraz długości genu (geny mają różną długość, więc liczby muszą być znormalizowane względem długości genu, aby móc porównywać poziomy między genami). FPKM i RPKM są w zasadzie takie same, przy czym RPKM jest stosowany w RNA-Seq z odczytem z jednego końca (single-end), gdzie każdy odczyt odpowiada pojedynczemu fragmentowi, natomiast FPKM jest stosowany w RNA-Seq z odczytem z obu końców (paired-end), ponieważ uwzględnia fakt, że dwa odczyty mogą odpowiadać temu samemu fragmentowi. Ostatecznym wynikiem tych analiz jest lista genów wykazujących różnicową ekspresję między badanymi warunkami i/lub szczepami.
Po pomyślnym zakończeniu pracy w systemie Galaxy i wygenerowaniu „listy genów”, kolejnym logicznym krokiem jest przeprowadzenie dalszych analiz bioinformatycznych w celu wyciągnięcia istotnych wniosków z zestawów danych. W celu zaspokojenia tej potrzeby powstało wiele pakietów oprogramowania, w tym ogólnodostępne narzędzia obliczeniowe oparte na przeglądarce internetowej, takie jak DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated discovery).15Narzędzie DAVID ułatwia przypisywanie znaczenia biologicznego obszernym listom genów pochodzącym z badań wysokoprzepustowych poprzez porównywanie przesłanej listy genów z zintegrowaną bazą wiedzy biologicznej i ujawnianie powiązanych z tą listą adnotacji biologicznych. Następnie przeprowadzana jest analiza wzbogacenia (Enrichment Analysis), t. j., testy służące do identyfikacji, czy dany proces biologiczny lub klasa genów jest reprezentowana w liście (lub listach) genów w stopniu nadmiernym i statystycznie istotnym. Stało się ono popularnym wyborem dzięki połączeniu szerokiej, zintegrowanej bazy wiedzy oraz potężnych algorytmów analitycznych, które umożliwiają badaczom wykrywanie motywów biologicznych wzbogaconych w „listach genów” pochodzących z analiz genomicznych10,16Dodatkowe zalety obejmują możliwość przetwarzania list genów stworzonych na dowolnej platformie sekwencjonowania oraz bardzo przyjazny dla użytkownika interfejs.
Nicień Caenorhabditis elegans jest genetycznym systemem modelowym, znanym z wielu zalet, takich jak niewielkie rozmiary, przezroczyste ciało, prosty plan budowy, łatwość hodowli oraz duża podatność na analizy genetyczne i molekularne. Nicienie posiadają niewielki, prosty i dobrze zinterpretowany genom, który obejmuje do 40% genów konserwowanych o znanych homologach ludzkich17. Rzeczywiście, C. elegans był pierwszym metazoą, którego genom został całkowicie zsekwencjonowany18, i jednym z pierwszych gatunków, w których zastosowano metodę RNA-Seq do mapowania transkryptomu organizmu19,20. Wczesne badania nad nicieniami obejmowały eksperymenty z różnymi metodami wysokoprzepustowego wychwytu RNA, przygotowania bibliotek i sekwencjonowania, a także potoki bioinformatyczne, które przyczyniły się do rozwoju tej technologii21,22. W ostatnich latach eksperymenty oparte na RNA-Seq u nicieni stały się powszechne. Jednak dla tradycyjnych biologów zajmujących się nicieniami wyzwania związane z analizą obliczeniową danych RNA-Seq pozostają główną przeszkodą w szerszym i lepszym wykorzystaniu tej techniki.
W niniejszym artykule opisujemy protokół wykorzystania platformy Galaxy do analizy wysokoprzepustowych danych RNA-Seq uzyskanych z C. elegans. Dla wielu nowych oraz małoskalowych użytkowników najbardziej efektywnym kosztowo i najprostszym sposobem przeprowadzenia eksperymentu RNA-Seq jest izolacja RNA w laboratorium i skorzystanie z komercyjnego (lub wewnętrznego) ośrodka NGS w celu przygotowania bibliotek cDNA do sekwencjonowania oraz samego sekwencjonowania NGS. W związku z tym szczegółowo opisaliśmy najpierw etapy izolacji, kwantyfikacji i oceny jakości próbek RNA C. elegans do analizy RNA-Seq. Następnie przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z interfejsu Galaxy do analizy danych NGS, zaczynając od testów kontroli jakości po sekwencjonowaniu, a następnie wyrównywania, składania i różnicowej kwantyfikacji ekspresji genów. Dodatkowo zawarliśmy wytyczne dotyczące weryfikacji list genów uzyskanych z Galaxy w celu przeprowadzenia badań wzbogacenia biologicznego przy użyciu bazy DAVID. Jako ostatni krok w schemacie postępowania przedstawiamy instrukcje przesyłania danych RNA-Seq na publiczne serwery, takie jak Sequence Read Archive (SRA) w bazie NCBI (<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra</a>), aby udostępnić je bezpłatnie społeczności naukowej. W ogólnym ujęciu przewidujemy, że artykuł ten dostarczy kompleksowych i wystarczających informacji biologom badającym nicienie, którzy po raz pierwszy przeprowadzają eksperymenty RNA-Seq, a także użytkownikom regularnie analizującym niewielką liczbę próbek.

<table><tbody><tr><td>RNaza w sprayu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-178</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Vibra Cell&nbsp;</td>Wirówka <td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Chloroform Eppendorf</td><td>5415C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz&nbsp;</td>Bioanalizator <td>Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Mac/PC</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza transkryptomiczna c. elegans powiedział: dane sekwencjonowania rna za pośrednictwem pakietu tuxedo suite w projekcie galaxy

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zrewolucjonizowały charakter badań biologicznych. Spośród nich sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) stało się potężnym narzędziem do analizy ekspresji genów i mapowania transkryptomu. Jednak obsługa zestawów danych RNA-Seq wymaga wyrafinowanej wiedzy obliczeniowej i stanowi nieodłączne wyzwanie dla badaczy biologii. To wąskie gardło zostało złagodzone przez projekt Galaxy o otwartym dostępie, który umożliwia użytkownikom bez umiejętności bioinformatycznych analizowanie danych sekwencyjnych RNA, a także przez Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), pakiet do analizy terminów Gene Ontology (GO), który pomaga uzyskać znaczenie biologiczne z dużych zbiorów danych. Jednak dla początkujących użytkowników i amatorów bioinformatyki samodzielna nauka i zapoznanie się z tymi platformami może być czasochłonne i zniechęcające. Opisujemy prosty przepływ pracy, który pomoże badaczom C. elegans wyizolować RNA robaka, przeprowadzić eksperyment RNA-Seq i przeanalizować dane za pomocą platform Galaxy i DAVID. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z różnych modułów Galaxy w celu uzyskania dostępu do surowych danych NGS, kontroli jakości, dopasowania i różnicowej analizy ekspresji genów, prowadząc użytkownika za pomocą parametrów na każdym kroku w celu wygenerowania listy genów, która może być badana pod kątem wzbogacenia klas genów lub procesów biologicznych za pomocą DAVID. Ogólnie rzecz biorąc, spodziewamy się, że ten artykuł dostarczy informacji badaczom C. elegans podejmującym po raz pierwszy eksperymenty z sekwencją RNA, a także częstym użytkownikom przeprowadzającym niewielką liczbę próbek.

U C. elegans eliminacja komórek macierzystych linii płciowej (GSCs) wydłuża czas życia, zwiększa odporność na stres i podnosi poziom tłuszczu w organizmie24,28. Utrata GSCs, wywołana ablacją laserową lub mutacjami takimi jak glp-1, prowadzi do wydłużenia czasu życia poprzez aktywację sieci czynników transkrypcyjnych29. Jednym z takich czynników jest TCER-1, który koduje homolog u nicieni l...

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Ogólnym celem tego protokołu jest pomoc badaczom C.elegans bez wiedzy bioinformatycznej w przeprowadzeniu eksperymentu sekwencjonowania RNA i analizie danych za pomocą otwartej platformy Galaxy. Metoda ta może pomóc w analizie złożonych danych sekwencjonowania na wysokim poziomie, aby zapewnić wgląd w sygnatury transkryptomiczne stojące za fenotypami u C. elegans. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona naukowcom bez wcześniejszego wykształcenia bioinformatycznego analizowanie surowych danych sekwencjonowania i tworzenie listy genów o zróżnicowanej ekspresji, wraz z powiązanymi z nimi terminami ontologii genów.Chociaż metoda ta jest specjalnie ukierunkowana na niuanse danych sekwencjonowania C. elegans, może być również stosowana do innych organizmów i kontekstu biologicznego, w którym należy zbadać kluczowe zmiany transkrypcji genomów. Ten film dotyczy korzystania z potoku Galaxy w Internecie. Jeśli to możliwe, uruchom przepływ pracy lokalnie.Pobierz i zainstaluj Galaxy zgodnie z instrukcjami na stronie wiki. Po skorzystaniu z samouczka Start Here znajdującego się na stronie głównej Galaxy, postępuj zgodnie z tym filmem. Bardzo ważne jest, aby użytkownik zapoznał się

transcriptomic-analysis-c-elegans-rna-sequencing-data-through-tuxedo

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film pokazuje podstawowe kroki do przeprowadzenia analizy całego transkryptomu na wypreparowanych próbkach rdzenia kręgowego piskląt po transfekcji z elektroporacją in ovo.

Analiza RNA-Seq zróżnicowanej ekspresji genów w rdzeniu kręgowym piskląt poddanych elektroporacji

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Celem tego protokołu jest zbadanie ewolucji i ekspresji genów kandydujących przy użyciu danych sekwencjonowania RNA.

Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA

Protokół przedstawiony tutaj opisuje kompletny potok do analizy danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, od surowych odczytów do analizy funkcjonalnej, w tym etapy kontroli jakości i wstępnego przetwarzania do zaawansowanych metod analizy statystycznej.

Wysokoprzepustowa analiza transkryptomu do badania interakcji gospodarz-patogen

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj analizę RNA-Seq w C. elegans przy użyciu platformy Galaxy i narzędzi Tuxedo Suite. Ta metoda umożliwia badaczom bez doświadczenia bioinformatycznego identyfikację różnicowo ekspresowanych genów i interpretację danych transkryptomicznych.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy (Wideo) | JoVE Journal

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Przeglądaj więcej filmów