Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

W tym badaniu staramy się odpowiedzieć na krytyczną, niezaspokojoną potrzebę w badaniach nad egzosomami, jaką jest opracowanie na dużą skalę i powtarzalnej metody produkcji mimetyki egzosomów. Ze względu na niską wydajność natywnych EV, mimetyki egzosomów, EM, zostały wyprodukowane jako substytuty za pomocą metod takich jak rzeczywiste wykluczenie i filtracja oparta na wirowaniu. Z pewnością większość mimetyki egzosomów wynika z bezpośredniego wykluczenia całych komórek, które wykazują podobne funkcje biologiczne, ale są nieuchronnie zanieczyszczone szczątkami komórkowymi i organellami.

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe przyciągnęły znaczną uwagę w badaniach biomedycznych, zwłaszcza w leczeniu chorób. Jednak tradycyjne techniki izolacji pojazdów elektrycznych, takie jak ultrawirowanie, wykluczanie wewnętrzne, glify katamentalne zaczynają się od niskiej wydajności, słabej odtwarzalności jakości orki i wymagają drogiego i wymagającego intensywnej inżynierii sprzętu produkcyjnego, który nie jest w stanie zaspokoić klinicznego zapotrzebowania na pojazdy elektryczne. Nasze badanie dostarczyło prostej i bezpłatnej metody zwiększania skali produkcji mimetyki egzosomów.

Korzystamy z unikalnego odkrycia biologicznego, zgodnie z którym nanocząstki magnetyczne mogą być internalizowane tylko w endosomach komórkowych, a nie w innych organellach. W ten sposób możemy przekształcić endosomy w jednolite nanopęcherzyki. Ta metoda skutecznie poprawia wydajność EM i obniża koszty.

Na początek hoduj komórki w kompletnym pożywce DMEM zawierającej 10% FBS i 5% streptomycyny penicyliny na płytce sześciodołkowej. Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia należy przeprowadzić wspólną hodowlę komórek z 10 nanocząsteczkami tlenku żelaza modyfikowanymi polilizyną (IONP).

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 12 godzin. Po inkubacji dodaj 0,5 mililitra trypsyny na studzienkę przez trzy minuty, aby strawić komórki. Następnie dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża na studzienkę, aby zatrzymać trawienie.

Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 1 000 G przez pięć minut i odrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w PBS. Następnie ponownie zawieś osad w ośmiu mililitrach świeżo przygotowanego roztworu hipotonicznego na 15 minut. Przenieś zawiesinę komórek do szklanej probówki i za pomocą szklanego homogenizatora zastosuj 20 wstrząsów przy 1 000 obr./min, aby uwolnić organelle.

Po homogenizacji przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umieść probówkę w separatorze magnetycznym na jedną godzinę, aby całkowicie oddzielić endosomy obciążone IONP od innych organelli i szczątków komórkowych. Aby zebrać endosomy, wylej płyn z probówki i dodaj trzy mililitry PBS w celu ponownego zawieszenia endosomów.

Następnie użyj pistoletu do pipet, aby przedmuchać, aby ponownie zawiesić brązowe granulki znajdujące się na powierzchni styku probówki, obok ramy magnetycznej. W celu szybkiej homogenizacji przenieś roztwór endosomu do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umieść pojemnik na lód pod rurką, a następnie umieść rurkę na homogenizatorze szybkoobrotowym.

Umieść sondę o pojemności 10 mililitrów w rurce, nie dotykając dna. Na ekranie homogenizatora ustaw prędkość na 140 G i ustaw czas na pięć minut. Naciśnij przycisk OK, a następnie przycisk Start.

Po szybkiej homogenizacji przenieś zawiesinę nanopęcherzyków do probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówkę w separatorze magnetycznym na godzinę. Na koniec zbierz płyn zawierający wymagane mimiki egzosomów lub EM, nie naruszając powierzchni obok ramy magnetycznej. Morfologia BMSC-EM analizowanych przez NTA i TEM wykazała typową strukturę pęcherzykowatą w kształcie misy, ograniczoną dwuwarstwą lipidową.

Zarówno BMSC-EM, jak i 293T-EM miały podobną średnicę hydrodynamiczną do natywnych pojazdów elektrycznych. Wyniki Western blot wykazały, że BMSC-EM zawierają te same biomarkery białkowe co EV i prawie nie mają zanieczyszczenia błony plazmatycznej. Wydajność EMs była znacznie wyższa niż natywnych EV przygotowanych przez ultrawirowanie.

EMs miały podobny skład białkowy do natywnych EV.