Name: Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj protokół mikrodysekcji laserowej do analizy proteomicznej granulek neuromelaniny z tkanki postmortalnej istoty czarnej. Metoda LC-MS/MS umożliwia identyfikację 1898 grup białkowych i porównanie stanów zdrowia oraz choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez de. NBI, projekt niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) (numer grantu FKZ 031 A 534A) oraz P.U.R.E. (Jednostka Badawcza ds. Białek w Europie w Europie) i Centrum Diagnostyki Białek (ProDi), oba z Ministerstwa Innowacji, Nauki i Badań Nadrenii Północnej-Westfalii w Niemczech.

<ol><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+profiling+of+spermatozoa+by+laser+capture+microdissection+and+low+volume-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR.</a> PloS One. 6 (8), 22316(2011).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Eggers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fiber+type-specific+protein+profiles+derived+from+adult+murine+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle.</a> Proteomes. 9 (2), 28(2021).</li>
<li>Kley, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+laser+microdissection+and+mass+spectrometry+approach+reveals+new+disease+relevant+proteins+accumulating+in+aggregates+of+filaminopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).</li>
<li>Güttsches, A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+rimmed+vacuoles+define+new+risk+allele+in+inclusion+body+myositis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis.</a> Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).</li>
<li>Bogerts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brainstem+atlas+of+catecholaminergic+neurons+in+man%2C+using+melanin+as+a+natural+marker%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker.</a> The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Engelen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanins+of+human+brain+have+soluble+and+insoluble+components+with+dolichols+attached+to+the+melanic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure.</a> PloS One. 7 (11), 48490(2012).</li>
<li>Duffy, P. E., Tennyson, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+electron+microscopic+observations+of+lewy+bodies+and+melanin+granules+in+the+substantia+nigra+and+locus+caeruleus+in+parkinson%CA%BCs+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).</li>
<li>Zecca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+human+substantia+nigra+neuromelanin+with+lipids+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).</li>
<li>Fenichel, G. M., Bazelon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+neuromelanin.+II.+Melanin+in+the+brainstems+of+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children.</a> Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).</li>
<li>Halliday, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specific+phases+in+the+development+of+human+neuromelanin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Transmission%22%5BJournal%5D)">Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin.</a> Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).</li>
<li>Zucca, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+iron%2C+dopamine+and+neuromelanin+pathways+in+brain+aging+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease.</a> Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).</li>
<li>Carballo-Carbajal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tyrosinase+overexpression+implicates+age-dependent+neuromelanin+production+in+Parkinson%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), 973(2019).</li>
<li>Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin+of+the+substantia+nigra%3A+a+neuronal+black+hole+with+protective+and+toxic+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics.</a> Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).</li>
<li>Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neurochemical+mechanisms+in+PD+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis.</a> Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).</li>
<li>Zecca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin+can+protect+against+iron-mediated+oxidative+damage+in+system+modeling+iron+overload+of+brain+aging+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease.</a> Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).</li>
<li>Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+a+synthetic+neuromelanin+on+yield+of+free+hydroxyl+radicals+generated+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).</li>
<li>Karlsson, O., Lindquist, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanin+affinity+and+its+possible+role+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+transmission%22%5BJournal%5D)">Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration.</a> Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigmentation+in+the+nucleus+substantiae+nigrae+of+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals.</a> Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).</li>
<li>Tribl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BSubcellular+proteomics%26%2334%3B+of+neuromelanin+granules+isolated+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">34;Subcellular proteomics&#34; of neuromelanin granules isolated from the human brain.</a> Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).</li>
<li>Zucca, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromelanin+organelles+are+specialized+autolysosomes+that+accumulate+undegraded+proteins+and+lipids+in+aging+human+brain+and+are+likely+involved+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 17(2018).</li>
<li>Plum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+neuromelanin+granules+isolated+from+human+substantia+nigra+by+laser-microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection.</a> Scientific Reports. 6, 37139(2016).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+quantitation+of+proteins+from+small+pools+of+developing+auditory+and+vestibular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells.</a> Scientific Data. 5, 180128(2018).</li>
<li>Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html">https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html</a> (2007).</li>
<li>Plum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+enrichment+of+neuromelanin+granules+and+synaptosomes+from+human+substantia+nigra+pars+compacta+tissue+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis.</a> Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

LMD jest szeroko stosowaną techniką izolacji określonych obszarów tkanek, pojedynczych komórek lub struktur subkomórkowych. W przedstawionym tutaj poprawionym i zautomatyzowanym protokole technika ta jest stosowana do specyficznej izolacji granulek neuromelaniny (NMG) i tkanki otaczającej NMG (SN). Do tej pory opublikowano i szeroko stosowano dwa różne podejścia do izolacji NMG z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej:
a) Nieciągły gradient sacharozy zużywający 1 g tkanki istoty cza...

Każda tkanka składa się z niejednorodnej mieszaniny różnych typów komórek, ale specyficzna izolacja jednego typu komórki często jest niezbędna do dokładniejszej charakterystyki. Mikrodysekcja laserowa (LMD), łącząca mikroskop z aplikacją laserową, jest potężnym narzędziem do specyficznej izolacji obszarów tkanek, pojedynczych komórek lub podstruktur komórkowych ze złożonego kompozytu. Zastosowanie LMD w połączeniu ze spektrometrią mas (LMD-MS) zostało już z powodzeniem wdrożone w przypadku kilku pytań badawczych, w tym izolacji DNA1, RNA2 i proteins3,4,5. W tym protokole opisano poprawiony i zoptymalizowany protokół LMD-MS do analizy proteomicznej ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej i składników subkomórkowych w celu rozszyfrowania nowych patomechanizmów choroby Parkinsona.
Neuromelanina to, prawie nierozpuszczalny pigment znajdujący się w katecholaminergicznym, wytwarzającym dopaminę neuronach istoty czarnej pars compacta6. Wraz z białkami i lipidami gromadzi się w ziarnistościach przypominających organelle otoczonych podwójną błoną, zwaną granulkami neuromelaniny (NMG)7,8,9. NMG można zaobserwować u ludzi od trzeciego roku życia, zwiększając swoją ilość i gęstość w procesie starzenia10,11. Do tej pory nie ma jednoznacznej hipotezy na temat powstawania neuromelaniny, ale jednym z założeń jest to, że neuromelanina powstaje w wyniku utleniania dopaminy12. Inne hipotezy opierają się na enzymatycznej produkcji neuromelaniny (np. tyrozynazy)13. Stwierdzono, że sama neuromelanina ma wysokie powinowactwo do wiązania lipidów, toksyn, jonów metali i pestycydów. Na podstawie tych ustaleń zakłada się, że powstawanie NMG chroni komórkę przed gromadzeniem się substancji toksycznych i utleniających oraz przed toksynami środowiskowymi14,15. Oprócz tej funkcji neuroprotekcyjnej istnieją dowody na to, że neuromelanina może powodować efekty neurodegeneracyjne, np. poprzez wysycenie żelaza i późniejszą katalizę wolnych rodników16,17. Co więcej, neuromelanina uwalniana podczas procesów neurodegeneracyjnych może być rozkładana przez nadtlenek wodoru, co może przyspieszać martwicę przez reaktywne metale i inne toksyczne związki wcześniej związane z neuromelaniną i może przyczyniać się do zapalenia nerwów i uszkodzenia komórek18. Jednak do tej pory dokładna rola NMG w procesach neurodegeneracyjnych, takich jak przebieg choroby Parkinsona, nie jest do końca poznana. Mimo to NMG wydają się być zaangażowane w patogenezę choroby Parkinsona, a ich specyficzna analiza ma ogromne znaczenie dla rozwikłania ich roli w neurodegeneracji. Niestety, powszechne zwierzęta laboratoryjne (np. myszy i szczury) oraz linie komórkowe nie mają NMGs19. Dlatego naukowcy szczególnie polegają na pośmiertnej tkance mózgowej do swojej analizy. W przeszłości izolacja NMG za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości opierała się na dostępności dużych ilości istoty czarnej tissue20,21. Obecnie LMD prezentuje wszechstronne narzędzie do specyficznego izolowania NMG z próbek ludzkiego mózgu, a następnie analizowania ich za pomocą LC-MS/MS.
W tym protokole przedstawiona jest ulepszona i zautomatyzowana wersja poprzedniego protokołu22 do izolacji NMG i otaczających tkanek (SN), umożliwiając szybsze generowanie próbek, większą liczbę zidentyfikowanych i ilościowo oznaczonych białek oraz znaczne zmniejszenie wymaganych ilości tkanek.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Merck</td><td>1.00029.2500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>AppliChem</td><td>A1666,0100</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tube 500</td><td>Carl Zeiss</td><td>415190-9221-000</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Fusion Lumos Tribrid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td></td></tr><tr><td>PALM MicroBeam</td><td>Zeiss</td><td>494800-0014-000</td><td></td></tr><tr><td>PEN Szkiełko</td><td>membranowe Carl Zeiss</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>substantia nigra pars compacta plastry tkanek</td><td>Navarrabiomed Biobank (Pampeluna, Hiszpania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Merck</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>Klasa sekwencjonowania trypsyny</td><td>Serva</td><td>37283.01</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RSLC nano LC system</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa oprogramowania</td><td>Weblink/Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1.6</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>https://www.maxquant.org/</td> <td>1.6.17.0</td><td></td></tr><tr><td>PALMRobo</td><td>Zeiss</td><td>4.6 pro</td><td></td></tr><tr><td>Perseus</td><td>https://www.maxquant.org/perseus/</td> <td>1.6.15.0</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td>https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view</td><td>20.2.0.343</td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4.3</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy lc-ms/ms profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

Neuromelanina to czarno-brązowawy pigment, obecny w tak zwanych granulkach neuromelaniny (NMG) w neuronach dopaminergicznych istoty czarnej pars compacta. Oprócz neuromelaniny, NMG zawierają różne białka, lipidy i metale. Chociaż neurony dopaminergiczne zawierające NMG są preferencyjnie tracone w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona i demencja z ciałami Lewy'ego, niewiele wiadomo o mechanizmie powstawania NMG i roli NMG w zdrowiu i chorobie. W związku z tym niezbędne są dalsze badania nad charakterystyką molekularną NMG. Niestety, standardowe protokoły izolacji białek opierają się na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości i dlatego wymagają dużych ilości tkanki ludzkiej. W ten sposób ustanowiono tutaj protokół oparty na zautomatyzowanej mikrodysekcji laserowej (LMD), który umożliwia pobieranie NMG i otaczającej tkanki istoty czarnej (SN) przy użyciu minimalnych ilości tkanki w bezstronny, zautomatyzowany sposób. Wycięte próbki są następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu rozszyfrowania ich składu proteomicznego. W tym procesie zidentyfikowano 2079 białek, z których 514 zidentyfikowano wyłącznie w NMG, a 181 w SN. Obecne wyniki zostały porównane z poprzednim badaniem, w którym zastosowano podobne podejście oparte na LMD, osiągając nakładanie się 87,6% dla obu proteomów, weryfikując możliwość zastosowania przedstawionego tutaj poprawionego i zoptymalizowanego protokołu. Aby potwierdzić obecne wyniki, interesujące białka analizowano za pomocą ukierunkowanej spektrometrii mas, np. eksperymentów z równoległym monitorowaniem reakcji (PRM).

Specyficzna izolacja NMG oraz tkanki SN jest najważniejszym krokiem dla skutecznego zastosowania niniejszego protokołu. Wykorzystując funkcję Field of View Analysis w oprogramowaniu dostarczonym przez producenta LMD, NMG mogą być automatycznie zaznaczane w sposób zależny od koloru. W związku z tym należy zidentyfikować obszary tkanki zawierające NMG (Rysunek 2A) i przeprowadzić analizę pola widzenia (Field of View Analysis) z dostosowanymi progami kolorystycznymi, co doprowa...

Solidny protokół jest tutaj prezentowany do izolowania granulek neuromelaniny z ludzkiej tkanki pośmiertnej istoty czarnej pars compacta za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ten zmieniony i zoptymalizowany protokół znacznie minimalizuje wymagany czas pobierania próbek, zmniejsza wymaganą ilość próbki oraz usprawnia identyfikację i kwantyfikację białek za pomocą analizy LC-MS/MS.

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

Nasze połączenie mikrodyssekcji laserowej i spektrometrii mas pozwala na badanie przestrzennie rozdzielczych zmian na poziomie proteomicznym w każdym rodzaju tkanki. W naszym przypadku granulki neuromelaniny. Nasz protokół pozwala na analizę proteomiczną w oparciu o ograniczony materiał próbki.Co zwykle stanowi duże wyzwanie podczas pracy z pośmiertną tkanką mózgową. Ponieważ pojedyncze komórki można wyizolować w celu porównania warunków zdrowotnych i chorobowych na poziomie proteomicznym. Może to poszerzyć naszą wiedzę na temat mechanizmów chorobowych.Aby rozpocząć, umieść szkiełko z błoną tkankową w uchwycie szkiełka na stoliku robo z tkanką skierowaną do góry. Aby uzyskać skan poglądowy przekroju tkanki. Użyj funkcji skanowania, wybierz obszar zainteresowania z lewego górnego rogu i prawego dolnego rogu.Następnie wybierz opcję skanuj wszystkie ROI, aby wykonać skanowanie. Do automatycznego wyboru granulek neuromelaniny w aktualnym polu widzenia. Wybierz analizę pola widzenia.Następnie wybierz odwróć wynik i ustaw próg dla kanałów RGB. Tak, aby tylko granulki neuromelaniny były podświetlone na czerwono w oknie podglądu. Teraz kliknij w porządku, aby użyć dostosowanych ustawień dla pola view.Dostosuj ustawienia lasera, używając tylko obszaru szkiełka pokrytego membraną. Napełnij nakrętkę probówki do pobierania próbek 50 mikrolitrami ultraczystej wody. I włóż nasadkę do kolektora robo movera.Korzystając z interfejsu oprogramowania, ustaw robo poruszacz nad robo stage twore, aby rozpocząć pobieranie próbek. Uruchom laser. Kontroluj ustawienia energii i ostrości podczas procesu laserowego i dostosuj ustawienia w razie potrzeby.Zapewnić właściwą izolację i katapultowanie wyizolowanych obiektów do nasadki probówki do pobierania próbek dla co najmniej pierwszych 10 obiektów. Po zakończeniu pobierania próbek przesuń robo mover do pozycji wyjściowej i wyjmij rurkę do pobierania próbek. Po odwirowaniu próbek przez odcentrowanie.Suszyć próbki przez 1,5 godziny w koncentratorze próżniowym. Po wykonaniu trawienia tryptycznego zgodnie z opisem w tekście. Przygotować próbkę do analizy HPLC-MS, rozpuszczając od 200 do 400 nanogramów peptydów próbki w określonej objętości 0,1% TFA.W obojętnych wlotach do fiolek ze szkła do spektrometrii mas. Jeżeli oznaczanie stężenia nie ma zastosowania ze względu na małą ilość próbki. Sprawdź identyczne obciążenie próbki, porównując całkowity prąd jonów.Aby rozpocząć proteomiczną analizę surowych danych. Kliknij przycisk Załaduj, aby załadować surowe pliki do oprogramowania. Kliknij ustaw eksperyment, aby przypisać nazwy próbek.Definiowanie parametrów specyficznych dla grupy. Dodaj modyfikacje, wybierając deamidację NQ, utlenianie M i karbamidometylację N-term jako modyfikacje zmiennych. a następnie dodać karbamidometylację C jako ustaloną modyfikację.Wybierz trypsynę jako enzym trawiący w zakładce trawienie. W zakładce kwantyfikacja bez etykiet dodaj opcję LFQ, a jeśli do przetworzenia ma być więcej niż 10 plików, wybierz opcję szybkiego LFQ, aby skrócić czas przetwarzania. Upewnienie się, że wszystkie inne parametry specyficzne dla grupy pozostają w ustawieniach fabrycznych.Przejdź do zakładki parametrów globalnych i dodaj plik FASTA pochodzący z uniprot. org w zakładce sekwencje. Zmodyfikuj odpowiednio regułę identyfikatora.I dodaj taksonomię o identyfikatorze 9606 dla Homo sapiens. Do ilościowego oznaczania białek wybierz unikalne i brzytwy peptydy. Następnie dodaj opcję iBAQ jako miarę do oznaczania ilościowego białka w zakładce kwantyfikacji bez etykiety.Upewnij się, że wszystkie inne parametry globalne pozostają w ustawieniach fabrycznych i kliknij start. Po pomyślnym przeprowadzeniu analizy pobierz grupy białek. Dane wyjściowe txt.Załaduj plik proteingroups. txt do oprogramowania analitycznego. Dodaj wartości iBAQ jako kolumny główne i posortuj wszystkie inne kolumny według ich typu.Odfiltruj wabiki i zanieczyszczenia, filtrując wiersze na podstawie kolumny kategorii i filtrując wyniki na podstawie prawidłowych wartości. Wyeksportuj dane wyjściowe w formacie txt do dalszego przetwarzania. I oceń wyniki dotyczące pytania badawczego.W niniejszym badaniu zidentyfikowano 1 898 grup białek w NMG i 1 565 w otaczającej tkance SN, z czego 1 384 zidentyfikowano w obu obszarach tkanki. W ten sposób grupy białek 514 i 181 zostały zidentyfikowane wyłącznie odpowiednio w tkankach NMG i SN. W reprezentatywnych pomiarach DDA.Nieco wyższe wartości iBAQ w NMG w porównaniu z SN wskazywały na większą obfitość białka cytoplazmatycznego dynien-1, łańcucha ciężkiego 1 w NMG. Obserwacja ta może zostać zweryfikowana w eksperymentach PRM dla peptydu ESPEVLLTLDILK. W którym wykryto większą obfitość NMG.Na podstawie obszaru piku na poziomie MS1 i MS2. Najważniejszym krokiem jest zdecydowanie izolacja NMG, ponieważ reszta protokołu opiera się na tym kroku, aby została prawidłowo wykonana. Po procedurze LMD próbki można wykorzystać i poddać dalszemu procesowi do dowolnego rodzaju techniki omicznej, takiej jak genomika, transkryptomika, proteomika lub lipidomika.

laser-microdissection-based-protocol-for-lc-msms-analysis-proteomic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Źródło: Wulf, M., et.al.  Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny. J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia analizę próbek peptydów z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Peptydy są najpierw rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich stosunku masy do ładunku (m / z). Docelowe...

Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Ludzkie komórki neuroprogenitorowe (NPC) były rozwijane w warunkach proliferacji. NPC różnicowano w kultury bogate w neurony w obecności kombinacji neurotrofin. Markery neuronalne wykryto za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Aby wyizolować czystą populację neuronów, NPC różnicowano na szkiełkach membranowych PEN i przeprowadzono mikrodysekcję wychwytywania laserowego.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji neuronów ze zróżnicowanych ludzkich komórek neuroprogenitorowych w hodowli

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Poznaj protokół mikrodysekcji laserowej do analizy proteomicznej granulek neuromelaniny z tkanki postmortalnej istoty czarnej. Metoda LC-MS/MS umożliwia identyfikację 1898 grup białkowych i porównanie stanów zdrowia oraz choroby.

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Przeglądaj więcej filmów