Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych
July 11th, 2017
Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.
Ogólnym celem tego oprogramowania do analizy obrazu jest równoległa analiza dynamiki wypukłości i względnego stężenia białka na całej długości filopodialnej. Ta metoda może naprawdę pomóc nam zrozumieć kluczowe pytania w biologii komórki, zwłaszcza poszczególne białka zaangażowane w wydłużanie i retrakcję filopodiów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastosowany adaptacyjny algorytm śledzenia kształtu umożliwia ilościową ocenę dynamiki wypukłości i przestrzennie rozdzielonej lokalizacji białek.
Na początek hoduj neurony, komórki HeLa lub COS, w uzupełnionej pożywce, jak opisano w protokole tekstowym. Po osiągnięciu 40% konfluencji transwekować komórki wybranymi konstruktami za pomocą odczynnika transwekcyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Utrzymuj transfekcyjne komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 15 do 18 godzin.
Po inkubacji napełnij komory hodowli komórkowych do 90% wstępnie podgrzaną pożywką o temperaturze 37 stopni Celsjusza, zawierającą 20 milimolowych HEPES, aby zmniejszyć zmiany pH i osmolarności spowodowane parowaniem podczas akwizycji obrazu. Aby uszczelnić pokrywkę, nałóż cienką warstwę tłuszczu próżniowego na wewnętrzną stronę pokrywki i delikatnie dociśnij ją do komory hodowlanej zawierającej transfekcyjne komórki. Prawdopodobnie najważniejszą częścią analizy obrazu jest jakość obrazu.
Jedną rzeczą, o którą musimy zadbać, jest stosunek sygnału do szumu, który musi być większy niż cztery i możemy zapewnić, że dostosowując czas naświetlania aparatu oraz intensywność i siłę lasera, śledzenie liczby klatek na sekundę musi być większe niż jeden herc. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu z obiektywem 60x lub 100x i bez zaginania pikseli. Używaj szybkości akwizycji nie mniejszej niż jeden herc do śledzenia dynamiki filopodialnej.
Aby zminimalizować artefakty nieostrości, zobrazuj filopodial blisko błony bazylii. Aby zapewnić płynne śledzenie, dostosuj czas naświetlania aparatu i intensywność lasera tak, aby stosunek sygnału do szumu był większy niż cztery. Po zakończeniu rozpocznij pobieranie obrazu.
Po wstępnym przetworzeniu obrazu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, załaduj obrazy, pobierając spakowany folder zawierający wszystkie wymagane pliki do analizy obrazu. Rozpakuj i skopiuj pliki do folderu roboczego. Po zainstalowaniu uruchom graficzny interfejs użytkownika, otwierając plik o nazwie filopodiaAnalysisM3.fig.
Załaduj zapisane pliki TIFF stosu dla poszczególnych białek w graficznym interfejsie użytkownika lub graficznym interfejsie użytkownika. Za pomocą przycisków 1B dla białka A, 1C dla białka B i opcjonalnie 1D dla białka C. Utwórz nałożony obraz komórki z kanałów białkowych, klikając 1A. Następnie kliknij na 2A, aby przypisać pierwszą klatkę i kliknij na 2B, aby przypisać ostatnią klatkę do analizy.
Opcjonalnie przytnij obszar zainteresowania lub ROI, zawierający filopodium zainteresowania za pomocą przycisku 2H. Obróć obraz za pomocą przycisku 2I lub usuń niechciane regiony za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego 2J. Przesuń suwak, 2C dla każdej klatki w celu kontroli jakości i sprawdzenia, czy filopodium pozostaje wyraźnie widoczne przez cały film.
Aby wygenerować ślad, najpierw kliknij przycisk 3A w pierwszym oknie GUI, aby otworzyć drugie okno GUI. Kliknij przycisk cztery w drugim oknie GUI, aby wygenerować masę nałożonej bryły komórki, która została wygenerowana w pierwszym oknie GUI, po kliknięciu 1A. Zalecamy poświęcenie trochę czasu na optymalizację parametrów, takich jak liczba segmentów, szerokość skanowania i promień skanowania dla eksperymentalnego zestawu danych.
Przesuń suwak w oknie numer dwa, aby sprawdzić, gdzie najpierw pojawia się końcówka filopodialna. Następnie kliknij przycisk piąty, a pojawi się kursor. Użyj kursora, aby wybrać podstawę, od której mierzona jest odległość końcówki filopodialnej.
Następnie czubek filopodiów w ramce, w której pojawia się po raz pierwszy. Następnie wybierz długość progu, powyżej którego filopodia będą się wyginać, używając 6C. Następnie należy podać liczbę segmentów użytych do przybliżenia kształtu filopodiów w ramce 6A.
Określ szerokość skanowania, która działa jak skaner poziomy, aby umieścić węzły w 6B. Określ promień skanowania w polu 6D, użyj wartości, która jest o około 50% większa niż obserwowane przemieszczenie końcówki między ramkami. Następnie określ kąt gięcia w polu 6E.
Zaznacz ślad historii pola w drugim oknie GUI, aby zapisać cały protokół śledzenia do wykorzystania w przyszłości, a następnie kliknij przycisk śledzenia i analizy, aby rozpocząć śledzenie. W przypadku przestrzennej analizy czasowej zaznacz pole reprezentowane przez 8B, a następnie kanał białkowy będący przedmiotem zainteresowania. Kliknij na 8A, aby rozpocząć śledzenie białka wzdłuż długości filopodiów, korzystając z wcześniej wygenerowanego śladu.
W przypadku ratiometrycznej analizy białek zaznacz pole 9B lub 9C i kliknij przycisk 9A, aby uzyskać przestrzenny czasowy wykres ratiometryczny. Aby przeprowadzić analizę końcówki filopodialnej, zaznacz pole 8F i określ długość końcówki oraz długość progu od podstawy, używając 8G i 8H. Kliknij przycisk, aby zapisać dane w pliku Excela o nazwie dynamics.xlsx.
Następnie kliknij Analizuj intensywność białka, aby wygenerować ślad intensywności białka w końcówce filopodialnej i zapisać do analizy ratiometrycznej. Kliknij żądany współczynnik do analizy, używając 9D lub 9E. Na koniec kliknij przycisk porównania, 9A, aby wygenerować dane ratiometryczne.
Analiza komórek COS transfekowanych markerem aktyny nitkowatej w kolorze czerwonym i odniesieniem cytozolowym w kolorze zielonym ujawnia bogate w aktynę wypukłości filopodialne. Szereg czasowy pokazuje, że bogate w aktynę wypukłości filopodialne szybko się rozciągają i chowają. Za pomocą oprogramowania do analizy obrazu prześledzono poszczególne filopodia.
Oprogramowanie do analizy obrazu niezawodnie śledzi wydłużenie filopodiów, oprócz tempa wzrostu i retrakcji poszczególnych filopodiów, chemigrafy pokazują również stężenie aktyny znormalizowane do odniesienia cytozolowego. Przy prawidłowym zastosowaniu technika ta umożliwia ilościową analizę dynamiki wypukłości i przestrzennie rozdzielonego stężenia białka wzdłuż filopodiów. Podczas próby wykonania procedury ważne jest, aby pamiętać o prędkości akwizycji i utrzymywać stosunek sygnału do szumu większy niż cztery, nie nasycając przy tym pojedynczych obrazów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia rozwiązanie oprogramowania do półautomatycznego śledzenia stężenia białka wzdłuż dynamicznych wypustek komórkowych. Oprogramowanie umożliwia równoległą analizę dynamiki wypustek i lokalizacji białka, zwiększając nasze zrozumienie biologii komórki.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Analiza obrazów
- Dynamika białka
Tło
- Rozumienie dynamiki wypustek jest kluczowe w biologii komórki.
- Filopoda odgrywają istotną rolę w rozciąganiu i kurczeniu komórek.
- Ilościowa ocena lokalizacji białka jest niezbędna do badania procesów komórkowych.
- Adaptacyjne algorytmy śledzenia kształtu mogą poprawić dokładność analizy.
Cel badania
- Rozwój metody analizy stężenia białka wzdłuż filopodi.
- Zwiększenie zrozumienia białek zaangażowanych w dynamikę wypustek.
- Dostarczenie narzędzia dla badaczy studiujących zachowanie komórek.
Stosowane metody
- Hodowla neuronów, komórek HeLa lub COS w środowisku uzupełnionym.
- Transfekcja komórek konstrukcjami za pomocą reagentu transfekcyjnego.
- Inkubacja transfekowanych komórek w 37°C i 5% CO2 przez 15-18 godzin.
- Wykorzystanie oprogramowania do śledzenia stężenia białka i dynamiki wypustek.
Główne wyniki
- Oprogramowanie umożliwia ilościową ocenę lokalizacji białka.
- Dostarcza wglądu w dynamikę wypustek komórkowych.
- Adaptacyjne śledzenie zwiększa dokładność pomiarów.
- Metoda może być stosowana do różnych typów komórek.
Wnioski
- Opracowane oprogramowanie jest cennym narzędziem do badania dynamiki białka.
- Pomaga w zrozumieniu mechanizmów rozciągania i kurczenia się komórek.
- Ta metoda może ułatwić przyszłe badania w biologii komórki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cell migration and signaling. This semi-automated image analysis workflow enables spatially resolved, reproducible measurement of protein localization and protrusion dynamics, supporting predictive confidence in target validation. Integrating such adaptive tracking tools strengthens portfolio triage by providing robust, quantitative outputs for mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of protein function during filopodial extension and retraction.
- Supports mechanistic de-risking by mapping spatial-temporal protein localization in live cells.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content imaging data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of modulators affecting protrusion dynamics.
- Standardizes assay conditions with defined signal-to-noise and acquisition thresholds.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for comparative compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein localization data with disease-relevant cell migration models when applicable.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of migration-related targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in cell motility and signaling programs.
Pipeline & Workflow Integration
This software-assisted tracking method fits within the early discovery to lead identification continuum, bridging hypothesis-driven mechanistic studies and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying protein dynamics in live-cell protrusions.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative readouts for downstream screening workflows.
- Analytics: Generates spatial-temporal protein concentration profiles and protrusion kinetics for robust comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant migration models when supported by the system.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable analytical capability for diverse protein localization and cell motility studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms related to cell migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs high-quality microscopy infrastructure with defined signal-to-noise and frame rate capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to various cell types exhibiting filopodia, with parameter optimization per system.
- Dependent on maintaining image quality and avoiding saturation for reliable outputs.
