Name: Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę śledzenia pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia badanie dynamiki białek błonowych i identyfikację ukrytych stanów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych FA9550-20-1-0324, FA9550-23-1-0583 (J.A.B. i G.P.N.) oraz FA9550-18-1-0395 (J.A.B.).
G.P.N. uznaje następujące instytucje finansujące: (1) NEXTGENERATIONEU (NGEU) finansowane przez Ministerstwo Uniwersytetów i Badań (MUR), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności (NRRP), projekt MNESYS (PE0000006) – Wieloskalowe zintegrowane podejście do badania układu nerwowego w zdrowiu i chorobach (DD nr 1553, 11.10.2022) (2) NEXTGENERATIONEU (NGEU) finansowany przez Ministerstwo Uniwersytetów i Badań (MUR), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności (NRRP), projekt CN_00000041 - Narodowe Centrum Terapii Genowej i Leków opartych na technologii RNA (DD nr 1035, 17.06.2022).

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

W tym artykule przedstawiamy metodę śledzenia pojedynczych cząstek, umożliwiającą bezpośrednią obserwację pojedynczych białek błonowych podczas ich przemieszczania się przez membranę lipidową podpartą przez stałe i wzajemne oddziaływanie. AQP4 został wybrany jako reprezentatywny przykład ze względu na zdolność tworzenia dynamicznych samoskładów regulowanych przez różne izoformy 32,33,34. Powyżej przedstawiamy wiarygodną metodę przygotowania próbki oraz kluczowe parametry śledzące białka jednobłonowe w milisekundowych skalach czasowych. Etapy obejmują: (1) przygotowanie SUV-ów, (2) określenie odpowiedniego poziomu znakowania fluorescencyjnego, (3) przygotowanie solidnych podpór, (4) stworzenie próbek białek transbłonowych w dwuwarstwie lipidowej podpartej stałym, (5) przygotowanie środków antyzanikania, (6) zbudowanie prostego mikroskopu jednocząsteczkowego, (7) zbieranie danych śledzących pojedynczych cząsteczek oraz (8) analizę danych śledzących za pomocą ImageJ.
Opisana metoda krok po kroku jest koncepcyjnie prosta; Jednak każdy kluczowy krok ma swoje pułapki i ograniczenia. Spośród nich przygotowanie próbki jest najtrudniejsze (kroki 1-5). Dlatego należy pamiętać o kilku szczegółach. Pierwsza to jak stworzyć lipidową dwuwarstwę wspieraną przez stałe. Istnieją trzy główne metody: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) fuzja i pęknięcie SUV-a oraz (3) powłoka obrotowa 35,36,37,38,39. Każda metoda ma swoje zalety i wady. Na przykład metoda Langmuira-Blodgetta zapewnia większą kontrolę nad właściwościami i składem chemicznym dwuwarstw, w tym asymetrycznym składem między dwoma listkami, oraz umożliwia kontrolowane tworzenie wielowarstwowych warstw. Jednak użycie LB-trough jest technicznie wymagające, czasochłonne i kosztowne w pozyskaniu35. Spin-coating to stosunkowo prosta technika tworzenia dwuwarstw lipidowych; jednak zwykle produkuje wielowarstwowe i wymaga dużej ilości materiału, często niepraktycznie dużej ilości39. Zespolenie i pęcherzykowe pęcherzyki to proste procesy, które wymagają tylko niewielkiej ilości materiału. Jednak stworzenie powierzchni hydrofilowej jest kluczowe, a niektóre składy lipidowe łatwiej tworzą się w dwuwarstwy poprzez fuzję pęcherzyków niż inne (np. w naszym laboratorium odkryliśmy, że pęcherzyki o ładunku ujemnym netto tworzą dwuwarstwy przez fuzję pęcherzyków tylko po dodaniu kationów dwuwartościowych i wydłużeniu czasu inkubacji)40. Poza ustanowieniem powierzchni hydrofilowej (krok 3), inne ważne kwestie przy tworzeniu dwuwarstwy wspieranej na stałe poprzez fuzję pęcherzyków obejmują płukanie nowo powstałej dwuwarstwy zarówno przed, jak i po włączeniu białka błonowego. Przedwstawienie usuwa nadmiar SUV i większe pęcherzyki wielolamelowe (MLV), natomiast ostatnie płukanie po wszczepieniu błony usuwa nieinkorporowane białko. Niewystarczające płukanie może wprowadzać sygnały tła podczas badań śledzenia.
Przeanalizowaliśmy liczne detergenty, aby ustalić, czy nadają się do inserwacji białek transbłonowych do lipidowych dwuwarstw wspieranych przez ciało stałe, w tym C12E9, Tween-20, TritonX-100 i wielu innych. Naszym ulubionym detergentem jest DOTM, ponieważ łatwo go usunąć i jest najdelikatniejszy dla błony (mniej narażony na jej integralność). Ilość dodanego białka jest kluczowa. Za dużo i niemożliwe będzie obserwowanie pojedynczych ścieżek. Podczas adaptacji tej procedury do innych białek transbłonowych, ilość należy dostosować metodą prób i błędów. Jednak wartości podane w tej procedurze są doskonałym punktem wyjścia. Ilość detergentu musi być utrzymwana na poziomie lub poniżej krytycznego stężenia micelarnego; w przeciwnym razie dwuwarstwa zostanie rozpuszczona i usunięta z podłoża kwarcowego.
Wprowadzenie białek błonowych do wspieranej dwuwarstwy lipidowej musi być zoptymalizowane pod kątem każdego zestawu warunków eksperymentalnych. Istnieje jednak kilka powszechnych metod osiągnięcia tego celu, w tym użycie proteoliposomów oraz bezpośrednie włączenie białek błonowych do uformowanej dwuwarstwy41. Proteoliposom to liposom, taki jak SUV, z wbudowanym białkiem. Te proteoliposomy mogą zespolić się z uformowaną, stałą dwuwarstwą lipidową lub być włączone jednocześnie do SUV-ów podczas formowania dwuwarstwy42. Zespolenie powoduje pęknięcie, uwalniając białko do błony. Jest prosta do implementacji, ale skutkuje losową orientacją białek błonowych. Może to prowadzić do silnych interakcji z ciałem stałym, co skutkuje różnymi właściwościami dyfuzyjnymi w zależności od orientacji białka3. Protokół ten opisuje metodę wykorzystującą bezpośrednią inkorporację, co daje preferencję orientacyjną dla AQP4 i innych białek błonowych z dużymi domenami hydrofilowymi po jednej stronie białka 2,5,43,44.
Bezpośrednia obserwacja to potężne narzędzie wykorzystywane w odkryciach naukowych. Dynamiczne obrazowanie pojedynczych cząsteczek jest szczególnie ważne w biofizyce błonowo-białkowej, gdzie obserwacja ruchu i interakcji poszczególnych białek służy do testowania hipotez lub generowania nowych, które lepiej opisują, jak białko się zachowuje. Opisany protokół i metody są idealne dla dwuwymiarowych dwuwarstw lipidowych wspieranych przez ciało stałe, ale można je rozszerzyć na bardziej złożone środowiska z wieloma składnikami2, komórkami żywymi 34,45,46,47 oraz trójwymiarowymi 48. Śledzenie pojedynczych cząsteczek otwiera drzwi do wielu innych eksperymentów, w tym dwukolorowego śledzenia pojedynczych cząsteczek49, pojedyncząsteczkowego FRET 50,51 oraz dynamicznego obrazowania superrozdzielczego, takiego jak Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) oraz Point Accumulation Imaging Nanoscale Topography (PAINT). Rozszerzając instrument o regulację temperatury, można również zbadać właściwości termodynamiczne białek błonowych 26,43,52.

W naturalnych warunkach biologicznych białka błonowe otaczają rozległą sieć interakcji, która obejmuje inne białka błonowe, białka w płynach wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, różne rodzaje lipidów i cholesterolu, substraty lub ligandy, interakcje roztworów oraz interakcje między macierzami zewnątrzkomórkowymi a wewnątrzkomórkowymi. Klasyczne podejście biofizyczne do lepszego zrozumienia specyficznych i zbiorowych interakcji zaczyna się od jednego komponentu, stopniowo wprowadzając kolejne elementy, aż złożoność odzwierciedla rodzime środowisko – podejście "dziel i rządź" w biofizyce. Nowoczesną metodą molekularną badania tych interakcji jest bezpośrednia obserwacja z wykorzystaniem poklatkowego obrazowania fluorescencyjnego pojedynczej cząsteczki, śledzącej poszczególne białka podczas ich ruchu i interakcji ze środowiskiem. W niniejszym artykule opisujemy podstawowe etapy tego podejścia, w tym tworzenie dwuwarstw lipidowych na kwarcowych pokrywkach oraz wprowadzenie dużego białka błonowego do tych gotowych dwuwarstw w sposób odpowiedni do obrazowania pojedynczego białka. Następnie zostanie wprowadzony protokół "roboczy" do śledzenia pojedynczych białek w wspieranych dwuwarstwach.
Ten artykuł opisuje, jak tworzyć dwuwarstwy lipidowe wspierane w stałych elementach za pomocą małych pęcherzyków jednoilamelarnych (SUV), które pękają na hydrofilowych pokrywach kwarcowych. Powierzchnie kwarcu są przygotowywane poprzez mycie kwasowe lub ultrafioletowe (UV) oczyszczanie ozonem. Lipid używany do tworzenia SUV-ów powinien, jeśli to możliwe, odpowiadać głównemu składowi chemicznemu interesującej się błony biologicznej (np. akwaporynę-4 (AQP4) występuje w błonie plazmatycznej astrocytatów, a głównymi składnikami są POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), cholesterol (30%), PI (2,5%) oraz SM (5,6%))1,2). Aby zapobiec interakcji z podłożem stałym, dodatki takie jak glikol polietylenowy (PEG) szczepiony do lipidu unoszą dwuwarstwę z powierzchni 3,4. Ilość każdego dodatku musi być starannie regulowana, aby dyfuzja białek nie była blokowana, a jednocześnie zapewnić wystarczające wsparcie do podniesienia błony z powierzchni podłoża. Dodatki, takie jak lipidy PEGylowane, zazwyczaj wykazują dwie fazy: "fazę szczotkowania" i "fazę grzyba". Faza szczotki zachodzi, gdy PEG jest w wysokim stężeniu, powodując, że polimer stoi pionowo, zmniejszając przeszkody steryczne. Faza grzybowa występuje w niskich stężeniach, gdy polimery są wystarczająco rozdzielone, by mogły istnieć jako przypadkowe spirale. Ogólnie faza szczotki utrudnia dyfuzję, ale faza grzyba zapewnia niewielkie wsparcie. Stężenie między fazą szczotki a grzyba jest optymalne, zapewniając wsparcie przy minimalnym wpływie na dyfuzję 3,4.
Niektóre białka błonowe samoistnie wchodzą do błon lipidowych wspieranych przez stałe, takie jak P450 i reduktaza cytochromu P4505, podczas gdy inne trzeba wprowadzać za pomocą detergentów, co jest delikatnym procesem. Konieczne jest staranne pranie, aby usunąć te detergenty oraz wszelkie niewchłonięte białka, które mogą zakłócać śledzenie pojedynczego białka – proces ten zostanie szczegółowo opisany. Głównym tematem tego artykułu jest przygotowanie próbki do śledzenia pojedynczych cząsteczek (SMT) za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w powrocie czasowym. Wymaga to obiektywu o dużym powiększeniu i aperturze numerycznej (NA) – zazwyczaj obiektywu immersyjnego oleju 100x i 1,45 NA 6,7. Wymaga także szybkiej, bardzo czułej kamery (EMCCD, CMOS lub ICCD) oraz wzbudzenia laserowego. Wzbudzenie laserowe musi obejmować wystarczająco duże pole widzenia, aby mierzyć długie trajektorie białek, co często osiąga się za pomocą całkowitego odbicia wewnętrznego do utworzenia pola unikającego o wymiarach około 50 μm x 100 μm lub oświetlenia epi-illuminacji z optyczną wiązką kształtującą wiązkę (od Gaussa do cylindra) około 80 μm x 80 μm8 lub wysoko pochyloną i laminowaną płytę optyczną (HILO) z polem podobnym do TIRF. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym odbiciem wewnętrznym (TIRF) ma tę zaletę, że zmniejsza sygnał tła. Poniżej przedstawiono prosty, stosunkowo niedrogi projekt mikroskopu TIRF. Dodając kontrolę temperatury, można zmierzyć kilka właściwości termodynamicznych, takich jak entalpia, entropia oraz energia swobodna Gibbsa9. Technika ta wymaga również znakowania fluorescencyjnego białka błonowego na poziomie znakowania, który zapewnia, że większość białek błonowych nosi znacznik fluorescencyjny.
Białkiem transbłonowym, którym interesuje się ten artykuł, jest AQP4. AQP4 to kanał wodny spolaryzowany w końcach stóp astrocytatów oraz innych obszarach naczyń ośrodkowego układu nerwowego10. Może transportować do 3 miliardów cząsteczek wody na sekundę i bierze udział w homeostazie wody, migracji komórek, obrzęku mózgu, uczeniu się i formowaniu pamięci dzięki plastyczności synaptycznej11. Zaburzenia funkcjonowania AQP4 zostały powiązane z różnymi schorzeniami neurologicznymi, w tym obrzękiem mózgu, neuromielitis optica oraz padaczką 12,13,14,15. AQP4 to białko o masie 32-37 kD, w zależności od izoformy, posiada tetramerową strukturę czwartorzędową z ośmioma hydrofobowymi domenami błonowymi połączonymi pętlami, wewnątrzkomórkową domeną N-terminalną oraz dużą wewnątrzkomórkową domeną C-terminalną16. Istnieją dwie główne izoformy AQP4, M1 i M23; Różnica wynika z inicjacji na resztie metioniny 1 lub na resztie metioniny 23. Badania wykazały, że izoforma M1 może tworzyć dyady lub triady ze sobą, w zależności od stanu palmitoylacji9. Izoforma M23 łączy się w duże agregaty białkowe zwane Ortogonalnymi Układami Cząstek (OAP). W przypadku współekspresji izoforma M1 ogranicza wzrost OAP, tworząc obwodową powłokę białkową wokół swojej zewnętrznej powierzchni 17,18,19. Dynamika agregacji OAP może być kluczowym czynnikiem modulującym przepuszczalność wody i homeostazę w mózgu. W tym artykule opisujemy niezbędne kroki do śledzenia pojedynczych AQP4 w błonie oraz obserwowania interakcji pojedynczych białek z białkiem.

<table><tbody><tr><td>Płyta falowa 1/4</td><td>Thorlabs</td><td>WPQ05M-633</td><td>Upewnij się, że laser jest dopasowany</td></tr><tr><td>100X Oil Objective</td><td>Olympus</td><td>12-563-659</td><td>1,45 N/A apochromatyczne</td></tr><tr><td>16:0-18:1 PC</td><td>Awantyczne lipidy polarne</td><td>850457</td><td>Fosfolipidy POPC</td></tr><tr><td>18:0 PEG2000 WF</td><td>Awantyczne lipidy polarne</td><td>880210</td><td>Sól amonowa</td></tr><tr><td>Obiektyw 300mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td></td></tr><tr><td>Laser He:Ne 633 nm</td><td>Melles Griot</td><td>05-LHP-927</td><td>Można je zmieniać na inne źródła i na inne długości fal</td></tr><tr><td>Filtr pasmowy 633 nm</td><td>Chroma Tech</td><td>633/10X</td><td>Dopasowanie do używanego lasera</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy 655nm</td><td>Chroma Tech</td><td>ET655lp</td><td>Zmień tak, aby dopasować się do długości fal barwnika/lasera</td></tr><tr><td>Andor Solis I</td><td>Andor&nbsp;</td><td>Andor Solis I</td><td>Oprogramowanie do przechwytywania obrazów</td></tr><tr><td>ATTO 655&nbsp;</td><td>ATTO-TEC</td><td>655 n.e.</td><td>Modyfikacja NHS-Ester, dowolny barwnik o tej modyfikacji odpowiedni do pracy z pojedynczą cząsteczką, może być użyty. Zaleca się ATTO, ale można też używać Cy5/7</td></tr><tr><td>Bio-kulki SM-2 żywica</td><td>BioRad</td><td>1523922</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155-50MG</td><td>z wątroby bydłej, soltion wodny i ge; 30000 jednostek/mg</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>C547-1</td><td>HPLC lub spektroskopowy</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywki</td><td>Optyka ESCO</td><td>R525000</td><td>Kwarc 25mm</td></tr><tr><td>Dichroiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Semrock</td><td>FF545/650-Di01-25x36</td><td>Zmień tak, aby dopasować się do długości fal barwnika/lasera</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor&nbsp;</td><td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubes 15mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Rurki do hodowli komórek Cellestar</td></tr><tr><td>Glukozoksydaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133-50KU</td><td>od Aspergillus niger, typer VII, &ge; 100000 jednostek/g stałego (bez dodatku tlenu)</td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Transport portowy</td><td>56434</td><td>Używana do podgrzewania parafilmu, zazwyczaj można użyć dowolnej pistoletu na oparcze</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioreagenty Fishera</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Olej immersyjny o niskiej autofluorescencji</td><td>Thorlabs</td><td>MOIL-30</td><td></td></tr><tr><td>Metanokalna</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>A452-1</td><td>HPLC lub spektroskopowy</td></tr><tr><td>Rurka mikrowirówki</td><td>VMR</td><td>525-1126</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikro Pipetery</td><td>Ependorf</td><td></td><td>Różne; 1000 &mikro; L, 100 & mikro; L i 10 & micro; L są sugerowane</td></tr><tr><td>&Oslash; Rurki obiektywowe 1,5"</td><td>Thorlabs</td><td>SM1.5L10</td><td>Zewnętrzny gwint jest ścięty do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Tabela optyczna</td><td>Newport</td><td>RPR Reliance</td><td>Rozmiar tabeli zależy od dostępnej przestrzeni</td></tr><tr><td>Tkanki optyczne</td><td>Thorlabs</td><td>MC-50E</td><td>Czyszczenie różnych komponentów</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7669</td><td>Nie sprawdzaj, czy podczas procesu nie ma żadnych fluorescencyjnych gazów</td></tr><tr><td>Siłownik piezo-piezonowy</td><td>Newport</td><td>PZA12</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczne izolatory drgań</td><td>Newport</td><td>Seria I-2000</td><td>używany do stabilizacji tablicy optycznej w przypadku wszelkich nierówności &nbsp;</td></tr><tr><td>Chłodnia</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler migawki</td><td>Thorlabs</td><td>SC10</td><td>Powiązane z oprogramowaniem obrazującym</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S988</td><td></td></tr><tr><td>Filtr Steritop</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik i kontroler Switchbox&nbsp;</td><td>Newport</td><td>PZC200</td><td>Kontroler sceny</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>J.T. Baker</td><td>SF01-98</td><td>PES 25mm 0.2 & micro; M</td></tr><tr><td>TEC Element</td><td>Thorlabs</td><td>TEC3-2.5</td><td>Używany do łączenia pompy ciepła Peltirer z uchwytem na próbkę i kołnierzem obiektywu</td></tr><tr><td>Kontrolator temperatury</td><td>Meerstetter Engineering</td><td>TEC-1091</td><td></td></tr><tr><td>Detektor temperatury</td><td>Thorlabs</td><td>TH100PT</td><td></td></tr><tr><td>Termistor</td><td>Thorlabs</td><td>TH10K</td><td></td></tr><tr><td>Tube-O-Dialyzer</td><td>G Biosciences</td><td>786-611</td><td>4K MWCO</td></tr><tr><td>Oczyszczacz ozonu UV</td><td>Novascan</td><td>PSDP_UV</td><td>Seria Pro - cyfrowa & nbsp;</td></tr><tr><td>Zoom Optics&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1NR1</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tracking Single Proteins in Lipid Bilayers Using Fluorescence Microscopy

Bezpośrednia obserwacja jest podstawową metodą odkryć naukowych i zrozumienia. Obrazowanie fluorescencji pojedynczej cząsteczki poklatkowej pozwala obserwować poszczególne białka w trakcie ich ruchu i interakcji z otoczeniem, czyniąc stany, które normalnie byłyby ukryte w pomiarach zbiorowych, widocznymi. Śledzenie pojedynczego białka jest szczególnie odpowiednie do badania białek błonowych, gdzie jego dwuwymiarowy charakter umożliwia szybkie, szerokokątne obrazowanie z czułością na pojedynczy fluorofor. Stosowanie sztucznych dwuwarstw lipidowych naśladujących błony, w których występują białka błon transbłonowych lub obwodowych (takie jak błony plazmatyczne lub błony organelli wewnątrzkomórkowych różnych typów komórek), umożliwia pomiar specyficznych interakcji w środowiskach bliskich naturalnym. Pozwala to także na stopniowe dodawanie złożoności, po jednym składniku, jednocześnie tłumiąc zakłócenia tła spowodowane fluorescencją i rozpraszaniem Ramana. Dodając kontrolę temperatury, możliwe staje się także określenie właściwości termodynamicznych oddziaływań pojedynczych cząstek. W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania próbek, zbierania danych, śledzenia fluorescencji pojedynczych cząsteczek oraz analizy trajektorii białek błonowych w dwuwarstwach lipidowych z użyciem akwaporyny-4. Ta praca stanowi podstawowy przykład i może być dostosowana do różnych białek i składu dwuwarstwowego.

Jak opisano w sekcji 2 protokołu, lizyny oznaczano za pomocą esterów NHS sprzężonych z fluorescencyjną cząsteczką barwnika (barwnik NHS). Po sprzężeniu z białkiem zmierz DOL spektrometrem UV-Vis. W tym eksperymencie DOL tetramerów AQP4 wynosił 4,12. Następnie określ prawdopodobieństwo, że każdy tetramer AQP4 będzie zawierał co najmniej jedną cząsteczkę barwnika, stosując rozkład Poissona podany poniżej.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/69095/69095eq7.jpg" style="margin: auto;" />(2)
Gdzie P to prawdopodobieństwo, że każdy AQP4 jest oznaczony, według równania 2, prawdopodobieństwo, że każdy tetramer AQP4 ma przymocowaną etykietę fluorescencyjną, wynosi 98%. Rozkład etykiet na tetramery przedstawiono na Rysunku 2 i odzwierciedla rozkład jasności zaobserwowany w próbce.
Stosunek sygnału do szumu osiągnięty w tym przykładzie danych wynosił 8-9 razy więcej niż tło dla pojedynczego fluoroforu i powyżej 15-20 dla najjaśniejszych cząstek. Ta wariancja wynika z pozycji wiązki wzbudzającej oraz DOL opisanej w kroku protokołu 2.
W wygenerowanym pliku XML interesujące kolumny to J, K, L i M, które odpowiadają identyfikatorowi numeru cząstki, ramce, w której wykryta była cząstka, pozycji X cząstki oraz pozycji Y cząstki odpowiednio (patrz Plik Uzupełniający 6). Na drugim arkuszu pliku oblicza się rozkład wielkości kroku i średni współczynnik dyfuzji, gdzie rozmiary kroków to odległości pokonywania cząstki między ramami, a średnia dyfuzja jest dana równaniem 3:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/69095/69095eq8.jpg" style="margin: auto;" />(3)
Gdzie Dave to średni współczynnik dyfuzji, a Δt to liczba klatek na sekundę. To równanie zakłada ruch Browna, który zazwyczaj jest prawdziwy dla małych przesunięcia i można potwierdzić, analizując średnią kwadrat przesunięcia względem czasu na próbie poszczególnych torów 3,30,31.
Histogram wielkości kroków pokazuje rozkład cząstek dyfuzujących, co można przypisać różnym rozmiarom OAP (Rysunek 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Urządzenie do suszenia lipidów. Aparat składa się z kolby o okrągłym dnie o pojemności 10 mL i złączem destylacji próżniowej. Azot wchodzi do wody przy niskim ciśnieniu przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 μm z igłą przymocowaną do żółtej nasadki syntezowej, która jest połączona z złączem destylacji próżniowej. Ciśnienie jest uwalniane przez rurkę Tygon podłączoną do strzykawki z igłą odcinaczącą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Oczekiwany rozkład fluorescencyjnych etykiet na każdej jednostce AQP4 z użyciem równania 2. Najbardziej prawdopodobna liczba fluoroforów to 4, a 98% wszystkich AQP4 będzie miało etykietę fluorescencyjną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Zespół uchwytu na próbki. Zespół wykonany jest z rury soczewki SM1 o średnicy 1" z usuniętymi i fazowanymi gwintami męskimi, aby zapobiec zakłóceniom obiektywu mikroskopowego. Zawiera kwarcową pokrywę i uszczelkę parafilmową. Cały zespół jest zabezpieczony pierścieniem stabilizującym SM1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig4.jpg" /> 
Rysunek 4: Mikroskop. Po prawej stronie znajduje się uproszczony diagram mikroskopu; Zielona linia pokazuje światło wzbudzające pochodzące z lasera. Zaczynając od prawej strony, światło lasera przechodzi przez płytę falową o średnicy 1/4, a następnie jest skupiane przez soczewkę o średnicy 300 mm. Światło jest odbite przez długoprzepustowe lustro dichroiczne na obiektyw, gdzie skupia się na tylnej aperturze. Poprzez zastosowanie lustra translacyjnego do przesunięcia wiązki wzbudzającej, wiązka jest umieszczona na krawędzi otworu obiektywu, tworząc pole unikające w próbce. Światło emitowane w ostrości jest zbierane przez obiektyw i reprezentowane przez czerwoną linię. Emitowane światło przechodzi następnie przez filtr dichroiczny, następnie przez długoprzepustowy filtr i jest skupiane obiektywem 300 mm na kamerze, zapewniając 1,7-krotne powiększenie optyczne (170-krotne całkowite powiększenie obiektywu i soczewki tubowej). Po lewej stronie znajduje się obraz mikroskopu. Należy zauważyć, że do prawidłowego ustawienia lasera stosuje się dodatkowe lustra obrotowe. Jednocześnie ramię detekcyjne jest ułożone tak, aby maksymalizować zbieranie fotonów z fluorescencyjnych białek transbłonowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69095/69095fig5.jpg" /> 
Rysunek 5: Histogram wielkości kroków. Niebieska linia z czerwonymi kółkami to histogram wszystkich rozmiarów kroków. linia jest dopasowana do wielu współczynników dyfuzji. Rozkład prawdopodobieństwa wielkości kroku jest dany wzorem: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/69095/69095eq9.jpg" style="margin: auto;" /> gdzie fi jest ułamkową populacją każdego typu cząstek dyfundującej, zakładając, że każda podlega ruchowi Browna. Histogram i dopasowanie pokazują niejednorodny rozkład wolniejszych i szybszych cząstek, przypisywany rozkładowi wielu rozmiarów OAP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/69095fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Plik uzupełniający 1: Kalkulator arkusza kalkulacyjnego służący do określenia składu mol%, całkowitej ilości lipidów oraz opcjonalnych składników fluorescencyjnej/FRAP do przygotowania SUV-a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/Lipid Blend Calculator.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Surowy stos obrazów poklatkowych mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczącej cząsteczki używany w śledzeniu trajektorii (plik źródłowy do tutorialu TrackMate). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_raw_cropped.tif" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Animowany podgląd surowych danych fluorescencji pojedynczej cząsteczki, pokazujący intensywność i tło przed obróbką. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_raw_cropped.gif" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Animacja filtrowanych ścieżek cząstek (post-thresholding) pokazująca reprezentatywne trajektorie AQP4 w czasie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_overlayParticles.gif" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Animowana nakładka pokazująca pełnopolowe śledzenie cząsteczek cząsteczek AQP4 za pomocą wyjścia TrackMate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/0_1_overlayALL.gif" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 6: Arkusz kalkulacyjny przedstawiający wyodrębnione współrzędne trajektorii oraz obliczone rozkłady wielkości kroku używane do analizy dyfuzji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69095/Reprentative Trajectoies and Step Sizes.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Direct observation is a fundamental method for scientific discovery and understanding. Time-lapse single-molecule fluorescence imaging allows the ...

Białka działają w przestrzeni stanów złożonych, a wiele z niej jest ukryte. Używamy obrazowania pojedynczych cząsteczek, aby ujawnić te stany. Podczas śledzenia białek pojedynczych błon w dwuwarstwie lipidowej główne wyzwania to przygotowanie próbki, fotobielenie oraz rozdzielanie czasowe.Na początek wyjmij roztwory z łodygi lipidowej z zamrażarki i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową. Wyjmij czystą kolbę 10 mililitrów z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodaj 900 mikrolitrów chloroformu o jakości spektroskopowej oraz 100 mikrolitrów metanolu o jakości spektroskopowej do schłodzonej, okrągłej kolby.Następnie dodaj odpowiednie ilości każdego lipidu do kolby i mieszaj, aby dokładnie wymieszać. Teraz umieść złącze destylacyjne próżniowe na górze okrągłej kolby i podłącz je do linii suszenia azotu. Następnie włącz gaz azotowy i reguluj ciśnienie tak, by przepływ był ledwo odczuwalny na grzbiecie dłoni.Pipetą włóż jeden mililitr buforu na każde pięć mikromolów całkowitej ilości lipidów do kolby z okrągłym dnem. Przyłóż szklany korek na kolbę i zapieczętuj ją filmem parafinowym. Ustaw kolbę i zacisk na podstawie pierścieniowym i zanurz jej dno w kąpieli sonikarowej o temperaturze 60 stopni.Potwierdź, że roztwór staje się nieprzezroczysty i że do wewnętrznej ścianki kolby nie pozostają lipidy. Po godzinnej inkubacji włącz sonikter i ustaw amplitudę na najwyższy poziom. Przesuwaj kolbę w środku kąpieli, aby znaleźć miejsce o najsilniejszym mieszaniu, gdzie roztwór widocznie uderza i rozpryskuje się wewnątrz piersiówki.Sonikuj roztwór przez 30 minut. Obserwowanie przejścia od nieprzezroczystości do przezroczystości i lekko opalescentyjnej. Usuń roztwór lipidowy z kolby i przelej go do rurki mikrowirówki.Wiruj rurkę w 100 000 G przez godzinę w czterech stopniach Celsjusza. Po wirowaniu usuń i przelej supernatant do nowej rurki wirówki. Umieść 25-milimetrową pokrywę kwarcową i wsuń ją do zlewki i dodaj równe ilości nanoczystej wody, 30% nadtlenku wodoru i skoncentrowanego kwasu azotowego.Podgrzewaj pokrywę i wsuwaj w przygotowany roztwór przez 30 minut, aż zaczną bulgotać. Sprawdzaj roztwór co 10 minut i delikatnie mieszaj, aby pokrywa nie przyklejała się do siebie. Obserwuj, jak pokrywa przesuwa się i rozsuwa podczas wirowania.Po rozdzieleniu stopniowo zmniejszaj prędkość wirowania, aby utrzymać ich rozdzielenie i pozwolić roztworowi bąbelkowemu równomiernie pokryć pokrywę. Następnie pokrywa dokładnie przesuwa się oczyszczoną wodą, delikatnie mieszając i usuwając wszelkie chemiczne pozostałości. Alternatywnie, wyczyść pokrywy kwarcowe za pomocą n-heksanu, a następnie metanolu, przetrzeć chusteczką soczewki dla każdego rozpuszczalnika.Umieść pokrywę w środku do czyszczenia ozonu UV, tak że powierzchnia będzie skierowana do lampy. Pozwól tlenowi przepływać do komory o temperaturze pięciu funtów na cal kwadratowy przez pięć minut. Następnie wyłącz dopływ tlenu.Teraz włącz światło ultrafioletowe na 15 minut, a następnie pozwól, by osłona odpoczęła przez co najmniej 10 minut, aby ozonowi się rozproszyło. Włóż świeżo wyczyszczoną pokrywkę do uchwytu na próbkę o średnicy 25 milimetrów. Używając rurki SM o długości jednej czwartej cala, wytnij dwuwarstwową uszczelkę filmową o średnicy ośmiu milimetrów i umieść ją na środku uchwytu próbki.Nałóż kroplę 50 mikrolitrów małych pęcherzyków jednolimelowych na środek uszczelki ośmiomilimetrowej. Po zamknięciu komory inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji użyj pipety, aby spłukać roztwór.Dodaj 50 mikrolitrów świeżego buforu do dwuwarstwy i powtórz ten proces łącznie 10 razy. Po ostatnim płukaniu usuń bufor z uchwytu na próbkę. Dodaj 50-litrową aliquotę pożądanego białka do detergentu, zapewniając, że stężenie jest równe lub niższe od krytycznego stężenia micelli.Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby umożliwić włączenie białka, a następnie przepłucz próbkę buforem, aby usunąć niewłączone białko i detergent. Ustaw pionową prędkość przesunięcia pikseli na około 600 nanosekund i zwiększ pionowe napięcie zegara w trybie podkręcenia. Następnie skonfiguruj poziomy odczyt pikseli na maksymalną prędkość.Ustaw wzmocnienie przedwzmacniacza na dwa. Ustaw wyjście wzmacniacza dla mnożenia elektronów i ustaw wzmocnienie mnożnika elektronów na najwyższy poziom. Następnie ustaw czas naświetlania na 25 milisekund.Potwierdź, że faktyczna liczba klatek na sekundę nieco przekracza czas naświetlania. Teraz reguluj moc lasera, aż sygnał wyraźnie wyróżnia się na tle szumów. Zbierz wystarczającą ilość danych obrazowych, aby uzyskać co najmniej 1000 śladów na próbkę.Do analizy śledzenia przytnij wszystkie zbiory danych do jednolitego rozmiaru i wykonaj korektę tła za pomocą Image J.In Fiji, przeciągnij i upuść film lub stack pliku TIFF, który wymaga analizy, do interfejsu. Aby wprowadzić szczegóły kalibracji pikseli, przejdź do zakładki analizy, wybierz ustaw skalę i zastosuj piksel do kalibracji odległości specyficznej dla danego instrumentu. Następnie zapisz kopię zbioru danych, aby zachować oryginał i śledzić wszelkie zmiany.Odejmij tło od wybranego obszaru zainteresowania i zastosuj je do zapisanej kopii oryginalnych danych. Wejdź do zakładki proces i wybierz odejmij tło. W zakładce wtyczki wybierz śledzenie, a następnie trackmate, aby uruchomić okno dialogowe trackmate do analizy śledzenia.Stopień oznaczania dla czterech tetramerów AQP został obliczony na 4,12 za pomocą spektrometrii widzialnej UV, a analiza rozkładu Poissona wykazała, że 98% tetramerów zawierało co najmniej jedną cząsteczkę barwnika fluorescencyjnego. Histogram pokazuje szeroki rozkład wielkości kroków zgodny z dyfuzją różnej wielkości ortogonalnych układów cząstek, a obliczony średni współczynnik dyfuzji wynosił 0,0143 mikrometra kwadratowego na sekundę. W tym filmie zidentyfikowaliśmy kluczowe stany ważne dla regulacji akwaporyny czterej oraz związanych z nimi sił termodynamicznych.Protokół ten eliminuje zgadywanie przy tworzeniu błon biomimetycznych z oczyszczonymi białkami transbłonowymi, które nadają się do poklatkowego śledzenia pojedynczych cząsteczek. Maszyny do białka działające w punktach zwrotu w czasie poskokowym śledzenie pojedynczego białka umożliwia bezpośrednią obserwację stochastycznych szlaków, gałęzi i ślepych zaułków.

tracking-single-proteins-lipid-bilayers-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Prezentujemy metodę przygotowania dwuwarstwowych lipidów na podłożu miki do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Mika jest przezroczysta i płaska w skali atomowej, ale rzadko stosowana w obrazowaniu ze względu na trudności w obsłudze; Nasze przygotowanie skutkuje równomiernym osadzaniem się arkusza miki i zmniejsza ilość materiału używanego do przygotowania dwuwarstwowego.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych na podłożu miki do obrazowania mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj metodę śledzenia pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia badanie dynamiki białek błonowych i identyfikację ukrytych stanów.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów