Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Białka działają w przestrzeni stanów złożonych, a wiele z niej jest ukryte. Używamy obrazowania pojedynczych cząsteczek, aby ujawnić te stany. Podczas śledzenia białek pojedynczych błon w dwuwarstwie lipidowej główne wyzwania to przygotowanie próbki, fotobielenie oraz rozdzielanie czasowe.

Na początek wyjmij roztwory z łodygi lipidowej z zamrażarki i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową. Wyjmij czystą kolbę 10 mililitrów z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Dodaj 900 mikrolitrów chloroformu o jakości spektroskopowej oraz 100 mikrolitrów metanolu o jakości spektroskopowej do schłodzonej, okrągłej kolby.

Następnie dodaj odpowiednie ilości każdego lipidu do kolby i mieszaj, aby dokładnie wymieszać. Teraz umieść złącze destylacyjne próżniowe na górze okrągłej kolby i podłącz je do linii suszenia azotu. Następnie włącz gaz azotowy i reguluj ciśnienie tak, by przepływ był ledwo odczuwalny na grzbiecie dłoni.

Pipetą włóż jeden mililitr buforu na każde pięć mikromolów całkowitej ilości lipidów do kolby z okrągłym dnem. Przyłóż szklany korek na kolbę i zapieczętuj ją filmem parafinowym. Ustaw kolbę i zacisk na podstawie pierścieniowym i zanurz jej dno w kąpieli sonikarowej o temperaturze 60 stopni.

Potwierdź, że roztwór staje się nieprzezroczysty i że do wewnętrznej ścianki kolby nie pozostają lipidy. Po godzinnej inkubacji włącz sonikter i ustaw amplitudę na najwyższy poziom. Przesuwaj kolbę w środku kąpieli, aby znaleźć miejsce o najsilniejszym mieszaniu, gdzie roztwór widocznie uderza i rozpryskuje się wewnątrz piersiówki.

Sonikuj roztwór przez 30 minut. Obserwowanie przejścia od nieprzezroczystości do przezroczystości i lekko opalescentyjnej. Usuń roztwór lipidowy z kolby i przelej go do rurki mikrowirówki.

Wiruj rurkę w 100 000 G przez godzinę w czterech stopniach Celsjusza. Po wirowaniu usuń i przelej supernatant do nowej rurki wirówki. Umieść 25-milimetrową pokrywę kwarcową i wsuń ją do zlewki i dodaj równe ilości nanoczystej wody, 30% nadtlenku wodoru i skoncentrowanego kwasu azotowego.

Podgrzewaj pokrywę i wsuwaj w przygotowany roztwór przez 30 minut, aż zaczną bulgotać. Sprawdzaj roztwór co 10 minut i delikatnie mieszaj, aby pokrywa nie przyklejała się do siebie. Obserwuj, jak pokrywa przesuwa się i rozsuwa podczas wirowania.

Po rozdzieleniu stopniowo zmniejszaj prędkość wirowania, aby utrzymać ich rozdzielenie i pozwolić roztworowi bąbelkowemu równomiernie pokryć pokrywę. Następnie pokrywa dokładnie przesuwa się oczyszczoną wodą, delikatnie mieszając i usuwając wszelkie chemiczne pozostałości. Alternatywnie, wyczyść pokrywy kwarcowe za pomocą n-heksanu, a następnie metanolu, przetrzeć chusteczką soczewki dla każdego rozpuszczalnika.

Umieść pokrywę w środku do czyszczenia ozonu UV, tak że powierzchnia będzie skierowana do lampy. Pozwól tlenowi przepływać do komory o temperaturze pięciu funtów na cal kwadratowy przez pięć minut. Następnie wyłącz dopływ tlenu.

Teraz włącz światło ultrafioletowe na 15 minut, a następnie pozwól, by osłona odpoczęła przez co najmniej 10 minut, aby ozonowi się rozproszyło. Włóż świeżo wyczyszczoną pokrywkę do uchwytu na próbkę o średnicy 25 milimetrów. Używając rurki SM o długości jednej czwartej cala, wytnij dwuwarstwową uszczelkę filmową o średnicy ośmiu milimetrów i umieść ją na środku uchwytu próbki.

Nałóż kroplę 50 mikrolitrów małych pęcherzyków jednolimelowych na środek uszczelki ośmiomilimetrowej. Po zamknięciu komory inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji użyj pipety, aby spłukać roztwór.

Dodaj 50 mikrolitrów świeżego buforu do dwuwarstwy i powtórz ten proces łącznie 10 razy. Po ostatnim płukaniu usuń bufor z uchwytu na próbkę. Dodaj 50-litrową aliquotę pożądanego białka do detergentu, zapewniając, że stężenie jest równe lub niższe od krytycznego stężenia micelli.

Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę, aby umożliwić włączenie białka, a następnie przepłucz próbkę buforem, aby usunąć niewłączone białko i detergent. Ustaw pionową prędkość przesunięcia pikseli na około 600 nanosekund i zwiększ pionowe napięcie zegara w trybie podkręcenia. Następnie skonfiguruj poziomy odczyt pikseli na maksymalną prędkość.

Ustaw wzmocnienie przedwzmacniacza na dwa. Ustaw wyjście wzmacniacza dla mnożenia elektronów i ustaw wzmocnienie mnożnika elektronów na najwyższy poziom. Następnie ustaw czas naświetlania na 25 milisekund.

Potwierdź, że faktyczna liczba klatek na sekundę nieco przekracza czas naświetlania. Teraz reguluj moc lasera, aż sygnał wyraźnie wyróżnia się na tle szumów. Zbierz wystarczającą ilość danych obrazowych, aby uzyskać co najmniej 1000 śladów na próbkę.

Do analizy śledzenia przytnij wszystkie zbiory danych do jednolitego rozmiaru i wykonaj korektę tła za pomocą Image J.In Fiji, przeciągnij i upuść film lub stack pliku TIFF, który wymaga analizy, do interfejsu. Aby wprowadzić szczegóły kalibracji pikseli, przejdź do zakładki analizy, wybierz ustaw skalę i zastosuj piksel do kalibracji odległości specyficznej dla danego instrumentu. Następnie zapisz kopię zbioru danych, aby zachować oryginał i śledzić wszelkie zmiany.

Odejmij tło od wybranego obszaru zainteresowania i zastosuj je do zapisanej kopii oryginalnych danych. Wejdź do zakładki proces i wybierz odejmij tło. W zakładce wtyczki wybierz śledzenie, a następnie trackmate, aby uruchomić okno dialogowe trackmate do analizy śledzenia.

Stopień oznaczania dla czterech tetramerów AQP został obliczony na 4,12 za pomocą spektrometrii widzialnej UV, a analiza rozkładu Poissona wykazała, że 98% tetramerów zawierało co najmniej jedną cząsteczkę barwnika fluorescencyjnego. Histogram pokazuje szeroki rozkład wielkości kroków zgodny z dyfuzją różnej wielkości ortogonalnych układów cząstek, a obliczony średni współczynnik dyfuzji wynosił 0,0143 mikrometra kwadratowego na sekundę. W tym filmie zidentyfikowaliśmy kluczowe stany ważne dla regulacji akwaporyny czterej oraz związanych z nimi sił termodynamicznych.

Protokół ten eliminuje zgadywanie przy tworzeniu błon biomimetycznych z oczyszczonymi białkami transbłonowymi, które nadają się do poklatkowego śledzenia pojedynczych cząsteczek. Maszyny do białka działające w punktach zwrotu w czasie poskokowym śledzenie pojedynczego białka umożliwia bezpośrednią obserwację stochastycznych szlaków, gałęzi i ślepych zaułków.