Name: Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych sond smFRET przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki molekularnej i interakcji w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekty P30214-N36, P32307-B Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF) oraz przez Wiedeński Fundusz Nauki i Technologii (WWTF) LS13-030.

<ol><li>McKinney, S. A., Déclais, A. -C., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+individual+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of individual holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2002).</li>
<li>Wang, S., Vafabakhsh, R., Borschel, W. F., Ha, T., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+potassium-channel+gating+revealed+by+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of potassium-channel gating revealed by single-molecule FRET.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 23 (1), 31-36 (2015).</li>
<li>Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidomain+structure+and+correlated+dynamics+determined+by+self-consistent+FRET+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks.</a> Nature Methods. 14 (2), 174-180 (2016).</li>
<li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+reveals+multiscale+chromatin+dynamics+modulated+by+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α.</a> Nature Communications. 9 (1), 235(2018).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47 (1), 819-846 (1978).</li>
<li>Wu, P. G., Brand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resonance+energy+transfer%3A+Methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resonance energy transfer: Methods and applications.</a> Analytical Biochemistry. 218 (1), 1-13 (1994).</li>
<li>Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecular+f%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+measurement+on+structures+and+interactions+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-molecular förster resonance energy transfer measurement on structures and interactions of biomolecules.</a> Micromachines. 12 (5), 492(2021).</li>
<li>Malkusch, N., Dörfler, T., Nagy, J., Eilert, T., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smFRET+experiments+of+the+RNA+polymerase+II+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">smFRET experiments of the RNA polymerase II transcription initiation complex.</a> Methods. 120, 115-124 (2017).</li>
<li>Lee, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+views+of+MutS+on+mismatched+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Single-molecule views of MutS on mismatched DNA.</a> DNA repair. 20, 82-93 (2014).</li>
<li>Phelps, C., Israels, B., Jose, D., Marsh, M. C., von Hippel, P. H., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microsecond+single-molecule+FRET+to+determine+the+assembly+pathways+of+T4+ssDNA+binding+protein+onto+model+DNA+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Using microsecond single-molecule FRET to determine the assembly pathways of T4 ssDNA binding protein onto model DNA replication forks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), E3612-E3621 (2017).</li>
<li>Deindl, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+conformational+dynamics+with+single-molecule+fluorescence+energy+transfer%3A+Applications+in+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: Applications in nucleosome remodeling.</a> Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).</li>
<li>Crawford, D. J., Hoskins, A. A., Friedman, L. J., Gelles, J., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+colocalization+FRET+evidence+that+spliceosome+activation+precedes+stable+approach+of+5%27+splice+site+and+branch+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule colocalization FRET evidence that spliceosome activation precedes stable approach of 5' splice site and branch site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6783-6788 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+single+molecule+FRET+signals+reveals+multiple+active+ribosome+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations.</a> Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Mori, T., Vale, R. D., Tomishige, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+kinesin+waits+between+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How kinesin waits between steps.</a> Nature. 450 (7170), 750-754 (2007).</li>
<li>Huppa, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463 (7283), 963-967 (2010).</li>
<li>Göhring, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+T-cell+receptor-imposed+forces+via+quantitative+single+molecule+FRET+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of T-cell receptor-imposed forces via quantitative single molecule FRET measurements.</a> Nature Communications. 12 (1), 2502(2021).</li>
<li>Hellenkamp, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+accuracy+of+single-molecule+FRET+measurements-a+multi-laboratory+benchmark+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study.</a> Nature Methods. 15 (9), 669(2018).</li>
<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+Analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: Analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nature Methods. 7 (3), 203-205 (2010).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophysical Journal. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>Asher, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+imaging+of+GPCR+dimers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET imaging of GPCR dimers in living cells.</a> Nature Methods. 18 (4), 397-405 (2021).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Single-molecule+FRET+with+total+internal+reflection+microscopy%22">Single-molecule FRET with total internal reflection microscopy</a>. (12), Cold Spring Harbor. 1223-1237 (2012).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+%28excitation%29+for+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Objective-type total internal reflection microscopy (excitation) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1189-1191 (2012).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective-type+total+internal+reflection+microscopy+%28emission%29+for+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Objective-type total internal reflection microscopy (emission) for single-molecule FRET.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 11, 1192-1194 (2012).</li>
<li>Allan, D. B., Caswell, T., van der Wel, C. M., Dimiduk, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllan%2C+DB+%22Soft-matter%2Fpims%3A+PIMS+v0.5%22">Soft-matter/pims: PIMS v0.5</a>. , https://github.com/soft-matter/pims (2020).</li>
<li>Anaconda Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Miniconda%22">Miniconda</a>. , https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html (2021).</li>
<li>conda-forge community. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+conda-forge+project%3A+community-based+software+distribution+built+on+the+conda+package+format+and+ecosystem%22">The conda-forge project: community-based software distribution built on the conda package format and ecosystem</a>. , (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JupyterLab+Contributors+Notebooks+-+JupyterLab+documentation%22">JupyterLab Contributors Notebooks - JupyterLab documentation</a>. , https://jupyterlab.readthedocs.io/en/stable/user/notebook.html (2021).</li>
<li>Babcock, H., Sigal, Y. M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-density+3D+localization+algorithm+for+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Nanoscopy%22%5BJournal%5D)">A high-density 3D localization algorithm for stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Optical Nanoscopy. 1 (6), (2012).</li>
<li>Gao, Y., Kilfoil, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+detection+and+complete+tracking+of+large+populations+of+features+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Accurate detection and complete tracking of large populations of features in three dimensions.</a> Optics Express. 17 (6), 4685(2009).</li>
<li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchrangl%2C+L+%22sdt-python%3A+Python+library+for+fluorescence+microscopy+data+analysis+%28v17.1%29%22">sdt-python: Python library for fluorescence microscopy data analysis (v17.1)</a>. , Zenodo. (2021).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nature Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Bradski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OpenCV+library%5BTitle%5D)+AND+%22Dr.+Dobb%27s+Journal%3A+Software+Tools+for+the+Professional+Programmer%22%5BJournal%5D)">The OpenCV library.</a> Dr. Dobb's Journal: Software Tools for the Professional Programmer. 25 (11), 120-123 (2000).</li>
<li>Allan, D. B., Caswell, T., Keim, N. C., van der Wel, C. M., Verweij, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft-matter%2Ftrackpy%3A+Trackpy+v0.5.0%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.</a> Zenodo. , 4682814(2021).</li>
<li>Killick, R., Fearnhead, P., Eckley, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+detection+of+changepoints+with+a+linear+computational+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">Optimal detection of changepoints with a linear computational cost.</a> Journal of the American Statistical Association. 107 (500), 1590-1598 (2012).</li>
<li>Schrangl, L., Göhring, J., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+single+molecule+FRET+transitions+without+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of single molecule FRET transitions without trajectories.</a> The Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123328(2018).</li>
<li>Santoso, Y., Torella, J. P., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+single-molecule+FRET+dynamics+with+probability+distribution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Characterizing single-molecule FRET dynamics with probability distribution analysis.</a> ChemPhysChem. 11 (10), 2209-2219 (2010).</li>
<li>Schrangl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+analysis+software+%283.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET analysis software (3.0).</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Platzer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unscrambling+fluorophore+blinking+for+comprehensive+cluster+detection+via+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unscrambling fluorophore blinking for comprehensive cluster detection via photoactivated localization microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4993(2020).</li>
<li>Johnson, I., Spence, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+I+%22+The+molecular+probes+handbook%3A+A+guide+to+fluorescent+probes+and+labeling+technologies%22"> The molecular probes handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies</a>. , Life Technologies Corporation. (2010).</li>
<li>Szalai, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+of+energy+transfer+by+intensity-based+STED-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging of energy transfer by intensity-based STED-FRET.</a> Nano Letters. 21 (5), 2296-2303 (2021).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Zhai, B., Zhai, S., Hao, R., Xu, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+two-photon+probe+for+in+vivo+tracking+of+pH+during+a+traumatic+brain+injury+process%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A FRET-based two-photon probe for in vivo tracking of pH during a traumatic brain injury process.</a> New Journal of Chemistry. 43 (43), 17018-17022 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje proces automatycznego rejestrowania i analizy ilościowej danych smFRET pochodzących z ruchomych, ale powierzchniowo uwiązanych cząsteczek sondy. Uzupełnia on dwa dominujące podejścia do eksperymentów smFRET, obejmujące sondy unieruchomione powierzchniowo lub sondy dyfundujące w roztworze do i z objętości wzbudzenia konfokalnego17. Zapewnia prawidłową wydajność FRET i pozycje molekularne w funkcji czasu. Może być zatem wykorzystany jako dane wejściowe dla specjalistycznych programów analitycznych, np. do ilościowego określenia kinetyki przejścia1, histogramów FRET39 lub dyfuzji dwuwymiarowej22.
Oprogramowanie jest wydawane na wolnej licencji typu open source zatwierdzonej przez Open Source Initiative, która przyznaje użytkownikowi wieczyste prawo do bezpłatnego użytkowania, modyfikacji i redystrybucji. Github został wybrany jako platforma programistyczna i dystrybucyjna, aby maksymalnie ułatwić uzyskanie oprogramowania i udział w procesie rozwoju poprzez zgłaszanie błędów lub wnoszenie kodu40. Napisane w Pythonie oprogramowanie nie jest zależne od zastrzeżonych komponentów. Wybór notebooków Jupyter jako interfejsów użytkownika ułatwia inspekcję danych na każdym etapie analizy i pozwala na dostosowanie i rozszerzenie potoku specjalnie dla danego systemu eksperymentalnego. Biblioteka sdt-python 32 służy jako podstawa i implementuje funkcje do oceny danych mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak lokalizacja pojedynczych cząsteczek, analiza dyfuzji, analiza intensywności fluorescencji, rejestracja kanału koloru, analiza kolokalizacji i obsługa ROI.
Zasadniczo śledzenie pojedynczych cząstek może odbywać się w systemach jedno-, dwu- lub trójwymiarowych. W tym przypadku potok analizy pojedynczych cząsteczek został dostosowany do badania systemów mobilnych 2D. Wybór ten odzwierciedla dostępność prostych systemów, takich jak dwuwarstwy lipidowe z podparciem planarnym (SLB), do prezentacji mobilnych sond fluorescencyjnych. Takie dwuwarstwowe systemy lipidowe składają się zazwyczaj z dwóch lub więcej ugrupowań fosfolipidów, przy czym frakcja masowa określa kluczowe parametry fizykochemiczne SLB (takie jak faza i lepkość), a frakcja mniejsza zapewnia miejsca przyłączenia dla biomolekuł. Te miejsca przyłączenia mogą być biotynylowanymi fosfolipidami dla platform białkowych opartych na awidynie lub streptawidynie lub fosfolipidami sprzężonymi niklowo-NTA dla platform białkowych ze znacznikami histydyny41. Wybór odpowiedniej platformy do łączenia białek z SLB zależy od kwestii naukowej. Czytelnicy mogą zapoznać się z literaturą 16,38,42 w celu zapoznania się z przykładami skutecznie zastosowanych strategii. Gęstość sond w próbce powinna być wystarczająco niska, aby uniknąć nakładania się funkcji rozpraszania punktów; Zazwyczaj zaleca się mniej niż 0,1 cząsteczki naμm2. Patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników (w szczególności rysunek 6), aby zapoznać się z przykładem przedstawiającym odpowiednią gęstość sondy. Metoda analizy ma również zastosowanie do pojedynczych znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek białka dyfundujących w błonie plazmatycznej żywych komórek.
Jednym z krytycznych aspektów eksperymentów smFRET jest produkcja i charakterystyka samych sond FRET. Wybierając fluorofory dla pary FRET, ich promień Förstera powinien odpowiadać oczekiwanym odległościom między barwnikami43. Preferowane są barwniki odporne na fotowybielanie, ponieważ dają długotrwałe ślady. Jednak w przypadku podwyższonych szybkości bielenia jeden gatunek fluoroforu można wykorzystać do rozpoznawania zdarzeń wieloemiterowych pochodzących z kolokalizowanych cząsteczek za pomocą krokowej analizy fotowybielania; Zobacz krok 8.1.4 w sekcji Protokół. Pary fluoroforów powinny być specyficznie i kowalencyjnie przyłączone do interesujących cząsteczek, tworząc wewnątrz- lub międzycząsteczkowe pary FRET.
Połączenie smFRET z innymi łatwo dostępnymi technikami może zwiększyć jego rozdzielczość przestrzenną poza granicę dyfrakcji (za pomocą STED44). Przedstawiony tutaj algorytm śledzenia smFRET rozszerza zastosowanie tego podejścia do nowych ustawień eksperymentalnych i systemów modelowych. Obejmuje to badania (i) zmian kinetycznych w stechiometrii ruchomych biomolekuł, (ii) dynamicznej asocjacji ruchomych biomolekuł, (iii) szybkości reakcji enzymatycznych swobodnie dyfuzyjnych reagentów oraz (iv) kinetyki zmian konformacyjnych ruchomych biomolekuł. Pierwsze dwa przykłady wymagają układów modelowych, które pokazują, że międzycząsteczkowy FRET, tj. donor i akceptor są sprzężone z oddzielnymi jednostkami biomolekularnymi będącymi przedmiotem zainteresowania. Te ostatnie przykłady mogą wykorzystywać biosensory przenoszące donor i akceptor w tej samej jednostce molekularnej (wewnątrzcząsteczkowy FRET).
Wewnątrzcząsteczkowe czujniki oparte na fret mogą zapewnić wgląd w wewnętrzne zmiany konformacyjne biomolekuł 1,2,3,4, zmiany konformacyjne spowodowane obciążeniem endogennym lub siłą zewnętrzną (czujniki siły molekularnej 16) lub stężenia jonów w nanośrodowisku, takim jak wapń45 i pH46. W zależności od systemu modelowego i preferowanej platformy kotwiczącej, takie zdarzenia smFRET mogą być śledzone w 2D lub 3D: (i) planarne śledzenie zdarzeń smFRET można wykorzystać do ilościowego określenia czasów interakcji receptor-ligand w błonie plazmatycznej, asocjacji kaskad wzmocnienia sygnału zakotwiczonych w błonie oraz zmian stechiometrycznych receptorów powierzchniowych; (ii) śledzenie objętości zdarzeń smFRET może być stosowane dla dowolnych wewnątrz- lub międzycząsteczkowych sond FRET w żywych komórkach lub w systemach odtworzonych in vitro.
Metoda śledzenia smFRET została opracowana głównie z myślą o wewnątrzcząsteczkowych sondach FRET. Sondy te mają ustaloną i dobrze znaną liczbę znaczników fluorescencyjnych, co zostało wykorzystane do odrzucenia danych z aglomerowanych i nieprawidłowo zsyntetyzowanych (np. niekompletnie znakowanych) cząsteczek, a także z sond, w których jeden z fluoroforów został fotowybielany. Jednak dostosowując etapy filtrowania, metoda ta może być również stosowana do międzycząsteczkowych sond FRET. Na przykład, zamiast akceptować tylko cząsteczki z pojedynczym donorem i jednym akceptorem fluoroforu, można zbadać trajektorie przestrzenne barwników donorowych i akceptorowych oraz wybrać, na przykład, trajektorie współdyfuzji donor-akceptor.
Ponieważ algorytm 3D-DAOSTORM obsługuje określanie pozycji sygnału wzdłuż osi optycznej za pomocą astygmatyzmu dzięki cylindrycznej soczewce na ścieżce wiązki emisyjnej, eksperymenty 3D można łatwo zintegrować z potokiem analizy. W takim przypadku sygnał akceptora po wzbudzeniu akceptora posłużyłby do określenia stechiometrii i położenia osiowego. Oprogramowanie analityczne może być również wykorzystywane do oceny danych z eksperymentów z unieruchomionymi sondami, wykorzystując jego wysoki stopień automatyzacji i schematów filtrowania. W rzeczywistości zestawy danych wydajności smFRET ze złączy Hollidaya unieruchomionych na dwuwarstwach żelowych38 zostały przeanalizowane przy użyciu wczesnej wersji oprogramowania.

Transfer energii przez rezonans Förstera (FRET) jest kluczowym narzędziem w badaniach biologii molekularnej i biofizyki, ponieważ umożliwia analizę procesów z rozdzielczością subnanometrową. Ponieważ wydajność transferu energii między fluoroforami donorem a akceptorem silnie zależy od odległości między barwnikami w zakresie od subnanometrów do nanometrów, metoda ta jest skutecznie wykorzystywana jako spektroskopowa linijka do badania statycznej i dynamicznej konformacji biomolekuł1,2,3,4. Dodatkowo zjawisko FRET jest szeroko stosowane w badaniach kolokalizacji białek związanych z błoną oraz białek wewnątrzkomórkowych w pomiarach zbiorczych5,6. W ciągu ostatnich dwóch dekad metodę tę przystosowano do monitorowania zdarzeń smFRET7, co pomogło znacząco zwiększyć rozdzielczość czasową i przestrzenną oraz pozwoliło na wyodrębnienie nawet rzadkich subpopulacji w próbkach heterogenicznych. Dzięki zastosowaniu tych technik uzyskano unikalny wgląd w dynamikę maszynerii molekularnej, m.in. w szybkość przetwarzania transkryptu przez polimerazę RNA II8, prędkość replikacji polimeraz DNA9,10, szybkość translokacji nukleosomów11, szybkość splicingu transkryptów i zatrzymywania się złożonych spliceosomów12, aktywność subpopulacji rybosomalnych13 oraz prędkość poruszania się silników kinezynowych14. Ilościowo określono również czas trwania oddziaływań receptor-ligand15 oraz siły molekularne16.
Badania smFRET oparte na intensywności zazwyczaj opierają się na emisji uwrażliwionej w celu pomiaru wydajności FRET: dzielnik wiązki w torze emisji rozdziela przestrzennie światło pochodzące od fluoroforów donora i akceptora po wzbudzeniu donora, co umożliwia ilościowe określenie poszczególnych intensywności fluorescencji. Wydajność można następnie obliczyć jako ułamek fotonów emitowanych przez akceptor w stosunku do całkowitej liczby fotonów17. Ponadto wzbudzanie akceptora po wzbudzeniu donora (ALEX) pozwala na pomiar stechiometrii zdarzeń FRET, co pomaga w odróżnieniu rzeczywistych sygnałów niskiego FRET od sygnałów wynikających np. z sond z fotowyblakłym fluoroforem akceptora18.
Eksperymenty smFRET są zazwyczaj przeprowadzane na jeden z dwóch sposobów. Po pierwsze, niewielki obszar objętości próbki jest oświetlany za pomocą mikroskopu konfokalnego. Pojedyncze cząsteczki sond w roztworze są wzbudzane w momencie, gdy dyfundują do objętości ogniskowej. W tej technice można zastosować szybkie detektory zliczające fotony, co umożliwia rozdzielczość czasową rzędu submikrosekund. Po drugie, sondy są specyficznie unieruchamiane na powierzchniach i monitorowane za pomocą mikroskopii szerokopolowej, często z wykorzystaniem konfiguracji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) w celu zminimalizowania fluorescencji tła. Unieruchomienie sond pozwala na znacznie dłuższy czas rejestracji niż w przypadku pierwszego podejścia. Dodatkowo większe pole widzenia umożliwia równoległe monitorowanie wielu sond. Konieczność użycia kamery sprawia, że metoda ta jest wolniejsza w porównaniu do opisanej powyżej. Rozdzielczość czasowa jest ograniczona do zakresu od milisekund do sekund.
Jeśli wymagane są długie ślady czasowe, np. do badania procesów dynamicznych w skali czasowej od milisekund do sekund, pierwsza metoda nie znajduje zastosowania, ponieważ rozbłyski fluorescencji są zazwyczaj zbyt krótkie. Drugie podejście zawodzi w przypadkach, gdy unieruchomienie nie jest możliwe, np. w eksperymentach na żywych komórkach z wykorzystaniem sond dyfundujących w obrębie błony komórkowej. Ponadto zaobserwowano, że biologiczne systemy modelowe mogą drastycznie zmieniać swoją odpowiedź w zależności od mobilności powierzchni kontaktu16.
Mimo że w przeszłości przeprowadzono eksperymenty łączące smFRET z śledzeniem pojedynczych cząsteczek przy użyciu mobilnych sond FRET19, nie istnieje publicznie dostępne oprogramowanie do analizy tych danych. Skłoniło to do opracowania nowej platformy analitycznej, która umożliwia określenie wielu właściwości mobilnych sond fluorescencyjnych, w tym wydajności smFRET i stechiometrii, pozycji z dokładnością subpikselową oraz natężeń fluorescencji jako funkcji czasu. Opracowano metody filtrowania otrzymanych śladów poprzez analizę stopniowego wybielania, odległości od najbliższego sąsiada, natężeń emisji i innych cech, aby wyselekcjonować wyłącznie prawidłowo zsyntetyzowane i funkcjonalne pojedyncze cząsteczki sond. Oprogramowanie wspiera również techniki eksperymentalne i analityczne, które zostały niedawno uzgodnione w badaniu wieloośrodkowym w celu uzyskania wiarygodnych, ilościowych danych smFRET17. W szczególności implementacja ta jest zgodna z walidowanymi procedurami obliczania wydajności FRET i stechiometrii. Natężenia fluorescencji po wzbudzeniu donora w kanale emisji donora IDD oraz w kanale emisji akceptora IDA są wykorzystywane do obliczenia pozornej wydajności FRET Eapp zgodnie z równaniem (1).
<img alt="Równanie dla E_app w analizie fluorescencji przedstawiające stosunki intensywności, do użytku edukacyjnego." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> (1)
Wykorzystując intensywność fluorescencji w kanale emisji akceptora po wzbudzeniu akceptora IAA, oblicza się pozorną stechiometrię zgodnie z równaniem (2).
<img alt="Równanie równowagi statycznej S_app=(I_DD+I_DA)/(I_DD+I_DA+I_AA) dla analizy optycznej." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> (2)
Wydajność FRET E oraz stechiometrię S można wyprowadzić z Eapp i Sapp, uwzględniając cztery współczynniki korekcyjne.
<img alt="Wzór kinetyki chemicznej, IDA→IDA-αIDD-δIAA, opisuje szybkości reakcji." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">
α opisuje przenikanie fluorescencji donora do kanału emisji akceptora i może być wyznaczone przy użyciu próbki zawierającej wyłącznie fluorofory donora lub poprzez analizę fragmentów trajektorii, w których akceptor został wybielony. δ koryguje bezpośrednie wzbudzenie akceptora przez źródło światła wzbudzającego donora i może być zmierzone przy użyciu próbki z samymi fluoroforami akceptora lub poprzez analizę fragmentów trajektorii, w których donor został wybielony.
<img alt="Formuła transformacji symbolu matematycznego, równanie statyczne, I_DD do γI_DD." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 4">.
γ skaluje IDD, aby skorygować rozbieżne wydajności detekcji w kanałach emisji donora i akceptora oraz różne wydajności kwantowe fluoroforów. Współczynnik ten można obliczyć poprzez analizę wzrostu intensywności donora po wybieleniu akceptora w trajektoriach o wysokiej wydajności FRET20 lub poprzez badanie próbki charakteryzującej się wieloma dyskretnymi stanami FRET.
<img alt="Wzór na równowagę statyczną; I&lt;sub&gt;AA&lt;/sub&gt; ↦ I&lt;sub&gt;AA&lt;/sub&gt;/β; równanie; edukacyjny koncept z fizyki." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 5">
β skaluje IAA, aby skorygować różnice w wydajności wzbudzenia donora i akceptora. Jeśli γ zostało wyznaczone za pomocą analizy wybielania akceptora, β można obliczyć na podstawie próbki o znanym stosunku donora do akceptora21. W przeciwnym razie β można uzyskać z próbki FRET w wielu stanach.
Wspólnie poprawki te umożliwiają obliczenie skorygowanej wydajności FRET przy użyciu równania (3).
<img alt="Równanie transferu energii, E=(IDA-aIDD-δIAA)/(IDA-aIDD-δIAA+γIDD), analiza oddziaływań molekularnych." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 6"> (3)
or poprawioną stechiometrię przy użyciu równania (4).
<img alt="Równanie równowagi statycznej; analiza stosunków; wzór matematyczny; schemat równania S; badanie z fizyki." src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 7"> (4)
W idealnych warunkach poprawiona stechiometria dla stosunku donora do akceptora 1:1 daje S = 0.5. W praktyce obniżony stosunek sygnału do szumu powoduje rozrzut mierzonych wartości S, co utrudnia odróżnienie ich od sygnałów pochodzących wyłącznie od donora (S = 1) i wyłącznie od akceptora (S = 0). Powstałe przebiegi czasowe mogą służyć jako dane wejściowe do bardziej szczegółowej analizy trajektorii pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania informacji takich jak czasoprzestrzenne profile sił16, mobilność zdarzeń pojedynczych cząsteczek22 lub kinetyka przejść między różnymi stanami1.
Poniższy protokół opisuje parametry eksperymentalne i procedury dla eksperymentów śledzenia smFRET, a także zasadę działania analizy danych z wykorzystaniem nowo opracowanego pakietu oprogramowania. Do pozyskiwania danych eksperymentalnych zaleca się użycie zestawu mikroskopowego spełniającego następujące wymagania: i) zdolność do wykrywania emisji pojedynczych cząsteczek barwnika; ii) oświetlenie szerokopolowe: w szczególności dla eksperymentów na żywych komórkach zaleca się konfigurację całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR23,24,25); iii) separacja przestrzenna światła emisji w zależności od długości fali, tak aby fluorescencja donora i akceptora była rzutowana na różne obszary tej samej matrycy kamery25 lub na różne kamery; iv) modulacja źródeł światła dla wzbudzenia donora i akceptora z precyzją milisekundową, np. przy użyciu laserów bezpośrednio modulowanych lub modulacji za pomocą modulatorów akustyczno-optycznych. Pozwala to na oświetlenie stroboskopowe w celu zminimalizowania fotobleachingu fluoroforów, a także na naprzemienne wzbudzanie w celu określenia stechiometrii; v) generowanie jednego pliku na zarejestrowaną sekwencję obrazów w formacie, który może być odczytany przez pakiet Python PIMS26. W szczególności obsługiwane są wielostronicowe pliki TIFF.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(Kwas N-(5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacet)sukcynylo] (sól niklu) (Ni-NTA-DOGS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; Obiektyw olejowy Plan-FLUAR 100x/1,45</td><td>Zeiss</td><td>000000-1084-514</td><td></td></tr><tr><td>Korpus mikroskopu Axio Observer</td><td>Filtr pasmowo-przepustowy Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET570/60m</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Filtr emisyjny akceptora</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET675/50m</td></tr><tr><td>Conda-forge</td><td>Conda-forge Społeczność</td><td></td><td>Repozytorium pakietów Pythona dla szkiełek nakrywkowych Anaconda/miniconda</td></tr><tr><td>60 mm x 24 mm #1.5</td><td>MENZEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Semrock Inc</td><td>FF640-FDi01-25&razy; 36</td><td>separacja emisji donorowej i akceptorowej</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (poczwórne pasmo)</td> <td>Semrock Inc</td><td>Di01-R405/488/532/635-25 razy; 36</td><td>separacja światła wzbudzenia i emisji</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>do obrazowania analizy progów bufora</td></tr><tr><td></td><td>Sch&uuml; tz group na TU Wien</td><td></td><td>Pakiet Python do analizy danych smFRET; wersja 3</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11524766</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td>do bufora obrazowania</td></tr><tr><td>iBeam Smart 405-S Laser 405 nm</td><td>Toptica Photonics AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 Kamera EMCCD</td><td>Andor Technology Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komory Lab-Tek ( 8 dołków)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402PK</td><td>do przygotowania próbek i obrazowania</td></tr><tr><td>Laser Millenia Prime 532 nm</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniconda</td><td>Anaconda Inc.</td><td></td><td>Dystrybucja Pythona 3. Min. wersja: 3.7</td></tr><tr><td>Monowalentna streptawidyna (plazmidy do ekspresji bakterii)</td><td>Addgene</td><td>20860 & 20859</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 640 nm</td><td>laser Coherent Inc</td><td>1185055</td><td></td></tr><tr><td>Optosplit II</td><td>Cairn Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253</td><td>do bufora obrazowania</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia</td> <td>plazmyHarrick Plasma</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>sdt-python</td><td>Sch&uuml; tz group na Uniwersytecie Technicznym w Wiedniu</td><td></td><td>Biblioteka Pythona do analizy danych; wersja 17</td></tr><tr><td>Zestaw rozmiarów koralików TetraSpek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T14792</td><td>Losowo rozmieszczone, unieruchomione markery referencyjne do rejestracji obrazu</td></tr><tr><td>USC500TH Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>VWR</td><td></td><td>do formowania SUV-ów</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond fret

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Jednocząsteczkowy transfer energii rezonansu Förstera (smFRET) to wszechstronna technika raportowania odległości w zakresie od sub-nanometra do nanometra. Został wykorzystany w szerokim zakresie eksperymentów biofizycznych i biologii molekularnej, w tym w pomiarze sił molekularnych, charakterystyce dynamiki konformacyjnej biomolekuł, obserwacji wewnątrzkomórkowej kolokalizacji białek oraz określaniu czasów interakcji receptor-ligand. W konfiguracji mikroskopii szerokokątnej eksperymenty są zwykle wykonywane przy użyciu sond unieruchomionych powierzchniowo. W artykule przedstawiono metodę łączącą śledzenie pojedynczych cząsteczek ze wzbudzeniem naprzemiennym (ALEX) eksperymenty smFRET, pozwalająca na uzyskanie śladów czasowych smFRET związanych z powierzchnią, ale ruchomych sond w błonach plazmatycznych lub dwuwarstwach lipidowych na podłożu szklanym. Do analizy zarejestrowanych danych opracowano zautomatyzowany zbiór oprogramowania typu open source, które wspiera (i) lokalizację sygnałów fluorescencyjnych, (ii) śledzenie pojedynczych cząstek, (iii) określanie wielkości związanych z FRET, w tym współczynników korekcyjnych, (iv) rygorystyczną weryfikację śladów smFRET oraz (v) intuicyjną prezentację wyników. Wygenerowane dane mogą być wygodnie wykorzystane jako dane wejściowe do dalszej eksploracji za pomocą specjalistycznego oprogramowania, np. do oceny zachowania dyfuzyjnego sond lub badania przejść FRET.

W zależności od pytania badawczego postawionego w eksperymencie, z przebiegów smFRET można wyodrębnić różnorodne informacje niskiego i wysokiego poziomu. Przedstawiono tutaj przykłady potoków analitycznych dla sond analogowych i cyfrowych: odpowiednio dla peptydowego molekularnego sensora siły16 oraz sondy DNA o stochastycznej zmianie konformacji38. Konstrukcję oraz zasadę działania tych sond przedstawiono na Rysunku 5.
Po wykonaniu algorytmów lokalizacji i śledzenia zgodnie z opisem w protokole, pakiet oferuje wiele narzędzi do wizualizacji danych w celu optymalizacji parametrów początkowych i kolejnych etapów filtrowania: (i) wizualizację pojedynczych zdarzeń smFRET, (ii) opcjonalną segmentację obrazu w celu analizy danych w określonych obszarach zainteresowania, (iii) monitorowanie etapów filtrowania za pomocą wykresów wydajności FRET względem stechiometrii (E-S). Wizualizacja danych z pojedynczych cząsteczek przedstawiona jest na Rysunku 6.
Na koniec przefiltrowane zdarzenia FRET są przedstawione na wykresie E-S oraz na histogramie wydajności FRET (Rysunek 4). Wykres E-S jest użytecznym narzędziem do optymalizacji wspomnianych kroków filtrowania oraz analizy końcowego wyniku. Częściowo wybielone lub niepełnie znakowane sensory FRET można wykluczyć na podstawie ich wartości stechiometrii. Parametry mobilności można badać poprzez wykreślenie ścieżki pojedynczej trajektorii na wykresie x-y (Rysunek 6) lub na wykresie średniego kwadratu przemieszczenia (MSD) (Rysunek 4). Pierwsza metoda jest szczególnie przydatna do odróżnienia zdarzeń mobilnych od unieruchomionych, natomiast druga służy do obliczenia współczynnika dyfuzji.
<img alt="Graficzna analiza wydajności stechiometrii, MSD w funkcji czasu opóźnienia, porównanie danych mikroskopowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykładowe wyniki. (A) Wydajność FRET jest przedstawiona w funkcji stechiometrii (wykres E-S) dla populacji molekularnego czujnika siły (lewy panel) zdobiącego wspieraną na szkle dwuwarstwę lipidową i poddanego naprężeniom przez komórkę T. Widoczna jest tylko jedna chmura populacyjna. Odpowiedni histogram wydajności FRET obrazuje różnicę między populacją czujników siły w obecności i w nieobecności komórek (środkowy panel). Nie obserwuje się przesunięcia populacji czujników w stronę niższych wydajności FRET w obecności komórek T, co wskazuje na niewielkie lub brak zależnego od siły rozciągania modułu czujnika. Wykres MSD dla tych warunków eksperymentalnych potwierdza, że populacja czujników siły pod komórką T porusza się znacznie wolniej niż ich niepowiązane odpowiedniki (prawy panel). (B) Tą samą analizę przeprowadzono z wykorzystaniem sensora DNA z łącznikiem Holliday zdobiącego wspieraną na szkle płynną dwuwarstwę lipidową. Wykres E-S wyraźnie pokazuje dwie populacje, które są również widoczne na histogramie wydajności FRET. Wykres MSD wskazuje na obecność jednej szybko poruszającej się populacji czujników. Skróty: FRET = Förster resonance energy transfer; MSD = mean square displacement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza FRET aktywacji receptora limfocytów T z efektem siły; schemat przedstawia stany niskiego i wysokiego FRET." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Projekt i zasada działania wewnątrzmolekularnych sond FRET. (A) Analogowy sensor peptydowy do kwantyfikacji mechanicznych sił molekularnych. Fluorofory donora i akceptora są kowalencyjnie przyłączone do obu końców szkieletu peptydowego. Moduł sensora jest przyłączony w sposób specyficzny względem miejsca do konkretnego ligandu, który z kolei wiąże interesujący nas receptor powierzchniowy komórki (tutaj fragment przeciwciała specyficznie rozpoznający łańcuch beta receptora limfocytów T). Po związaniu receptora z ligandem wywierana jest siła, a moduł sensora rozciąga się i ostatecznie cofa po rozszczepieniu wiązania. Panel ten został zmodyfikowany na podstawie 16. (B) Cyfrowy sensor DNA do kwantyfikacji przejść FRET. Sensor FRET składa się z czterech nici DNA tworzących skrzyżowanie Hollidaya. Fluorofor donora i akceptora są kowalencyjnie przyłączone do dwóch nici. Skrzyżowania Hollidaya często zmieniają swoją konformację w zależności od warunków buforu w otoczeniu. Stochastyczne przełączanie tych konformacji można monitorować poprzez kwantyfikację wydajności FRET poszczególnych sond. Skróty: TCR = receptor limfocytów T; FRET = Förster resonance energy transfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy FRET z obrazowaniem komórek, trajektoriami, wykresami intensywności, wydajnością i stechiometrią." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Przykłady lokalizacji i śledzenia sond FRET. (A) Wydajność FRET i stechiometria poszczególnych zdarzeń są obliczane poprzez kwantyfikację intensywności fluoroforu donora przy wzbudzeniu donora (D → D), fluoroforu akceptora przy wzbudzeniu donora (D → A) oraz fluoroforu akceptora przy wzbudzeniu akceptora (A → A). Filtrowanie najbliższych sąsiadów zapobiega błędom wynikającym z nakładania się funkcji rozproszenia punktowego (PSF) blisko położonych emiterów. Segmentacja obrazu pozwala użytkownikowi wybrać określone zdarzenia smFRET zlokalizowane w obszarze zainteresowania (np. w komórce lub mikrowzorcu). Jako przykład segmentacji obrazu, limfocyty T zostały zabarwione Fura-2 (widoczne po lewej stronie) i poddane adaptacyjnemu progowaniu w celu zidentyfikowania krawędzi komórek (pomarańczowa przerywana linia). Paski skali = 5 µm. (B) Trajektorie smFRET z użyciem molekularnego sensora siły. Pojedyncze trajektorie mogą być naniesione na płaszczyznę x-y, co pozwala na wizualizację ich zachowania dyfuzyjnego i lokalizacji (panel lewy). Ponadto intensywności każdej trajektorii mogą być przedstawione w funkcji czasu w celu zidentyfikowania przejść FRET lub etapów wybielania (panel środkowy pokazuje czerwoną trajektorię z panelu lewego). Wynikową wydajność FRET i stechiometrię można zwizualizować w podobny sposób (panel prawy). (C) Trajektorie smFRET z użyciem sensora DNA w formie skrzyżowania Hollidaya. Jako bufor podczas pomiarów zastosowano HBSS + 12 mM MgCl2. Poza widocznym etapem wybielania akceptora w pobliżu końca sekwencji w tych przykładach, można określić częstotliwość przejść FRET dla każdego sensora. Skrzyżowania Hollidaya zmieniają swoją konformację z wysoką częstotliwością, podczas gdy molekularny sensor siły nie wykazuje przejść FRET. Informacje te umożliwiają dostosowanie warunków eksperymentalnych, takich jak opóźnienie między klatkami, w celu zwiększenia lub zmniejszenia liczby obserwowanych przejść. Skróty: FRET = Förster resonance energy transfer; smFRET = single-molecule FRET; HBSS = Hank's balanced salt solution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Informacje uzupełniające: Lokalizacja i śledzenie pojedynczych cząsteczek (01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu sond powierzchniowych były w przeszłości przeprowadzane prawie wyłącznie na unieruchomionych cząsteczkach. Jednak wiele biomolekuł dyfunduje i można je analizować za pomocą naszej metody. Połączenie jednocząsteczkowego FRET ze śledzeniem umożliwia nie tylko analizę śladów czasowych niedoboru FRET poruszających się sond, ale także badanie aspektów czasoprzestrzennych, takich jak zachowanie dyfuzyjne.Nasza metoda jest kompatybilna z wieloma różnymi sondami opartymi na FRET. Na przykład może dostarczyć informacji na temat sił molekularnych, dynamiki konformacyjnej i kinetyki wiązania w eksperymentach na żywych komórkach. Wysokiej jakości eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET są notorycznie trudne do przeprowadzenia.Aby zapewnić wiarygodną kwantyfikację, ważne jest, aby rejestrować dane z dobrym stosunkiem sygnału do szumu i ścieżkami pojedynczych cząsteczek o wystarczającej długości. Aby rozpocząć pomiar próbki, wzbudz fluorofory dawcy i akceptora przez odpowiedni czas oświetlenia podczas wyzwalania kamery i poczekaj, aż odczyt z kamery zostanie włączony. Powtórzyć na przemian wzbudzenie fluoroforów dawcy i akceptora.Wybierz liczbę powtórzeń, która jest wystarczająco duża, aby zapewnić fotowybielanie co najmniej jednego fluoroforu na sondę w polu widzenia, co pozwala na krokową analizę fotowybielania w celu odróżnienia sygnałów jednocząsteczkowych od agregatów. Określ sekwencję oświetlenia, aby umożliwić wybór ramek wzbudzenia donorowego i akceptacyjnego, a także ramek do segmentacji obrazu z zarejestrowanych sekwencji obrazu. Jednocześnie analizuj zestawy danych zarejestrowane przy użyciu tych samych ustawień oświetlenia.W tym celu należy przypisać identyfikator i wzorzec, który odpowiada odpowiednim nazwom plików sekwencji obrazów do każdego zestawu danych. Ponadto można zdefiniować specjalne zestawy danych do specjalnych celów, takich jak nagrania znaczników odniesienia do rejestracji obrazu, profile światła wzbudzenia do korekcji płaskiego pola oraz opcjonalnie próbki tylko dla dawcy i akceptanta w celu określenia współczynników korekcyjnych. Następnie wybierz kanały emisji i obrazy RAW, jeśli oba kanały są nagrywane za pomocą jednej kamery.W tym celu należy użyć odpowiedniego widżetu graficznego, aby wybrać odpowiednie regiony dla emisji dawcy i osoby akceptującej, a następnie zlokalizować znaczniki odniesienia w obu kanałach emisyjnych i przeprowadzić rejestrację obrazu. Użyj dostarczonego interfejsu użytkownika, aby znaleźć odpowiednie parametry algorytmu lokalizacji zarówno dla kanałów emisji dawcy, jak i akceptora. Następnie należy ustawić parametry lokalizacji pojedynczej cząsteczki dla sond FRET po wzbudzeniu donora w sumie obrazów uzyskanych z emisji donorowej i akceptorowej, a następnie ustawić parametry lokalizacji dla sond po wzbudzeniu akceptora w kanale emisyjnym akceptora.Lokalizuj sondy FRET po wzbudzeniu donora i akceptora niezależnie we wszystkich ramkach. Wyniki są scalane w jedną tabelę, która zawiera oryginalny numer klatki, współrzędne dwuwymiarowe oraz identyfikator odnoszący się do źródłowego pliku obrazu. Aby śledzić i mierzyć intensywność fluorescencji, wybierz odpowiednie opcje dla algorytmu Trackpy, aby połączyć lokalizacje sondy FRET w trajektorie.Następnie, korzystając z funkcjonalności oprogramowania analitycznego, przetwarzaj pomocnicze dane obrazu z sekwencji obrazów. Wyodrębnij dodatkowe obrazy zarejestrowane w celu ułatwienia segmentacji oznaczonej literą S w sekwencji wzbudzenia. Na koniec określ profile światła wzbudzenia donorowego i akceptorowego w całym polu widzenia na podstawie obrazów zarejestrowanych na gęsto oznakowanej próbce.W początkowych krokach filtrowania należy odrzucić sygnały z funkcjami nakładania się punktów, ponieważ trudno jest wiarygodnie określić ich intensywność fluorescencji. W przypadku niejednorodnego oświetlenia należy akceptować tylko sygnały znajdujące się w dobrze oświetlonych obszarach w polu widzenia, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu. Jeśli badasz wewnątrzcząsteczkowy FRET, ogranicz analizę do tych trajektorii, które są obecne od początku sekwencji obrazu.Następnie wykonaj korekcję pola płaskiego, która wykorzystuje uzyskane wcześniej profile źródła światła wzbudzenia do odwrócenia zależnych od położenia zmian intensywności fluorescencji spowodowanych niejednorodnym oświetleniem, a następnie oblicz pozorną wydajność FRET i pozorną stechiometrię. Aby przeprowadzić krokową analizę fotowybielania w celu rozróżnienia między pojedynczymi sondami molekularnymi a agregatami, należy znaleźć odpowiednie parametry dla algorytmu wykrywania punktu zmiany przy niezależnym wzbudzeniu dawcy i akceptora. Następnie wykonaj algorytm wykrywania punktu zmiany.Aby usunąć ścieżkę wykazującą niejednoznaczne zachowanie fotowybielania, zdefiniuj progi intensywności, poniżej których fluorofor jest uważany za wybielony, a następnie wybierz jedną z poniższych opcji. Opcja pierwsza, w której akceptor fluoroforu wybiela się w jednym kroku, podczas gdy dawca nie wykazuje częściowego wybielania. Opcja druga, w której dawca wybiela w jednym kroku, podczas gdy nie ma częściowego wybielania akceptora.Opcja trzecia, w której jeden fluorofor wybiela w jednym kroku, podczas gdy drugi nie wybiela częściowo. I opcja czwarta, w której fluorofory dawcy i akceptora wykazują jednoetapowe fotowybielanie lub brak fotowybielania w ogóle. Następnie oblicz współczynniki korygujące dla wycieku emisji donora do kanału akceptora, bezpośredniego wzbudzenia akceptora, skuteczności wykrywania i sprawności wzbudzenia.Następnie użyj współczynników korekcyjnych, aby obliczyć wydajność FRET na podstawie wydajności pozornej i stechiometrię na podstawie stechiometrii pozornej. W celu dalszego filtrowania wybierz tylko punkty danych sprzed pierwszego zdarzenia wybielania w każdej trajektorii. Dodatkowo, aby ograniczyć analizę do sond jednocząsteczkowych, akceptuj tylko trajektorie z co najmniej 75% punktów danych w odpowiednich granicach stechiometrii.Następnie należy przeprowadzić segmentację obrazu za pomocą globalnych lub adaptacyjnych metod progowania na odpowiednich obrazach pomocniczych, aby ograniczyć analizę do odrębnych obszarów w polu widzenia. Utwórz wykresy wydajności w funkcji stechiometrii, aby sprawdzić, czy sygnały nieprawidłowej stechiometrii zostały prawidłowo zidentyfikowane i usunięte. Następnie narysuj histogramy wydajności FRET, aby uzyskać dobrze ugruntowany przegląd rozkładów wydajności FRET i pogrupuj histogramy w celu wygodnego porównania wyników z różnych eksperymentów.Korzystając z naukowych bibliotek Pythona, możliwa jest dalsza ocena danych w notatniku, wykonując np. analizę dyfuzji. Wizualizacja i śledzenie zdarzenia FRET pojedynczej cząsteczki są pokazane tutaj. Przefiltrowane zdarzenia FRET są reprezentowane przez wykresy wydajności w funkcji stechiometrii na histogramie wydajności FRET.Ponadto parametry mobilności można badać, wykreślając pojedynczą ścieżkę trajektorii na wykresie XY lub wykresie przemieszczenia średniokwadratowego. Dane wyjściowe naszej platformy pozwalają nam na dalszą identyfikację zmian w śladach czasowych wydajności FRET sond mobilnych. Na przykład w celu oceny zmian konformacyjnych biomolekuł.Korzystając z czujnika siły opartego na FRET, platforma analityczna pozwoliła nam określić ilościowo zdarzenia siły pojedynczej cząsteczki w synapsie immunologicznej podczas wczesnej sygnalizacji limfocytów T.

automated-two-dimensional-spatiotemporal-analysis-mobile-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.

Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych sond smFRET przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki molekularnej i interakcji w żywych komórkach.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Przeglądaj więcej filmów