Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu sond powierzchniowych były w przeszłości przeprowadzane prawie wyłącznie na unieruchomionych cząsteczkach. Jednak wiele biomolekuł dyfunduje i można je analizować za pomocą naszej metody. Połączenie jednocząsteczkowego FRET ze śledzeniem umożliwia nie tylko analizę śladów czasowych niedoboru FRET poruszających się sond, ale także badanie aspektów czasoprzestrzennych, takich jak zachowanie dyfuzyjne.

Nasza metoda jest kompatybilna z wieloma różnymi sondami opartymi na FRET. Na przykład może dostarczyć informacji na temat sił molekularnych, dynamiki konformacyjnej i kinetyki wiązania w eksperymentach na żywych komórkach. Wysokiej jakości eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami FRET są notorycznie trudne do przeprowadzenia.

Aby zapewnić wiarygodną kwantyfikację, ważne jest, aby rejestrować dane z dobrym stosunkiem sygnału do szumu i ścieżkami pojedynczych cząsteczek o wystarczającej długości. Aby rozpocząć pomiar próbki, wzbudz fluorofory dawcy i akceptora przez odpowiedni czas oświetlenia podczas wyzwalania kamery i poczekaj, aż odczyt z kamery zostanie włączony. Powtórzyć na przemian wzbudzenie fluoroforów dawcy i akceptora.

Wybierz liczbę powtórzeń, która jest wystarczająco duża, aby zapewnić fotowybielanie co najmniej jednego fluoroforu na sondę w polu widzenia, co pozwala na krokową analizę fotowybielania w celu odróżnienia sygnałów jednocząsteczkowych od agregatów. Określ sekwencję oświetlenia, aby umożliwić wybór ramek wzbudzenia donorowego i akceptacyjnego, a także ramek do segmentacji obrazu z zarejestrowanych sekwencji obrazu. Jednocześnie analizuj zestawy danych zarejestrowane przy użyciu tych samych ustawień oświetlenia.

W tym celu należy przypisać identyfikator i wzorzec, który odpowiada odpowiednim nazwom plików sekwencji obrazów do każdego zestawu danych. Ponadto można zdefiniować specjalne zestawy danych do specjalnych celów, takich jak nagrania znaczników odniesienia do rejestracji obrazu, profile światła wzbudzenia do korekcji płaskiego pola oraz opcjonalnie próbki tylko dla dawcy i akceptanta w celu określenia współczynników korekcyjnych. Następnie wybierz kanały emisji i obrazy RAW, jeśli oba kanały są nagrywane za pomocą jednej kamery.

W tym celu należy użyć odpowiedniego widżetu graficznego, aby wybrać odpowiednie regiony dla emisji dawcy i osoby akceptującej, a następnie zlokalizować znaczniki odniesienia w obu kanałach emisyjnych i przeprowadzić rejestrację obrazu. Użyj dostarczonego interfejsu użytkownika, aby znaleźć odpowiednie parametry algorytmu lokalizacji zarówno dla kanałów emisji dawcy, jak i akceptora. Następnie należy ustawić parametry lokalizacji pojedynczej cząsteczki dla sond FRET po wzbudzeniu donora w sumie obrazów uzyskanych z emisji donorowej i akceptorowej, a następnie ustawić parametry lokalizacji dla sond po wzbudzeniu akceptora w kanale emisyjnym akceptora.

Lokalizuj sondy FRET po wzbudzeniu donora i akceptora niezależnie we wszystkich ramkach. Wyniki są scalane w jedną tabelę, która zawiera oryginalny numer klatki, współrzędne dwuwymiarowe oraz identyfikator odnoszący się do źródłowego pliku obrazu. Aby śledzić i mierzyć intensywność fluorescencji, wybierz odpowiednie opcje dla algorytmu Trackpy, aby połączyć lokalizacje sondy FRET w trajektorie.

Następnie, korzystając z funkcjonalności oprogramowania analitycznego, przetwarzaj pomocnicze dane obrazu z sekwencji obrazów. Wyodrębnij dodatkowe obrazy zarejestrowane w celu ułatwienia segmentacji oznaczonej literą S w sekwencji wzbudzenia. Na koniec określ profile światła wzbudzenia donorowego i akceptorowego w całym polu widzenia na podstawie obrazów zarejestrowanych na gęsto oznakowanej próbce.

W początkowych krokach filtrowania należy odrzucić sygnały z funkcjami nakładania się punktów, ponieważ trudno jest wiarygodnie określić ich intensywność fluorescencji. W przypadku niejednorodnego oświetlenia należy akceptować tylko sygnały znajdujące się w dobrze oświetlonych obszarach w polu widzenia, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu. Jeśli badasz wewnątrzcząsteczkowy FRET, ogranicz analizę do tych trajektorii, które są obecne od początku sekwencji obrazu.

Następnie wykonaj korekcję pola płaskiego, która wykorzystuje uzyskane wcześniej profile źródła światła wzbudzenia do odwrócenia zależnych od położenia zmian intensywności fluorescencji spowodowanych niejednorodnym oświetleniem, a następnie oblicz pozorną wydajność FRET i pozorną stechiometrię. Aby przeprowadzić krokową analizę fotowybielania w celu rozróżnienia między pojedynczymi sondami molekularnymi a agregatami, należy znaleźć odpowiednie parametry dla algorytmu wykrywania punktu zmiany przy niezależnym wzbudzeniu dawcy i akceptora. Następnie wykonaj algorytm wykrywania punktu zmiany.

Aby usunąć ścieżkę wykazującą niejednoznaczne zachowanie fotowybielania, zdefiniuj progi intensywności, poniżej których fluorofor jest uważany za wybielony, a następnie wybierz jedną z poniższych opcji. Opcja pierwsza, w której akceptor fluoroforu wybiela się w jednym kroku, podczas gdy dawca nie wykazuje częściowego wybielania. Opcja druga, w której dawca wybiela w jednym kroku, podczas gdy nie ma częściowego wybielania akceptora.

Opcja trzecia, w której jeden fluorofor wybiela w jednym kroku, podczas gdy drugi nie wybiela częściowo. I opcja czwarta, w której fluorofory dawcy i akceptora wykazują jednoetapowe fotowybielanie lub brak fotowybielania w ogóle. Następnie oblicz współczynniki korygujące dla wycieku emisji donora do kanału akceptora, bezpośredniego wzbudzenia akceptora, skuteczności wykrywania i sprawności wzbudzenia.

Następnie użyj współczynników korekcyjnych, aby obliczyć wydajność FRET na podstawie wydajności pozornej i stechiometrię na podstawie stechiometrii pozornej. W celu dalszego filtrowania wybierz tylko punkty danych sprzed pierwszego zdarzenia wybielania w każdej trajektorii. Dodatkowo, aby ograniczyć analizę do sond jednocząsteczkowych, akceptuj tylko trajektorie z co najmniej 75% punktów danych w odpowiednich granicach stechiometrii.

Następnie należy przeprowadzić segmentację obrazu za pomocą globalnych lub adaptacyjnych metod progowania na odpowiednich obrazach pomocniczych, aby ograniczyć analizę do odrębnych obszarów w polu widzenia. Utwórz wykresy wydajności w funkcji stechiometrii, aby sprawdzić, czy sygnały nieprawidłowej stechiometrii zostały prawidłowo zidentyfikowane i usunięte. Następnie narysuj histogramy wydajności FRET, aby uzyskać dobrze ugruntowany przegląd rozkładów wydajności FRET i pogrupuj histogramy w celu wygodnego porównania wyników z różnych eksperymentów.

Korzystając z naukowych bibliotek Pythona, możliwa jest dalsza ocena danych w notatniku, wykonując np. analizę dyfuzji. Wizualizacja i śledzenie zdarzenia FRET pojedynczej cząsteczki są pokazane tutaj. Przefiltrowane zdarzenia FRET są reprezentowane przez wykresy wydajności w funkcji stechiometrii na histogramie wydajności FRET.

Ponadto parametry mobilności można badać, wykreślając pojedynczą ścieżkę trajektorii na wykresie XY lub wykresie przemieszczenia średniokwadratowego. Dane wyjściowe naszej platformy pozwalają nam na dalszą identyfikację zmian w śladach czasowych wydajności FRET sond mobilnych. Na przykład w celu oceny zmian konformacyjnych biomolekuł.

Korzystając z czujnika siły opartego na FRET, platforma analityczna pozwoliła nam określić ilościowo zdarzenia siły pojedynczej cząsteczki w synapsie immunologicznej podczas wczesnej sygnalizacji limfocytów T.