Inżynieria białka przepuszczalnego dla komórek

Manipulacja funkcją komórkową może być osiągnięta za pomocą klasycznych podejść do transfekcji DNA lub transdukcji wirusa w ciągu ostatnich 15 lat. Ewoluowała inna metoda. Biologicznie aktywne białko transdukcji białka może być bezpośrednio dostarczane do komórek ssaków za pomocą małych peptydów połączonych z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, co wspomaga wychwyt komórkowy.

Ponieważ nie stosuje się DNA, zapobiega się ryzyku agenezji wysiłkowej. W przeciwieństwie do wyżej wymienionych klasycznych metod. Transdukcja białek umożliwia dostarczanie białek w sposób miareczkowy.

Co więcej, można modulować zarówno małe populacje komórek, jak i komórki niedzielące się, takie jak neurony postmitotowe. Aby uzyskać efektywną ekspresję białka rekombinowanego, zalecamy stosowanie systemu wektorowego Paciz. Jest to modułowy system wektorowy składający się z terminala końcowego i wariantu terminala C.

Oba wektory umożliwiają łatwe wprowadzenie interesującego Cię genu w celu oczyszczenia. Zintegrowany jest znacznik histydyny, a także domena transdukcji białka. W naszym przypadku dotyk wirusa HI sprzyja wychwytowi komórkowemu do dystrybucji komórkowej.

Sygnał lokalizacji jądrowej uzupełnia wektor ze względów kontrolnych, znaczniki fuzji można po prostu usunąć. Poza tym rozmieszczenie tych znaczników może mieć duży wpływ na właściwości białek fuzyjnych. Wpływ na plon i czystość, a także na zdolność do sprzedaży i funkcję biologiczną jest nieprzewidywalny.

Cześć, nazywam się Bernard Mus i pracuję w grupie inżynierii komórek macierzystych w Instytucie Neurobiologii Rekonstrukcyjnej w Bond w Niemczech. Cześć, nazywam się Christoph P i jestem również członkiem Laboratorium Hoovera. Nasza grupa robocza intensywnie wykorzystuje technikę transdukcji białek do bezpośredniego dostarczania biologicznie aktywnego białka do różnych komórek ssaków, a dziś chcemy przeprowadzić Cię przez proces ekspresji i oczyszczania w i z E. coli.

Następnie chcielibyśmy pokazać Państwu, jak zastosować białko do trwałej fuzji komórkowej w hodowli komórkowej, aby zilustrować całą procedurę wyrażania, oczyszczania i aplikacji. Wykorzystujemy rekombinację specyficzną dla miejsca Cree do genetycznej modyfikacji mysich komórek macierzystych. Dobra. Dobra. Zacznijmy.

Aby zaszczepić nocną hodowlę, używamy już przekształconych bakterii przechowywanych w bulionie glicerolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Bakterie te zawierają już wektor kodujący rekombinację decre. Za pomocą końcówki pipera zdrapujemy niewielką ilość bakterii na końcówce pipera i wrzucamy ją do zlewki zawierającej nocną hodowlę.

Posiew nocny składa się z pożywki LB uzupełnionej glukozą o końcowym stężeniu oh 0,5% i 50 mikrogramów insuliny węglowej na ml. Zlewkę umieszcza się następnie w inkubatorze pracującym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu ekspresji specyficznego dla danego miejsca Recombinate Cree. Używamy przedwojennych pożywek gruźlicy w naszej kulturze ekspresji na dużą skalę.

Aby przyspieszyć odciąganie pokarmu, zalecamy stosowanie pożywek gruźliczych podgrzanych do 37 stopni Celsjusza, co odpowiada temperaturze podczas ekspresji rekombinowanego białka. Następnie dodajemy glukozę do pożywki gruźliczej w końcowym stężeniu oh 0,5%Glukoza zapobiega zwiększonej podstawowej ekspresji białka fuzyjnego podczas wzrostu kultury ekspresyjnej przed indukcją. Na koniec, ampicylina jest dodawana do kultury ekspresyjnej w końcowym stężeniu 100 mikrogramów na ml, aby zapewnić, że czysta kultura zawiera tylko bakterie, które nadal zawierają plazmid kodujący białko dekretowe.

Teraz możemy uzyskać naszą nocną hodowlę i zaszczepić kulturę ekspresji w stosunku jeden do 50. Zlewki są następnie przenoszone do inkubatora pracującego w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Należy regularnie pobierać próbki w celu pomiaru gęstości optycznej w całym wyrazie.

Gdy tylko kultura osiągnie gęstość optyczną 1,5, bakterie są indukowane końcowym stężeniem oh 0,5 milimola IPTG. Po jednej godzinie indukcji kultura ekspresji jest przenoszona do rurek, a następnie zbierana przez wirowanie. Do tego celu wykorzystujemy wirnik SLA 3000.

Wirówka pracuje z prędkością 5 000 rund na minutę przez 10 minut pod kątem czterech stopni do tyłu. Snat jest następnie odrzucany, a osad bakteryjny może być przechowywany w nieskończoność w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Zamrożone granulki są ponownie zawieszane w buforze lizza, który odpowiada jednemu litrowi kultury ekspresyjnej.

Używamy 10 ml buforu lizza, czekamy około 15 minut, aż roztwór stanie się jednorodny. Następnie dodaje się jeden miligram lizozymu na każdy ml zawiesiny. Roztwór miesza się przez 20 minut, aby enzym mógł rozbić bakterie.

Następnie dodaje się Benson Nase w rozcieńczeniu od 1 do 1000 przez dodatkowe 15 minut, co spowoduje przecięcie DNA, dając nielepki roztwór. Na koniec stosuje się sonator, aby zapewnić lizę komórek. Program trwa półtorej minuty z mocą 45% po zakończeniu certyfikacji.

Pamiętaj, aby pobrać próbkę każdego kroku tutaj, surowego lizatu lub analizy strony SDS oczyszczania. Teraz bardzo ważne jest, aby dodać jeden ml lodowatego buforu TSB na ml zawiesiny, ponieważ białko dekretowe będzie miało tendencję do wytrącania się w zapasie glicerolu. Jeśli zamierzasz pominąć ten krok, roztwór zostanie wkrótce wymieszany, a surowy produkt jest teraz gotowy do wirowania.

Do tego celu używamy wirnika SS 34. Wirówka pracuje z prędkością 17 000 obr./min przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu, wirówka Inc ostrożnie przeniosła supernatant S do świeżych probówek Falcon o pojemności 50 ml.

Teraz dodaj zawiesinę niklu anty A do supernatantu niklu. Anty A jest kluczowym odczynnikiem do prawidłowego oczyszczania białek fuzyjnych histydyny. Histydyna tworzy kompleks z jonami niklu, umożliwiając oczyszczanie powinowactwa, teraz delikatnie potrząsaj rurkami parkingowymi przez 60 minut w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Po godzinie można teraz nałożyć zawiesinę na kolumny o objętości 20 ml i pozwolić, aby roztwór przepływał przez przepływ grawitacyjny. W przypadku produkcji na dużą skalę możliwe jest podzielenie zawieszenia na kilka kolumn. Następnie dwukrotnie myjemy kolumnę buforem zawierającym 15 milimolów wkładki.

Ilość zastosowanego buforu zależy od objętości żywicy. Dwa MLS niklu NTA odpowiadają jednemu ml żywicy do prania. Po umyciu nakładamy na kolumnę pięć objętości żywicy buforu myjącego, jesteśmy teraz gotowi do ucieczki naszego białka.

Dlatego używamy buforu elucyjnego o stężeniu 250 milimolów immunologii. Zauważ więc, jak kolor żywicy zmienia się w kierunku zielonego. Ze względu na wysokie stężenia białka CRE, frakcja OID czasami staje się niestabilna.

Aby temu zapobiec, wymieszaj roztwór i dodaj dodatkowy bufor lizy, wszystkie frakcje są teraz łączone, a następnie przenoszone do rurki do lizy. Liza usunie ole Pierwszy etap dializatora jest wykonywany w stosunku do buforu zawierającego wysokie stężenie soli. Po godzinie następuje wymiana buforu o wysokiej zawartości soli i zastosowanie procedury dializy przez noc.

Następnego dnia rurki dializacyjne wyjmuje się z buforu o wysokiej zawartości soli i przenosi do buforu glicerynowego. Po trzech do pięciu godzinach następuje wymiana buforu glicerolu i ponowne przeprowadzenie dializy przez noc. Liza przeciwko buforowi glicerolu spowoduje powstanie co najmniej trzykrotnie stężonego roztworu podstawowego.

Roztwór podstawowy może być teraz przechowywany w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka lat bez utraty aktywności W celu zapewnienia jakości można załadować pobrane próbki stron SDS na żel, a następnie je zabarwić. W przypadku Kamasi białko fuzyjne Cree jest wykrywalne jako wyraźne pasmo we frakcji OID. Aby zastosować odpowiednie stężenie rekombinacji załogi, należy określić stężenie za pomocą testu Redforda.

Jak zastosować tak trwałe białka w komórkach ssaków. Przede wszystkim należy przygotować komórki docelowe w celu osiągnięcia najwyższej wydajności transdukcji białek. Zobacz komórki jednowarstwowe o gęstości powodującej warstwę komórek zbiegu od 80 do 90% następnego dnia, w przypadku, gdy twoje komórki docelowe są komórkami tak, które są hodowane w zwartych koloniach.

Oddziel komórki i somatycznie i zobacz je w zawiesinie pojedynczej komórki z pięciogodzinnym wyprzedzeniem. Ważne jest, aby wykonać zawiesinę pojedynczej komórki przed transdukcją białka, ponieważ w przeciwnym razie tylko komórki powietrzne na powierzchni kolonii mogą być przetaczane. Zasysaj pożywkę i krótko obserwuj komórki powietrzne za pomocą PPS przed próbnym leczeniem.

Usunąć pozostałe tak, grube podłoża zawierające surowicę. Po zaessaniu PPS nałóż komórki z kapaniem i pozwól im inkubować od trzech do pięciu minut. Teraz sprawdź pod mikroskopem, czy wszystkie kolonie są rozpuszczone w pojedynczych komórkach.

Powody właśnie wymienione, jest to kluczowy krok dla transdukcji białka do komórek tak. Przenieś oderwane komórki do probówki. Umieść probówkę na stole, odwiruj i odwiruj komórki w dół, odessaj super środek i ponownie zawieś komórkę.

P w pożywce wzrostowej rozcieńczyć komórki do odpowiedniej liczby komórek. To oczywiście zależy od wielkości hodowli tkankowej. Na naczyniu inkubuj komórki powietrzne przez dodatkowe pięć godzin.

Da to komórkom powietrznym wystarczająco dużo czasu, aby przyczepić się do dna i przylgnąć. Materiał trzyklasowy może być przechowywany w temperaturze minus 20 stopni przez ponad dwa lata. Podczas pracy z białkiem do trwałej fuzji komórek rekombinowanych bardzo korzystne jest posiadanie takiego podstawowego roztworu, który można stosować na żądanie.

Czekając, aż komórki przyczepią się do naczynia, można przygotować pożywkę do transdukcji C, po prostu rozcieńczyć odpowiednią objętość białka trwałego pełzania komórek z zapasu cholesterolu do siebie. Media. Ponieważ roztwór podstawowy Clare nie jest jeszcze sterylny, pożywki trans muszą być sterylnie przefiltrowane przed jego zastosowaniem. Zalecamy użycie strzykawki, którą można przykręcić do filtra wiążącego białka krzywkowe.

Końcowe stężenie potoku zależy od rodzaju komórek lub dodatków do pożywki. Na przykład surowica ma silnie negatywny wpływ na wydajność transdukcji. Można temu zaradzić, stosując pożywki wolne od surowicy lub zwiększając stężenie w potoku.

Znajdujemy optymalne warunki umożliwiające najwyższą wydajność rekombinacji. Stężenie hydratu zaczyna się od oh 0,5 do 10 mikromolowych. Zalecamy testowanie różnych czasów inkubacji od sześciu do 18 godzin.

Po pięciu godzinach inkubacji wyjmij komórki docelowe i odessaj pożywkę krzyżową. Następnie zastępujemy go pożywką do transdukcji białek, po całonocnej inkubacji wkładamy komórki powietrzne z powrotem do inkubatora. Krótko przemyłem komórki D PPS i zmieniono pożywkę transdukcji białka na normalną pożywkę ES.

48 godzin po inkubacji komórki można wykryć stałą ekspresję genu Cree vent za pomocą xul. Barwienie komórek z dodatnim fenotypem bega zostało z powodzeniem zmodyfikowane genetycznie przez rekombinację specyficzną dla danego miejsca. Cree w raporcie.

Komórki zawierają CRE wykorzystują konstrukcję Lae po wstępnie pomediowanej rekombinacji. Sekwencja zatrzymania flanki blokady P jest wycinana i aktywowany jest luksusowy gen reporterowy, napędzany przez promotora drużyny. Aby ocenić skuteczność rekombinacji we wstępnie poddanych działaniu komórek powietrza reporterowego, należy ustalić ich moc.

Odessać pożywkę, dwukrotnie przemyć komórki za pomocą komórek nakładających PBS z 4% PFA i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie trzykrotnie przemyć komórki PBS. Po zassaniu PBS z ostatniego etapu mycia roztworem barwienia Xal do studzienek, inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 stopni w inkubatorze.

Następnego dnia aktywność Beala może być monitorowana przez komórki z niebieskim kołnierzem. Skuteczność rekombinacji można określić na podstawie liczby niebieskich kolonii. W optymalnych warunkach powinieneś być w stanie osiągnąć wydajność rekombinacji wyższą niż 90%W porządku, dzisiaj pokazaliśmy, jak wyrazić i oczyścić rekombinację zapytania specyficznego dla miejsca Z e coli.

W tym badaniu potwierdzającym zasadę byliśmy w stanie wywołać rekombinację w większości soli. Dobra, to wszystko. Powodzenia w Experiments.I.