Name: Inżynieria białka przepuszczalnego dla komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: Poznaj metodę translokacji białek do komórek ssaków jako alternatywę dla transfekcji DNA. Technika ta umożliwia bezpieczną manipulację komórkową bez ryzyka trwałej modyfikacji genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Oliverowi Brüstle oraz wszystkim członkom Grupy Inżynierii Komórek Macierzystych (Stem Cell Engineering Group) na Uniwersytecie w Bonn za wsparcie i cenne dyskusje. Dziękujemy Sabine Schenk za przygotowanie SDS-PAGE oraz nieustające wsparcie w trakcie realizacji projektu. Nicole Russ i Anna Magerhans zapewniły doskonałe wsparcie techniczne. Ponadto chcielibyśmy podziękować Andreasowi Bärowi i Sheili Mertens za produkcję filmu. Praca ta była finansowana z grantów Fundacji Volkswagena (Az I/77864) oraz niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF, 01 GN 0813).

Konstrukcja wektora ekspresyjnego i ekspresja:
Wektor ekspresyjny pSESAME-Cre skonstruowano poprzez wstawienie fragmentu kodującego Cre do pSESAME za pomocą miejsc restrykcyjnych AvrII oraz NheI z wykorzystaniem standardowych metod klonowania. pSESAME koduje białko fuzyjne składające się z przeciągu histydynowego, domeny TAT, sekwencji NLS i Cre, w skrócie HTNCre. W celu ekspresji HTNCre wektor pSESAME-Cre transformowano do szczepu TUNER (DE3) pLacI, a następnie przygotowano zapas w glicerolu.
<ol>
 <li>Kulturę nocną zaszczepiono za pomocą końcówki do pipety pokrytej bakteriami transformowanymi z zapasu glicerolowego. Kultura nocna składała się z pożywki LB uzupełnionej o 0,5% glukozy [v/v] oraz karbenicyliny w stężeniu końcowym 50 μg/mL i była inkubowana w temperaturze 37°C przez 16 godzin.</li>
 <li>Następnego dnia gęstą kulturę noczną wykorzystano do zaszczepienia kultury ekspresyjnej w stosunku 1:40, a następnie umieszczono ją w inkubatorze w temperaturze 37°C. Kultura ekspresyjna składała się z pożywki TB uzupełnionej o 0,5% glukozy [v/v] oraz ampicyliny w stężeniu końcowym 100 μg/mL.</li>
 <li>Przy wartości OD595 wynoszącej 1,5 indukowano ekspresję w kulturze za pomocą 0,5 mM IPTG przez 1 h.</li>
 <li>Następnie bakterie zebrano poprzez wirowanie przy 5000 rpm przez 10 minut w rotorze SLA3000.</li>
 <li>Osady bakteryjne przechowywano w temperaturze minus 20°C do momentu oczyszczania.</li>
</ol>
Oczyszczanie białka przenikającego przez błony komórkowe:
<ol>
 <li>Zamrożone osady bakterii resuspendowano w 10 mL buforu lizującego na litr hodowli w kolbie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zawiesinę inkubowano następnie z 1 mg/mL lizozymu przez kolejne 15 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu.</li>
 <li>Następnie dodano 25 U/mL benzonukleazy i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy mieszaniu.</li>
 <li>Po sonikacji na lodzie przez 1,5 min z impulsami 0,5 s przy mocy 45%, ostrożnie dodano 1 mL zimnego buforu soli winianowej (TSB) na każdy 1 mL zawiesiny przy mieszaniu i inkubowano przez 5 min na lodzie. Pobrano próbkę frakcji lizatu (L) do analizy SDS-PAGE.</li>
 <li>Oczyszczony lizat otrzymano poprzez wirowanie w 4°C przez 30 min przy 30 000g. Pobrano próbki frakcji rozpuszczalnej (S) i nierozpuszczalnej (I) do analizy SDS-PAGE.</li>
 <li>Nadsącz przeniesiono do nowych probówek typu Falcon o pojemności 50 mL, a następnie delikatnie mieszano przez 1 h w 4°C z 2 mL 50% zawiesiny Ni-NTA na litr początkowej hodowli ekspresyjnej.</li>
 <li>Zawiesinę nałożono na kolumnę grawitacyjną EconoPac (pobrano próbkę frakcji przepływowej (FT) do analizy SDS-PAGE) i przemyto dwukrotnie 5 objętościami złoża buforu płuczącego. Zebrano próbki obu frakcji płukania (W1 i W2) do analizy SDS-PAGE.</li>
 <li>Frakcje zawierające HTNCre eluowano 3 objętościami złoża buforu elucyjnego i pobrano próbkę frakcji eluatu (E) do analizy SDS-PAGE.</li>
 <li>Imidazol usunięto poprzez dwukrotną dializę frakcji elucyjnej przeciwko buforowi wysokosolnemu.</li>
 <li>Roztwór białka dalej zagęszczano poprzez dwukrotną dializę przeciwko buforowi glicerolowemu. we wszystkich etapach dializy stosunek buforu do próbki wynosił co najmniej 50. Procedura ta pozwoliła na otrzymanie roztworu stockowego w glicerolu zawierającego HTNCre w typowym stężeniu od 200 do 450 μM, co oznacza, że 1 litr hodowli ekspresyjnej daje ok. 12 mg białka. Pobrano próbkę roztworu stockowego w glicerolu (GS) do analizy SDS-PAGE. Roztwór stockowy HTNCre można przechowywać w temperaturze minus 20°C.</li>
</ol>
<img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="Wyniki elektroforezy oczyszczania białka, prążki żelowe, frakcje kolumnowe, analiza SDS-PAGE." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1: Analiza SDS-PAGE próbek pobranych podczas procesu oczyszczania rekombinazy Cre. Indukcję ekspresji Cre wskazuje dominujący prążek we frakcji lizatu. Mimo że część białka jest nierozpuszczalna, białko Cre można dalej wzbogacać, co widać w frakcjach eluatu i zapasu w glicerolu. L: lizat, I: frakcja nierozpuszczalna, S: supernatant, FT: przedział przepływowy, W: przemywanie, E: eluat, GS: zapas w glicerolu. Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny 1.
Transdukcja białka do murzych embrionalnych komórek macierzystych (ES):
<ol>
 <li>Komórki ES zawierające konstruktyw warunkowego reportera β-Galaktozydazy5 wysiano jako pojedyncze komórki, wykorzystując TrypLE™ Express do dysocjacji komórek adherentnych. Po 4 do 6 godzinach komórki ponownie przytwierdziły się do podłoża, a następnie usunięto medium.</li>
 <li>Następnie komórki ES inkubowano w medium zawierającym HTNCre przez 16 godzin.
 <ul>
 <li>Odpowiednią ilość białka HTNCre (odpowiadającą stężeniu 10 μM) z zapasu w glicerolu rozcieńczono w medium dla komórek ES, a następnie poddano filtracji sterylnej (0.22 μm).</li>
 </ul></li>
 <li>Po transdukcji białkiem zmieniono medium z powrotem na standardowe medium wzrostowe.</li>
 <li>Po dwóch dniach komórki przemyto PBS i utrwalono w 4% Paraformaldehydzie (PFA) przez 10 minut.</li>
 <li>Przed przystąpieniem do barwienia X-Gal wykonano dwa dodatkowe etapy płukania PBS.</li>
 <li>Utrwalone komórki przykryto warstwą roztworu barwiącego X-Gal6 i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Następnego dnia odessano roztwór barwiący X-Gal, a komórki przykryto warstwą PBS w celu przeprowadzenia analizy mikroskopowej. Na podstawie aktywności β-Galaktozydazy zaobserwowano, że od 80 do 100% komórek ES myszy uległo rekombinacji.

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li>
<li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl%2FTal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li>
</ol>

Podczas procesu oczyszczania białka fuzyjnego Cre ważne jest, aby nie pominąć dodania schłodzonego w lodzie&nbsp;buforu TBS przed wirowaniem. W przeciwnym razie rekombinaza Cre ma tendencję do wytrącania się w buforze glicerolowym.
Jeśli frakcja eluatu stanie się mętna z powodu wysokiego stężenia białka fuzyjnego, należy dodać dodatkowy bufor elucyjny, aż roztwór ponownie stanie się klarowny.
Zastosowanie 10 μM białka fuzyjnego Cre zazwyczaj skutkuje wydajnością rekombinacji na poziomie od 80 do 100%. Serum z płodu cielęcego (FCS), będące głównym składnikiem pożywki dla komórek ES, silnie hamuje transdukcję białek. W związku z tym konieczne było zastosowanie wysokiego stężenia rekombinazy Cre. W warunkach bezsurowiczych do osiągnięcia podobnej wydajności rekombinacji można zastosować mniejszą ilość białka (0,5 - 2 μM).
Wykorzystując system wektorowy pSESAME można zastosować technikę transdukcji białek w odniesieniu do innych białek, w tym czynników transkrypcyjnych, takich jak Oct4 i Sox27 oraz Scl/Tal18.

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypton/Pepton</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-winowy, sól sodowa (dwusodowa) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% zawiesina Ni-NTA</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>kolumny EconoPac</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Filtr sterylny 0,22 μm&amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka LB</td><td></td><td></td><td>Ekstrakt z drożdży, trypton/pepton, NaCl</td></tr><tr><td>podłoże TB</td><td></td><td></td><td>Ekstrakt z drożdży, Trypton/Pepton, Glicerol, K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Bufor do lizy</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 mM Tris, pH 7,8</td></tr><tr><td>Bufor z winianu sodu (TSB)</td><td></td><td></td><td>PTB zawierający 2 M kwas L-winowy, sól sodową oraz 20 mM imidazolu</td></tr><tr><td>Bufor płuczący</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM imidazol</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol</td></tr><tr><td>Bufor wysokosolny</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>Bufor glicerolowy</td><td></td><td></td><td>50% glicerolu, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Ekspresować</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>niepodstawowe aminokwasy egzogenne</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica z płodu cielęcego (FCS)</td><td>Laboratoria PAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór barwiący X-Gal:</td><td></td><td></td><td>4 mM K+&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;), 4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;),&lt;br/&gt;2mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 0,4 mg/ml X-Gal rozpuszczonego w PBS</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

Engineering Cell-permeable Protein

Technika transdukcji białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie aktywnego materiału do komórek ssaków [przegląd w 1,2]. Można w tym celu wykorzystać zdolność translokacyjną tzw. peptydów przenikających przez błony komórkowe (CPPs), określanych również jako domeny transdukcji białek (PTDs). Powszechnie stosowany jest TAT-CPP, pochodzący z białka Tat (trans-aktywator transkrypcji) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Dodatnio naładowany TAT zwiększa przepuszczalność komórkową, pokonując bariery błony komórkowej poprzez endocytozę i/lub bezpośrednie przenikanie przez błonę2. W połączeniu z sygnałem lokalizacji jądrowej (NLS) białka fuzyjne są w stanie wniknąć do jądra komórkowego, zachowując swoją funkcjonalność. Nasza prezentacja wideo demonstruje, jako przykład inżynierii białek przepuszczalnych przez błony komórkowe, konstrukcję, produkcję i zastosowanie wersji przepuszczalnej przez błony enzymu modyfikującego DNA — Cre.
Cre jest rekombinazą specyficzną dla miejsca, która jest zdolna do rozpoznawania i rekombinacji 34-par zasadowych miejsc loxP w komórkach ssaków in vitro oraz in vivo. W związku z tym system Cre/loxP jest szeroko stosowany do warunkowego indukowania mutacji w genomie żywych komórek3,4. Ograniczeniem jest jednak dostarczenie aktywnej rekombinazy Cre do komórek.
Opisujemy system wektorów pSESAME, który umożliwia bezpośrednią insercję genu zainteresowania i stanowi platformę do szybkiego klonowania różnych domen i znaczników stosowanych w wektorze w wygodny i ustandaryzowany sposób. Wykazano, że zmiana rozmieszczenia różnych znaczników modyfikuje właściwości biochemiczne białek fuzyjnych, co daje możliwość uzyskania wyższej wydajności i lepszej rozpuszczalności. Demonstrujemy, jak eksponować i oczyszczać rekombinowane białka przenikające przez błony komórkowe w komórkach i z komórek E. coli. Funkcjonalność rekombinowanego białka Cre zostaje ostatecznie zwalidowana w hodowli komórkowej poprzez ocenę jego wewnątrzkomórkowej aktywności rekombinazy.

Transdukcja białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie czynnych białek do komórek. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, takich jak transfekcja DNA czy transdukcja wirusowa, ten nieinwazyjny paradygmat pozwala na wysoce efektywną manipulację komórkową w sposób miareczkowalny, unikając toksyczności komórkowej oraz ryzyka transformacji onkogennej wynikającej z trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

Technika transdukcji białek umożliwia bezpośrednie dostarczanie biologicznie aktywnego materiału do komórek ssaków [przegląd patrz 1,2]. W tym celu można...

W ciągu ostatnich 15 lat manipulowanie funkcjami komórkowymi było możliwe dzięki klasycznym podejściom, takim jak transfekcja DNA lub transdukcja wirusowa. Wyewoluowała jednak kolejna metoda. Transdukcja białek pozwala na bezpośrednie dostarczenie biologicznie aktywnego białka do komórek ssaków przy użyciu małych peptydów połączonych z białkiem docelowym, co sprzyja jego pobraniu przez komórkę.Ponieważ nie wykorzystuje się DNA, zapobiega się ryzyku agenezy wywołanej przez czynnik zewnętrzny. W przeciwieństwie do wspomnianych wyżej metod klasycznych, transdukcja białek umożliwia dostarczanie białek w sposób mierzalny.Ponadto można modulować małe populacje komórek, jak i komórki niedzielące się, takie jak neurony pomitotyczne. W celu wydajnej ekspresji białka rekombinowanego zalecamy zastosowanie systemu wektorowego Paciz. Jest to modularny system wektorowy składający się z wariantu N-końcowego i C-końcowego.Oba wektory umożliwiają łatwą insercję genu zainteresowania w celu oczyszczania białka. Zintegrowano w nich znacznik histydynowy oraz domenę transdukcji białek. W naszym przypadku jest to domena z wirusa HIV, która wspomaga pobieranie komórkowe w celu dystrybucji wewnątrzkomórkowej.Sygnał lokalizacji jądrowej dopełnia wektor; ze względów kontrolnych tagi fuzyjne można po prostu usunąć. Ponadto układ tych tagów może mieć istotny wpływ na właściwości białek fuzyjnych. Wpływ na wydajność i czystość, a także na rozpuszczalność i funkcję biologiczną, nie jest przewidywalny.Witajcie, nazywam się Bernard Mus i pracuję w grupie Inżynierii Komórek Macierzystych w Instytucie Neurobiologii Rekonstrukcyjnej w Bonn, w Niemczech. Cześć, nazywam się Christoph P i również jestem członkiem laboratorium Hoovera. Nasza grupa badawcza intensywnie wykorzystuje technikę transdukcji białek do bezpośredniego wprowadzania biologicznie aktywnych białek do różnych komórek ssaków, a dzisiaj chcemy przeprowadzić Was przez proces ekspresji i oczyszczania białek w bakteriach e coli oraz z nich.Następnie chcielibyśmy pokazać, jak zastosować stałe białko fuzyjne w hodowli komórkowej, aby zilustrować całą procedurę: ekspresję, oczyszczanie i zastosowanie. Wykorzystujemy miejsce-specyficzną rekombinację Cree do modyfikacji genetycznej mysich komórek macierzystych onic. Dobrze. Zaczynajmy.Aby zaszczepić hodowlę nocną, wykorzystujemy uprzednio przekształcone bakterie przechowywane w zamrażarce z glicerolem w temperaturze -80°C. Bakterie te zawierają już wektor kodujący dla rekombinacji. Za pomocą końcówki pipety pobieramy niewielką ilość bakterii i przenosimy ją do naczynia zawierającego pożywkę do hodowli nocnej.Kultura nocna składa się z pożywki LB uzupełnionej glukozą do stężenia końcowego 0.5% oraz 50 µg insuliny carbonic na ml. Zlewkę umieszczono następnie w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu ekspresji specyficznej dla miejsca rekombinazy Cree. Do kultury ekspresyjnej w dużej skali stosujemy podgrzaną wcześniej pożywkę TB.Aby przyspieszyć ekspresję, zaleca się stosowanie pożywki TB ogrzanej do 37 °C, co odpowiada temperaturze podczas ekspresji rekombinowanego białka. Następnie do pożywki TB dodajemy glukozę do stężenia końcowego 0,5%. Glukoza zapobiega zwiększonej ekspresji podstawowej białka fuzyjnego podczas wzrostu kultury ekspresyjnej przed indukcją. Na koniec do kultury ekspresyjnej dodaje się ampicylinę do stężenia końcowego 100 µg/ml, aby zapewnić czystość kultury zawierającej wyłącznie bakterie, które nadal posiadają plazmid kodujący białko.Możemy teraz pobrać kulturę nocną i zaszczepić kulturę ekspresyjną w stosunku 1:50. Zlewki zostają następnie przeniesione do inkubatora ustawionego na temperaturę 37 °C. Należy regularnie pobierać próbki w celu pomiaru gęstości optycznej w trakcie procesu ekspresji.Gdy tylko kultura osiągnie gęstość optyczną 1,5, bakterie poddaje się indukcji końcową stężeniem 0,5 millimolar IPTG. Po jednej godzinie indukcji kulturę ekspresyjną przenosi się do probówek, a następnie zbiera za pomocą wirowania. W tym celu używamy rotora SLA 3000.Wirówkę ustawiono na prędkość 5 000 obr./min na 10 minut w temperaturze 4°C. Następnie odrzuca się nadsącz, a osad bakteryjny można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -20°C. Zamrożone osady resuspendsuje się w buforze Lizza, stosując objętość odpowiadającą jednemu litrowi hodowli ekspresyjnej.Używamy 10 ml buforu Lizza i czekamy około 15 minut, aż roztwór stanie się jednorodny. Następnie do każdego ml zawiesiny dodaje się jeden miligram lizozymu. Roztwór miesza się przez 20 minut, aby umożliwić enzymowi rozbicie bakterii.Następnie dodaje się Benzonase w rozcieńczeniu 1:1000 na kolejne 15 minut, co spowoduje rozcięcie DNA i uzyskanie roztworu o niskiej lepkości. Na koniec używa się sonikatora, aby zapewnić lizę komórek. Program jest uruchamiany na jedną i pół minuty przy mocy 45% po zakończeniu certyfikacji.Należy pamiętać o pobraniu próbki na każdym etapie, w postaci surowego lizatu lub do analizy SDS-PAGE procesu oczyszczania. Bardzo ważne jest teraz dodanie 1 ml lodowatego buforu TSB na każdy 1 mL zawiesiny, ponieważ białko w formie zdenaturowanej może mieć tendencję do wytrącania się w zapasach z glicerolem. Jeśli ten krok zostanie pominięty, roztwór należy krótko wymieszać, po czym surowy lizat jest gotowy do wirowania.W tym celu wykorzystujemy rotor SS 34. Wirówka pracuje z prędkością 17 000 RPM przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania supernatant ostrożnie przeniesiono do nowych probówek Falcon o pojemności 50 ml.Następnie do supernatantu należy dodać zawiesinę niklową Anti A. Anti A jest kluczowym odczynnikiem dla prawidłowego oczyszczania białek fuzyjnych z tagiem histydynowym. Histydyna tworzy kompleks z jonami niklu, co umożliwia oczyszczanie powinowactwa; teraz delikatnie wstrząsaj probówkami przez 60 minut w temperaturze 40 °C.Po upływie jednej godziny można nanieść zawiesinę na kolumny 20 ML i pozwolić roztworowi przepłynąć siłami grawitacji. W przypadku produkcji na dużą skalę możliwe jest rozdzielenie zawiesiny na kilka kolumn. Następnie kolumnę przemywamy dwukrotnie buforem zawierającym 15 millimolar innersole.Ilość naniesionego buforu zależy od objętości żywicy. Dwa ml niklu NTA odpowiadają jednemu ml żywicy w celu płukania. Po płukaniu nakładamy na kolumnę pięciokrotność objętości żywicy w buforze płuczącym, po czym jesteśmy gotowi do elucji białka.W związku z tym stosujemy bufor elucyjny o stężeniu 250 milimolarnożowym immuno. Zauważcie, jak kolor żywicy zmienia się na zielony. Ze względu na wysokie stężenia białka CRE, frakcja OID czasami staje się mętna.Aby temu zapobiec, wymieszaj roztwór i dodaj dodatkowy bufor lizujący; wszystkie frakcje są teraz łączone, a następnie przenoszone do probówki do lizy. Liza usunie ole; pierwszy etap dializy jest przeprowadzany przeciwko buforowi zawierającemu wysoką koncentrację soli. Po jednej godzinie bufor z wysoką zawartością soli zostaje wymieniony, a procedura dializy jest stosowana przez noc.Następnego dnia rurkę do dializy wyjmuje się z buforu o wysokim stężeniu soli i przenosi do buforu glicerolowego. Po trzech do pięciu godzinach bufor glicerolowy zostaje wymieniony i dializę przeprowadza się ponownie przez noc. Lizę w buforze glicerolowym uzyskamy w formie roztworu zapasu o co najmniej trzykrotnie zwiększonym stężeniu.Roztwór zapasowy można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka lat bez utraty aktywności. W celu zapewnienia kontroli jakości można nałożyć zebrane próbki do elektroforezy SDS-PAGE na żel, a następnie go zabarwić. W przypadku białka fuzyjnego Cree, jest ono wykrywalne jako wyraźny prążek w frakcji OID. Aby zastosować odpowiednie stężenie rekombinowanego białka Cree, należy określić jego stężenie za pomocą testu Redforda.Sposób wprowadzania trwałych białek do komórek ssaków. Przede wszystkim należy przygotować komórki docelowe, aby uzyskać najwyższą wydajność transdukcji białek. W przypadku komórek rosnących w formie zwartych kolonii, należy zasiać komórki w monowarstwie w gęstości, która zapewni 80 do 90% konfluencji warstwy komórkowej w dniu następnym.Oddziel komórki w sposób somatyczny i przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek na pięć godzin przed badaniem. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek przed transdukcją białka jest istotne, ponieważ w przeciwnym razie przetransdukowane zostaną jedynie komórki znajdujące się na powierzchni kolonii. Odessij medium i krótko obejrzyj komórki przy użyciu PPS przed rozpoczęciem obróbki.Usunąć pozostałe medium wzrostowe zawierające serum. Po odessaniu nakładki PPS opłukać komórki i pozostawić je do inkubacji przez trzy do pięciu minut. Następnie sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie kolonie zostały rozdzielone na pojedyncze komórki.Z powyższych powodów jest to kluczowy etap transdukcji białek do komórek drożdży. Przenieść oderwane komórki do probówki. Umieścić probówkę w wirówce i odwirować komórki, odessać nadsącz i resuspenderć komórki.W medium wzrostowym rozcieńczyć komórki do odpowiedniej liczby. Zależy to oczywiście od wielkości naczynia do hodowli tkankowej. Inkubować komórki w szalce przez dodatkowe pięć godzin.Zapewni to komórkom powietrznym wystarczająco dużo czasu na przytwierdzenie się do dna i wzrost adherentny. Zapasy z trzech rzędów klas można przechowywać w temperaturze -20 °C przez ponad dwa lata. Podczas pracy z rekombinowanym stałym białkiem fuzyjnym komórek, posiadanie takiego roztworu zapasu, który można wykorzystać na żądanie, jest bardzo korzystne.Podczas oczekiwania na przytwierdzenie komórek do naczynia, można przygotować medium do transdukcji, po prostu rozcieńczając odpowiednią objętość roztoku białka z zapasów w odpowiednim medium. Ponieważ roztwór zapasowy nie jest jeszcze sterylny, medium do transdukcji musi zostać poddane filtracji sterylizującej przed zastosowaniem. Zalecamy użycie strzykawki, którą można przykręcić do filtra wiążącego białka.Końcowe stężenie kompleksów creek zależy od typu komórek lub dodatków do pożywki. Na przykład surowica wywiera silny negatywny wpływ na wydajność transdukcji. Można temu przeciwdziałać, stosując pożywki bezsurowicze lub zwiększając stężenie kompleksów creek.Wyznaczamy optymalne warunki zapewniające najwyższą wydajność rekombinacji. Stężenia hydratu dobieramy w zakresie od 0,5 do 10 µM. Zalecamy przetestowanie różnych czasów inkubacji od 6 do 18 godzin.Po pięciu godzinach inkubacji wyjmij komórki docelowe i odessij medium transferowe. Następnie zastąp je medium do transdukcji białek i umieść komórki z powrotem w inkubatorze na noc. Następnie krótko przemyj komórki przy użyciu PPS i zmień medium do transdukcji białek na zwykłe medium ES.48 godzin po inkubacji komórek można wykryć trwałą ekspresję genu Cre za pomocą XUL. Barwienie komórek z pozytywnym fenotypem beta świadczy o pomyślnym poddaniu ich inżynierii genetycznej poprzez rekombinację specyficzną dla miejsca. Raport Cre.Komórki zawierają konstrukt Lae wykorzystujący CRE po rekombinacji zapośredniczonej przez pre. Wycięta zostaje sekwencja stop flankowana przez lock P, co aktywuje gen reporterowy luxe sterowany przez promotor team. Aby ocenić wydajność rekombinacji w uprzednio traktowanych komórkach reporterowych air, komórki muszą zostać utrwalone.Odssać medium, przemyć komórki dwukrotnie PBS, pokryć komórki 4% PFA i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć komórki ponownie trzykrotnie PBS. Po odsaniu PBS z ostatniego etapu mycia, dodać do dołków roztwór barwiący Xal i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 stopni w inkubatorze.Następnego dnia aktywność Beal można monitorować poprzez obecność niebieskich komórek. Wydajność rekombinacji można określić na podstawie liczby niebieskich kolonii. W optymalnych warunkach powinni Państwo być w stanie osiągnąć wydajność rekombinacji powyżej 90%. W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak ekskresjonować i oczyszczać specyficzną dla miejsca rekombinazę query z E. coli.W niniejszym badaniu dowodowym udało nam się zindukować rekombinację w większości soli. To wszystko. Powodzenia w Państwa eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowanie białka przenikającego przez komórkę

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Organiczny tranzystor elektrochemiczny jest zintegrowany z żywymi komórkami i służy do monitorowania przepływu jonów przez barierę nabłonkową przewodu pokarmowego. W tym badaniu mierzony jest wzrost strumienia jonów, związany z rozerwaniem połączeń ścisłych, wywołany obecnością chelatora wapnia EGTA (glikol etylenowy-bis(beta-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas).

Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Elektroporacja została użyta do wprowadzenia oczyszczonych bakteryjnych białek efektorowych wirulencji bezpośrednio do żywych komórek eukariotycznych. Lokalizację białek monitorowano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta pozwala na badania nad transportem, funkcją i interakcjami białko-białko przy użyciu aktywnych białek egzogennych, unikając potrzeby heterologicznej ekspresji w komórkach eukariotycznych.

Elektroporacja funkcjonalnych efektorów bakteryjnych w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Ten protokół opisuje techniki mikrofabrykacji wymagane do zbudowania urządzenia do elektroporacji mikroprzepływowej typu lab-on-a-chip. Konfiguracja eksperymentalna wykonuje kontrolowane transfekcje na poziomie pojedynczej komórki w ciągłym przepływie i może być rozszerzona do wyższych przepustowości dzięki kontroli populacyjnej. Przedstawiono analizę pokazującą możliwość elektrycznego monitorowania stopnia przepuszczalności błony komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wytwarzanie i działanie systemu mikroelektroporacji o ciągłym przepływie z detekcją przepuszczalności

Elektroporacja porowatego podłoża (PSEP) łączy spójne, wysokowydajne dostarczanie z wysoką żywotnością ogniw. Wprowadzenie pomiarów transnabłonkowej impedancji elektrycznej (TEEI) zapewnia wgląd w pośrednie procesy PSEP i pozwala na dostarczanie bez etykietowania. W tym artykule omówiono metodę jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów z dostarczaniem PSEP i analizy pomiarów TEEI.

Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Poznaj metodę translokacji białek do komórek ssaków jako alternatywę dla transfekcji DNA. Technika ta umożliwia bezpieczną manipulację komórkową bez ryzyka trwałej modyfikacji genetycznej.

Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

Przeglądaj więcej filmów