Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne wyekstrahowanie białek z zastawki mitralnej serca człowieka, nadających się do analizy proteomicznej. Metoda ta może potencjalnie pomóc w odkryciu mechanizmów patogennych w dziedzinie chorób zastawek serca, umożliwiając identyfikację nowych markerów diagnostycznych i prognostycznych chorób oraz, miejmy nadzieję, celów terapeutycznych. Główną zaletą tego protokołu jest to, że zapewnia wydajny przepływ pracy ekstrakcji kompatybilny z wieloma aplikacjami analitycznymi.

Wynikiem jest bardziej wyczerpująca charakterystyka proteum zastawki mitralnej serca. Co więcej, protokół ten można również zastosować do innych systemów, takich jak zastawka mitralna świni, która jest bardzo podobna do zastawki ludzkiej i jest wykorzystywana w modelu eksperymentalnym do oceny funkcji zastawki. Eksperymentalną procedurę zademonstruje Stefania Ghilardi, technik z mojego laboratorium.

Aby przygotować ludzką zastawkę mitralną, zacznij od eksplantowanego serca, które było w zimnym niedokrwieniu przez cztery do 12 godzin. W pomieszczeniu czystym wyjmij serce z torby transportowej i włóż je do wysterylizowanego wiadra. Następnie przenieś serce do szafki bezpieczeństwa biologicznego.

Tam, za pomocą jednorazowego skalpela, naciąć prostopadle do głównej osi na poziomie lewej i prawej komory, około czterech centymetrów od wierzchołka. Następnie umieść serce na sterylnym serwecie. Następnie odsuń na bok aortę wstępującą i tętnicę płucną, aby uzyskać dostęp do dachu lewego przedsionka.

Na lewym dachu przedsionkowym użyj kleszczyków i kilofów, aby przeciąć wokół lewej małżowiny usznej, aby odsłonić zastawkę mitralną. Zastawka mitralna jest w całości zawarta w lewej komorze. W ten sposób odsłoń dużą płatek mitralny i mały płatek mitralny.

Spoidła przednio-boczne i tylno-przyśrodkowe wyznaczają granicę obszaru przedniego i tylnego. Teraz za pomocą nożyczek i nieurazowych kleszczy rozetnij lewy przedsionek i grubość ściany komory otaczającej zastawkę mitralną. Podczas tej sekcji zidentyfikuj ciągłość zastawki mitralnej aortalnej.

Następnie oddziel przednią płatkę zastawki mitralnej od tylnej płatki zastawki mitralnej, przecinając wzdłuż spoidła otaczającego tylną płatkę. Po zakończeniu procedury zdezynfekuj stół szafki 70% roztworem alkoholu izopropylowego i 6% roztworem nadtlenku wodoru. Teraz umyj tylną ulotkę zastawki mitralnej w soli fizjologicznej.

Następnie pokrój zawór na małe kawałki, każdy mniejszy niż centymetr kwadratowy. Zawiń kawałki pojedynczo w folię aluminiową i zatrzaskowo zamroź je ciekłym azotem. Aby rozpocząć ekstrakcję białka, użyj kleszczyków, aby usunąć próbkę z ciekłego azotu i natychmiast umieść ją na suchym lodzie.

Nie dopuścić do rozmrożenia próbki. Następnie w kolbie Dewara wypełnionej ciekłym azotem umieść moździerz, związane z nim tłuczki i próbkę. Bardzo ważne jest, aby ciekły azot był używany do zamrażania próbki i schładzania systemu rozdrabniania.

Ten etap zapobiega degradacji biologicznej i pozwala na efektywne proszkowanie, ale wymaga przeszkolenia technicznego w zakresie bezpiecznej obsługi. Po błyskawicznym zamrożeniu włóż moździerz i tłuczki do styropianowego pudełka zawierającego suchy lód. Połóż również szpatułkę na suchym lodzie.

Następnie usuń próbkę z folii i załaduj ją do zaprawy. I umieść nad nim większy tłuczek. Za pomocą śrubokręta obróć tłuczek, zmiel próbkę od 15 do 20 razy.

Podczas mielenia wymieszać próbkę z końcówką schłodzonej szpatułki. Po użyciu dużego tłuczka powtórz proces mielenia mniejszym tłuczkiem. Uzyskanie drobnego proszku ma kluczowe znaczenie dla wydajnej ekstrakcji białek.

Teraz wrzuć sproszkowaną próbkę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej o znanej masie. Następnie wstrzyknij pozostały materiał do zaprawy za pomocą zimnej szpatułki. Trzymaj probówkę z próbką na suchym lodzie i szybko określ masę próbki.

Następnie wrzuć próbkę do szklanej probówki homogenizatora. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu mocznikowego na każde 10 miligramów próbki. W ten sposób należy odzyskać pozostałości pozostawione w probówce, wypłukując je podwielokrotnością buforu mocznikowego.

Następnie homogenizować próbkę za pomocą zmotoryzowanego tłuczka PFTE pracującego z prędkością 1 500 obr./min. Powoli dociśnij tłuczek do próbki ruchem obrotowym 10 razy. Następnie przenieś lepki żółty supernatant do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra za pomocą szklanej pipety.

Teraz powtórzyć homogenizację na pozostałej próbce, używając o połowę mniej mocznika. Odzyskaj supernatant i połącz go z poprzednią kolekcją. Następnie umieść probówkę na rotatorze rurki na 30 minut.

Po 30 minutach załadować probówkę do zimnej wirówki i wirować próbkę o masie 13 000 G przez pół godziny. Następnie odzyskaj supernatant. I zmierz stężenie białka za pomocą testu białka Bradforda.

Po wykonaniu przepisanego protokołu, ekstrakt białkowy został przebadany przy użyciu różnych metod po kilku dodatkowych zabiegach. W sumie 422 białka zidentyfikowano w tkance zastawki mitralnej za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy, ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej, chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i chromatografii cieczowej 2D ze spektrometrią mas. 422 białka sklasyfikowano za pomocą analizy ontologii genów.

Regiony zewnątrzkomórkowe zawierały kilka oczekiwanych białek i innych białek wewnątrzkomórkowych i powierzchniowych komórek. Wiele z nich zidentyfikowano po raz pierwszy w zastawkach mitralnych. Obecność czterech takich białek, które nie zostały wcześniej zidentyfikowane w zastawkach mitralnych, została potwierdzona przeciwciałami w trzech unikalnych próbkach.

Białka to Septyna-11, cztery i pół domeny LIM, białko jeden, Dermatoponina i alfa krystaliczna B. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić białka z zastawki mitralnej serca w celu ich identyfikacji i kwantyfikacji. Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu prawie dwóch godzin, jeśli zostanie prawidłowo wykonany. Podczas wykonywania tej procedury, aby uzyskać jak największą wydajność białek o wysokiej integralności białkowej, ważne jest, aby próbki nie rozmrażały się podczas żadnego z transferów.