Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywna ekstrakcja białek z ludzkiej zastawki mitralnej serca, odpowiednia do analiz proteomicznych. Metoda ta może potencjalnie pomóc w odkryciu mechanizmów patogennych w obszarze chorób zastawek serca, umożliwiając identyfikację nowych diagnostycznych i prognostycznych markerów chorobowych, a w nadziei również celów terapeutycznych. Główną zaletą niniejszego protokołu jest zapewnienie efektywnego schematu ekstrakcji, który jest kompatybilny z wieloma zastosowaniami analitycznymi.

Wyniki stanowią bardziej wyczerpującą charakterystykę proteomu zastawki mitralnej serca. Ponadto protokół ten można zastosować do innych układów, takich jak zastawka mitralna świni, która wykazuje duże podobieństwo do zastawki ludzkiej i jest wykorzystywana w modelach eksperymentalnych do oceny funkcji zastawek. Procedurę eksperymentalną zaprezentuje Stefania Ghilardi, technik z mojego laboratorium.

Aby przygotować ludzką zastawkę mitralną, należy rozpocząć od wycięcia serca, które znajdowało się w stanie zimnego niedokrwienia przez okres od 4 do 12 godzin. W pomieszczeniu typu Cleanroom należy wyjąć serce z torby transportowej i umieścić je w sterylnym wiadrze. Następnie serce należy przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza

Następnie, używając jednorazowego skalpela, wykonaj cięcie prostopadle do osi głównej na wysokości lewej i prawej komory, około czterech centymetrów od wierzchołka. Po tym czasie połóż serce na sterylnej serwetce. Następnie odsuń aortę wstępującą oraz tętnicę płucną, aby uzyskać dostęp do sklepienia lewego przedsionka.

Na sklepieniu lewego przedsionka, używając pęsety i zgłębnika, należy wyciąć obszar wokół lewego uszka przedsionka, aby odsłonić zastawkę mitralną. Zastawka mitralna znajduje się w całości w lewej komorze. W związku z tym należy odsłonić przedni płatek zastawki mitralnej oraz tylny płatek zastawki mitralnej.

Przednio-boczne i tylno-przyśrodkowe spoidła wyznaczają granicę obszaru przedniego i tylnego. Następnie, za pomocą nożyczek i nieurazowych pincek, przeprowadź preparację lewego przedsionka oraz grubości ściany komory otaczającej zastawkę mitralną. Podczas tej preparacji zidentyfikuj ciągłość zastawki mitralnej i aortalnej.

Następnie oddziel przedni płatek zastawki mitralnej od tylnego płatka zastawki mitralnej, przecinając wzdłuż komisur ograniczających płatek tylny. Po zakończeniu procedury zdezynfekuj blat szafki roztworem 70% isopropyl alcohol oraz roztworem 6% hydrogen peroxide. Teraz przemyj tylny płatek zastawki mitralnej w soli fizjologicznej.

Następnie potnij zastawkę na małe fragmenty, każdy o powierzchni mniejszej niż 1 cm². Każdy fragment zawiń osobno w folię aluminiową i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie. Aby rozpocząć ekstrakcję białek, za pomocą pęsety wyjmij próbkę z ciekłego azotu i natychmiast umieść ją na suchym lodzie.

Nie dopuszczać do rozmrożenia próbki. Następnie do naczynia typu dewar wypełnionego ciekłym azotem należy włożyć moździerz, dopasowane tłuczki oraz próbkę. Kluczowe jest wykorzystanie ciekłego azotu do zamrożenia próbki oraz schłodzenia systemu rozcierającego.

Krok ten zapobiega degradacji biologicznej i umożliwia efektywne rozdrobnienie w proszek, lecz wymaga przeszkolenia technicznego w zakresie bezpiecznego obchodzenia się z materiałem. Po błyskawicznym zamrożeniu należy umieścić moździerz i tłuczki w pojemniku polistyrenowym z suchym lodem. Na suchym lodzie należy również położyć szpatułkę.

Następnie należy wyjąć próbkę z folii i umieścić ją w moździerzu, a nad nią ustawić większy tłuczek. Obracając tłuczek za pomocą śrubokręta, należy rozetrzeć próbkę od 15 do 20 razy.

Podczas ucierania należy mieszać próbkę końcówką schłodzonej szpatułki. Po użyciu dużego tłuczka powtórzyć proces ucierania za pomocą mniejszego tłuczka. Uzyskanie drobnego proszku jest kluczowe dla efektywnej ekstrakcji białek.

Następnie przesyp próbkę w proszku do probówki wirówkowej o objętości 15 ml o znanej masie. Pozostały materiał zgarnij do probówki za pomocą zimnej szpatułki. Próbkę w probówce przechowuj na suchym lodzie i szybko określ jej masę.

Następnie przelej próbkę do szklanej rurki homogenizatora. Potem dodaj 200 µL buforu mocznikowego na każde 10 mg próbki. Podczas tej czynności odzyskaj pozostałości pozostałe w rurce, wypłukując je alikwotem buforu mocznikowego.

Następnie należy zhomogenizować próbkę za pomocą zmotorizowanego tłuczka z PTFE obracającego się z prędkością 1 500 rpm. Powoli dociskać tłuczek do próbki, wykonując 10 ruchów obrotowych. Następnie przenieść lepki, żółty supernatant do czystej probówki do wirowania o pojemności 1,7 mililitra, używając pipety szklanej.

Następnie powtórz homogenizację pozostałej próbki, stosując połowę ilości mocznika. Odzyskaj nadsącz i połącz go z poprzednią porcją. Potem umieść probówkę w rotatorze do probówek na 30 minut.

Po 30 minutach umieść probówkę w zimnej wirówce i odwiruj próbkę z prędkością 13 000 G przez pół godziny. Następnie pobierz supernatant. Stężenie białka zmierz za pomocą metody Bradforda.

Po przeprowadzeniu opisanego protokołu ekstrakt białkowy poddano badaniu z wykorzystaniem różnych metod po zastosowaniu dodatkowych zabiegów. Łącznie 422 białka w tkance zastawki mitralnej zidentyfikowano za pomocą elektroforezy dwuwymiarowej, izoelektrowania w fazie ciekłej, chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas oraz dwuwymiarowej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. 422 białka sklasyfikowano przy użyciu analizy Gene Ontology.

Regiony zewnątrzkomórkowe zawierały kilka oczekiwanych białek oraz inne białka wewnątrzkomórkowe i białka powierzchni komórkowych. Wiele z nich zidentyfikowano po raz pierwszy w zastawkach mitralnych. Obecność czterech takich białek, których wcześniej nie zidentyfikowano w zastawkach mitralnych, została potwierdzona za pomocą przeciwciał w trzech unikalnych próbkach.

Białka to Septin-11, białko z czterema i pół domenami LIM 1, Dermatoponina oraz alfa-krystalina B. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekstrahować białka z zastawki mitralnej serca w celu ich identyfikacji i kwantyfikacji. Po opanowaniu techniki protokół ten można zrealizować w niemal dwie godziny, jeśli jest przeprowadzany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury, aby uzyskać najwyższą wydajność białek przy zachowaniu ich wysokiej integralności, kluczowe jest, aby próbki nie rozmroziły się podczas żadnego z etapów przenoszenia.