Name: Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej do analiz proteomicznych. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych markerów diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach zastawkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Włoskie Ministerstwo Zdrowia wsparło to badanie (RC 2013-BIO 15). Dziękujemy Barbarze Micheli za doskonałą pomoc techniczną.

W tym protokole, ludzkie serca są pobierane podczas eksplantacji wielonarządowej (czas zimnego niedokrwienia 4-12 h, średnio 6 ± 2 h) od dawców wielonarządowych wykluczonych z transplantacji narządów z przyczyn technicznych lub funkcjonalnych, pomimo normalnych parametrów echokardiograficznych. Są one wysyłane do Banku Tkanek Sercowo-Naczyniowych w Mediolanie, Centrum Kardiologicznego Monzino (Mediolan, Włochy) w celu bankowania zastawek aortalnych i płucnych. Płatki zastawki mitralnej tylnej nie są wykorzystywane do celów klinicznych, dlatego pobiera się je podczas izolacji zastawki aortalnej i płucnej po uzyskaniu świadomej zgody krewnych dawców. Tkanki do przeszczepu i badań są pobierane wyłącznie za zgodą rodziców; w karcie zgody, zezwalają (lub nie) na wykorzystanie tkanki serca do badań tylko wtedy, gdy nie nadaje się ona do użytku klinicznego u ludzi (tj. problemy mikrobiologiczne, funkcjonalne i serologiczne), zgodnie z wytycznymi komisji etycznej Centrum Kardiologicznego Monzino.
1. Przygotowanie zastawki mitralnej
<ol>
	<li>Zbierz ludzką zastawkę mitralną tak szybko, jak to możliwe po eksplantacji narządów (czas zimnego niedokrwienia 4-12 godzin).</li>
	<li>W pomieszczeniu czystym wyjąć serce z torby transportowej zawierającej zimny (4 °C) roztwór (tj. roztwór soli fizjologicznej lub zbilansowane podłoże Eurocollins lub Wisconsin). Włóż go do wiadra i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego (pionowy przepływ powietrza o zagrożeniu biologicznym, klasa A, klasyfikacja Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP)), aby przystąpić do przygotowania zaworu.</li>
	<li>Umieść serce na sterylnej jednorazowej serwety w szafce. Za pomocą sterylnego jednorazowego skalpela należy przeciąć serce całkowicie, prostopadle do jego osi głównej, na poziomie lewej i prawej komory, w odległości około 4 cm od wierzchołka.</li>
	<li>Przesuń aortę wstępującą i tętnicę płucną, aby wyświetlić dach lewego przedsionka.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczyków i kilofów, które można sterylizować w autoklawie, przeciąć wokół lewej małżowiny usznej na lewym dachu przedsionka, uwidaczniając zastawkę mitralną i umożliwiając identyfikację dużej płatka mitralnego (przedniej) i małej płatka mitralnego (tylnej). 
	UWAGA: Spoidła przednio-boczne i tylne przyśrodkowe wyznaczają granicę przedniego płatka i tylnego obszaru.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych nożyczek do sterylizacji w autoklawie i nieurazowych kleszczy należy rozciąć lewy przedsionek i grubość ściany komory na całym obwodzie całej zastawki mitralnej.</li>
	<li>Zidentyfikuj ciągłość mitro-aortalnej zastawki. 
	UWAGA: Lewa komora zawiera całą zastawkę mitralną i cięciwy.</li>
	<li>Oddziel przednią płatkę zastawki mitralnej od tylnej płatki zastawki mitralnej, przecinając tylną płatkę wzdłuż przyczepu z komorą (spoidło).</li>
	<li>Umyj tylną ulotkę w roztworze soli fizjologicznej. Pokrój ulotkę na małe kawałki (<1 cm2) i pojedynczo zawiń je w folię aluminiową. Zamroź je ciekłym azotem. 
	Ostrzeżenie: Podczas korzystania z ciekłego azotu należy przestrzegać organizacyjnych procedur bezpieczeństwa.
	<ol>
		<li>Pod koniec zabiegu zdezynfekuj stół szafki 70% roztworem alkoholu izopropylowego i 6% roztworem nadtlenku wodoru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś próbkę przechowywaną w ciekłym azocie i natychmiast umieść ją na suchym lodzie, nadal owinięta w folię aluminiową. Nie pozostawiać próbki do rozmrożenia podczas przenoszenia.</li>
	<li>Przed mieleniem schłodzić moździerz porcelanowo-cyrkonowy i tłuczki systemu młynka (np. CryoGrinder) wraz z próbką, umieszczając je w kolbie Dewara zawierającej ciekły azot (~500 ml). 
	Ostrzeżenie: Podczas korzystania z ciekłego azotu należy przestrzegać organizacyjnych procedur bezpieczeństwa.</li>
	<li>Umieść moździerz i tłuczki w styropianowym pudełku zawierającym suchy lód. Wyjmij próbkę z folii aluminiowej i włóż ją do moździerza.</li>
	<li>Zmiel próbkę dużym tłuczkiem o moździerz 15-20 razy, używając śrubokręta do obracania tłuczka. Wymieszać próbkę z końcówką wstępnie schłodzonej szpatułki podczas procesu mielenia.
	<ol>
		<li>Powtórz z małym tłuczkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś zmieloną próbkę do wcześniej zważonej probówki (np. probówki wirówkowej o pojemności 15 ml), odwracając probówkę, umieszczając ją nad zaprawą i odwracając je razem, aby przenieść próbkę do probówki. Użyj wstępnie schłodzonej szpatułki, aby odzyskać cały materiał z zaprawy.
	<ol>
		<li>Probówkę z próbką należy przechowywać na suchym lodzie, aby uniknąć rozmrożenia próbki podczas przenoszenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć masę netto próbki.</li>
	<li>Oczyścić moździerz i tłuczki po każdej próbce i odkazić je poprzez autoklawowanie lub podgrzewanie w temperaturze 200 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Przenieść sproszkowaną próbkę z probówki wirówkowej do szklanej probówki homogenizatora przez odwrócenie.</li>
	<li>Dodać przefiltrowany bufor mocznikowy (8 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% w/v CHAPS, 20 mM Tris i 55 mM ditiotreitol) do szklanej probówki, 200 μl buforu mocznikowego na każde 10 mg sproszkowanej tkanki. 
	UWAGA: Pozostałą sproszkowaną próbkę pozostawioną w probówce wirówkowej można odzyskać, wykorzystując część obliczonej objętości buforu mocznikowego.</li>
	<li>Homogenizować próbkę za pomocą mieszadła wyposażonego w moździerz ze szkła borokrzemianowego i tłuczek z politetrafluoroetylenu (PTFE). Powoli dociśnij tłuczek do próbki ruchem obrotowym (1 500 obr./min) 10 razy.</li>
	<li>Odzyskać supernatant i przenieść go do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml. Ponownie ekstrahować pozostałą próbkę świeżym buforem mocznikowym, dodając połowę objętości użytej podczas pierwszej ekstrakcji.</li>
	<li>Powtórz krok 2.10.</li>
	<li>Odzyskać supernatant i połączyć go z supernatantem z kroku 2.11. Umieścić połączony supernatant na rotatorze probówkowym na 30 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę przez 30 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odzyskać supernatant i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu białkowego Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).</li>
<li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).</li>
<li>Hanash, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12634796">Disease proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).</li>
<li>Ahram, M., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19578516">Proteomics Discovery of Disease Biomarkers.</a> Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).</li>
<li>Chandramouli, K., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+challenges%2C+techniques+and+possibilities+to+overcome+biological+sample+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genomics+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity.</a> Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).</li>
<li>Singleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+bioanalytical+sample+preparation+for+LC-MS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis.</a> Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).</li>
<li>Williams, T. H., Jew, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+mitral+valve+passive+flap+theory+overstated%3F+An+active+valve+is+hypothesized%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized.</a> Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).</li>
<li>Rabkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+interstitial+myofibroblasts+express+catabolic+enzymes+and+mediate+matrix+remodeling+in+myxomatous+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves.</a> Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).</li>
<li>Martins Cde, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mitral+valve+proteomic+profiles+in+rheumatic+heart+disease+and+myxomatous+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Med+Insights+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration.</a> Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).</li>
<li>Tan, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+proteome+of+degenerative+human+mitral+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves.</a> Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).</li>
<li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+of+platelets+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Proteome of platelets in patients with coronary artery disease.</a> Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).</li>
<li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+human+low-density+lipoprotein+reveals+the+presence+of+prenylcysteine+lyase%2C+a+hydrogen+peroxide-generating+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme.</a> Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+density+lipoprotein-mediated+signal+transduction+and+plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cultured+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells.</a> Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).</li>
<li>Brioschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+mitral+valve+proteome%3A+A+preliminary+investigation+by+gel-based+and+gel-free+proteomic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches.</a> Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).</li>
<li>Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+endothelial+cell+secretome%3A+a+means+of+studying+the+pleiotropic+effects+of+Hmg-CoA+reductase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors.</a> J Proteomics. 78, 346-361 (2013).</li>
<li>Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+carbamylation+in+urea+solution+using+ammonium-containing+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers.</a> Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).</li>
<li>Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+solubilization+of+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis+with+immobilized+pH+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).</li>
<li>Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+and+proteomics%3A+un+amour+impossible%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?</a> Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment%3A+application+to+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).</li>
<li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).</li>
<li>Mann, M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+proteomics%3A+the+case+for+high+resolution+and+high+mass+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).</li>
<li>Thakur, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+highly+sensitive+proteome+coverage+by+LC-MS%2FMS+without+prefractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).</li>
<li>Loardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+mitral+valve+prolapse%3A+the+harvest+is+big%2C+but+the+workers+are+few%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few.</a> Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+cardiac+valve+dynamics%3A+the+continuum+of+development%2C+functional+structure%2C+pathobiology%2C+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering.</a> Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).</li>
<li>Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomic+and+physiologic+overview+of+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z krytycznych etapów tego protokołu jest użycie ciekłego azotu do zamrożenia próbki i schłodzenia systemu mielenia. Stosowanie ciekłego azotu zapobiega degradacji biologicznej i pozwala na efektywne sproszkowanie, ale wymaga specjalnego przeszkolenia w zakresie bezpiecznej obsługi.
W tym protokole zastosowano system młynka do mielenia próbek, ponieważ małe próbki są trudne do odzyskania ze standardowego moździerza i tłuczków. W tym przypadku małe próbki rozprowadzają się w postaci drobn...

Ostatnie dowody zmieniły rozumienie ról wielu mechanizmów regulacyjnych, które zachodzą po syntezie mRNA. Rzeczywiście, procesy translacyjne, potranskrypcyjne i proteolityczne mogą regulować obfitość i funkcję białek. Dogmat – który mówi, że stężenia mRNA są wskaźnikami zastępczymi odpowiednich białek, zakładając, że poziomy transkryptów są głównym wyznacznikiem obfitości białek – został częściowo zrewidowany. Rzeczywiście, poziomy transkryptów tylko częściowo przewidują obfitość białek, co sugeruje, że zdarzenia potranskrypcyjne zachodzą w celu regulacji białek w komórkach1,2.
Ponadto, białka ostatecznie dyktują funkcję komórki, a tym samym dyktują jej fenotyp, który może ulegać dynamicznym zmianom w odpowiedzi na czynniki autokrynne, parakrynne i endokrynne, mediatory przenoszone przez krew, temperaturę, leczenie farmakologiczne i rozwój choroby. W związku z tym analiza ekspresji skoncentrowana na poziomie białka jest przydatna do scharakteryzowania proteomu i rozwikłania krytycznych zmian, które zachodzą w nim w ramach patogenezy choroby3.
Dlatego możliwości, jakie stwarza proteomika w celu wyjaśnienia warunków zdrowotnych i chorobowych, są ogromne, pomimo istniejących wyzwań technologicznych. Szczególnie obiecujące obszary badań, do których może przyczynić się proteomika, obejmują: identyfikację zmienionej ekspresji białek na dowolnym poziomie (tj. całych komórek lub tkanek, przedziałów subkomórkowych i płynów biologicznych); identyfikację, weryfikację i walidację nowych biomarkerów przydatnych w diagnozowaniu i prognozowaniu choroby; oraz, miejmy nadzieję, identyfikacja nowych celów białkowych, które mogą być wykorzystane do celów terapeutycznych, a także do oceny skuteczności i toksyczności leków4.
Uchwycenie złożoności proteomu stanowi wyzwanie technologiczne. Obecne narzędzia proteomiczne dają możliwość przeprowadzania wielkoskalowych, wysokoprzepustowych analiz w celu identyfikacji, kwantyfikacji i walidacji zmienionych poziomów białek. Ponadto wprowadzenie technik frakcjonowania i wzbogacania, mających na celu uniknięcie zakłóceń powodowanych przez białka najliczniej występujące, również poprawiło identyfikację białek poprzez włączenie białek najobficiej występujących. Wreszcie, proteomika została uzupełniona o analizę modyfikacji potranslacyjnych, które stopniowo stają się ważnymi modulatorami funkcji białek.
Jednak przygotowanie próbki i odzyskiwanie białek w analizowanych próbkach biologicznych nadal pozostaje etapem ograniczającym w przepływie pracy proteomicznej i zwiększa potencjał możliwych pułapek5. Rzeczywiście, w większości technik biologii molekularnej, które muszą zostać zoptymalizowane, pierwszymi krokami są homogenizacja tkanek i liza komórek, zwłaszcza podczas analizy białek o niskiej liczebności, dla których nie istnieją metody amplifikacji. Ponadto chemiczna natura białek może wpływać na ich własną regenerację. Na przykład analiza białek o wysokiej hydrofobowości jest bardzo trudna, ponieważ łatwo wytrącają się one podczas ogniskowania izoelektrycznego, podczas gdy białka transbłonowe są prawie nierozpuszczalne (przegląd w Piśmiennictwie 5). Co więcej, zmienność składu tkanek stanowi istotną barierę dla opracowania uniwersalnej metody ekstrakcji. Wreszcie, ponieważ prawie wszystkie próbki kliniczne mają ograniczoną ilość, konieczne jest umożliwienie przygotowania białka z maksymalnym odzyskiem i odtwarzalnością przy minimalnych ilościach próbki6.
Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół ekstrakcji białka z normalnej ludzkiej zastawki mitralnej serca, która stanowi bardzo trudną próbkę do analizy proteomicznej. Prawidłowa zastawka mitralna jest złożoną strukturą leżącą między lewym przedsionkiem a lewą komorą serca (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1). Odgrywa ważną rolę w kontroli przepływu krwi z przedsionka do komory, zapobiegając cofaniu się i zapewniając prawidłowy poziom dopływu tlenu do całego organizmu, utrzymując tym samym odpowiedni rzut serca. Jednak często uważa się, że jest to tkanka "nieaktywna", o niskiej komórkowości i niewielu składnikach, głównie w macierzy zewnątrzkomórkowej. Dzieje się tak, ponieważ w normalnych warunkach rezydentne zastawkowe komórki śródmiąższowe (VIC) prezentują fenotyp spoczynkowy o niskim tempie biosyntezy białek7.
Wykazano jednak, że w stanie patologicznym liczba VIC w gąbczastym wzrasta i aktywowana jest ich synteza białek, wraz z innymi zmianami funkcjonalnymi i fenotypowymi8. Nic więc dziwnego, że minimalne dane dostępne w literaturze koncentrują się na analizie patologicznych zastawek mitralnych 9,10, w których zwiększona liczba aktywowanych VIC może wyjaśniać stosunkowo dużą liczbę zidentyfikowanych białek.
Podsumowując, obecny protokół może służyć do pogłębienia zrozumienia mechanizmów patogennych odpowiedzialnych za choroby zastawki mitralnej poprzez badanie składników białkowych zastawki mitralnej. Rzeczywiście, lepsze zrozumienie leżących u podstaw procesów patologicznych może pomóc w poprawie leczenia klinicznego chorób zastawek, których obecne wskazania do interwencji są w dużej mierze oparte na rozważaniach hemodynamicznych.

<table><tbody><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> soli <td>fizjologicznej 0,9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>Zrównoważona pożywka transportowa narządu. Połączyć 400 ml Eurocollins A ze 100 ml Eurocollins B, aby uzyskać zrównoważoną pożywkę Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>Zrównoważona pożywka transportowa narządów. Połącz 400 ml Eurocollins A ze 100 ml Eurocollins B, aby uzyskać zrównoważoną pożywkę Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Żywotność mostka</td><td>RM/N 4081</td><td>Zrównoważone podłoże do transportu narządów</td></tr><tr><td>Zagrożenie biologiczne przepływ pionowy powietrza</td><td>Burdinola</td><td></td><td>klasa A Klasyfikacja GMP Dewar</td></tr><tr><td>Flask</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>System kriomłynka</td><td>Diagnostyka OPS</td><td>CG 08-01</td><td>System młynka zawierający moździerze, tłuczki i śrubokręt</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>ze stali</tr><tr><td>nierdzewnej Szpatułka</td><td></td><td></td><td></td>ze stali nierdzewnej</tr><tr><td>Jednorazowy sterylny skalpel</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td> ze stali nierdzewnej <td>Autoklawowalne</td></tr><tr><td>Wykitiery</td><td></td><td></td> ze stali nierdzewnej <td>Autoklawowalne</td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna serwetka</td><td>Mon& Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór sterylizujący z alkoholem</td><td></td><td></td> izopropylowym <td>70% alkohol izopropylowy</td></tr><tr><td>Roztwór sterylizujący z nadtlenkiem</td><td></td><td></td> wodoru <td>6% Nadtlenek wodoru</td></tr><tr><td>Mikropipeta, 1 mL, z końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml</td><td>VWR International</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> mocznikowy <td>8 M mocznik, 2 M tiomocznik, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Ditiotreitol</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>Do stosowania jako Bufor mocznikowy</td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma aldrich</td><td>T8656</td><td>Do stosowania jako Bufor mocznikowy</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma aldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>Do stosowania jako Bufor mocznikowy</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>Do stosowania do buforu mocznikowego</td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td></td><td></td><td>Do stosowania do filtrowania buforu mocznika</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Do stosowania do filtrowania Bufor mocznikowy</td></tr><tr><td>PFTE Tłuczek, 2 ml</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Część homogenizatora Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Moździerz ze szkła borokrzemianowego</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Część homogenizatora Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>VELP scientifica</td><td>Mieszadło DLH</td><td>Do stosowania do homogenizacji metodą Potter-Elvehjem</td></tr><tr><td>Bradford Test białka</td><td>Laboratoria Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folia</td><td></td><td></td><td></td>aluminiowa</tr><tr><td>Lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pudełko</td><td></td><td></td><td></td>polistyrenowe</tr><tr><td>Wirówka</td> do suchego lodu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Do wirowania probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml przy 13 000 x g</td></tr><tr><td>Zamrażarka -80&deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wagi</td><td></td><td></td><td></td>precyzyjnej</tr> Do sterylizacji <tr><td>Rękawice kriogeniczne do ciekłego azotu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profesjonalna wentylacja wymuszona i piec</td><td></td><td></td> konwekcyjny z naturalnym powietrzem <td>Do sterylizacji</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitora proteazy</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X roztwór</td></tr><tr><td>Zestaw do wytrącania białek ProteoExtract</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>wersja 2.7</td><td>Platforma oprogramowania do analizy ontologii genów</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>wersja 3.0.3</td><td>Wtyczka do analizy ontologii genów</td></tr><tr><td>Przeciwciało AlphaB Crystallin/CRYAB</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko</td></tr><tr><td>przeciwciału CryAB Septin-11</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko septynie-11</td></tr><tr><td>Przeciwciało FHL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko przeciwciału Dermatopontyny FHL-1</td></tr><tr><td></td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko dermatopontynie</td></tr><tr><td>Koza Anty mysie IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0,5ML</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Koza Anty królik IgG HRP</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-5046</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do immunoblottingu</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Analiza proteomu komórkowego może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób dzięki rozwojowi technologii, które pozwalają na identyfikację i kwantyfikację białek obecnych w złożonych systemach biologicznych. Wiedza uzyskana dzięki podejściu proteomicznemu może potencjalnie doprowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów patogennych leżących u podstaw chorób, co pozwoli na identyfikację nowych markerów diagnostycznych i prognostycznych chorób oraz, miejmy nadzieję, celów terapeutycznych. Jednak zastawka mitralna serca stanowi bardzo trudną próbkę do analizy proteomicznej ze względu na niską komórkowość proteoglikanów i macierzy zewnątrzkomórkowej wzbogaconej kolagenem. To sprawia, że ekstrakcja białek do globalnej analizy proteomicznej jest trudna. W tej pracy opisano protokół, który jest zgodny z późniejszą analizą białek, taką jak proteomika ilościowa i immunoblotting. Może to pozwolić na korelację danych dotyczących ekspresji białek z danymi dotyczącymi ilościowej ekspresji mRNA i nieilościowej analizy immunohistochemicznej. Rzeczywiście, podejścia te, jeśli zostaną przeprowadzone razem, doprowadzą do bardziej wszechstronnego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób, od mRNA po potranslacyjną modyfikację białek. W związku z tym metoda ta może być istotna dla naukowców zainteresowanych badaniem fizjopatologii zastawek serca.

Ekstrakcja i rozpuszczanie białek w buforze mocznika jest bezpośrednio kompatybilne z metodami proteomiki opartymi na izoelektrofokusowaniu (elektroforeza dwuwymiarowa (2-DE)11 i izoelektrofokusiowanie w fazie ciekłej (IEF)12) i immunoblotting po rozcieńczeniu w buforze Laemmli13 zawierającym koktajl inhibitorów proteaz14.
W przypadku...

Skład białkowy ludzkiej zastawki mitralnej jest nadal częściowo nieznany, ponieważ jego analiza jest skomplikowana przez niską komórkowość, a tym samym niską biosyntezę białek. Praca ta zapewnia protokół do efektywnej ekstrakcji białka do analizy proteomu zastawki mitralnej.

Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywna ekstrakcja białek z ludzkiej zastawki mitralnej serca, odpowiednia do analiz proteomicznych. Metoda ta może potencjalnie pomóc w odkryciu mechanizmów patogennych w obszarze chorób zastawek serca, umożliwiając identyfikację nowych diagnostycznych i prognostycznych markerów chorobowych, a w nadziei również celów terapeutycznych. Główną zaletą niniejszego protokołu jest zapewnienie efektywnego schematu ekstrakcji, który jest kompatybilny z wieloma zastosowaniami analitycznymi.Wyniki stanowią bardziej wyczerpującą charakterystykę proteomu zastawki mitralnej serca. Ponadto protokół ten można zastosować do innych układów, takich jak zastawka mitralna świni, która wykazuje duże podobieństwo do zastawki ludzkiej i jest wykorzystywana w modelach eksperymentalnych do oceny funkcji zastawek. Procedurę eksperymentalną zaprezentuje Stefania Ghilardi, technik z mojego laboratorium.Aby przygotować ludzką zastawkę mitralną, należy rozpocząć od wycięcia serca, które znajdowało się w stanie zimnego niedokrwienia przez okres od 4 do 12 godzin. W pomieszczeniu typu Cleanroom należy wyjąć serce z torby transportowej i umieścić je w sterylnym wiadrze. Następnie serce należy przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrzaNastępnie, używając jednorazowego skalpela, wykonaj cięcie prostopadle do osi głównej na wysokości lewej i prawej komory, około czterech centymetrów od wierzchołka. Po tym czasie połóż serce na sterylnej serwetce. Następnie odsuń aortę wstępującą oraz tętnicę płucną, aby uzyskać dostęp do sklepienia lewego przedsionka.Na sklepieniu lewego przedsionka, używając pęsety i zgłębnika, należy wyciąć obszar wokół lewego uszka przedsionka, aby odsłonić zastawkę mitralną. Zastawka mitralna znajduje się w całości w lewej komorze. W związku z tym należy odsłonić przedni płatek zastawki mitralnej oraz tylny płatek zastawki mitralnej.Przednio-boczne i tylno-przyśrodkowe spoidła wyznaczają granicę obszaru przedniego i tylnego. Następnie, za pomocą nożyczek i nieurazowych pincek, przeprowadź preparację lewego przedsionka oraz grubości ściany komory otaczającej zastawkę mitralną. Podczas tej preparacji zidentyfikuj ciągłość zastawki mitralnej i aortalnej.Następnie oddziel przedni płatek zastawki mitralnej od tylnego płatka zastawki mitralnej, przecinając wzdłuż komisur ograniczających płatek tylny. Po zakończeniu procedury zdezynfekuj blat szafki roztworem 70% isopropyl alcohol oraz roztworem 6% hydrogen peroxide. Teraz przemyj tylny płatek zastawki mitralnej w soli fizjologicznej.Następnie potnij zastawkę na małe fragmenty, każdy o powierzchni mniejszej niż 1 cm². Każdy fragment zawiń osobno w folię aluminiową i zamroź gwałtownie w ciekłym azocie. Aby rozpocząć ekstrakcję białek, za pomocą pęsety wyjmij próbkę z ciekłego azotu i natychmiast umieść ją na suchym lodzie.Nie dopuszczać do rozmrożenia próbki. Następnie do naczynia typu dewar wypełnionego ciekłym azotem należy włożyć moździerz, dopasowane tłuczki oraz próbkę. Kluczowe jest wykorzystanie ciekłego azotu do zamrożenia próbki oraz schłodzenia systemu rozcierającego.Krok ten zapobiega degradacji biologicznej i umożliwia efektywne rozdrobnienie w proszek, lecz wymaga przeszkolenia technicznego w zakresie bezpiecznego obchodzenia się z materiałem. Po błyskawicznym zamrożeniu należy umieścić moździerz i tłuczki w pojemniku polistyrenowym z suchym lodem. Na suchym lodzie należy również położyć szpatułkę.Następnie należy wyjąć próbkę z folii i umieścić ją w moździerzu, a nad nią ustawić większy tłuczek. Obracając tłuczek za pomocą śrubokręta, należy rozetrzeć próbkę od 15 do 20 razy.Podczas ucierania należy mieszać próbkę końcówką schłodzonej szpatułki. Po użyciu dużego tłuczka powtórzyć proces ucierania za pomocą mniejszego tłuczka. Uzyskanie drobnego proszku jest kluczowe dla efektywnej ekstrakcji białek.Następnie przesyp próbkę w proszku do probówki wirówkowej o objętości 15 ml o znanej masie. Pozostały materiał zgarnij do probówki za pomocą zimnej szpatułki. Próbkę w probówce przechowuj na suchym lodzie i szybko określ jej masę.Następnie przelej próbkę do szklanej rurki homogenizatora. Potem dodaj 200 µL buforu mocznikowego na każde 10 mg próbki. Podczas tej czynności odzyskaj pozostałości pozostałe w rurce, wypłukując je alikwotem buforu mocznikowego.Następnie należy zhomogenizować próbkę za pomocą zmotorizowanego tłuczka z PTFE obracającego się z prędkością 1 500 rpm. Powoli dociskać tłuczek do próbki, wykonując 10 ruchów obrotowych. Następnie przenieść lepki, żółty supernatant do czystej probówki do wirowania o pojemności 1,7 mililitra, używając pipety szklanej.Następnie powtórz homogenizację pozostałej próbki, stosując połowę ilości mocznika. Odzyskaj nadsącz i połącz go z poprzednią porcją. Potem umieść probówkę w rotatorze do probówek na 30 minut.Po 30 minutach umieść probówkę w zimnej wirówce i odwiruj próbkę z prędkością 13 000 G przez pół godziny. Następnie pobierz supernatant. Stężenie białka zmierz za pomocą metody Bradforda.Po przeprowadzeniu opisanego protokołu ekstrakt białkowy poddano badaniu z wykorzystaniem różnych metod po zastosowaniu dodatkowych zabiegów. Łącznie 422 białka w tkance zastawki mitralnej zidentyfikowano za pomocą elektroforezy dwuwymiarowej, izoelektrowania w fazie ciekłej, chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas oraz dwuwymiarowej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas. 422 białka sklasyfikowano przy użyciu analizy Gene Ontology.Regiony zewnątrzkomórkowe zawierały kilka oczekiwanych białek oraz inne białka wewnątrzkomórkowe i białka powierzchni komórkowych. Wiele z nich zidentyfikowano po raz pierwszy w zastawkach mitralnych. Obecność czterech takich białek, których wcześniej nie zidentyfikowano w zastawkach mitralnych, została potwierdzona za pomocą przeciwciał w trzech unikalnych próbkach.Białka to Septin-11, białko z czterema i pół domenami LIM 1, Dermatoponina oraz alfa-krystalina B. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekstrahować białka z zastawki mitralnej serca w celu ich identyfikacji i kwantyfikacji. Po opanowaniu techniki protokół ten można zrealizować w niemal dwie godziny, jeśli jest przeprowadzany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury, aby uzyskać najwyższą wydajność białek przy zachowaniu ich wysokiej integralności, kluczowe jest, aby próbki nie rozmroziły się podczas żadnego z etapów przenoszenia.

optimized-protocol-for-extraction-proteins-from-human-mitral

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Analiza ekspresji białek w młodych embrionalnych zastawkach myszy została utrudniona przez ograniczoną dostępną tkankę. Manuskrypt ten zawiera protokół przygotowania białka z rozwijających się embrionalnych obszarów zastawki myszy do analizy western blot.

Izolacja białka z rozwijającego się zarodkowego regionu zastawki serca myszy

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.

Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana

Mitochondria mają wyspecjalizowane rybosomy, które różnią się od swoich bakteryjnych i cytoplazmatycznych odpowiedników. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mitoribosomy można uzyskać z ich natywnego przedziału w komórkach HEK. Metoda polega na izolacji mitochondriów z komórek zawiesinowych, a następnie oczyszczeniu mitoribosomów.

Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Poznaj zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej do analiz proteomicznych. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych markerów diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach zastawkowych.

Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Przeglądaj więcej filmów