Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Ogólnym celem tego zminiaturyzowanego badania z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej połączonej z LC-MS/MS jest dokładne oznaczenie ilości wolnej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych. Wolna 3-nitrotyrozyna służy jako biomarker stresu oksydacyjnego. Jednak dokładne oznaczenie ilości 3-nitrotyrozyny w próbkach biologicznych do zastosowań klinicznych w sytuacjach nagłych pozostaje szczególnym wyzwaniem ze względu na niewystarczającą czułość, selektywność oraz uciążliwe przygotowanie próbek.

Technika ta, łącząca skuteczną ekstrakcję do fazy stałej z wysokoczułym układem LC-MS/MS, umożliwia szybkie, specyficzne i dokładne oznaczanie niskich poziomów endogennej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu bez konieczności stosowania konstytucji i dwuwymiarowej chromatografii cieczowej (LC). Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w badaniach nad stresem oksydacyjnym, może być ona również zastosowana w innych stanach patologicznych, takich jak złożone zaburzenia zapalne i neurodegeneracyjne. Zastosowanie tej techniki można rozszerzyć na monitorowanie skuteczności leczenia antyoksydacyjnego, ponieważ poziom 3-nitrotyrozyny może być obniżany przez przeciwutleniacze. Aby rozpocząć procedurę, należy wymieszać w wirówce (vortex) wcześniej przygotowane i rozmrożone próbki moczu, wzorce oraz próbki kontroli jakości (QC).

Po wymieszaniu w wortexie należy przenieść 250 µL każdej próbki oraz wzorca do 32 studzienek czystej płytki kolektorskiej o pojemności 2 ml i 96 studzienkach. Do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienki z próbką podwójnie ślepą, należy dodać 50 µL wcześniej przygotowanego roztworu roboczego standardu wewnętrznego. Następnie do studzienki z próbką podwójnie ślepą należy dodać 50 µL wody klasy LC-MS z dodatkiem 0,01% kwasu mrówkowego.

Następnie do dołków należy dodać 250 µL wody klasy LC-MS z 0,1% kwasem mrówkowym. Roztwory należy wymieszać trzykrotnie za pomocą pipety ośmiokanałowej, a następnie przykryć płytkę do momentu załadunku na SPE. W dalszej kolejności należy umieścić 96-dołkową mikropłytkę ekstrakcyjną do kationowymiennej wymiany mieszanej oraz zbiornik na eluaty w procesorze nadciśnieniowym.

Ekstrakcja do fazy stałej z wykorzystaniem mikropłytki do kationowej wymiany mieszanej umożliwia jednoczesne oczyszczanie próbki i wzbogacanie 3-nitrotyrozyny w jednej ekstrakcji. Przygotuj płytkę ekstrakcyjną, przepuszczając 200 µL metanolu klasy LC-MS przez sorbent. Przekręć pokrętło regulacji ciśnienia w procesorze dodatniego ciśnienia, aby ustawić niskie ciśnienie dodatnie, co pozwoli mieszaninie powoli przepływać przez sorbent, w razie potrzeby korygując wartość ciśnienia.

Równoważenie przeprowadź poprzez przepuszczenie 200 µL wody klasy LC-MS z 2% kwasem mrówkowym przez sorbent. Używając pipety ośmiokanałowej, ostrożnie nanieś całą objętość każdej z wymieszanych wcześniej próbek na przygotowaną płytkę do ekstrakcji. Na procesorze ciśnienia dodatniego ustaw niskie ciśnienie, aby mieszanina powoli przepływała przez sorbent, dostosowując wartość ciśnienia w razie potrzeby.

Następnie przemyj studzienki, przepuszczając przez sorbent 200 µL wody klasy LC-MS z 2% kwasem mrówkowym. Po przemyciu 200 µL metanolem i wodą, ustaw procesor ciśnienia dodatniego na wysokie ciśnienie, aby osuszyć studzienki. Gdy studzienki będą suche, zastąp zbiornik czystą 96-dołkową płytką kolektorską o pojemności 2 mL.

Następnie nanieś 50 µL 25 mM roztworu octanu amonu, aby powoli eluować zatrzymany anality oraz standard wewnętrzny z płytki do ekstrakcji. Następnie dodaj 50 µL wody klasy LC-MS z 5% kwasem mrówkowym w celu zneutralizowania eluentu. Zastosowanie łagodnego roztworu octanu amonu do elucji 3-nitrotyrozyny zapewnia znaczną poprawę selektywności i czułości.

Wymieszaj próbki za pomocą pipety ośmiokanałowej trzykrotnie w ramach przygotowania do analizy metodą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Po skonfigurowaniu instrumentu LC-MS/MS przeprowadź equilibrację metody LC-MS/MS dla 3-nitrotyrozyny przez 10 minut za pomocą elucji gradientowej LC. Dzięki equilibracji metody gradient LC zostanie przywrócony do początkowych warunków elucji gradientowej.

Temperaturę autosamplera należy ustawić na 4 °C, a temperaturę pieca na 30 °C. Należy stworzyć listę serii, która obejmuje próbki moczu, standardy oraz próbki kontroli jakości (QC). Następnie należy rozpocząć analizę serii poprzez wstrzyknięcie przygotowanych próbek.

Po zakończeniu wszystkich wstrzykiwań, należy sporządzić krzywą wzorcową w zakresie od 10 do 2 500 picogramów na mililitr dla oznaczania ilości 3-nitrotyrozyny poprzez regresję liniową stosunku powierzchni piku 3-nitrotyrozyny i standardu wewnętrznego względem nominalnego stężenia 3-nitrotyrozyny. Następnie należy wyznaczyć ilości w pozostałych próbkach, korzystając z opracowanej krzywej wzorcowej, oraz sprawdzić, czy próbki kontrolne (QC) mieszczą się w ustalonym zakresie. Dane LC próbek ludzkiego moczu wykazują, że w zoptymalizowanych warunkach 3-nitrotyrozyna jest chromatograficznie oddzielona od innych strukturalnie podobnych analogów tyrozyny, co eliminuje interferencje wynikające ze współeluowania tych licznych związków i w konsekwencji zwiększa selektywność analizy.

W chromatogramie monitorowania wielu reakcji (MRM) próbki ślepej podwójnej nie zaobserwowano sygnału 3-nitrotyrozyny, co wskazuje, że 3-nitrotyrozyna nie powstaje podczas całego procesu. Przedstawiono tutaj reprezentatywne chromatogramy MRM 3-nitrotyrozyny oraz standardu wewnętrznego dla zdrowej osoby. W czasach retencji 3-nitrotyrozyny i standardu wewnętrznego nie zaobserwowano sygnałów zakłócających.

Poniżej przedstawiono reprezentatywną krzywą wzorcową. Granicę wykrywalności, zdefiniowaną jako najniższe stężenie z wartością stosunku sygnału do szumu powyżej trzech, określono na poziomie 2 pg/mL. Dolna granica oznaczalności została określona jako 10 pg/mL i jest definiowana jako najniższe stężenie z precyzją i dokładnością w granicach 20% oraz stosunkiem sygnału do szumu powyżej 10.

Zoptymalizowany test integracyjny zapewnia znacznie lepszą specyficzność, czułość i przepustowość przy jednoczesnym ograniczeniu efektu matrycy, zużycia sorbentu oraz ilości odpadów. Dzięki temu prostemu i szybkiemu testowi próbka moczu może zostać przetworzona w ciągu 24 godzin. Należy wziąć pod uwagę nieinwazyjny i niedrogi charakter pobierania próbek moczu.

Ta znacząco ulepszona metoda jest odpowiednia do oceny roli 3-nitrotyrozyny jako biomarkera stresu oksydacyjnego w badaniach przedklinicznych i klinicznych.