Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Ogólnym celem tej zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej w połączeniu z testem LC-MS / MS jest dokładne ilościowe określenie wolnej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych. Wolna 3-nitrotyrozyna pomaga w plonach i jest biomarkerem stresu oksydacyjnego. Jednak dokładne ilościowe określenie 3-nitrotyrozyny w nagłych przypadkach biologicznych do zastosowań klinicznych pozostanie szczególnym wyzwaniem ze względu na niewystarczającą czułość, selektywność i kłopotliwe przygotowanie próbek.

Technika ta obejmująca skuteczną ekstrakcję do fazy stałej w bardzo czułej interakcji LC-MS / MS umożliwia szybkie, specyficzne i dokładne określenie niskich poziomów endogennej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu bez konieczności konstytucji i dwuwymiarowego LC. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w badanie stresu oksydacyjnego, może być również stosowana do innych stanów patologicznych, takich jak złożone zaburzenia zapalne i neurodegeneracyjne. Implikacje tej techniki można rozszerzyć w kierunku monitorowania skuteczności leczenia przeciwutleniaczami, ponieważ poziom 3-nitrotyrozyny może być obniżony przez przeciwutleniacze. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wirować wcześniej przygotowane i rozmrożone próbki moczu, wzorce i próbki kontroli jakości.

Po wirowaniu dodaj 250 mikrolitrów każdej próbki i wzorca do 32 dołków czystej, dwumililitrowej 96-dołkowej płytki zbiorczej. Dodać 50 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu roboczego wzorca wewnętrznego do każdej studzienki, z wyjątkiem studzienki z podwójną próbą ślepą. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wody klasy LC-MS z 0,01% kwasu mrówkowego do podwójnej ślepej próbki.

Następnie dodaj do studzienek 250 mikrolitrów wody klasy LC-MS z 0,1% kwasu mrówkowego. Następnie trzykrotnie wymieszaj roztwory za pomocą ośmiokanałowej pipety i przykryj płytkę do momentu załadowania SPE. Następnie umieść 96-dołkową mikropłytkę ekstrakcyjną z wymianą kationową w trybie mieszanym i zbiornik zbiorczy na procesorze nadciśnieniowym.

Ekstrakcja do fazy stałej z wykorzystaniem mikropłytki kationowymiennej w trybie mieszanym umożliwia jednoczesne oczyszczanie próbki i wzbogacanie 3-nitrotyrozyny w jednej ekstrakcji. Kondycjonować płytkę ekstrakcyjną, przepuszczając przez sorbent 200 mikrolitrów metanolu klasy LC-MS. Obróć pokrętło regulacji ciśnienia na procesorze nadciśnieniowym, aby ustawić niskie nadciśnienie, aby mieszanina mogła powoli przepływać przez sorbent, w razie potrzeby regulując ciśnienie.

Zrównoważyć, przepływając przez sorbent 200 mikrolitrów wody klasy LC-MS z 2% kwasem mrówkowym. Za pomocą pipety ośmiokanałowej ostrożnie załadować całą objętość każdej z wstępnie zmieszanych próbek na wstępnie kondycjonowaną płytkę ekstrakcyjną. Ustaw niskie nadciśnienie na procesorze nadciśnieniowym, aby mieszanina mogła powoli przepływać przez sorbent, dostosowując ciśnienie w razie potrzeby.

Następnie umyj studnie, przepuszczając przez sorbent 200 mikrolitrów wody klasy LC-MS z 2% kwasem mrówkowym. Po umyciu 200 mikrolitrami metanolu i wodą należy ustawić procesor nadciśnieniowy na wysokie ciśnienie w celu wysuszenia studzienek. Po wyschnięciu studzienek wymień zbiornik na czystą, dwumililitrową 96-dołkową płytkę zbiorczą.

Teraz nałóż 50 mikrolitrów 25-milimolowego roztworu octanu amonu, aby powoli eluować zatrzymany analit i wzorzec wewnętrzny z płytki ekstrakcyjnej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wody klasy LC-MS z 5% kwasem mrówkowym, aby zneutralizować eluent. Zastosowanie łagodnego roztworu octanu amonu do elucji 3-nitrotyrozyny zapewnia znacznie zwiększoną selektywność i czułość.

Trzykrotnie wymieszać próbki za pomocą pipety ośmiokanałowej, przygotowując je do analizy metodą tandemowej spektrometrii mas w chromatografii cieczowej. Po ustawieniu przyrządu LC-MS/MS należy zrównoważyć metodę 3-nitrotyrozyny LC-MS/MS przez 10 minut z elucją gradientu LC. Równoważąc metodę, gradient LC zostanie zrównoważony do początkowej elucji gradientu.

Temperatura automatycznego próbnika zostanie ustawiona na cztery stopnie Celsjusza, a temperatura piekarnika zostanie ustawiona na 30 stopni Celsjusza. Utwórz listę partii zawierającą próbki moczu, wzorce i próbki kontroli jakości. Następnie rozpocznij partię od wstrzyknięcia przygotowanych próbek.

Po zakończeniu wszystkich wstrzyknięć należy ustalić krzywą wzorcową w zakresie od 10 do 2 500 pikogramów na mililitr dla ilościowego oznaczania 3-nitrotyrozyny przez regresję liniową stosunku powierzchni piku 3-nitrotyrozyny do wzorca wewnętrznego w stosunku do nominalnego stężenia 3-nitrotyrozyny. Na koniec należy określić ilościowo wszystkie inne próbki przy użyciu ustalonej krzywej wzorcowej i określić, czy próbki kontroli jakości mieszczą się w ustalonym zakresie. Dane LC próbek ludzkiego moczu pokazują, że 3-nitrotyrozyna jest chromatograficznie oddzielona od innych strukturalnie podobnych analogów tyrozyny w zoptymalizowanych warunkach, co eliminuje zakłócenia koelucji spowodowane przez te znacznie nadmierne związki, a w konsekwencji zwiększa stopień selektywności testu.

W chromatogramie monitorującym wielokrotną reakcję podwójnej próbki ślepej nie obserwuje się sygnału 3-nitrotyrozyny, co wskazuje, że podczas całego procesu nie powstaje 3-nitrotyrozyna. Przedstawiono tutaj reprezentatywne chromatogramy monitorujące wielokrotne reakcje 3-nitrotyrozyny i wzorca wewnętrznego dla osoby zdrowej. Nie zaobserwowano żadnych sygnałów zakłócających w czasie retencji 3-nitrotyrozyny i wzorca wewnętrznego.

Reprezentatywna krzywa standardowa jest pokazana tutaj. Granicę wykrywalności zdefiniowaną jako najniższe stężenie o stosunku sygnału do szumu większym niż trzy określono na dwa pikogramy na mililitr. Dolna granica oznaczalności została określona na 10 pikogramów na mililitr i jest definiowana jako najniższe stężenie w granicach 20% niedokładności i dokładności przy stosunku sygnału do szumu większym niż 10.

Precyzyjnie dostrojony test integracji zapewnia znacznie lepszą specyficzność, czułość i przepustowość przy zmniejszonym efekcie matrycy, zużyciu sorbentu i utylizacji odpadów. Dzięki temu prostemu i szybkiemu testowi próbka moczu może zostać przetworzona w ciągu 24 godzin. Weź pod uwagę nieinwazyjne i niedrogie pobieranie próbek moczu.

Ta niezwykle ulepszona metoda doskonale nadaje się do oceny roli 3-nitrotyrozyny jako biomarkera stresu oksydacyjnego w badaniach przedklinicznych i klinicznych.