Name: Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę LC-MS/MS z miniaturową ekstrakcją do fazy stałej do ilościowego oznaczania wolnej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu. Technika umożliwia szybką i selektywną analizę biomarkera stresu oksydacyjnego w zastosowaniach klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Scottowi Howardowi i Abigail Marinack za ogólne wsparcie i koordynację tej pracy.

Wszystkie badania z udziałem próbek ludzkiego moczu zostały przeprowadzone zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Pharmasan/Neuroscience Institutional Review Board (IRB).
1. Pobieranie próbek moczu i oznaczanie kreatyniny (Cr)
<ol>
	<li>Zebrać 5 ml próbek moczu następnego ranka po ok. 10 godzinach całonocnego postu w 5 ml probówce transportowej A zawierającej 250 μl 3 N HCl jako środka konserwującego i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Rozmrozić i odwirować 5 ml moczu transportować probówkę A i odwirować w wirówce (np. Sorvall) (2297 x g, 10 min).</li>
	<li>Podajcie 1 ml moczu dwa razy z 5 ml probówki transportowej A.</li>
	<li>Określ Cr metodą kreatyniny w moczu26.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek wzorcowych, IS i kontroli jakości (QC)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 3-NT o stężeniu 100 μg/ml w wodzie z 0,01% ruchomą fazą A (MA) HCOOH i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roboczy roztwór wzorcowy 3-NT o stężeniu 100 ng/ml, rozcieńczając 100 μg/ml roztworu podstawowego 3-NT MA.</li>
	<li>Generuj wzorce w zakresie od 5 do 2500 pg/ml przez rozcieńczenie wzorca roboczego 100 ng/ml z 0,15 M zakwaszonym ślepym moczem HCl wolnym od 3-NT wraz z ślepymi i podwójnie ślepymi próbkami.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy IS 13C 9-3-NT o stężeniu 100 μg/ml w wodzie z MA i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy IS o stężeniu 500 pg/ml przez rozcieńczenie 100 μg/ml 13C 9-3-NT roztworu podstawowego IS z MA.</li>
	<li>Ustalić pięć poziomów próbek kontroli jakości obejmujących LLOQ, niski, średni i wysoki poziom (tj. 10, 25, 100, 500 i 1,250 pg/ml), przez rozcieńczenie wzorca roboczego 3-NT w zakwaszonym ślepym moczu.</li>
</ol>
3. Procedura ekstrakcji do fazy stałej
<ol>
	<li>Rozmrażanie i wirowanie próbek moczu, wzorców i próbek kontroli jakości.</li>
	<li>Dodać próbki moczu, wzorce i próbki kontroli jakości (po 250 μl każda) do 32 dołków czystej 2 ml 96-dołkowej płytki zbiorczej.</li>
	<li>Wprowadzić roztwór roboczy IS o stężeniu 500 pg/ml (50 μl) do każdego dołka, z wyjątkiem studzienki z podwójną próbą ślepą. Dodać 0,01% HCOOH (50 μl) do studzienki z podwójną ślepą próbą.</li>
	<li>Dodaj wodę LC-MS/MS z 0,1% HCOOH (250 μL).</li>
	<li>Wymieszaj powyższą mieszaninę trzykrotnie pipetą 8-kanałową.</li>
	<li>Przykryj płytę do momentu załadowania SPE.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę ekstrakcyjną MCX i zbiornik zbiorczy na procesorze nadciśnieniowym.</li>
	<li>Kondycjonować płytkę ekstrakcyjną z przepływającym MeOH (200 μl) przez sorbent.</li>
	<li>Zrównoważyć przez przepływającą wodę z 2% HCOOH (200 μL) przez sorbent.</li>
	<li>Ostrożnie załadować całą objętość każdej z wstępnie zmieszanych próbek na wstępnie kondycjonowaną płytkę ekstrakcyjną za pomocą 8-kanałowej pipety.</li>
	<li>Ustawić niskie nadciśnienie (np. 3 psi) na procesorze nadciśnieniowym, aby mieszanina mogła powoli przepływać przez sorbent, w razie potrzeby wyreguluj ciśnienie.</li>
	<li>Umyć studnie przepływającą wodą z 2% HCOOH (200 μL) przez sorbent.</li>
	<li>Przepłukać studzienki, przepuszczając metanol (200 μl) przez sorbent.</li>
	<li>Umyć studzienki przepływającą wodą (200 μl) przez sorbent.</li>
	<li>Całkowicie wysuszyć studzienki przy ustawieniu wysokiego nadciśnienia (np. 40 psi) na procesorze nadciśnieniowym.</li>
	<li>Wymień zbiornik na czystą 96-dołkową płytkę o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Zastosować 25 mM NH4OAc przy pH 9 (50 μl) w celu wymycia pozostałego analitu i stabilizacji z płytki ekstrakcyjnej.</li>
	<li>Odpipetować LC-MS wodą z 5% HCOOH (50 μL) w celu zneutralizowania eluatu.</li>
	<li>Wymieszać trzykrotnie z pipetą 8-kanałową i przesłać do stacji LC-MS/MS w celu analizy.</li>
</ol>
4. Analiza LC-MS/MS
<ol>
	<li>Dokładnie odmierz 2,000 ml wody LC-MS za pomocą cylindra z podziałką i przenieś ją do butelki o pojemności 2 litrów.</li>
	<li>Odpipetować 200 μl czystego HCOOH do powyższej butelki zawierającej wodę LC-MS.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać i oznaczyć jako ruchomą fazę A (MA). Dołącz inicjały, datę przygotowania i datę ważności.</li>
	<li>Weź 2-litrową butelkę metanolu LC-MS i oznacz ją jako fazę ruchomą B (MB) z datą początkową i datą ważności.</li>
	<li>Ustawić temperaturę automatycznego próbnika na 4 °C.</li>
	<li>Umieścić płytkę zbiorczą z przygotowanymi próbkami w automatycznym podajniku próbek.</li>
	<li>Umieść kolumnę PFP (150 mm x 2.1 mm średnica wew., 3 μm) i kolumnę ochronną w piekarniku.</li>
	<li>Ustaw temperaturę piekarnika na 30 °C.</li>
	<li>Równoważyć 10 minut przy użyciu metody akwizycji z elucją w gradiacji LC, jak pokazano w tabeli 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>moduł</td>
			<td>Zdarzenia</td>
			<td>parametr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>Rozdział 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>90</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>Norma 4.01</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>95 Rozdział 95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdział 5.5</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>95 Rozdział 95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,6</td>
			<td>Pompy</td>
			<td>Pompa B Conc.</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>kontroler</td>
			<td>zatrzymać</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Warunki elucji gradientu chromatografii cieczowej
<ol start="10">
	<li>Utwórz listę partii zawierającą wzorce, kontrolę jakości i próbki moczu.</li>
	<li>Rozpocząć partię od wstrzyknięcia przygotowanych próbek (12 μl).</li>
</ol>
5. Identyfikacja szczytów, integracja i przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Kontroluj gromadzenie i przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Zidentyfikuj i zintegruj piki 3-NT i IS dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Ustalić krzywą wzorcową w zakresie 10-2,500 pg/ml dla oznaczania ilościowego 3-NT przez regresję liniową stosunku powierzchni pików 3-NT i IS w stosunku do nominalnego stężenia 3-NT ze współczynnikiem wagowym 1/x.</li>
	<li>Określić ilościowo wszystkie próbki za pomocą krzywej wzorcowej.</li>
	<li>Określ, czy próbki kontroli jakości mieszczą się w ustalonym zakresie.</li>
	<li>Przelicz wykryte stężenia próbek moczu na wyniki końcowe w jednostce nM lub nmol/mmol Cr.</li>
</ol>

<ol><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitrotyrosine%2C+a+marker+of+nitrosative+stress%2C+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li>
<li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration%3A+Cause%2C+effect%2C+or+association%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li>
<li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li>
<li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Biochem.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li>
<li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li>
<li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples%3A+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li>
<li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine%3A+strategies%2C+controversies%2C+and+our+current+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li>
<li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li>
<li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative%2Fnitrative+changes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li>
<li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li>
<li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li>
<li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+o%2Co%27-dityrosine%2C+o-nitrotyrosine%2C+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC%2Felectrospray+ionization-MS%2FMS+using+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li>
<li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tyrosine%2C+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li>
<li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li>
<li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity%3A+validity+and+clinical+applicability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized%2C+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS%2FMS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li>
<li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS%2FMS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li>
<li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-015-8934-5">Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li>
<li>Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from:
 <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> 2011-2011 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS%2FMS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Znaczne różnice w stężeniach zgłaszanych wcześniej w literaturze dla endogennego wolnego 3-NT w próbkach moczu ludzkiego ujawniają problemy metodologiczne związane z dostępnymi testami 8,9,10,11. Dokładne określenie niskiego podstawowego poziomu 3-NT w ludzkim moczu pozostaje trudnym zadaniem, które wymaga specjalnych środków ostrożności przy przygotowywaniu próbek i analizie LC-MS/MS. Protokó...

Wpływ stresu oksydacyjnego na obraz kliniczny został wysunięty na pierwszy plan w ostatnich latach1. Jednym z badanych biomarkerów jest 3-nitrotyrozyna (3-NT), stabilny produkt końcowy, który powstaje, gdy reaktywne formy azotu (RNS) oddziałują z tyrozyną, prekursorem neuroprzekaźnika katecholaminowego. Podczas gdy 3-NT może mieć wartość kliniczną jako biomarker RNS in vivo, istotne zmiany właściwości i funkcji tyrozyny mogą niekorzystnie wpływać na odpowiednie białka i funkcje komórkowe1,2. Pojawiające się badania sugerują, że 3-NT może odgrywać ważną rolę w stanach zapalnych3, zaburzeniach neurodegeneracyjnych4,5, chorobach sercowo-naczyniowych6 i cukrzycy7, a także w stanach związanych ze stresem oksydacyjnym. Obserwacje te opierają się jednak na wynikach metodologii, w których brakuje czułości i/lub selektywności8,9,10,11. Ogromne zakresy stężeń 3-NT dla próbek biologicznych wcześniej zgłoszonych w literaturze ujawniają, że z tymi testami wiążą się poważne problemy analityczne i potrzebne są ulepszenia techniczne, aby dokładnie określić ilościowo poziomy 3-NT i zweryfikować jego rolę w patologii tych stanów.
Ilościowe określenie wolnego 3-NT w matrycach biologicznych stanowi szczególne wyzwanie dla człowieka i instrumentu8,9,10,11. Po pierwsze, śladowy poziom endogennego 3-NT wymaga ultraczułego wykrywania; po drugie, istnienie licznych strukturalnie podobnych analogów, zwłaszcza tyrozyny, która występuje w znacznym nadmiarze, wymaga wysokiego stopnia selektywności; po trzecie, sztuczne tworzenie 3-NT przez nitrowanie tyrozyny z wszechobecnym azotanem i azotynami wymaga szczególnej uwagi podczas przygotowywania próbki, aby uniknąć fałszywego przeszacowania 3-NT.
Wśród szerokiej gamy metodologii stosowanych do pomiaru 3-NT, MS/MS został uznany za złoty standard ze względu na jego wysoką czułość i selektywność11,12,13,14. Chromatografia gazowa (GC) sprzężona z MS/MS oferuje najlepszą czułość, jednak niezbędne etapy derywatyzacji próbki są zbyt żmudne i czasochłonne, aby były efektywne dla użyteczności klinicznej15,16. LC-MS/MS nie wymaga skomplikowanej derywatyzacji próbki, co czyni ją bardziej obiecującą opcją. Niemniej jednak istnieje kilka przeszkód do pokonania, takich jak czułość metod LC-MS/MS opisana w literaturze, która musi ulec poprawie w przypadku pomiaru niskiej obfitości 3-NT7,17,18 oraz stosunkowo długi czas realizacji musi zostać skrócony dla aplikacji o wysokiej przepustowości12,13,17,19.
Dodatkowo, przy rozważaniu zastosowań klinicznych, znaczącą rolę odgrywa zastosowana matryca biologiczna. Powinien być łatwy i niedrogi do uzyskania oraz nieinwazyjny, jeśli to możliwe20,21,22. Osocze, tradycyjnie stosowana próbka w literaturze, nie jest klinicznie pożądaną matrycą, dlatego poszukiwano metodologii wykorzystującej mocz, która jest nieinwazyjna i opłacalna.
Podjęto kilka prób opracowania wiarygodnych i specyficznych metodologii LC-MS/MS przy użyciu urine9,10,11. Jednak wszystkie one nie są ani selektywne, ani wystarczająco niezawodne, ani wystarczająco skuteczne do użytku klinicznego. Zakwestionowano skuteczność dominującego SPE przy użyciu tradycyjnego wkładu z odwróconą fazą (typ C18) jako oczyszczania próbki do analizy 3-NT i zaproponowano sekwencyjną SPE silnej wymiany kationów (SCX) i odwróconej fazy C18-OH6,7,19. Jedna z niedawno opracowanych metod LC-MS/MS wykorzystywała wieloetapowy proces oczyszczania ręcznego C18 SPE, preparatywnej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) i SPE online do analizy klasy 3-NT<sup="xref">23. Chociaż metoda ta była wystarczająco czuła do celów klinicznych, z LLOQ 0,041 nM, proces oczyszczania był intensywny i żmudny oraz wymagał 3 ml moczu, co ograniczało jego wykonalność w przypadku wysokiej przepustowości. Jako sorbent SPE zastosowano polimer z nadrukiem molekularnym, aby poprawić wydajność procesu oczyszczania14, ale uzyskany LLOQ (0,7 μg/ml) nie był wystarczająco niski dla próbek klinicznych. Inna metoda wymagała dwuwymiarowej (2D) LC-MS/MS i chromatografii immunopowinowactwa do oczyszczania próbki w celu osiągnięcia granicy wykrywalności (LOD) wynoszącej 0,022 nM24. Chociaż wszystkie te metody poczyniły postępy w ocenie 3-NT, żadna z nich nie osiągnęła czułości, niezawodności i wydajności niezbędnych do zastosowań klinicznych.
W celu zbadania patologii wolnego 3-NT i jego roli jako biomarkera stresu oksydacyjnego w warunkach klinicznych, opracowaliśmy metodologię, która jest prosta, wydajna, dokładna i precyzyjna, umożliwiając zastosowanie kliniczne o wysokiej przepustowości25. Wdrożono zminiaturyzowaną mikropłytkę ekstrakcyjną z 96-dołkową wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX), aby uzyskać proste i skuteczne oczyszczanie próbki i wzbogacanie 3-NT w jednej ekstrakcji, z pominięciem wad widocznych w istniejących metodach, które wymagają derywatyzacji, odparowania i 2D-LC. Chromatografia cieczowa z 0,01% HCOOH jako dodatkiem w fazie ruchomej zapewniła lepszą odpowiedź sygnału przy krótkim czasie cyklu. Selektywność została dodatkowo poprawiona dzięki zastosowaniu łagodnego roztworu elucji NH4OAc do selektywnej elucji 3-NT oraz zastosowaniu przejścia MRM zarówno dla 3-NT, jak i wzorca wewnętrznego (IS). Efekt matrycy skompensowano poprzez zastosowanie zmniejszonej ilości preferowanego izotopowego IS znakowanego 13C do oceny ilościowej. Wraz z pojawieniem się tej metodologii, naukowcy i klinicyści będą mogli zweryfikować rolę 3-NT w stanach klinicznych i dalej badać wpływ stresu oksydacyjnego.

<table><tbody><tr><td>3-Nitro-L-tyrozyna</td><td>Sigma</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitro-L-tyrozyna-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5,0 mg</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spec Gold Urine</td><td>Golden West Biologicals</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 96-well &micro; Płytka elucyjna</td><td>Wody</td><td>186001830BA</td> 2 ml 96-dołkowa płytka zbiorcza <td></td></tr><tr><td></td><td>Phenomenex&nbsp; &nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 dodatni procesor</td><td>Waters&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV metanol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy do spektrometrii mas</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny propylowe Ultra PFP</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Triple quad</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać więcej informacji</td></tr><tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu&nbsp;</td><td>/</td><td>Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać więcej szczegółów</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>Roche</td><td>/</td><td>kreatynina w moczu Jaff&eacute; Metoda Gen 2</td></tr><tr><td>Fiolka z gwintem 12 x 32 mm z gwintem z certyfikatem LCMS</td><td>Woda</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>Certyfikat LCGC Fiolka z całkowitą szyjką 12 x 32 mm</td><td>Wody</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml rurka transportowa</td><td>Phenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa</td><td>Crystalgen&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta elektroniczna eLine</td><td></td><td>Wirówka do mikrofuzy Sartorius</td> 730391<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Waga OHAUS&nbsp; &nbsp;</td><td>Skale Kennedy'ego, inc.</td><td>735</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy&nbsp;</td><td>Bernstead Thermolyne</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania lc-ms/ms 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Free 3-nitrotyrozyna (3-NT) była szeroko stosowana jako możliwy biomarker stresu oksydacyjnego. Podwyższone poziomy 3-NT odnotowano w wielu różnych stanach patologicznych. Jednak istniejące metody nie mają wystarczającej czułości i/lub swoistości niezbędnej do wiarygodnego pomiaru niskiego endogennego poziomu 3-NT i są zbyt kłopotliwe do zastosowań klinicznych. W związku z tym pilnie potrzebne są ulepszenia analityczne, aby dokładnie określić ilościowo poziomy 3-NT i zweryfikować rolę 3-NT w stanach patologicznych. Protokół ten przedstawia opracowanie nowatorskiej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) w połączeniu ze zminiaturyzowaną ekstrakcją do fazy stałej (SPE) w celu szybkiego i dokładnego pomiaru 3-NT w ludzkim moczu jako nieinwazyjnego biomarkera stresu oksydacyjnego. SPE przy użyciu 96-dołkowej płytki znacznie uprościło proces, łącząc oczyszczanie próbki i wzbogacanie analitu bez żmudnych etapów derywatyzacji i odparowywania, zmniejszając zużycie rozpuszczalnika, utylizację odpadów, ryzyko zanieczyszczenia i całkowity czas przetwarzania. Zastosowanie octanu amonu 25 mM (NH4OAc) o pH 9 jako roztworu elucji SPE znacznie zwiększyło selektywność. Odpowiedź sygnału spektrometrii mas została poprawiona dzięki dostosowaniu przejść monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Zastosowanie 0,01% HCOOH jako dodatku w kolumnie pentafluorofenylowej (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) poprawiło odpowiedź sygnału o kolejne 2,5 razy i skróciło całkowity czas pracy do 7 minut. Osiągnięto dolną granicę oznaczalności (LLOQ) wynoszącą 10 pg/ml (0,044 nM), co stanowi znaczną poprawę czułości w porównaniu z raportowanymi testami. Ta uproszczona, szybka, selektywna i czuła metoda pozwala na przetworzenie dwóch płytek z próbkami moczu (n = 192) w ciągu 24 godzin. Biorąc pod uwagę znacznie lepszą wydajność analityczną oraz nieinwazyjne i niedrogie pobieranie próbek moczu, proponowany test jest korzystny dla badań przedklinicznych i klinicznych.

Rysunek 1 ilustruje, że 3-NT jest całkowicie rozdzielony chromatograficznie od innych strukturalnie podobnych analogów tyrozyny w zoptymalizowanych warunkach LC, co eliminuje współeluujące interferencje wywołane przez te występujące w nadmiarze związki, a w konsekwencji zwiększa stopień selektywności analizy. Ponadto elucja gradientowa z dodatkiem 0,01% HCOOH w MA i metanolu przy szybkości przepływu 0,45 mL/min umożliwia szybką elucję 3-NT (t.j. 3 mi...

Selektywna i czuła metoda tandemowej chromatografii mas chromatografii cieczowej (LC-MS/MS) w połączeniu z efektywną ekstrakcją do fazy stałej na 96-dołkowej mikropłytce z wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX) została opracowana do pomiaru wolnej 3-nitrotyrozyny (3-NT) w ludzkim moczu o wysokiej przepustowości, która jest odpowiednia do zastosowań klinicznych.

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Ogólnym celem tego zminiaturyzowanego badania z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej połączonej z LC-MS/MS jest dokładne oznaczenie ilości wolnej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych. Wolna 3-nitrotyrozyna służy jako biomarker stresu oksydacyjnego. Jednak dokładne oznaczenie ilości 3-nitrotyrozyny w próbkach biologicznych do zastosowań klinicznych w sytuacjach nagłych pozostaje szczególnym wyzwaniem ze względu na niewystarczającą czułość, selektywność oraz uciążliwe przygotowanie próbek.Technika ta, łącząca skuteczną ekstrakcję do fazy stałej z wysokoczułym układem LC-MS/MS, umożliwia szybkie, specyficzne i dokładne oznaczanie niskich poziomów endogennej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu bez konieczności stosowania konstytucji i dwuwymiarowej chromatografii cieczowej (LC). Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w badaniach nad stresem oksydacyjnym, może być ona również zastosowana w innych stanach patologicznych, takich jak złożone zaburzenia zapalne i neurodegeneracyjne. Zastosowanie tej techniki można rozszerzyć na monitorowanie skuteczności leczenia antyoksydacyjnego, ponieważ poziom 3-nitrotyrozyny może być obniżany przez przeciwutleniacze.

integration-miniaturized-solid-phase-extraction-lc-msms-detection-3

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

α-hydroksylacja rakotwórczych nitrozoamin przez cytochrom P450s jest akceptowanym szlakiem metabolicznym, który wytwarza produkty pośrednie uszkadzające DNA, które powodują mutacje. Jednak nowe dane wskazują, że może dojść do dalszego utleniania do nitrozamidów. Opisujemy ogólną metodę wykrywania nitrozamidów wytwarzanych w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmem nitrozoamin katalizowanym cytochromem P450.

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Prezentujemy metodę wykrywania chemicznych modyfikacji białek atmosferycznych 3-nitrotyrozyny za pomocą krążków o średnicy 6 mm wyciętych z filtrów wstępnych próbnika powietrza za pomocą wysokowydajnego detektora chromatografii cieczowej i elektrochemicznego (HPLC-ECD).

Wykrywanie 3-nitrotyrozyny w środowisku atmosferycznym za pomocą wysokowydajnego systemu chromatografii cieczowej z detektorem elektrochemicznym

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Profilowanie proteomiczne białek azotowanych tyrozyną było trudną techniką ze względu na niską obfitość modyfikacji 3-nitrotyrozyny. W tym miejscu opisano nowatorskie podejście do wzbogacania i profilowania nitropeptydów przy użyciu angiotensyny II jako modelu. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne systemy in vitro lub in vivo.

Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II

Opisany tutaj jest protokół oznaczania czterech różnych metabolitów tryptofanu generowanych w szlaku kinureniny (kynurenina, 3-hydroksykinurenina, kwas ksanturonowy, kwas 3-hydroksyantranilowy) w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych analizowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z pojedynczą kwadrupolową spektrometrią mas.

Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Poznaj metodę LC-MS/MS z miniaturową ekstrakcją do fazy stałej do ilościowego oznaczania wolnej 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu. Technika umożliwia szybką i selektywną analizę biomarkera stresu oksydacyjnego w zastosowaniach klinicznych.

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych (Wideo) | JoVE Journal

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Przeglądaj więcej filmów