Jednoczesna kwantyfikacja wybranych kinurenin analizowanych metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas w pożywce pobranej z kultur komórek nowotworowych

Kinureniny są związane z regulacją odpowiedzi immunologicznej w wielu chorobach, w tym w raku. Wiarygodne i zwalidowane metody identyfikacji wielu kinureninów pomagają w opracowywaniu skuteczniejszych terapii. Nasz protokół wykorzystuje chromatografię cieczową sprzężoną ze spektrometrią mas w celu identyfikacji różnych metabolitów tryptofanu generowanych przez szlak kinureniny w pożywce pobranej z kultur komórek rakowych.

Niedoświadczeni użytkownicy mogą mieć pewne trudności na etapie przygotowania próbki lub pozyskiwania i interpretacji danych. Postępując zgodnie z naszym protokołem i zaleceniami, można uniknąć błędów i uzyskać wiarygodne dane. Aby przygotować roztwory podstawowe odczynników, odważyć 0,3 miligrama każdego odczynnika w fiolce z najwyższą dokładnością i rozpuścić każdy odczynnik w 300 mikrolitrach odpowiedniego rozpuszczalnika, aby uzyskać jeden gram na litr roztworów podstawowych każdego odczynnika.

Aby przygotować pożywkę hodowlaną traktowaną węglem drzewnym, odważ 280 miligramów węgla aktywnego w stożkowej probówce i dodaj pięć mililitrów płynnej pożywki przygotowanej do hodowli komórek będących przedmiotem zainteresowania. Potrząśnij rurką z podłożem i węglem drzewnym na huśtawce przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i 50 oscylacjach na minutę. Pod koniec inkubacji osadzamy węgiel drzewny przez odwirowanie i ostrożnie zbieramy supernatant bez naruszania węgla drzewnego, a następnie filtrujemy pożywkę za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrometra.

Aby przygotować roztwór kalibracyjny, należy dodać do pożywki hodowlanej poddanej działaniu węgla drzewnego 0,75 mikrolitra 0,1 grama na litr roztworu 3NT i dodać 3-H kinureninę, 3-HAA kinureninę i kwas ksanturynowy do co najmniej sześciu różnych stężeń, aby pokryć wszystkie zakresy kalibracji do końcowej objętości 150 mikrolitrów na próbkę. Po wirowaniu dodaj 150 mikrolitrów zimnego metanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza uzupełnionego 1% kwasem mrówkowym do każdej probówki w celu odbiałczenia próbki i szczelnie zakręć i ponownie zwiruj probówki. Po 40-minutowej inkubacji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza odwirować próbki i za pomocą automatycznej pipety przenieść 270 mikrolitrów każdego supernatantu do pojedynczych szklanych fiolek z płaskim dnem.

Umieścić fiolki w parowniku i użyć odpowiedniego programu do frakcji wodno-metanolowych, aby delikatnie odparować lotne składniki przez około 30 minut. Gdy probówki wyschną, rozpuść każdą próbkę w 60 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie i zwiruj próbki przed przeniesieniem każdego roztworu do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra w celu odwirowania. Nie naruszając osadu, przenieść supernatanty do fiolek chromatograficznych ze stożkowymi wkładkami szklanymi i umieścić fiolki w automatycznym próbniku LC-MS.

Przed uruchomieniem próbek należy przepłukać system LC fazą ruchomą, aby usunąć pęcherzyki i zalać wszystkie kanały rozpuszczalnika. Następnie należy przepłukać osłonę i kolumnę analityczną 100% acetonitrylem przez około 30 minut przed przepłukaniem układu 100% rozpuszczalnikiem A do momentu zaobserwowania stabilnego ciśnienia w kolumnie, a następnie ustawić odpowiednie parametry LC w oprogramowaniu do akwizycji danych i skonstruować listę roboczą do uruchomienia próbek w systemie LC. Aby skonstruować krzywą kalibracyjną, w oprogramowaniu do akwizycji danych dodaj wzorce kalibracyjne do listy roboczej i uruchom wzorce w trzech egzemplarzach, a następnie zintegruj i zmierz powierzchnię piku odpowiadającą 3-hydroksykinureninie, kinureninie, kwasowi 3-hydroksyantranilowemu, 3-nitrotyrozynie i kwasowi ksantrienowemu w czasie retencji wynoszącym odpowiednio około 4,4, 10, 16, 21 i 30 minut.

Aby pobrać próbki supernatantu z hodowli komórkowej in vitro, po 48 godzinach standardowej hodowli komórkowej komórek będących przedmiotem zainteresowania, przenieść 500 mikrolitrów supernatantu z każdej studzienki do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 mililitra i usunąć resztki komórek przez odwirowanie, a następnie przenieść supernatanty pożywki do nowych probówek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy i utrzymać granulki komórek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy oszacowania białka. Aby przygotować próbki do analizy LC-MS, przenieś 149,25 mikrolitrów każdej rozmrożonej próbki pożywki hodowlanej do nowej probówki o pojemności 1,5 mikrolitra i dodaj 0,75 mikrolitra 0,1 grama na litr roztworu 3NT do każdej probówki. Po przygotowaniu próbek, jak pokazano, dodać 150 mikrolitrów metanolu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza uzupełnionego 1% kwasem mrówkowym do każdej probówki i przygotować próbkę do analizy LC-MS, jak pokazano.

Gdy lista robocza jest kompletna, zmierz powierzchnię piku każdego analitu i użyj indywidualnego równania kalibracji liniowej dedykowanego dla każdego analitu do obliczenia stężeń analitów obecnych w każdej próbce doświadczalnej. Aby ocenić zawartość białka komórkowego odpowiadającą próbce pożywki hodowlanej, należy ponownie zawiesić każdą komórkę w 100 mikrolitrach PBS i zamrozić próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na godzinę przed rozmrożeniem ich na lodzie. Po trzykrotnym zamrożeniu i rozmrożeniu próbek, należy zebrać lizaty komórkowe przez odwirowanie i przenieść supernatanty do nowych probówek bez naruszania granulek.

Rozcieńczyć próbkę 10 razy świeżym PBS i dodać odpowiednie objętości roztworu wzorcowego albuminy surowicy bydlęcej w dwóch egzemplarzach do odpowiednich studzienek na płytce 96-dołkowej. Załadować od 10 do 15 mikrolitrów supernatantu próbki lizatu komórkowego do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki i napełnić zarówno basenik wzorcowy, jak i studzienkę na próbkę do końcowej objętości 50 mikrolitrów PBS na studzienkę. Następnie dodaj 200 mikrolitrów odczynnika Bradforda rozcieńczonego pięciokrotnie ultra czystą wodą do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji załadować płytkę do czytnika mikropłytek i zmierzyć absorbancję przy 595 nanometrach, a następnie skonstruować krzywą kalibracyjną, aby umożliwić obliczenie ilości białka w każdej próbce i podzielić stężenie każdej kinureniny przez całkowitą zawartość białka, aby znormalizować ilość kinureniny w każdej próbce na jeden mikrogram białka. Oto wyniki spektrometrii mas pojedynczego kwadrupola uzyskane podczas analizy pożywki zawierającej 4,5 grama na litr D-glukozy i 10% płodowej surowicy bydlęcej. Zwróć uwagę na mały pik wskazujący na obecność kinureniny w próbce.

Przeprowadź kontrolę jakości próbki przed zapotrzebowaniem rzeczywistych danych próbki w celu potwierdzenia odpowiednich czasów retencji analitów, ponieważ można zaobserwować przesunięcie sygnałów LC lub niedopasowania. Składniki matrycy koelucyjnej mogą generować jony o stosunku ładunku głównego wybranym dla docelowych analitów. Na przykład w tej analizie pik nieznanego związku pojawił się w okresie skanowania, podczas którego monitorowano stosunek jonów głównego ładunku 206.

Ze względu na niezgodność czasu retencji sygnał nie odpowiadał analitowi. Chociaż izotop tryptofanu miał ten sam stosunek jonów co ładunek główny 206, analiza chromatograficzna wykazała, że sygnał tryptofanu był dobrze oddzielony od sygnału kwasu ksanturenowego, co wskazuje, że poziom tryptofanu obecnego w badanej pożywce komórek rakowych nie miał wpływu na kwantyfikację kwasu ksanturenowego. Analiza pożywki hodowlanej z dwóch typów linii komórek nowotworowych pokazuje, że oceniane ludzkie komórki nabłonkowego raka piersi uwalniały różne ilości metabolitów tryptofanu, podczas gdy badane ludzkie komórki raka jajnika wytwarzały znacznie wyższe poziomy kinureniny.

Stosowanie wewnętrznego wzorca podczas przygotowywania próbki pomaga w niezawodnym pozyskiwaniu danych. Normalizacja danych do zawartości białka koryguje zmienność liczby komórek w poszczególnych studzienkach. Nasz protokół może być dalej rozszerzany w celu określenia dodatkowych analitów, ale może się kumulować w pożywce hodowlanej w różnych warunkach eksperymentalnych.