Name: Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę wykrywania powstawania nitrozamidów z nitrozoamin przez cytochrom P450 in vitro. Technika wykorzystuje wysoko czuły spektrometr masowy do oceny toksykologicznej i badań nad rakiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant nr. CA-81301 z National Cancer Institute. Dziękujemy Bobowi Carlsonowi za pomoc redakcyjną, dr Peterowi Villalta i Xun Mingowi za pomoc w zakresie spektrometrii mas w Analytical Biochemistry Shared Resource of the Masonic Cancer Center oraz dr Adamowi T. Zarthowi i dr Annie K. Michel za ich cenne dyskusje i wkład. Wspólny zasób biochemii analitycznej jest częściowo wspierany przez grant wsparcia National Cancer Institute Cancer Center CA-77598

1. Materiały i ogólne procedury
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj NNN zgodnie z wcześniejszym opisem15. Otrzymaj norkotyninę, bakulosomy P450 2A6, system regeneracji NADPH, 0,5-krotny bufor reakcyjny i wszystkie inne chemikalia lub rozpuszczalniki ze źródeł komercyjnych w klasie odczynnika.</li>
	<li>Rejestruj widma NMR na spektrometrze 500 MHz. Raportuj zmiany chemiczne w częściach na milion (ppm). Użyć pozostałych pików rozpuszczalnika jako wewnętrznych odniesień dla 1H-NMR (7,26 ppm CDCl3) i 13C-NMR (77,2 ppm CDCl3). 
	UWAGA: Przy dzieleniu pików stosowano następujące skróty: s = singlet, d = dublet, dd = dublet dubletów, dt = dublet trójek, dq = dublet kwartetów, ddd = dublet dubletu dubletów i m = multiplet.</li>
	<li>Wykonaj spektrometrię mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) dla wybranych związków na LTQ Orbitrap Velos i raportuj dane w m/z.</li>
	<li>Do chromatografii cienkowarstwowej (TLC) należy użyć wstępnie pokrytych poligramem płytek TLC z żelu krzemionkowego (40 mm x 80 mm, grubość 0,2 mm) ze wskaźnikiem fluorescencyjnym 254 nm. Wizualizacja płytek TLC za pomocą naświetlania lampą UV.</li>
	<li>Przeprowadzić chromatografię błyskową na żelu krzemionkowym o oczkach 60 A, 70-150 przy użyciu szklanej kolumny o wymiarach 1,5 cm x 15 cm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pozytywnej kontroli nitrozamidowej (N′-nitrozonorkotynina, NNC)
<ol>
	<li>Wysuszyć przez noc w piekarniku (16 h, ~140 °C) kolbę okrągłodenną o pojemności 25 ml zawierającą mieszadło magnetyczne. Rano schłodzić kolbę pod strumieniemN2, używając bełkotki olejowej, aby utrzymać natężenie przepływuN2 poniżej jednego pęcherzyka na sekundę. 
	UWAGA: Po schłodzeniu nie są wymagane żadne środki ostrożności, aby utrzymać kolbę w temperaturze poniżejN2.</li>
	<li>Do schłodzonej kolby dodać norkotyninę (31,8 mg, 0,196 mmol), bezwodnik octowy (5 ml) i kwas octowy (1 ml). Mieszaninę tę mieszać w sposób ciągły, schładzając do temperatury 0 °C w łaźni wodno-lodowej. 
	ostrożność: Bezwodnik octowy i kwas octowy są.</li>
	<li>Dodać NaNO2 (33,3 mg, 0,483 mmol) w jednej porcji i ciągle mieszać mieszaninę przez 2,5 godziny. Monitorować postęp reakcji za pomocą TLC (100% EtOAc, Rf = 0,19, patrz krok 1.4). 
	UWAGA: W tym czasie mieszanina będzie stawać się coraz bardziej żółta z okazjonalnym bulgotaniem.</li>
	<li>Ugasić reakcję, wlewając mieszaninę do lodowategoH2O(18 ml). Natychmiast wyekstrahować roztwór wodny z 18 ml CH2Cl2 w lejku separatorowym o pojemności 100 ml. Ekstrahować warstwę wodną co najmniej 2 razy za pomocą CH2Cl2 (9 ml każdy).</li>
	<li>Suszyć zebrane substancje organiczne w ciągu ~100 mgMgSO4 przez 2 minuty. Przefiltrować i zagęścić roztwór przez odparowanie obrotowe, aby uzyskać surowy, żółty olej. Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 30 °C podczas parowania, aby usunąć pozostałości kwasu octowego. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać, jeśli związek zostanie rozpuszczony w CH2Cl2, a roztwór będzie przechowywany w ciemności w temperaturze 2 - 8 °C.</li>
	<li>Oczyść surowy związek za pomocą chromatografii kolumnowej (patrz krok 1.5) używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 100% EtOAc jako eluentu16. 
	ostrożność: Z NNC i pokrewnymi nitrozamidami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ zakłada się, że są one substancjami rakotwórczymi dla ludzi.</li>
	<li>Rozpuść czysty związek w CDCl3 i użyj NMR (patrz krok 1.2), aby potwierdzić strukturę i określić molowość tego roztworu17. Roztwór należy przechowywać w ciemności w temperaturze 2 - 8 °C, aż będzie potrzebny. 
	UWAGA: Roztwór ten będzie stosowany jako kontrola pozytywna w teście in vitro (etap 3.5). Widma NMR i przesunięcia chemiczne są dostępne w informacjach uzupełniających.</li>
	<li>Za pomocą czystego roztworu NNC potwierdzić dokładną masę macierzystą i oznaczyć masy jonów produktu przez bezpośrednią infuzję na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS) zgodnie z parametrami opisanymi w krokach 1.3 i 4.3. 
	UWAGA: Masy produktu zostaną wykorzystane do wykrycia tego związku w teście metabolizmu in vitro (krok 4.3).</li>
</ol>
3. Przykład inkubacji in vitro nitrozoaminy-P450
<ol>
	<li>Wyjmij bakulosomy P450 2A6, system regeneracji Vivid-NADPH i 10 mM roztworu podstawowego NADP+ z zamrażarki w temperaturze -80 °C i pozwól im rozmrozić się na lodzie. Po rozmrożeniu rozcieńczyć bakulosomy i system regeneracji NADPH odpowiednio 1:10 i 1:50 w pojedynczej probówce o pojemności 1 ml z 0,5-krotnym buforem reakcyjnym. Podobnie, dodaj 3 μl roztworu podstawowego NADP+ do 97 μl 0,5-krotnego buforu reakcyjnego. 
	UWAGA: NADP+ jest wrażliwy na światło. Chroń ten roztwór, owijając jego pojemnik folią aluminiową. Roztwory enzymatyczne są wrażliwe na cykle zamrażania i rozmrażania; Ogranicz to do nie więcej niż 2 cykli. Przygotuj podwielokrotności w razie potrzeby dla przyszłych eksperymentów.</li>
	<li>Do każdej inkubacji dodać 50 μl roztworu enzymatycznego (zawierającego 5 pmol P450) do 1 ml probówki zawierającej 40 μl 4 μM roztworu NNN wykonanego z buforem reakcyjnym. Tę nową mieszaninę należy wstępnie inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a następnie dodać 10 μl rozcieńczonego roztworu NADP+. Inkubować cały system przez 1 - 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Stosowanie 5-minutowych odstępów czasu inkubacji (np. 5, 10, 15 minut itp.) zapewni wystarczający przebieg czasu tworzenia nitrozamidu.</li>
	<li>Po pożądanym czasie inkubacji schładzać, dodając najpierw 10 μl 3,0 N ZnSO4, a następnie 10 μl 3,0 N Ba(OH)2. Odwiruj ten roztwór, a utworzy się biały osad. Odwirować próbkę o masie 8000 x g przez 4 minuty w celu osadu. 
	UWAGA: Procedura nie może być przerywana na tym etapie, ponieważ powstałe nitrozamidy mają ograniczoną stabilność w roztworach wodnych. Długie przerwy mogą skutkować wynikami fałszywie ujemnymi.</li>
	<li>Natychmiast odpipetować supernatant i przeanalizować 2 μl metodą chromatografii cieczowej z dodatnią tandemową spektrometrią mas z jonizacją w wysokiej rozdzielczości (LC-NSI+-HRMS/MS, kroki 4.1 - 4.3).</li>
	<li>W przypadku inkubacji kontroli dodatniej odparować podwielokrotność zawierającą 100 fmol zsyntetyzowanego roztworu NNC do probówki o pojemności 1 ml pod strumieniemN2. Do tej fiolki dodać pełny układ enzymatyczny z kroku 3.2 i postępować zgodnie z opisem dla kroków 3.3 - 3.4.</li>
	<li>W przypadku inkubacji kontroli ujemnej należy przeprowadzić doświadczenie zgodnie z opisem (kroki 3.2 - 3.4), z wyjątkiem zastąpienia 50 μl roztworu enzymu buforem reakcyjnym 0,5x.</li>
</ol>
4. Przykładowe parametry do wykrywania nitrozamidów przez LC-NSI+-HRMS/MS
<ol>
	<li>W przypadku komponentu LC zastosuj następujący wieloetapowy gradient w kroku 4.2 do systemu UPLC za pomocą komercyjnej, ręcznie pakowanej 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm kryza kolumny kapilarnej.</li>
	<li>Używając 5 mM NH4OAc jako rozpuszczalnika A i MeCN jako rozpuszczalnika B, załadować próbkę do kolumny, pracując z prędkością 5% B przy 1 μl/min od 0 do 5 minut, a następnie zmniejszając natężenie przepływu do 0,3 μL/min. Następnie uruchom nachylenie od 5 do 20% B w ciągu 4 minut, a następnie rampę do 55% B w ciągu 10 minut, a następnie ponownie zrównoważ do 5% B.</li>
	<li>Wykonaj LC-NSI+-HRMS/MS na LTQ Orbitrap. Monitoruj NNC zarówno przez pełne skanowanie, jak i fragmentację MS2. Wykonaj pełne skanowanie w rozdzielczości 60 000 i wyodrębnij dokładną masę macierzystą (192.07670) z tolerancją masy 5 ppm. Użyj fragmentacji MS2 do wyizolowania jonów macierzystych (2,0 amu) i fragmentacji przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID) o energii zderzenia 25 eV, rozdzielczości 15 000 i czasie skanowania 30 ms. Wyodrębnić dokładne masy jonów poproduktowych NNC (m/z 192 m/z 134.04739 i 162.07874) z tolerancją masową 5 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Rom, W. N., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRom%2C+WN+%22Environmental+and+Occupational+Medicine%22">Environmental and Occupational Medicine</a>. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).</li>
<li>Preussmann, R., Stewart, B. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreussmann%2C+R+%22Chemical+Carcinogens%2C+ACS+Monograph+182%22">Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182</a>. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).</li>
<li>Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagee%2C+PN+%22Chemical+Carcinogens.+ACS+monograph+173%22">Chemical Carcinogens. ACS monograph 173</a>. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).</li>
<li>Zhu, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alaska+Native+smokers+and+smokeless+tobacco+users+with+slower+CYP2A6+activity+have+lower+tobacco+consumption%2C+lower+tobacco-specific+nitrosamine+exposure+and+lower+tobacco-specific+nitrosamine+bioactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation.</a> Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).</li>
<li>Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja961178h">Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).</li>
<li>Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403900787478">Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation.</a> Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).</li>
<li>Guttenplan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cytosol+on+mutagenesis+induced+by+N-nitrosodimethylamine%2C+N-nitrosomethylurea+and+%C3%A0-acetoxy-N-nitrosodimethylamine+in+different+strains+of+Salmonella%3Aevidence+for+different+ultimate+mutagens+from+N-nitrosodimethylmine%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine.</a> Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).</li>
<li>Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/carcin/article-abstract/14/6/1189/297752/Examination-of-carbonyl-derivatives-of?redirectedFrom=fulltext">Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens.</a> Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).</li>
<li>Chow, Y. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+YL+%22ACS+Symposium+Series%22">ACS Symposium Series</a>. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).</li>
<li>von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2A6-+and+CYP2A13-catalyzed+metabolism+of+the+nicotine+delta5%27%281%27%29iminium+ion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).</li>
<li>Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+cytochrome+P450+2E1-catalyzed+oxidation+of+ethanol+to+acetic+acid+via+acetaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).</li>
<li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+methyl+and+ethyl+nitrosamines+by+cytochrome+P450+2E1+and+2B1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1.</a> Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).</li>
<li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+N-nitrosoalkylamines+by+human+cytochrome+P450+2A6%3A+sequential+oxidation+to+aldehydes+and+carboxylic+acids+and+analysis+of+reaction+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps.</a> J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).</li>
<li>Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nitrosamide+formation+in+the+cytochrome+P450-mediated+metabolism+of+tobacco-specific+nitrosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines.</a> Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).</li>
<li>Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+tobacco-specific+N-nitrosamines+and+their+metabolites+and+results+of+related+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays.</a> Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).</li>
<li>Clark, A. G., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+chromatographic+technique+for+the+detection+of+dye-binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding.</a> Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).</li>
<li>Pauli, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+purity+evaluation+and+the+potential+of+quantitative+%281%29H+NMR+as+a+purity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay.</a> J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).</li>
<li>van der Heeft, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcapillary+column+switching+HPLC-electrospray+ionization+MS+system+for+the+direct+identification+of+peptides+presented+by+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules.</a> Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).</li>
<li>White, E. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01627a063">The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation.</a> J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).</li>
<li>Patten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cytochrome+P450+2A6+and+3A4+as+major+catalysts+for+N%27-nitrosonornicotine+alpha-hydroxylation+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes.</a> Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).</li>
<li>Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2A-catalyzed+metabolic+activation+of+structurally+similar+carcinogenic+nitrosamines%3A+N%27-nitrosonornicotine+enantiomers%2C+N-nitrosopiperidine%2C+and+N-nitrosopyrrolidine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine.</a> Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).</li>
<li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+biology%2C+and+carcinogenicity+of+tobacco-specific+N-nitrosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines.</a> Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).</li>
<li>von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+8-methoxypsoralen+on+cytochrome+P450+2A13%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyjaśnienie metabolizmu nitrozoamin jest kluczowym elementem zrozumienia ich rakotwórczości. Ponieważ zaangażowany cytochrom P450 i inne enzymy metaboliczne są polimorficzne, dalsze zastosowanie tej wiedzy może potencjalnie zidentyfikować osoby wysokiego ryzyka 1,4. Nowe dane wskazują, że możliwe jest dalsze utlenianie α-hydroksynitrozoamin, przypuszczalnych głównych metabolitów nitrozoamin biorących udział w wiązaniu DNA, do nitrozamidów; Nie zostało to jednak s...

N-nitrozaminy stanowią szeroką klasę kancerogenów występujących w diecie, produktach tytoniowych oraz w środowisku ogólnym; mogą być one również tworzone endogennie w organizmie człowieka1. Przebadano ponad 300 związków N-nitrozowych, z czego &gt;90% oceniono jako kancerogenne w modelach zwierzęcych2,3. Aby przejawić swoją kancerogenność, związki te muszą zostać najpierw aktywowane przez cytochromy P4501,2,3. Badania wykazują, że cytochromy P450 łatwo utleniają nitrozaminy do α-hydroksynitrozamin (Ryc. 1), które są związkami wysoce reaktywnymi o czasie połowicznego rozpadu wynoszącym ~5 s przed spontanicznym rozkładem do alkilodiazohydroksydów. Te ostatnie mogą alkilować DNA po utracie H2O i N2. Powstałe addukty DNA, jeśli nie zostaną naprawione, mogą powodować mutacje, które – jeśli wystąpią w krytycznych genach onkogennych lub supresorowych – prowadzą do rozwoju nowotworu1. Z tego powodu podjęto wiele wysiłków w celu pełnego zrozumienia szlaków metabolicznych, adduktów DNA oraz produktów metabolizmu wtórnego wynikających z utleniania kancerogennych nitrozamin przez cytochromy P450. Wiedza ta ma potencjalne zastosowanie w indywidualnej ocenie ryzyka raka4.
<img alt="Schemat reakcji chemicznej, wiązanie nitrosamin z DNA, enzym P450, nitrosamid, tworzenie adduktów DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ogólny i proponowany metabolizm nitrosamin. 
Nitrosaminy (1) są utleniane przez enzymy P450 do α-hydroksynitrosamin (2), które ulegają spontanicznemu rozkładowi do alkilodiazohydroksydów (3). Związki te mogą wiązać się z DNA, tworząc addukty DNA. Przypuszcza się, że 2 są dalej utleniane przez P450 do nitrosamidów 4. Te mogą bezpośrednio wiązać się z DNA, tworząc nowe addukty DNA, lub ulegać hydrolizie do 3, tworząc znane addukty DNA. R1 i R2 oznaczają dowolną grupę alkilową. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56312/56312fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Choć hipoteza α-hydroksynitrozamin jest mocno poparta obszernymi danymi, istnieje kilka niespójności; jedną z głównych jest krótki okres półtrwania α-hydroksynitrozamin5,6. Wiadomo, że związki te powstają w błonie siateczki śródplazmatycznej, a następnie alkilują DNA jądrowe. Biorąc pod uwagę ich czas życia wynoszący zaledwie kilka sekund, zastanawiające jest, w jaki sposób produkty pośrednie te przetrwają niezbędny transport przez cytozol. Jedna z hipotez zakłada, że część α-hydroksynitrozamin ulega procesywnemu utlenieniu do nitrosamidów7,8, które są w porównaniu z nimi dość stabilne9. Prawdopodobnie odbywa się to poprzez zatrzymanie α-hydroksynitrozamin w centrum aktywnym cytochromu P450. Precedensy dla tego rodzaju utleniania zaobserwowano w przypadku nikotyny10, alkoholi11 oraz prostych alkilonitrozamin12,13. Ponadto nitrosamidy są kancerogenami bezpośrednio działającymi2,3. Na podstawie ich reaktywności9 uważa się, że związki te tworzą addukty DNA identyczne z tymi powstającymi z α-hydroksynitrozamin, a także nowe, nieznane dotąd addukty DNA (Ryc. 1). Zatem hipoteza ta wyjaśnia nie tylko transport przez cytozol, ale również powstawanie produktów uszkodzeń DNA.
W niniejszej pracy opisano ogólny protokół oceny konwersji nitrozoamin do nitrozoamidów katalizowanej in vitro przez cytochrom P450. Jako przykład przedstawiono wcześniej opisaną konwersję N′-nitrozonornikotyny (NNN) do N′-nitrozonornikotyny (NNC) przez cytochrom P450 2A614. Zastosowanie tego protokołu do szerokiego zakresu systemów substrat-enzym pomoże określić znaczenie nitrozoamidów w ogólnym metabolizmie nitrozoamin.

<table><tbody><tr><td>Norkotynina</td><td>AKoS GmbH (Steinen, Niemcy)</td><td>CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431311</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek baru</td><td>Sigma-Aldrich 433373</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek metylenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ViVid CYP2A6 Zestaw do niebieskiego przesiewania</td> Life <td>Technologies</td><td>PV6140</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td></td></tr><tr><td>probówki 0,5 ml</td><td>Fisher</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>100 ml kolba okrągłodenna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z510424</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Kolba Erlenmeyera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4980125</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Lejek separacyjny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z261017</td><td></td></tr><tr><td>25 ml okrągły dolna kolba</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>500 MHz Spektrometr NMR</td><td>Wirówka Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-22R</td> Fiolki <td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>ChromTech</td><td>CTC&ndash; 0957&ndash; BOND</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Rurka NMR Sigma-Aldrich</td><td>Z127035</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274682</td><td></td></tr><tr><td>P1000, P200 i P10</td><td>Parownik obrotowy Eppendorf</td><td></td><td></td></tr> System RSLCnano <tr><td></td><td></td> UPLC <td></td> Sigma-Ald Z691410 <td></td>rich</tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wytrząsaniem</td><td>Fisher</td><td>FSSWB15</td><td></td></tr><tr><td>Płytka mieszająca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6795420</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna PicoFrit</td><td>Nowy obiektyw</td><td>PF3607515N5</td><td></td></tr><tr><td>Luna C18, 5 um</td><td>Phenomenex</td><td>535913-1</td><td></td></tr></tbody></table>

ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom p450

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrozoaminy to dobrze znana grupa środowiskowych czynników rakotwórczych, które wymagają utleniania cytochromu P450, aby wykazywać aktywność. Przyjęty mechanizm aktywacji metabolicznej polega na tworzeniu α-hydroksynitrozoamin, które spontanicznie rozkładają się do czynników alkilujących DNA. Nagromadzenie uszkodzeń DNA i wynikające z nich mutacje mogą ostatecznie prowadzić do raka. Nowe dowody wskazują, że α-hydroksynitrozoaminy mogą być dalej utleniane do nitrozoamidów przez cytochrom P450. Ponieważ nitrozamidy są na ogół bardziej stabilne niż α-hydroksynitrozoaminy i mogą również alkilować DNA, nitrozamidy mogą odgrywać rolę w kancerogenezie. W niniejszym raporcie opisujemy ogólny protokół oceny produkcji nitrozamidów w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmu nitrozoamin katalizowanego cytochromem P450. Protokół ten wykorzystuje ogólne podejście do syntezy odpowiednich nitrozamidów i test metabolizmu cytochromu P450 in vitro przy użyciu chromatografii cieczowej, jonizacji nanosprayu, tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do wykrywania. W badaniu tym metoda wykryła N′-nitrozonorkotyninę jako drugorzędny metabolit N′-nitrosonornikotyny. Metoda charakteryzuje się wysoką czułością i selektywnością dzięki dokładnej detekcji masy. Zastosowanie tej metody do szerokiej gamy układów nitrozoamina-cytochrom P450 pomoże określić ogólność tej przemiany. Ponieważ cytochromy P450 są polimorficzne i różnią się aktywnością, lepsze zrozumienie powstawania nitrozamidów może pomóc w indywidualnej ocenie ryzyka zachorowania na raka.

W oparciu o prace White et al.19, norcotyninę poddano nitrosowaniu do NNC w sposób czysty i z wysoką wydajnością (80 - 92%), aby uzyskać standard do eksperymentu in vitro. Dowody strukturalne potwierdzające przebieg reakcji uzyskano z analiz spektroskopowych, w tym 1H-NMR, 13C-NMR, COSY i HSQC (Informacje uzupełniające), a także z HRMS, która potwierdziła masę jonu rodzica [M + H]+ z dokładnością do 5 ppm względem ...

α-hydroksylacja rakotwórczych nitrozoamin przez cytochrom P450s jest akceptowanym szlakiem metabolicznym, który wytwarza produkty pośrednie uszkadzające DNA, które powodują mutacje. Jednak nowe dane wskazują, że może dojść do dalszego utleniania do nitrozamidów. Opisujemy ogólną metodę wykrywania nitrozamidów wytwarzanych w wyniku katalizowanego in vitro metabolizmem nitrozoamin katalizowanym cytochromem P450.

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Ogólnym celem tej metodologii jest ustalenie, czy cytochrom P450 może procesowo utleniać n nitrozoamin do n nitozamidów in vitro. Metoda ta jest korzystna dla toksykologii, ponieważ pozwala ocenić, czy nitozaminy są bezpośrednio metabolizowane do nitrozamidów. Ponieważ nitrozamidy są stosunkowo stabilne w alkilatowym DNA, mogą odgrywać rolę w kancerogenezie.Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie bardzo czułego spektrometru masowego, który daje granice wykrywalności niższe niż wcześniej osiągane dla podobnych testów metabolizmu nitrozoamin in vitro. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść w piekarniku kolbę okrągłodenną o pojemności 25 mililitrów, zawierającą mieszadło magnetyczne. Suszyć przez 16 godzin w temperaturze 140 stopni Celsjusza.Następnie przenieść kolbę do dygestorium i schłodzić ją pod strumieniem azotu. Dodać 31,8 miligrama norkotyniny, pięć mililitrów bezwodnika octowego i jeden mililitr kwasu octowego do kolby i rozpocząć mieszanie. Przenieść kolbę do lodowatej łaźni wodnej.Dodać 33,3 miligrama azotynu sodu. Kontynuuj mieszanie przez 2,5 godziny, a następnie wlej reakcję do 18 mililitrów lodowatej wody, aby ugasić reakcję. Natychmiast przenieść roztwór do rozdzielacza zawierającego 18 mililitrów DCM i wyekstrahować roztwór wodny.Ekstrahuj warstwę wodną jeszcze dwa razy, za każdym razem używając 9 mililitrów DCM. Następnie wysusz zebrane substancje organiczne w ponad 100 miligramach siarczanu magnezu przez dwie minuty. Po przefiltrowaniu użyj wyparki obrotowej, aby stężyć roztwór w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby uzyskać surowy żółty olej.Oczyścić surowy związek za pomocą chromatografii kolumnowej, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie rozpuść czysty związek w jednym mililitrze deuterowanego chloroformu. Za pomocą NMR potwierdź strukturę i molowość roztworu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przechowuj ten roztwór w ciemności w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Następnie potwierdź dokładną masę macierzystą i oznacz masy jonów produktowych czystego roztworu NNC przez bezpośrednią infuzję na spektrometrze masowym o wysokiej rozdzielczości, jak opisano w protokole tekstowym. Na początek wyjmij potrzebne odczynniki z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza i rozmroź na lodzie.Po rozmrożeniu użyj buforu reakcyjnego o sile 0,5, aby rozcieńczyć bakulosomy w systemie regeneracji NADPH odpowiednio 1-10 i 1-50 w probówce o pojemności jednego mililitra. Następnie dodaj trzy mikrolitry roztworu podstawowego NADP do jednomililitrowej probówki zawierającej 97 mikrolitrów buforu reakcyjnego o sile 0,5. Do każdej inkubacji należy przygotować jednomililitrową probówkę, dodając 40 mikrolitrów czteromikromolowego roztworu NNN wykonanego z buforem reakcyjnym.Dodać 50 mikrolitrów roztworu enzymatycznego zawierającego pięć pikomoli P450 2A6 do każdej probówki. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni przez dwie minuty. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu NADP+ do każdej probówki.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza od jednej do 30 minut. Następnie najpierw dodaj 10 mikrolitrów 3,0 normalnego siarczanu, a następnie dodaj 10 mikrolitrów 3,0 normalnego wodorotlenku baru, aby wygasić reakcję. Zwiruj roztwór, aby utworzyć biały osad.Następnie odwiruj w temperaturze ośmiu tysięcy G przez cztery minuty. Natychmiast zebrać supernatant i przeanalizować dwa mikrolitry za pomocą chromatografii cieczowej dodatniej jonizacji nanoelektronsprayu w tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. W tym badaniu norkotynina jest nitrozowana do NNC w sposób czysty i z wysoką wydajnością, co stanowi standard do stosowania w eksperymencie in vitro.Powodzenie reakcji jest weryfikowane za pomocą analizy spektroskopowej, w tym tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, która potwierdziła, że masa rodzica mieści się w granicach pięciu części na milion wartości teoretycznej. Fragmentacja NNC za pomocą tandemowej spektrometrii mas jest następnie wykorzystywana do określenia najobfitszych mas jonów produktowych. Jak widać, dwa najliczniejsze jony produktowe to 134 i 162, z dokładnym wykrywaniem masy z dokładnością do pięciu miejsc po przecinku.Zsyntetyzowany NNC jest następnie wykorzystywany jako wzorzec do testu metabolizmu P450 in vitro. W zastosowanych warunkach syntetyczny NNC eluuje po około 17,5 minuty, z dobrze rozdzielonymi pikami zarówno w kanale jonów macierzystych, jak i jonów produktowych. Zgodnie z kontrolą pozytywną, tworzenie NNC obserwuje się w inkubacjach trwających jedną minutę, pięć minut i 10 minut.Przy prawidłowym wykonaniu analizę spektroskopową syntezy nitrozamidu można przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Podobnie test in vitro z wielokrotnymi inkubacjami nie powinien trwać dłużej niż osiem godzin. Implikacje tej techniki rozciągają się na ocenę ryzyka nowotworów związanych z tytoniem, ponieważ pomiar biomarkerów związanych z nitrozamidem może dostarczyć informacji na temat indywidualnej aktywacji nitrozoamin.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim przetwarzaniu inkubacji enzymów. Nitrozamidy hydrolizują w tych warunkach i nie powinny długo czekać na analizę masy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wzorce nitrozamidów i ocenić, czy są one tworzone in vitro przez odpowiedni system cytochromu P450 nitrozoaminy.Nie zapominaj, że praca z NNN, NNC lub pokrewnymi czynnikami rakotwórczymi może być niebezpieczna. Z tymi związkami należy zawsze obchodzić się w dygestorium, nosząc fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice. Dodatkowo wszystkie odpady rakotwórcze powinny być odpowiednio przechowywane i oznakowane.

a-general-method-for-detecting-nitrosamide-formation-vitro-metabolism

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Tlenek azotu (NO) jest ważną cząsteczką sygnałową w homeostazie naczyń krwionośnych. Produkcja in vivo NIE jest zbyt niska do bezpośredniego pomiaru. Chemiluminescencja dostarcza użytecznych informacji na temat cyklu NO poprzez pomiar jego prekursorów i produktów utleniania, azotynów i azotanów. Wyjaśniono oznaczanie azotynów / azotanów w tkankach i płynach ustrojowych.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Selektywna i czuła metoda tandemowej chromatografii mas chromatografii cieczowej (LC-MS/MS) w połączeniu z efektywną ekstrakcją do fazy stałej na 96-dołkowej mikropłytce z wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX) została opracowana do pomiaru wolnej 3-nitrotyrozyny (3-NT) w ludzkim moczu o wysokiej przepustowości, która jest odpowiednia do zastosowań klinicznych.

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Prezentujemy wygodną ekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC) z detekcją elektrochemiczną (ECD) do jednoczesnego oznaczania trzech neuroprzekaźników monoaminowych i dwóch ich metabolitów w moczu niemowląt. Identyfikujemy również metabolit MHPG jako potencjalny biomarker do wczesnej diagnostyki uszkodzeń mózgu u niemowląt.

Wygodna metoda ekstrakcji i analizy za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej neuroprzekaźników katecholaminy i ich metabolitów

Ocena siły działania chemikaliów i leków środowiskowych, które mają być enzymatycznie bioaktywowane do produktów pośrednich generujących kowalencyjne addukty DNA, jest ważnym polem w rozwoju raka i jego leczeniu. Opisano metody aktywacji związków w celu utworzenia adduktów DNA, a także techniki ich wykrywania i kwantyfikacji.

Tworzenie kowalencyjnych adduktów DNA przez enzymatycznie aktywowane czynniki rakotwórcze i leki in vitro oraz ich oznaczanie za pomocą 32p-posttagingu

Prezentujemy metodę wykrywania chemicznych modyfikacji białek atmosferycznych 3-nitrotyrozyny za pomocą krążków o średnicy 6 mm wyciętych z filtrów wstępnych próbnika powietrza za pomocą wysokowydajnego detektora chromatografii cieczowej i elektrochemicznego (HPLC-ECD).

Wykrywanie 3-nitrotyrozyny w środowisku atmosferycznym za pomocą wysokowydajnego systemu chromatografii cieczowej z detektorem elektrochemicznym

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Poznaj metodę wykrywania powstawania nitrozamidów z nitrozoamin przez cytochrom P450 in vitro. Technika wykorzystuje wysoko czuły spektrometr masowy do oceny toksykologicznej i badań nad rakiem.

Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

Przeglądaj więcej filmów