Ogólna metoda wykrywania powstawania nitrozamidów w metabolizmie nitrozoamin in vitro przez cytochrom P450

Ogólnym celem tej metodologii jest ustalenie, czy cytochrom P450 może procesowo utleniać n nitrozoamin do n nitozamidów in vitro. Metoda ta jest korzystna dla toksykologii, ponieważ pozwala ocenić, czy nitozaminy są bezpośrednio metabolizowane do nitrozamidów. Ponieważ nitrozamidy są stosunkowo stabilne w alkilatowym DNA, mogą odgrywać rolę w kancerogenezie.

Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie bardzo czułego spektrometru masowego, który daje granice wykrywalności niższe niż wcześniej osiągane dla podobnych testów metabolizmu nitrozoamin in vitro. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść w piekarniku kolbę okrągłodenną o pojemności 25 mililitrów, zawierającą mieszadło magnetyczne. Suszyć przez 16 godzin w temperaturze 140 stopni Celsjusza.

Następnie przenieść kolbę do dygestorium i schłodzić ją pod strumieniem azotu. Dodać 31,8 miligrama norkotyniny, pięć mililitrów bezwodnika octowego i jeden mililitr kwasu octowego do kolby i rozpocząć mieszanie. Przenieść kolbę do lodowatej łaźni wodnej.

Dodać 33,3 miligrama azotynu sodu. Kontynuuj mieszanie przez 2,5 godziny, a następnie wlej reakcję do 18 mililitrów lodowatej wody, aby ugasić reakcję. Natychmiast przenieść roztwór do rozdzielacza zawierającego 18 mililitrów DCM i wyekstrahować roztwór wodny.

Ekstrahuj warstwę wodną jeszcze dwa razy, za każdym razem używając 9 mililitrów DCM. Następnie wysusz zebrane substancje organiczne w ponad 100 miligramach siarczanu magnezu przez dwie minuty. Po przefiltrowaniu użyj wyparki obrotowej, aby stężyć roztwór w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby uzyskać surowy żółty olej.

Oczyścić surowy związek za pomocą chromatografii kolumnowej, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie rozpuść czysty związek w jednym mililitrze deuterowanego chloroformu. Za pomocą NMR potwierdź strukturę i molowość roztworu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przechowuj ten roztwór w ciemności w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Następnie potwierdź dokładną masę macierzystą i oznacz masy jonów produktowych czystego roztworu NNC przez bezpośrednią infuzję na spektrometrze masowym o wysokiej rozdzielczości, jak opisano w protokole tekstowym. Na początek wyjmij potrzebne odczynniki z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza i rozmroź na lodzie.

Po rozmrożeniu użyj buforu reakcyjnego o sile 0,5, aby rozcieńczyć bakulosomy w systemie regeneracji NADPH odpowiednio 1-10 i 1-50 w probówce o pojemności jednego mililitra. Następnie dodaj trzy mikrolitry roztworu podstawowego NADP do jednomililitrowej probówki zawierającej 97 mikrolitrów buforu reakcyjnego o sile 0,5. Do każdej inkubacji należy przygotować jednomililitrową probówkę, dodając 40 mikrolitrów czteromikromolowego roztworu NNN wykonanego z buforem reakcyjnym.

Dodać 50 mikrolitrów roztworu enzymatycznego zawierającego pięć pikomoli P450 2A6 do każdej probówki. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni przez dwie minuty. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu NADP+ do każdej probówki.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza od jednej do 30 minut. Następnie najpierw dodaj 10 mikrolitrów 3,0 normalnego siarczanu, a następnie dodaj 10 mikrolitrów 3,0 normalnego wodorotlenku baru, aby wygasić reakcję. Zwiruj roztwór, aby utworzyć biały osad.

Następnie odwiruj w temperaturze ośmiu tysięcy G przez cztery minuty. Natychmiast zebrać supernatant i przeanalizować dwa mikrolitry za pomocą chromatografii cieczowej dodatniej jonizacji nanoelektronsprayu w tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. W tym badaniu norkotynina jest nitrozowana do NNC w sposób czysty i z wysoką wydajnością, co stanowi standard do stosowania w eksperymencie in vitro.

Powodzenie reakcji jest weryfikowane za pomocą analizy spektroskopowej, w tym tandemowej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, która potwierdziła, że masa rodzica mieści się w granicach pięciu części na milion wartości teoretycznej. Fragmentacja NNC za pomocą tandemowej spektrometrii mas jest następnie wykorzystywana do określenia najobfitszych mas jonów produktowych. Jak widać, dwa najliczniejsze jony produktowe to 134 i 162, z dokładnym wykrywaniem masy z dokładnością do pięciu miejsc po przecinku.

Zsyntetyzowany NNC jest następnie wykorzystywany jako wzorzec do testu metabolizmu P450 in vitro. W zastosowanych warunkach syntetyczny NNC eluuje po około 17,5 minuty, z dobrze rozdzielonymi pikami zarówno w kanale jonów macierzystych, jak i jonów produktowych. Zgodnie z kontrolą pozytywną, tworzenie NNC obserwuje się w inkubacjach trwających jedną minutę, pięć minut i 10 minut.

Przy prawidłowym wykonaniu analizę spektroskopową syntezy nitrozamidu można przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Podobnie test in vitro z wielokrotnymi inkubacjami nie powinien trwać dłużej niż osiem godzin. Implikacje tej techniki rozciągają się na ocenę ryzyka nowotworów związanych z tytoniem, ponieważ pomiar biomarkerów związanych z nitrozamidem może dostarczyć informacji na temat indywidualnej aktywacji nitrozoamin.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim przetwarzaniu inkubacji enzymów. Nitrozamidy hydrolizują w tych warunkach i nie powinny długo czekać na analizę masy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować wzorce nitrozamidów i ocenić, czy są one tworzone in vitro przez odpowiedni system cytochromu P450 nitrozoaminy.

Nie zapominaj, że praca z NNN, NNC lub pokrewnymi czynnikami rakotwórczymi może być niebezpieczna. Z tymi związkami należy zawsze obchodzić się w dygestorium, nosząc fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice. Dodatkowo wszystkie odpady rakotwórcze powinny być odpowiednio przechowywane i oznakowane.