Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ekstrakcja endosymbiontów z maleńkich owadów do dalszych eksperymentów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w ujęciu entomologii i makrobiologii, ponieważ większość endosymbiontów nie może być hodowana in vitro. Bardzo ważne jest wyizolowanie odpowiedniej ilości bakterii do dalszych eksperymentów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wygodnie wyizolować endosymbionty bakteryjne mączlika. Można to również zastosować do izolacji endosymbiontów od innych owadów, takich jak mszyce, skoczki roślinne i wciornastki. Na początek zbierz pojedynczego dorosłego mączlika i homogenizuj go w 30 mikrolitrach buforu do lizy.

Inkubować homogenat w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Używając DNA mączlika i starterów mitochondialnej oksydazy cytochromowej 1, przygotuj 25 mikrolitrowych reakcji PCR przy użyciu następujących odczynników.

Następnie uruchom reakcje PCR za pomocą pokazanego tutaj programu. Następnie użyj zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z zalecanym protokołem, aby oczyścić produkt PCR. Następnie należy przeprowadzić analizę sekwencji zgodnie z protokołem tekstowym.

Aby amplifikować określone geny każdego endosymbionta w obrębie mączlika, należy przeprowadzić PCR na DNA mączlika. Zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem, poddaj amplifikowaną próbkę elektroforezie w żelu agarozowym i sekwencjonowaniu w celu określenia gatunków bakterii w mączliku i zidentyfikowania specyficznego genu każdej bakterii. Aby wypreparować i oczyścić bakteriomę mączlika, dodaj 100 mikrolitrów 1x roztworu PBS na szkiełko mikroskopowe.

Następnie zbierz trzecie lub czwarte nimfy z liści bawełny. I zanurz je w PBS. Pod mikroskopem użyj cienkich igieł entomologicznych, aby wyciągnąć bakteriomy z ciała mączlika.

Zachowaj ostrożność podczas izolowania bakteriomu, ponieważ jest on mały i delikatny. Delikatnie wytnij otwór po jednej stronie nimfy i lekko dociśnij drugą stronę, aby wypuścić bakteriomy. Następnie zamontuj mikroładowarkę o pojemności 20 mikrolitrów na pipecie o pojemności od 0,5 do 10 mikrolitrów i wyekstrahuj pojedynczą bakteriomę z PBS do mikroładowarki.

Umyj bakteriom, aby wyeliminować zanieczyszczenie innych tkanek mączlika, wprowadzając bakteriom do PBS i ekstrahując go. Powtórz pranie trzy razy. Zdecydowanie zaleca się powtórzenie prania, aby wyeliminować jak najwięcej zanieczyszczeń.

Natychmiast odpipetować umytą bakteriomę do probówki wirówkowej zawierającej 60 mikrolitrów PBS. Strzykawka przefiltrować zmontowany bakteriom przez membranę filtracyjną o grubości pięciu mikrometrów. Powtórz filtrację wiele razy, aby dokładnie przesunąć zmieszaną ciecz przez membranę.

W celu amplifikacji filtratu należy przygotować bufor D2, który będzie stosowany z zalecanym protokołem amplifikacji genomowego DNA z krwi lub komórek z pewnymi modyfikacjami. Bezpośrednio dodać 1,5 mikrolitra filtratu do probówki wirówkowej, a następnie 1,5 mikrolitra buforu D2. Dobrze wymieszać i inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra roztworu zatrzymującego.

Dodać 15 mikrolitrów buforu reakcyjnego i jeden mikrolitr polimerazy DNA i delikatnie wymieszać. Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 16 godzin, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Przeprowadzić PCR bezpośrednio na amplifikowanym filtracie przy użyciu specjalnych starterów przeznaczonych dla bakterii, aby potwierdzić gatunki bakterii.

Przeprowadź również PCR, aby potwierdzić, czy występuje zanieczyszczenie z genomu gospodarza, używając starterów dla genów mączlika, beta-aktyny i EF1, zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą. Na koniec przeprowadź sekwencjonowanie metagenomu zgodnie z protokołem tekstowym. Na tym rysunku pokazano bawełnę do hodowli mączlików i kilka etapów rozwoju mączlików.

W tym dorosły oraz nimfy w pierwszym, drugim i czwartym stadium rozwojowym. Analiza FISH endosymbiontów Portiera i Hamiltonella w obrębie czwartej nimfy w stadium rozwojowym MEAM1 jest pokazana tutaj. Obserwuje się nakładanie się dwóch bakterii i obie są ograniczone do bakteriocytów mączlika.

Pokazano tutaj obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej endosymbionta Portiera mączlika, co wskazuje, że Portiera może stracić ścianę komórkową. Po sekwencjonowaniu i oczyszczeniu danych dotyczących skażenia adapterami i duplikacjami uzyskano pełny genom obligatoryjnego symbionta Portiera. W wyniku czego powstaje okrągły genom składający się z 358 232 par zasad.

Ponadto uzyskano szkic genomu Hamiltonelli, który zawierał 138 kontigów, które zostały złożone w 89 rusztowań w oparciu o sparowane relacje końcowe. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby chronić próbki przed zanieczyszczeniem bakteriami środowiskowymi.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne analizy, takie jak sekwencja RZS i bakteriom masowym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja genów endosymbiontów i metabolizm. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny entomologii i mikrobiologii do zbadania funkcji endosymbiontów u owadów lub stawonogów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić symbionty z bakteriomanów owadów.

Nie zapominaj, że praca z niektórymi odczynnikami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.