Name: Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci w celu badań nad mutualizmem owadów i mikroorganizmów. Protokół obejmuje homogenizację, filtrację oraz amplifikację DNA do sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla tego badania zostało zapewnione przez National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) oraz National Natural Science Foundation of China (31390421).

1. Hodowla mączlików i identyfikacja gatunków tajemniczych
<ol>
	<li>Gatunki mączlików należy utrzymywać na bawełnie Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) w klatkach w standardowych warunkach 27 ± 1 °C, wilgotności 70 ± 10% i 14 godzin w reżimie jasnym: 10 godzin ciemności.</li>
	<li>Zebrać pojedynczego dorosłego mączlika i homogenizować w 30 μl buforu do lizy (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] żelatyna, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinaza K).</li>
	<li>Inkubować homogenat w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 100 °C przez 10 minut 
	UWAGA: W razie potrzeby czas inkubacji w temperaturze 65 °C można wydłużyć. Czas inkubacji w temperaturze 100 °C powinien być krytycznie kontrolowany, aby w wystarczającym stopniu dezaktywować proteinazę K i uniknąć uszkodzenia DNA.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu DNA mączlika (uzyskanego w sekcji 1.3) na podstawie mitochondrialnych starterów oksydazy cytochromowej I. 
	COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3' 
	COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcje PCR w końcowej objętości 25 μl zawierającej 1 U polimerazy DNA Taq, 2,5 μl 10x buforu, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM każdego startera i 2 μL DNA mączlika.</li>
		<li>Stosować następujące warunki procedury PCR: początkowa denaturacja 95 °C przez 3 minuty, a następnie 35 cykli 95 °C przez 45 s (denaturacja), 50 °C przez 45 s (wyżarzanie) i 72 °C przez 1 minutę (przedłużenie) i kolejne 10 minut w temperaturze 72 °C przez dalsze przedłużenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść produkt amplifikowany PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z zalecanym protokołem.</li>
	<li>Sekwencjonować oczyszczone próbki DNA za pomocą systemu sekwencjonowania próbek DNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przeanalizuj sekwencje za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), aby zidentyfikować tajemnicze gatunki mączlika i uniknąć zanieczyszczenia innymi gatunkami.</li>
</ol>
2. Identyfikacja i lokalizacja endosymbiontów
<ol>
	<li>Przeprowadzić PCR na DNA mączlika (uzyskanym w kroku 1.3) w celu amplifikacji specyficznych genów każdego endosymbionta w obrębie mączlika (receptura PCR jest opisana w sekcji 1.4, a procedury PCR i startery są wymienione w Tabeli 1).</li>
	<li>Poddaj amplifikowaną próbkę elektroforezie w żelu agarozowym zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem20 (1% żel agarozowy, tris-acetate-EDTA jako bufor do biegania, napięcie 5 V/cm) w celu zidentyfikowania specyficznego genu każdej bakterii.</li>
	<li>Odzyskaj i zsekwencjonuj każde prążki, aby określić gatunki bakterii w mączliku (patrz punkty 1.5-1.7).</li>
	<li>Wykonaj fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) na mączlikach, aby zidentyfikować lokalizację endosymbiontów zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem19. 
	UWAGA: W razie potrzeby zwiększ stężenie sond fluorescencyjnych.</li>
</ol>
3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
<ol>
	<li>Zanurzyć i utrwalić mączliki w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) zawierającym 2,5% [vol/vol] glutaraldehydu przez 4 godziny.</li>
	<li>Przemyć próbki w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) trzy razy, za każdym razem po 15 minut.</li>
	<li>Zanurzyć i ponownie utrwalić próbki w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,0) zawierającym 1% [wag./obj.] OsO4 przez 2 godziny.</li>
	<li>Odwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii etanolu (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% i 100%), za każdym razem przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieść próbki i zanurzyć je w 100% acetonie na 20 minut.</li>
	<li>Umieścić próbki w mieszaninie 100% acetonu i 100% żywicy Spurr (1:1) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbki do mieszaniny 100% acetonu i 100% żywicy Spurr (1:3) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieść próbki i zanurzyć je w 100% żywicy Spurr (inkubowanej w temperaturze 70 °C) na ponad 9 godzin.</li>
	<li>Próbki mączlika należy podzielić na sekcje za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Zabarwić ultracienkie warstwy (uzyskane w sekcji 3.9) przez zanurzenie w absolutnym octanie uranylu na 5-10 minut, a następnie zanurzenie w 50% alkalicznym roztworze cytrynianu ołowiu na kolejne 5-10 min. 
	UWAGA: Objętości odczynników użytych w sekcji 3.1-3.10 zależą od próbek. Upewnij się, że próbki są zanurzone w odczynnikach.</li>
	<li>Obserwuj próbki pod transmisyjną mikroskopią elektronową (15 000 razy) w celu określenia lokalizacji, kształtu i wielkości bakterii do dalszego wykorzystania (patrz sekcja 4.6).</li>
</ol>
4. Sekcja i oczyszczanie bakteriomu mączlika
<ol>
	<li>Dodać 100 μl 1x roztworu PBS na szkiełko mikroskopowe. Zbierz kilka nimf w 3. lub 4. stadium z liści bawełny i zanurz je w roztworze PBS.</li>
	<li>Użyj cienkich igieł entomologicznych pod mikroskopem stereoskopowym i wyciągnij bakteriomy z ciała mączlika.
	<ol>
		<li>Delikatnie wytnij otwór po jednej stronie nimfy i lekko dociśnij drugą stronę, aby wypuścić bakteriomy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj mikroładowarkę o pojemności 20 μl (z końcówką prowadzącą naciętą tak, aby odpowiadała rozmiarowi bakteriomu) na pipecie o pojemności 0,5-10 μl. Wyekstrahuj pojedynczy bakteriom z roztworu PBS do mikroładowarki.</li>
	<li>Przemyć bakteriom, aby wyeliminować zanieczyszczenie innych tkanek mączlika, pipetując bakteriom do roztworu PBS i ekstrahując bakteriom. Powtórz trzy razy.</li>
	<li>Natychmiast odpipetować przemyty bakteriom do probówki wirówkowej zawierającej 60 μl 1x PBS roztworu.</li>
	<li>Przefiltruj strzykawką zmontowany bakteriom przez membranę filtracyjną o wielkości 5 μm (określoną na podstawie wielkości bakterii i jądra bakteriocytów u mączlika). Powtórz wiele razy, aby dokładnie przesunąć zmieszaną ciecz przez membranę filtracyjną. 
	UWAGA: Aby osiągnąć lepszy wynik amplifikacji i sekwencjonowania, zbierz ponad 100 bakteriomów. Najpierw zwilż membranę filtracyjną za pomocą 1x roztworu PBS, aby zmniejszyć utratę bakterii wiążących się z membraną.</li>
</ol>
5. Amplifikacja genomów endosymbiontów
<ol>
	<li>Amplifikować filtrat (zawierający głównie endosymbionty mączlika) za pomocą zestawu do amplifikacji DNA zgodnie z zalecanym protokołem z pewnymi modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Wybierz zalecany protokół amplifikacji genomowego DNA z krwi lub komórek i przygotuj bufor D2 do kolejnego eksperymentu.</li>
		<li>Bezpośrednio dodać 1,5 μl filtratu (patrz sekcja 4.6) do probówki wirówkowej, a następnie 1,5 μl buforu D2 i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Inkubować na lodzie przez 10 minut i dodać 1,5 μl roztworu zatrzymującego.</li>
		<li>Dodać 15 μl buforu reakcyjnego i 1 μl polimerazy DNA i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 16 godzin, a następnie przez 3 minuty w temperaturze 65 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić PCR bezpośrednio na amplifikowanym filtracie (w razie potrzeby rozcieńczyć amplifikowane próbki), stosując specjalne startery przeznaczone dla bakterii w celu potwierdzenia gatunków bakterii (patrz sekcja 2.1).</li>
	<li>Przeprowadź PCR w celu potwierdzenia, czy doszło do zanieczyszczenia genomu gospodarza, używając genów mączlika beta-aktyny i starterów EF1 zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą21 (receptura PCR jest opisana w punkcie 1.4).</li>
</ol>
6. Sekwencjonowanie metagenomu endosymbiont
<ol>
	<li>Amplifikowany filtrat należy poddać działaniu spektrofotometru i fluorometru (zgodnie z instrukcjami producenta) przed sekwencjonowaniem w celu zbadania jakości próbek i sprawdzenia, czy próbki spełniają kryteria sekwencjonowania.</li>
	<li>Poddaj amplifikowany sekwenator genomu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Buchner, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jobm.19670070219/abstract">Endosymbiosis of animals with plant microorganisms.</a> J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).</li>
<li>Sloan, D. B., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosymbiotic+bacteria+as+a+source+of+carotenoids+in+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Letters%22%5BJournal%5D)">Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies.</a> Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).</li>
<li>Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+pipientis%3A+microbial+manipulator+of+arthropod+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction.</a> Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).</li>
<li>Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1744-7917.2010.01396.x/abstract">Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype.</a> Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).</li>
<li>Hansen, A. K., Degnan, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+expression+of+conserved+small+RNAs+in+small+symbiont+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes.</a> ISME J. 8, 2490-2502 (2014).</li>
<li>Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+evolution+of+heritable+bacterial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).</li>
<li>Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+endocellular+bacterial+symbiont+of+aphids+Buchnera+sp.+APS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS.</a> Nature. 407, 81-86 (2000).</li>
<li>Nikoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origin+of+insect-Wolbachia+nutritional+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).</li>
<li>Sloan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+histories+of+horizontal+gene+transfer+facilitated+extreme+reduction+of+endosymbiont+genomes+in+sap-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects.</a> Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+the+rice+pest+brown+planthopper+and+its+endosymbionts+reveal+complex+complementary+contributions+for+host+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation.</a> Genome Biol. 15 (12), 521(2014).</li>
<li>Campbell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+via+lineage+splitting+and+genomereduction+in+the+cicada+endosymbiont+Hodgkinia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).</li>
<li>Wilson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+insight+into+the+amino+acid+relations+of+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%2C+with+its+symbiotic+bacterium+Buchnera+aphidicola%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola.</a> Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).</li>
<li>Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+conservation+and+functional+constraint+on+intergenic+spacers+in+reduced+genomes+of+the+obligate+symbiont+Buchnera%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera.</a> PLoS Genet. 7 (9), e1002252(2011).</li>
<li>Nakabachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+160-kilobase+genome+of+the+bacterial+endosymbiont+Carsonella%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella.</a> Science. 314 (5797), 267(2006).</li>
<li>De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci%3A+a+statement+of+species+status%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci: a statement of species status.</a> Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).</li>
<li>Himler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+a+bacterial+symbiont+in+an+invasive+whitefly+is+driven+by+fitness+benefits+and+female+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias.</a> Science. 332 (6026), 254-256 (2011).</li>
<li>Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+secondary+endosymbionts+among+different+putative+species+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).</li>
<li>Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+discovered+symbiont+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).</li>
<li>Kliot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridizations+%28FISH%29+for+the+localization+of+viruses+and+endosymbiotic+bacteria+in+plant+and+insect+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues.</a> J. Vis. Exp. (84), e51030(2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Rao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+reduction+and+potential+metabolic+complementation+of+the+dual+endosymbionts+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci.</a> BMC Genomics. 16 (1), 226(2015).</li>
<li>Thao, L. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li>
<li>Zhu, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+and+comparison+of+the+Rickettsia+genomes+from+the+whitefly+Bemisia+tabaci+Middle+East+Asia+Minor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I.</a> Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).</li>
<li>Gottlieb, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+localization+of+a+Rickettsia+sp.+in+Bemisia+tabaci+%28HomopteraAleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae).</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).</li>
<li>Zhang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+temporal+changes+of+primary+and+secondary+bacterial+symbionts+and+whitefly+host+fitness+following+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments.</a> Sci. Rep. 5, 15898(2015).</li>
<li>Shan, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+of+symbiont+density+and+host+fitness+after+rifampicin+treatment+in+a+whitefly+of+the+Bemisia+tabaci+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex.</a> Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).</li>
<li>Zchori-Fein, E., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.bioone.org/doi/abs/10.1603/0013-8746(2002)095%5B0711:DOPAWB%5D2.0.CO%3B2">Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).</li>
<li>Thao, M. L., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+of+primary+prokaryotic+endosymbionts+of+whiteflies+and+their+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).</li>
<li>Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+the+bacterial+symbiont+Cardinium+in+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods.</a> Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).</li>
<li>O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((116S+rRNA+phylogenetic+analysis+of+the+bacterial+endosymbionts+associated+with+cytoplasmic+incompatibility+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).</li>
<li>Nirgianaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia+infections+of+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci.</a> Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).</li>
<li>Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chlamydiae+in+whiteflies+and+scale+insects%3A+endosymbionts+%27Candidatus+Fritschea+bemisiae%27+strain+Falk+and+%27Candidatus+Fritschea+eriococci%27+strain+Elm%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Syst.+Evol.+Micr%22%5BJournal%5D)">Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm.</a> Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ endosymbionty w mączlikach nie mogą być hodowane in vitro, sekcja i składanie bakteriocytów jest skutecznym sposobem na uzyskanie wystarczającej ilości materiału genetycznego endosymbiontów. Przed sekcją należy wyraźnie potwierdzić gatunki mączlika i endosymbionty, których to dotyczy. Mączlik B. tabaci jest kompleksem gatunkowym składającym się z ponad 35 morfologicznie nierozróżnialnych gatunków, a różne gatunki kryptyczne mogą zawierać różne endosymbionty. Portiera jest jednolicie ho...

Bakterie tworzące bliski symbiotyczny związek z krewnymi gospodarzami są szeroko rozpowszechnione u stawonogów1. Wykazano, że endosymbionty wpływają na aspekty gospodarzy, takie jak odżywianie, metabolizm, rozmnażanie, reakcje na stresy środowiskowe2,3,4 itd., na prawie każdym etapie rozwoju5. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych stowarzyszeń nadal pozostaje w dużej mierze nieznany. Genomika ma priorytet i znaczenie przy badaniu potencjalnych funkcji i ról bakterii. Z sekwencji genomu można wywnioskować pewne podstawowe informacje, tj. status taksonomiczny genów, funkcjonalne geny, szlaki metaboliczne, systemy wydzielania, co rzuca światło na potencjalną rolę symbiontów w symbiozie. Wraz z rozwojem sekwencjonowania wysokoprzepustowego, ogromna liczba genomów bakteryjnych została zsekwencjonowana z różnymi funkcjami ujawnionymi6.
Endosymbionty mają kluczowe znaczenie u pluskwiaków, takich jak mszyce7, pluskwy8, psyllids9, brązowe skoczki roślinne10 i cykady11. Na przykład wykazano, że Buchnera u mszyc, jako obowiązkowy symbiont, bierze udział w biosyntezie aminokwasów egzogennych, wraz z genami genomu mszyc12. Co więcej, ujawniono również regulację transkrypcji Buchnera13. U psyllidów Carsonella jest sekwencjonowana i klasyfikowana jako najmniejszy genom bakteryjny, jaki kiedykolwiek znaleziono14. Wszystkie te cechy endosymbiontów są oparte i wywnioskowane z sekwencji genomu. Ponieważ te endosymbionty nie mogą być hodowane in vitro, zastosowano kilka podejść w celu wyizolowania odpowiednich bakterii do sekwencjonowania. U mszyc endosymbionty są ekstrahowane poprzez wirowanie i filtrację, a następnie poddawane dalszej analizie genomowej i transkryptomicznej5. U skoczków brunatnych endosymbionty są sekwencjonowane wraz z całym genomem owada10.
Mączlik B. tabaci to kompleks gatunkowy zawierający ponad 35 morfologicznie nierozróżnialnych gatunków (gatunków tajemniczych), wśród których dwa gatunki inwazyjne zaatakowały cały świat i spowodowały ogromne szkody w produkcji rolnej15. Warto zauważyć, że endosymbionty z gatunku B. tabaci wykazały znaczenie w rozwoju szkodników16. Do tej pory u mączlika zidentyfikowano osiem endosymbiontów, w tym symbiont obligatoryjny, Candidatus Portiera aleyrodidarum, oraz siedem symbiontów drugorzędowych Hamiltonella, Rickettsia, Arsenophonus, Cardinium, Wolbachia, Fritschea i Hemipteriphilus defin17,18.
W przeciwieństwie do opisanych wcześniej pluskwiaków, mączlik B. tabaci jest niezwykle małym owadem o długości zaledwie 1 mm. Większość endosymbiontów jest ograniczona do bakteriocytów19 (wyspecjalizowane komórki zawierające symbionty, które dalej tworzą bakteriomę w B. tabaci). Ponadto tych endosymbiontów nie można hodować in vitro. Jedynym sposobem na uzyskanie endosymbiontów z B. tabaci jest wypreparowanie bakteriomu. Istnieje jednak trudność w sekcji. Po pierwsze, delikatna bakterioma zawsze łączy się z innymi tkankami mączlika, które są trudne do oddzielenia. Po drugie, niewielki rozmiar mączlika ogranicza izolację wystarczającej ilości bakteriomu. Po trzecie, endosymbionty skupiają się w bakteriomie, co sprawia, że uzyskanie jednego gatunku bakterii jest niezwykle skomplikowane.
Tutaj przedstawiamy prosty i tani protokół izolowania endosymbiontów mączlików do późniejszego sekwencjonowania metagenomu. Poprzez preparację, oczyszczanie i amplifikację można uzyskać odpowiednie endosymbiontyczne DNA i potwierdzić gatunek bakterii. Opisany protokół może być podobnie stosowany u innych stawonogów.

<table><tbody><tr><td>Taq Polimeraza DNA</td><td>Takara</td><td>R001A</td><td>, w tym rTaq, 10 i razy; Zestaw do ekstrakcji DNA w postaci buforu i żelu dNTP</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>System sekwencjonowania próbek DNA</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L mikroładowarka</td><td>Eppendorf</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt filtra</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy</td><td>Millipore</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &mu; m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>150033</td> zestaw <td>do amlizacji DNA</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer genomu</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Symbionty bakteryjne tworzą bliskie relacje ze swoimi gospodarzami i w większości przypadków dają im przewagę. Informacje genomiczne mają kluczowe znaczenie dla badania funkcji i ewolucji symbiontów bakteryjnych w ich gospodarzu. Ponieważ większość symbiontów nie może być hodowana in vitro, bardzo ważne są metody izolowania odpowiedniej ilości bakterii do sekwencjonowania genomu. U mączlika Bemisia tabaci zidentyfikowano szereg endosymbiontów i przewiduje się, że będą miały znaczenie w rozwoju i rozmnażaniu szkodników na wiele sposobów. Jednak mechanizm leżący u podstaw tych stowarzyszeń pozostaje w dużej mierze nieznany. Przeszkoda częściowo wynika z faktu, że endosymbionty mączlika, w większości ograniczone przez bakteriocyty, są trudne do oddzielenia od komórek gospodarza. Tutaj przedstawiamy krok po kroku protokół identyfikacji, ekstrakcji i oczyszczania endosymbiontów z mączlika B. tabaci, głównie poprzez rozbiór i filtrację. Próbki endosymbiontów przygotowane tą metodą, choć nadal stanowią mieszaninę różnych gatunków endosymbiontów, nadają się do późniejszego sekwencjonowania genomu i analizy możliwych ról endosymbiontów w B. tabaci. Metoda ta może być również stosowana do izolowania endosymbiontów od innych owadów.

gatunek Middle East Asia Minor 1 (MEAM1) z *B. tabaci* kompleks został tutaj przyjęty jako przykład do opisu. Bawełna wykorzystywana do hodowli mszaric oraz kilka stadiów rozwojowych mszaric przedstawiono w Rysunek 1 w tym roślinę bawełny, dorosłe mączniki i 1st, 2nd oraz 4th nimfy białoszczytki w trzecim stadium rozwoju (3. stadium)rd nimfa w tym stadium przypomina stadium 4th stadia nymphalnego...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wyizolowanie endosymbiontów z niewielkich owadów do dalszych badań. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z perspektywy entomologii i makrobiologii, ponieważ większości endosymbiontów nie można hodować in vitro. Bardzo ważne jest zastosowanie metody pozwalającej na wyizolowanie ilości bakterii wystarczających do dalszych eksperymentów.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wygodnej izolacji bakteryjnych endosymbiontów mączlików. Metodę tę można zastosować również do izolacji endosymbiontów z innych owadów, takich jak mszyce, skoczki i wiciowce. W celu rozpoczęcia procedury należy odłowić pojedynczą dorosłą osobę mączlika i zhomogenizować ją w 30 µL buforu lizującego.Inkubować homogenat w temperaturze 65 °C przez jedną godzinę, a następnie w 100 °C przez 10 minut. Wykorzystując DNA mącznika białkowika oraz startery do mitochondrialnej oksydazy cytochromowej 1, przygotować reakcje PCR o objętości 25 µL z użyciem następujących odczynników.Następnie przeprowadź reakcje PCR zgodnie z programem przedstawionym tutaj. W kolejnym kroku, używając zestawu do izolacji DNA z żelu i postępując zgodnie z zalecanym protokołem, oczyść produkt PCR. Następnie przeprowadź analizę sekwencji zgodnie z protokołem opisanym w tekście.Aby przeprowadzić amplifikację specyficznych genów każdego endosymbionta w mączniku, należy wykonać reakcję PCR na DNA mącznika. Zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem, zamplifikowaną próbkę należy poddać elektroforezie w żelu agarozowym oraz sekwencjonowaniu w celu określenia gatunków bakterii występujących w mączniku i identyfikacji specyficznego genu każdej z bakterii. Aby wypreparować i oczyścić bakteriom mącznika, należy nanieść 100 µL roztworu 1x PBS na szkiełko przedmiotowe.Następnie należy zebrać nimfy trzeciego lub czwartego stadium z liści bawełny i zanurzyć je w PBS. Pod mikroskopem, za pomocą cienkich igieł entomologicznych, należy wyciągnąć bakteriomy z ciała mącznika.Należy zachować ostrożność podczas izolowania bakteriomu, ponieważ jest on mały i delikatny. Ostrożnie wytnąć otwór po jednej stronie nimfy i lekko docisnąć drugą stronę, aby uwolnić bakteriomy. Następnie zamontować mikrodozownik 20 µL na pipecie 0,5–10 µL i pobrać pojedynczy bakteriom z PBS do mikrodozownika.Przemyj bakteriom, aby wyeliminować zanieczyszczenia innymi tkankami mącznika, pipetując go do PBS i wyciągając. Powtórz przemywanie trzy razy. Wielokrotne przemywanie jest wysoce zalecane, aby wyeliminować jak najwięcej zanieczyszczeń.Niezwłocznie przenieś wypłukany bakteriom za pomocą pipety do probówki wirówkowej zawierającej 60 µL PBS. Przesącz zmontowany bakteriom przez membranę filtrującą o rozmiarze porów 5 µm przy użyciu strzykawki. Powtórz filtrację kilkakrotnie, aby dokładnie przepuścić zmieszaną ciecz przez membranę.Aby przeprowadzić amplifikację filtratu, należy przygotować bufor D2 do wykorzystania z zalecanym protokołem amplifikacji genomowego DNA z krwi lub komórek, wprowadzając pewne modyfikacje. Do probówki wirówkowej należy dodać bezpośrednio 1,5 µl filtratu, a następnie 1,5 µl buforu D2. Po dokładnym wymieszaniu próbkę inkubuje się w lodzie przez 10 minut. Następnie dodaje się 1,5 µl roztworu stopującego.Dodaj 15 µL buforu do reakcji oraz 1 µL polimerazy DNA i delikatnie wymieszaj. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 30 °C przez 16 godzin, a następnie w 65 °C przez trzy minuty. Przeprowadź reakcję PCR bezpośrednio na amplifikowanym filtracie, używając specyficznych starterów zaprojektowanych dla bakterii, aby potwierdzić gatunek bakterii.Należy również przeprowadzić reakcję PCR, aby potwierdzić, czy nie występuje kontaminacja genomem gospodarza, używając starterów dla genów beta-aktyny i EF1 mączlika zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą. Na koniec należy przeprowadzić sekwencjonowanie metagenomowe zgodnie z protokołem tekstowym. Na tej rycinie przedstawiono bawełnę służącą do hodowli mączlików oraz kilka stadiów rozwojowych tych owadów.W tym zestawieniu znajdują się osobnik dorosły oraz nimfy pierwszego, drugiego i czwartego stadium. Przedstawiono tutaj analizę FISH endosymbiontów Portiera i Hamiltonella w nimfie czwartego stadium MEAM1. Obserwowane jest nakładanie się obu bakterii, a obie są ograniczone do bakteriocytów mącznika.Przedstawione tutaj obrazy z transmisyjnego mikroskopu elektronowego endosymbionta Portiera mącznika białokrzewkowego wskazują, że Portiera może tracić ścianę komórkową. Po sekwencjonowaniu i oczyszczeniu danych z kontaminacji adapterami oraz duplikacjami uzyskano kompletny genom obligatoryjnego symbionta Portiera. Wynikiem jest kolisty genom o długości 358 232 par zasad.Dodatkowo uzyskano wstępny szkic genomu Hamiltonella, który obejmował 138 kontigów, złożonych w 89 skafoldów na podstawie relacji końców parzystych. Po opanowaniu tej techniki procedura ta może zostać wykonana w ciągu 20 godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby chronić próbki przed zanieczyszczeniem bakteriami środowiskowymi.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne analizy, takie jak sekwencjonowanie RA oraz analiza masy bakteriomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji genów i metabolizmu endosymbiontów. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny entomologii i mikrobiologii do zgłębiania funkcji endosymbiontów u owadów lub stawonogów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak izolować symbionty z bakteriomów owadów.Należy pamiętać, że praca z niektórymi z odczynników może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Osy pasożytnicze stanowią główną grupę naturalnych wrogów wielu owadów, w tym Drosophila melanogaster. Przedstawimy techniki rozmnażania tych pasożytów w gatunkach Drosophila spp. oraz zademonstrujemy sposób analizy ich wpływu na tkanki odpornościowe larw Drosophila.

Wprowadzenie do os w pasożytach Drosophila i odpowiedzi immunologicznej przeciwpasożytniczej

Poprawa naszego zrozumienia i zdolności do zwalczania wielu wirusów roślin przenoszonych przez owady wymaga wykorzystania wektorów. Przenoszenie wirusów roślin przez owady jest interakcją tritroficzną, a zatem wymaga manipulacji owadami, wirusem i rośliną. Wektory muszą być hodowane w dużych ilościach i manipulowane w taki sposób, aby zapewnić wysoką skuteczność przenoszenia na rośliny testowe. Przedstawiono podstawy hodowli i manipulacji mączczykiem, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae),...

Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Tablice życia pozwalają na ilościowe określenie źródeł i wskaźników śmiertelności w populacjach owadów oraz przyczyniają się do zrozumienia, przewidywania i manipulowania dynamiką populacji w agroekosystemach. Przedstawiono metody prowadzenia i analizy kohortowych tablic trwania życia w terenie dla owadów z siedzącymi niedojrzałymi stadiami życia.

Metodyka opracowywania tablic życia owadów siedzących w terenie z wykorzystaniem mączlika (Bemisia tabaci) w układzie bawełnianym jako systemu modelowego

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Prezentujemy prostą technikę cytogenetyczną z użyciem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do określenia wskaźnika zapłodnienia i pierwotnego stosunku płci haplodifidowego szkodnika inwazyjnego Bemisia tabaci.

Określanie szybkości zapłodnienia jaj Bemisia tabaci za pomocą techniki cytogenetycznej

Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Do wykrywania wewnątrzkomórkowej Wolbachii użyto czterech metod, które wzajemnie się uzupełniały i poprawiały dokładność wykrywania infekcji Wolbachia Aa23 pochodzącej z Aedes albopictus i Aa23-T wyleczonej z rodzimej infekcji Wolbachia za pomocą antybiotyków.

Wykrywanie szczepu Wolbachia wAlbB w liniach komórkowych Aedes albopictus

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji jadu z Trichogramma dendrolimi za pomocą sztucznego gospodarza stworzonego z folii polietylenowej i roztworu aminokwasów.

Ekstrakcja jadu z pasożytniczej osy Trichogramma dendrolimi przy użyciu sztucznego żywiciela

Poznaj metodę ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci w celu badań nad mutualizmem owadów i mikroorganizmów. Protokół obejmuje homogenizację, filtrację oraz amplifikację DNA do sekwencjonowania.

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Przeglądaj więcej filmów