Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego
30 czerwca 2017
Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.
Ogólnym celem tej metodologii jest ilościowa ocena dynamicznych odpowiedzi fenotypowych populacji heterokomórkowych na pertubacje przy jednoczesnym rozróżnieniu subpopulacji. Większość interakcji fizjologicznych zachodzi w obecności wielu typów komórek. Metoda ta może pomóc biologom komórkowym ocenić, w jaki sposób heterogeniczne komórki reagują na identyczne ciśnienie środowiskowe i jak różne wpływają na siebie nawzajem.
Technika ta ma kilka zalet, rozróżnia wiele typów komórek, pozwala na jednoczesną analizę subpopulacji, w tym wskaźników urodzeń i zgonów oraz dynamiki morfologicznej. Chociaż protokół ten może być wykorzystany do badania wielu procesów biologicznych, zademonstrujemy przepływ pracy przy użyciu komórek nowotworowych H3255 i komórek CCD19LU fibroblastów leczonych erlotynibem, lekiem chemioterapeutycznym. Na początek, po przygotowaniu zawiesin komórkowych w probówkach zgodnie z protokołem tekstowym, odwróć probówki, aby wymieszać komórki w roztworze w celu standaryzacji wysiewu.
Następnie odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny każdej komórki do mikroprobówki wirówkowej i dodać 10 mikrolitrów błękitu trypanowego. Odpipetować 10 mikrolitrów roztworu do szkiełka do liczenia komórek i włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek. Powtórz liczbę komórek co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy uzyskana liczba będzie spójna.
Za pomocą pipety wielokanałowej zasiaj łącznie 1 500 komórek w 100 mikrolitrach RPMI w dołkach płytki 96-dołkowej. Zawiesinę każdej komórki należy umieścić w trzech egzemplarzach z identycznymi układami płytek dla każdego punktu czasowego. Inkubuj komórki przez noc.
Dodać DMSO do proszku erlotynibu, aby uzyskać 10-milimolowy roztwór podstawowy erlotynibu. Następnie użyj pożywki do hodowli komórkowych, aby rozcieńczyć lek do dwukrotności najwyższego stężenia końcowego wynoszącego 10 mikromolów. Lek należy rozcieńczyć czterokrotnie w stosunku 1:10, co daje w sumie pięć stężeń leku i brak kontroli leku.
Odpipetować 100 mikrolitrów roztworu leku do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki komórek, aby uzyskać końcowe stężenie leku 1x rozcieńczonego w pożywce. Następnie, aby wybarwić komórki do klasyfikacji na podstawie fluorescencji, przygotuj pięć mikrogramów na mililitr barwienia jądrowego i pięć mikromolowych barwień martwych komórek w PBS. Do klasyfikacji opartej na morfologii przygotuj pięć mikrogramów na mililitr barwienia jądrowego, pięć mikromolowych barwień martwych komórek i pięć mikromolowych barwień komórek w PBS.
Dodaj 20 mikrolitrów roztworu barwnika do każdej studzienki. Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem przez 30 minut. Aby uzyskać obrazy, użyj 70% etanolu, aby wytrzeć spód płytki i umieść płytkę w komorze obrazowania.
Na karcie konfiguracji w obszarze wyboru kanału kliknij przycisk plusa, aby dodać odpowiednie kanały do obrazu. W obszarze wyboru układu ustaw stos obrazów testowych z co dwa mikrony, zaczynając od zera mikronów i kończąc na 20 mikronach, aby zidentyfikować płaszczyznę ostrości. Kliknij migawkę pod każdym kanałem, aby ocenić intensywność i zoptymalizować czasy ekspozycji.
W razie potrzeby wprowadź wyższe lub niższe wartości w polu czas. Jądra w komórkach muszą być zogniskowane, aby zapewnić dokładność dalszej analizy. Na schemacie płyty zaznacz odpowiednie dołki.
Następnie na schemacie studzienek zaznacz 25 pól, które mają być zobrazowane w podobny sposób. W obszarze uruchom eksperyment zidentyfikuj płytkę w nazwie płyty, a następnie kliknij przycisk Start, aby uruchomić protokół akwizycji obrazu z obiektywem 10x w celu wygenerowania obrazów TIFF w skali szarości w wybranych kanałach. Po zainstalowaniu oprogramowania open source, CellProfiler i analizy CellProfiler, otwórz CellProfiler, kliknij Plik, Importuj, Potok z pliku i wybierz odpowiedni plik.
Wybierz potok klasyfikacji oparty na fluorescencji, aby sklasyfikować komórki jako H3255 lub CCD19LU na podstawie intensywności EGFP i obliczyć cechy morfologii. Kliknij opcję Wyświetl ustawienia wyjściowe, a następnie wybierz lokalizację plików obrazów do analizy oraz miejsce docelowe wyodrębnionych danych. Przed uruchomieniem analizy protokół powinien zostać przetestowany w trybie testowym w celu sprawdzenia wartości parametrów.
Ważne jest, aby segmentacja jądrowa i komórkowa była dokładna. Protokół ten został zaprojektowany w celu identyfikacji komórek o różnym zabarwieniu jąder, upewnienia się, że wartość piksela, o którą rozszerzają się jądra, jest wystarczająco duża, aby zamaskować jądra o najwyższym zabarwieniu DNA, ale wystarczająco mała, aby nie maskować otaczających jąder. Aby sklasyfikować populacje na podstawie fluorescencji, najpierw należy przeskalować zakres intensywności GFP, a następnie zmierzyć intensywność GFP każdego zidentyfikowanego jądra i sklasyfikować obiekty na podstawie progu zdefiniowanego przez użytkownika.
Następnie kliknij przycisk Analizuj obrazy, aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy przejdź do domyślnego folderu wyjściowego, aby wyświetlić obliczone dane. W przypadku klasyfikacji opartej na morfologii uruchom odpowiedni protokół w profilerze komórek, aby wygenerować cechy morfologii całej komórki.
Otwórz oprogramowanie Cell Profiler Analysis, wybierz plik właściwości bazy danych wygenerowany w Cell Profiler i kliknij, otwórz. Kliknij kartę Klasyfikator w lewym górnym rogu ekranu. Aby wywołać losowe obrazy komórek z eksperymentu, kliknij pobierz, obrazy pojawią się w niesklasyfikowanym oknie.
Ręcznie sklasyfikuj komórki jako dodatnie lub ujemne, co w tym przypadku reprezentuje H3255 lub CCD19LU, zaznaczając i przeciągając komórki do odpowiedniego kosza. Po sklasyfikowaniu co najmniej 50 komórek na subpopulację kliknij pozycję Train Classifier (Klasyfikator szkoleń), a następnie kliknij pozycję Check Progress (Sprawdź postęp). Na koniec kliknij Oceń wszystko, aby wygenerować tabelę z liczbą komórek dla każdej subpopulacji.
W heterokomórkowej zimnej hodowli komórek nowotworowych H3255 i CCD19LU fibroblastów jądra zidentyfikowano i podzielono na segmenty na podstawie barwienia DNA. Populacje komórek klasyfikowano albo za pomocą sztucznie indukowanej fluorescencji, albo przez szkolenie w algorytmie uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów komórek na podstawie różnic morfologicznych. Istnieje wysoka zgodność między metodologiami opartymi na fluorescencji i morfologii.
Obie metody klasyfikacji były niezależnie implikowane do tych samych obrazów i zgadzały się odpowiednio 97,4% i 92,5% dla populacji nieleczonej i leczonej. W tym przypadku badano zmiany w morfologii komórek i odpowiedzi na leczenie erlotynibem. Po trzech dniach leczenia farmakologicznego zaobserwowano zmniejszenie powierzchni jąder i zwiększenie powierzchni komórkowej komórek H3255.
Było to prawdopodobnie spowodowane śmiercią komórki. Aby sprawdzić, czy erlotynib ma działanie cytotoksyczne lub cytostatyczne na komórki, martwe komórki zidentyfikowano na podstawie barwienia jodkiem propidyny. Obserwowano zarówno cytotoksyczne, jak i cytostatyczne działanie erlotynibu na komórki H3255, przy jednoczesnym wzroście liczby zgonów i zmniejszeniu liczby urodzeń po leczeniu farmakologicznym.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch nienastępujących po sobie godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak interferencja RA lub CRISPR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące genomiki funkcjonalnej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do zbadania wpływu komórek zrębu na progresję guza w wielu typach raka.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać reakcje heterokomórkowe na bodźce środowiskowe, w szczególności jak analizować dane obrazowania oparte na mikroskopii w sposób wysokoprzepustowy.
Przegląd
To badanie przedstawia nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowych w odpowiedzi na zakłócenia. Metodologia wykorzystuje platformę opartą na obrazowaniu do generowania ilościowych zestawów danych do charakteryzacji wielu fenotypów komórkowych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki obrazowania
- Dynamika populacji
Tło
- Interakcje fizjologiczne często występują między wieloma typami komórek.
- Zrozumienie, jak heterogeniczne komórki reagują na czynniki środowiskowe, jest kluczowe.
- Ta metoda umożliwia ocenę interakcji między różnymi populacjami komórek.
- Może być zastosowana do różnych procesów biologicznych.
Cel badania
- Ilościowa ocena dynamicznych odpowiedzi fenotypowych populacji heterokomórkowych.
- Rozróżnianie subpopulacji w identycznych warunkach.
- Przedstawienie przepływu pracy przy użyciu określonych typów komórek i terapii.
Stosowane metody
- Przygotowanie zawiesin komórkowych i standaryzacja siewu.
- Użycie niebieskiego trypanu do liczenia komórek i zautomatyzowanej analizy.
- Leczenie lekami z Erlotyniby i barwienie fluorescencyjne do klasyfikacji.
- Zbieranie i analiza obrazów przy użyciu oprogramowania CellProfiler.
Główne wyniki
- Duże zgodności między metodami fluorescencyjnymi a morfologicznymi.
- Dokładność klasyfikacji 97,4% i 92,5% dla populacji nieleczonych i leczonych odpowiednio.
- Udane zidentyfikowanie i segmentacja jąder komórkowych na podstawie barwienia.
Wnioski
- Protokół skutecznie rozróżnia między wieloma typami komórek.
- Umożliwia jednoczesną analizę subpopulacji, w tym współczynników urodzeń i śmierci.
- Ta metodologia może być dostosowana do różnych badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively dissect heterogeneous cell population responses to drug perturbations, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology and stromal-tumor interaction studies. By distinguishing subpopulations via fluorescence or morphology, it provides predictive confidence in compound effects on specific cellular compartments, informing go/no-go decisions in early discovery. The approach reduces assay variability and reagent consumption while increasing throughput for phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying subpopulation-specific responses to perturbations.
- Operational Value: Discriminates between cell types using fluorescence intensity or morphology, clarifying pathway contributions in co-culture systems.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by revealing differential drug effects on tumor versus stromal compartments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative phenotypic readouts including morphology changes, proliferation, and apoptosis for each subpopulation.
- Operational Value: Standardizes seeding and staining protocols to ensure reproducibility across wells and time points.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and automated imaging for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase phenotypic responses to preclinical validation by tracking birth/death rates and morphological dynamics.
- Mechanistic De-risking: Isolates stromal influence on tumor progression, reducing ambiguity in target mechanism interpretation.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-based morphology shifts with functional outcomes for translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing subpopulation-resolved data that informs mechanistic understanding and compound prioritization before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how heterogeneous cells respond to identical environmental pressures and influence one another.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized cell counting, drug dilution, and staining protocols that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Outputs segmentation, classification, and feature extraction data (nuclei area, cellular area, death rates) that allow teams to compare conditions quantitatively.
- Translational Research: Connects early phenotypic responses to stromal-tumor interactions, informing preclinical models of cancer progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable to diverse co-culture systems and perturbation types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through deconvolution of mixed population responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced reagent use versus traditional assays.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by revealing cytotoxic/cytostatic effects on specific subpopulations.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on differential effects in tumor and stromal compartments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, image analysis, and CellProfiler pipeline configuration.
- Dependent on automated imaging hardware capable of z-stack acquisition and multi-channel fluorescence detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and classification thresholds for fluorescence or morphology-based methods.
- Adaptation to new model systems may require optimization of nuclear/cellular segmentation parameters and classifier training.
- Practical limitations include challenges in identifying populations with complex morphological features, necessitating troubleshooting as noted in the protocol.
