Name: Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę dyskryminacji i charakterystyki populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego. Protokół umożliwia jednoczesną analizę podpopulacji komórek H3255 i CCD19LU oraz ocenę ich dynamiki fenotypowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Cancer Institute (NCI) Granty U54CA143798 i U54CA143907 na założenie Centrów Nauk Fizycznych i Onkologii (PS-OCs) odpowiednio w Instytucie Raka Dana-Farber i Uniwersytecie Południowej Kalifornii. S.M. Mumenthaler otrzymał nagrodę PS-OC transnetwork, która wspierała niektóre z tych prac.
Chcielibyśmy wyrazić naszą najgłębszą wdzięczność naszym filantropijnym sympatykom, szczególnie rodzinie Stephensonów, Emmetowi, Toni i Tessie, za ich darowiznę platformy Operetta HCS. Chcielibyśmy również podziękować J. Foo za wskazówki oraz członkom zespołu Centrum Stosowanej Medycyny Molekularnej: D. Agusowi za wskazówki kliniczne i mentoring, K. Patschowi za konstruktywne dyskusje na temat projektu eksperymentalnego, R. Rawatowi za pomoc w protokołach analizy obrazu, J. Katzowi za pomoc techniczną przy Operetce oraz P. Macklinowi i D. Rudermanowi za pomocne dyskusje i informacje zwrotne.

1. Hodowla komórkowa
UWAGA: Tutaj badano fenotypowe odpowiedzi komórek NSCLC (H3255) na czynnik celujący w EGFR, erlotynib, podczas wspólnej hodowli z fibroblastami płuc (CCD-19Lu GFP). Dla tego samego zestawu danych przeprowadzono klasyfikację opartą na fluorescencji i morfologii dwóch populacji komórek (H3255 i CCD-19Lu GFP) w celu zilustrowania ich zgodności. Należy jednak zastosować tylko jedną metodę klasyfikacji, którą należy wybrać na podstawie zastosowania.
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml RPMI-1640 uzupełnionego 10% inaktywowanym termicznie FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. 
	UWAGA: Pożywkę wzrostową i suplementy można w razie potrzeby wymienić na inne typy komórek.</li>
	<li>Hodować komórki w 10 cm3 płytki jako czyste populacje w 5% CO2 w temperaturze 37 °C i pasować w odpowiednim stosunku co 3-4 dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Aby przygotować zawiesinę komórkową, usuń pożywkę komórkową i umyj komórki 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS).</li>
	<li>Odessać z PBS, dodać 1 ml 0,05% trypsyny ogrzanej do 37 °C i inkubować przez 5 minut (lub do momentu, gdy komórki przestaną przylegać do płytki) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby zneutralizować trypsynę, dodaj 4 ml RPMI do płytek GFP H3255 i CCD-19Lu i odpipetuj roztwory komórek do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 150 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 10 ml pożywki RPMI w stożkowych probówkach, aby przygotować się do wysiewu.</li>
</ol>
3. Poszycie komórek
<ol>
	<li>Policz komórki, aby ustandaryzować wysiew.
	<ol>
		<li>Odwróć probówki, aby wymieszać komórki w roztworze. Pobrać pipetą 10 μl zawiesiny każdej komórki do probówki mikrowirówkowej i dodać 10 μl błękitu trypanowego.</li>
		<li>Odpipetować 10 μl tego roztworu do szkiełka do liczenia komórek i włożyć do automatycznego licznika komórek. 
		UWAGA: Można stosować inne metody zliczania komórek (np. hemocytometr).</li>
		<li>Powtórz liczbę komórek co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy uzyskana liczba będzie spójna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki nasienne na płytce wielodołkowej 
	UWAGA: Liczba płytek do wysiewu zależy od liczby punktów czasowych, które zostaną zobrazowane. Alternatywnie, jedna płytka może być ponownie obrazowana w czasie, jeśli komórki są transdukowane histonem-2B-GFP (lub innymi stabilnymi barwnikami jądrowymi lentiwirusa, które zapewniają odpowiednią segmentację jądrową).
	<ol>
		<li>Wysiewaj łącznie 1,500 komórek/studzienkę w 100 μl RPMI. Przygotuj trzy zawiesiny komórkowe do pokrycia trzech populacji komórek: H3255, CCD-19Lu GFP i 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Wykonaj każdy z nich w trzech egzemplarzach z identycznymi ustawieniami płytek dla każdego punktu czasowego. 
		UWAGA: Początkowe gęstości wysiewu powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej i rozmiaru płytki.</li>
		<li>Komórki nasienne w 3 x 96-dołkowych płytkach za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Dawkowanie leków
<ol>
	<li>Dodać DMSO do proszku erlotynibu, aby uzyskać końcowy roztwór podstawowy erlotynibu o stężeniu 10 mM. 
	UWAGA: Lek można zastąpić według uznania.</li>
	<li>Rozcieńczyć lek pożywką do hodowli komórkowych do 2x końcowego stężenia o najwyższym stężeniu końcowym przy 10 μM i seryjnie rozcieńczyć czterokrotnie w stosunku 1:10, co daje w sumie pięć stężeń leku i brak kontroli leku. 
	UWAGA: Jeśli stężenie DMSO jest równe lub przekracza 0,1% v/v przy najwyższej dawce leku, kontrola bez leku powinna zawierać równoważną ilość DMSO, aby zapewnić, że obserwowane efekty nie są spowodowane toksycznością DMSO.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl roztworu leku do odpowiedniego dołka, aby uzyskać końcowe stężenie leku 1x rozcieńczonego w pożywce.</li>
</ol>
5. Akwizycja obrazu
UWAGA: Obrazy zostały pozyskane w dniach 0, 2 i 3. W zależności od typów komórek i badanych procesów komórkowych można badać inne pożądane punkty czasowe.
<ol>
	<li>Wybarwiaj komórki, aby przygotować się do obrazowania.
	<ol>
		<li>Uzupełnić roztwór barwnika w następujących końcowych stężeniach.
		<ol>
			<li>Do klasyfikacji na podstawie fluorescencji należy przygotować 5 μg/ml barwienia jądrowego i 5 μM barwienia martwych komórek w PBS (patrz tabela materiałów).</li>
			<li>Do klasyfikacji opartej na morfologii należy przygotować 5 μg/ml barwienia jądrowego, 5 μM barwienia martwych komórek i 5 μM barwienia komórek w PBS (patrz tabela materiałów).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dodaj 20 μl roztworu barwnika do każdej studzienki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizuj i pozyskuj obrazy.
	<ol>
		<li>Wyjąć płytkę dołka z inkubatora, przetrzeć spód płytki 70% EtOH i umieścić płytkę w komorze obrazowania.</li>
		<li>W zakładce "Konfiguracja" kliknij przycisk "+" w sekcji "Wybór kanału", aby dodać odpowiednie kanały do obrazu (np. jasne pole, plama jądrowa, plama martwych komórek, sygnały GFP i RFP).</li>
		<li>Kliknij "Wybór układu" i wykonuj zdjęcia testowe ze stosem z co 2 μm, zaczynając od 0 μm i kończąc na 20 μm, aby zidentyfikować płaszczyznę ostrości. Wprowadź tę odległość dla każdego kanału w polu "Wysokość".</li>
		<li>Kliknij "Migawka" pod każdym kanałem, aby ocenić intensywność i zoptymalizować czas ekspozycji. W razie potrzeby wprowadź wyższe lub niższe wartości w polu "Czas".</li>
		<li>Po prawej stronie ekranu zaznacz odpowiednie dołki (do zobrazowania) na schemacie tablicy. Na poniższym schemacie studni zaznacz dwadzieścia pięć pól, które mają zostać zobrazowane w podobny sposób.</li>
		<li>W sekcji "Uruchom eksperyment" zidentyfikuj tabliczkę w "Nazwa tablicy" po lewej stronie i kliknij przycisk "Start" (poniżej), aby uruchomić protokół akwizycji obrazu z obiektywem 10X w celu wygenerowania obrazów TIFF w skali szarości w wyżej wymienionych kanałach. 
		UWAGA: Instrukcje krok po kroku dotyczące protokołu obrazowania mogą się różnić w zależności od instrumentu, ale wartości parametrów powinny być nadal zoptymalizowane.</li>
		<li>Powtórz obrazowanie w drugim i trzecim dniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
UWAGA: Wszystkie analizy obrazów zostały przeprowadzone przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania. Ponieważ jednak nie jest to publicznie dostępna, porównywalne analizy zaprojektowano również dla CellProfiler 2.2 i CellProfiler Analyst 2.0, z krótkim protokołem wymienionym poniżej i szczegółowym protokołem dostarczonym jako materiał uzupełniający (obrazy testowe są już załadowane do potoków w celu przetestowania przepływu pracy). Obrazy z tego eksperymentu zostały pogrupowane razem dla każdego dołka, tak aby każdy studzienek mógł być ładowany indywidualnie. Poniższe potoki CellProfiler zawierają wyrażenie regularne, które analizuje informacje o metadanych z każdej nazwy pliku obrazu i umożliwia dalsze grupowanie obrazów według kanałów.
<ol>
	<li>Pobierz i zainstaluj oprogramowanie open source: "CellProfiler" i "CellProfiler Analyst". Zaakceptuj wszystkie domyślne opcje i dodatki podczas instalacji.</li>
	<li>Klasyfikuj kultury heterokomórkowe do subpopulacji.
	<ol>
		<li>Otwórz program 'CellProfiler', kliknij 'Plik'| 'Import Pipeline'| 'From File' i wybierz odpowiedni plik ("Fluorescence_Classification.cppipe" do klasyfikacji opartej na fluorescencji lub "Morphology_Classification.cppipe" do klasyfikacji opartej na morfologii). 
		UWAGA: Pliki te zawierają protokoły podstawowego przetwarzania obrazu i segmentacji jąder/komórek. Ze względu na nierównomierne zabarwienie Hoechsta obecne w tych komórkach, jądra zostały podzielone na segmenty i powiększone, a następnie wykorzystane do zamaskowania obrazu, aby umożliwić segmentację jąder o mniejszej intensywności.
		<ol>
			<li>Wybierz potok klasyfikacji oparty na fluorescencji, aby sklasyfikować komórki jako H3255 lub CCD-19Lu na podstawie intensywności eGFP i obliczyć cechy morfologii. 
			UWAGA: Komórki CCD-19Lu transdukowano za pomocą GFP.</li>
			<li>Wybierz potok klasyfikacji oparty na morfologii, aby podzielić jądra i komórki na segmenty oraz obliczyć cechy morfologii. 
			UWAGA: Do klasyfikacji potrzebna jest dalsza analiza w programie "CellProfiler Analyst". Martwe komórki są klasyfikowane za pomocą klasyfikacji opartej na fluorescencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kliknij "Wyświetl ustawienia wyjściowe" w lewym dolnym rogu ekranu. Wybierz lokalizację plików graficznych do analizy ("Domyślny folder wejściowy") i miejsce docelowe wyodrębnionych danych ("Domyślny folder wyjściowy").</li>
		<li>Kliknij "Analizuj obrazy", aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy kliknij "OK" i przejdź do "Domyślnego folderu wyjściowego", aby wyświetlić obliczone dane. 
		UWAGA: Przykładowe wartości parametrów i obrazy są dostępne w pliku uzupełniającym 1-CellProfilerProtocol.pdf.</li>
		<li>W przypadku klasyfikacji opartej na morfologii (tylko) wykonaj następujące czynności.
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie 'CellProfiler Analyst', wybierz plik właściwości bazy danych wygenerowany w CellProfiler i kliknij 'Otwórz'.</li>
			<li>Kliknij zakładkę "Klasyfikator" w lewym górnym rogu ekranu. Aby wywołać losowe obrazy komórek z eksperymentu, kliknij "Pobierz"; Obrazy pojawią się w oknie Niesklasyfikowane.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ręcznie sklasyfikuj komórki jako dodatnie (H3255) lub ujemne (CCD-19Lu), zaznaczając i przeciągając komórki do odpowiedniego kosza (patrz Plik uzupełniający 2-Pipeline.pdf: Rysunek B). Po sklasyfikowaniu co najmniej 50 komórek na subpopulację kliknij "Trenuj klasyfikator", a następnie kliknij "Sprawdź postęp". 
		UWAGA: Komórki są klasyfikowane za pomocą nadzorowanego przez użytkownika algorytmu losowego uczenia maszynowego lasu12. Jeśli dokładność nie przekracza zatwierdzonego progu (>90%), może być konieczne cofnięcie się i optymalizacja segmentacji komórek w programie "CellProfiler" lub komórki mogą nie być idealne do klasyfikacji według morfologii.</li>
		<li>Kliknij "Oceń wszystko", aby wygenerować tabelę z liczbą komórek dla każdej subpopulacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem%2Fprogenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li>
<li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+pH+dependence+of+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li>
<li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li>
<li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li>
<li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790(2015).</li>
<li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li>
<li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li>
<li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482(2008).</li>
<li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+interactive+data+exploration%2C+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li>
<li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752(2016).</li>
<li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92(2016).</li>
<li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Inform%22%5BJournal%5D)">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, Suppl 4. 19-31 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany powyżej protokół ulepsza obecne testy biologii komórki, zapewniając bardziej wszechstronny wgląd w dynamikę fenotypową wielu typów komórek w odpowiedzi na zakłócenia środowiskowe przy użyciu zredukowanych odczynników i czasu. Główną zaletą tego eksperymentalnego projektu jest możliwość analizowania wielu fenotypów za pomocą jednej konfiguracji i generowania danych ilościowych charakteryzujących te fenotypy na poziomie pojedynczej komórki. Jedną z technicznych zalet tej platformy jest łatwość początkowego rozwiązywania problemów w porównaniu z innymi testami. Ponieważ ta metoda jest oparta na obrazie, można wizualizować studnie pod kątem pozornego wysiewu nad/niedostatecznego. Wskazane jest, aby komórki znajdowały się w fazie wzrostu wykładniczego przez cały czas trwania eksperymentu i nie były ograniczone przez ograniczenia żywieniowe lub przestrzenne, ani nie były zakłócone przez starzenie się z powodu rzadkiego wysiewu. W przeciwnym razie wskaźniki urodzeń i zgonów mogą nie być powtarzalne między eksperymentami. Dla porównania, CellPD jest publicznie dostępnym programem do obliczania współczynników urodzeń i zgonów14. Dodatkowo można zwizualizować, czy do każdej studzienki dodano odpowiednie stężenia barwników. Problemy z pipetowaniem w pojedynczej studzience mogą powodować błędną segmentację i zniekształcone dane, ale można je łatwo wykryć za pomocą wyżej wymienionego protokołu.
Niestety, nie wszystkie typy komórek mogą być podatne na tę aplikację. Ważne jest, aby móc dokładnie segmentować jądra i komórki, dlatego analiza komórek, które organizują się w bardziej kuliste lub zbite struktury, może nie być odpowiednia. W przypadku niektórych komórek korzystne może być również użycie sitka komórkowego przed wysiewem, aby zapewnić wstępny wysiew pojedynczych komórek. Ponadto technika klasyfikatora liniowego ma zastosowanie tylko do typów komórek, które można łatwo odróżnić na podstawie cech morfologicznych. 
Aby protokół był skuteczny, ważne jest, aby najpierw zoptymalizować warunki obrazowania, ponieważ ważność dalszych analiz zależy od jakości obrazów. Podczas gdy w tym przypadku przeprowadziliśmy eksperymenty przy użyciu platformy przesiewowej o wysokiej zawartości, akwizycję obrazu można również przeprowadzić za pomocą dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego (chociaż zautomatyzowana platforma obrazowania jest idealna do podejść o wysokiej przepustowości). Obrazy testowe powinny być wykonywane przed każdym punktem czasowym obrazowania, aby upewnić się, że nie ma problemów z mikroskopem lub protokołem. Stosunek sygnału do szumu powinien być wysoki, szczególnie dla kanałów, które będą wykorzystywane do segmentacji (tj. jądra, barwienia komórek). Dodatkowo ważne jest, aby obrazować w optymalnej płaszczyźnie ostrości. Jeśli obrazy są nieostre, segmentacja staje się znacznie trudniejsza, a obliczone cechy morfologiczne będą prawdopodobnie niedokładne. Różnice w oświetleniu między polami mogą również powodować problemy z segmentacją obrazu. Duże różnice w jasności utrudniają automatyczny wybór wartości progowych. Dodatkowo, jeśli między komórkami występują niejednorodne intensywności fluorescencji, pojedyncza wartość progowa może nie wystarczyć do segmentacji wszystkich komórek na obrazie. W tej analizie problemy te zostały przezwyciężone poprzez stworzenie masek wokół jaśniejszych i ciemniejszych populacji komórek oraz segmentację każdej populacji osobno. 
Podczas gdy fenotypy badane w tym protokole ograniczają się do charakterystyki żywej, martwej i morfologicznej, można je łatwo rozszerzyć w celu zbadania innych cech. Na przykład funkcjonalne badania genetyczne mogą być dodawane z RNAi, nadekspresją lub innymi zaburzeniami chemicznymi. 
W niniejszej pracy zademonstrowano możliwości protokołu do pomiaru odpowiedzi komórek niedrobnokomórkowego raka płuca na erlotynib w obecności i bez CAF. Jest to jednak tylko jeden z wielu typów komórek i parametrów mikrośrodowiskowych, które można przetestować. Rozszerzyliśmy ten protokół, aby można go było stosować z innymi typami komórek i badaniami leków, w tym komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z guzów pacjentów13,15.

Testy oparte na komórkach były koniem pociągowym w podstawowych badaniach i opracowywaniu leków. Jednak ograniczenia tych standardowych testów stają się coraz bardziej widoczne wraz z rozbieżnością między danymi in vitro a danymi klinicznymi oraz nieuzyskaniem zatwierdzenia przez FDA większości leków. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę wykorzystania obrazowania ilościowego do jednoczesnej analizy fenotypów heterokomórkowych w odpowiedzi na odpowiednie, współwystępujące bodźce środowiskowe.
Tradycyjne testy komórkowe, które są używane do pomiaru żywotności komórek, obejmują: testy wykluczenia błękitu trypanowego, MTT/MTS i barwienie cytometrią przepływową Annexin V-FITC. Testy wykluczania błękitu trypanowego, choć proste i niedrogie, wymagają dużej liczby komórek, są czasochłonne i często wpływają na nie stronniczość użytkownika1. Testy MTT i MTS pośrednio mierzą żywotność komórek poprzez pomiary tempa metabolizmu mitochondriów. Jednak na aktywność metaboliczną komórek mogą wpływać różne warunki hodowli (takie jak pożywka lub stężenie tlenu), co prowadzi do niedokładnych wyników i uniemożliwia standaryzację między typami komórek i warunkami2,3. Inną poważną wadą tych technik jest ich niezdolność do rozróżnienia wielu typów komórek – większość systemów biologicznych jest heterokomórkowa. Chociaż metody cytometrii przepływowej mają zdolność rozróżniania wielu populacji komórek, wymagane są etykiety komórek, dynamiczne pobieranie próbek jest trudne, a w przypadku korzystania z przylegających komórek aplikacja ta staje się czasochłonna i podatna na błędy.
Inne ważne fenotypy komórkowe, w tym zmiany morfologiczne, występują w odpowiedzi na bodźce środowiskowe, ale nie są wychwytywane przez tradycyjne testy komórkowe. Profilowanie stanów komórek poprzez charakterystykę morfologiczną i mapowanie podobieństw między próbkami jest potężnym, bezstronnym narzędziem, które może dostarczyć nowatorskich spostrzeżeń w wielu aspektach badań podstawowych i translacyjnych, w tym podstawowej biologii komórki i odkrywania leków4. Ponadto wykazano, że morfologia komórek nowotworowych koreluje z podtypami nowotworów5 i agresywność6. W związku z tym bardzo interesujące jest badanie tych cech komórkowych i ich związku z określonymi zaburzeniami środowiskowymi. Dodatkowo można wykorzystać różnice w cechach morfologicznych do rozróżnienia subpopulacji w systemach kokulturowych. Znakowanie fluorescencyjne komórek ma wady (tj. zmiana wrodzonych właściwości komórek, jest czasochłonne) i dlatego korzystne są dodatkowe metody klasyfikacji typów komórek.
Obrazowanie oparte na mikroskopii jest alternatywną metodą profilowania fenotypów komórkowych w sposób multipleksowany, ilościowy i solidny. W tym manuskrypcie stosujemy nasz potok obrazowania ilościowego, aby podkreślić dynamikę ewolucyjną heterogenicznych populacji komórek w guzie. Koncentrujemy się na interakcji między komórkami niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) a fibroblastami związanymi z rakiem (CAF), najbardziej rozpowszechnionym typem komórek zrębu występującym w nowotworach. CAF są zaangażowane w inicjację, progresję i odpowiedź terapeutyczną guza; dlatego wykonywanie testów fenotypowych na komórkach nowotworowych przy braku CAF może być mylące7,8,9. W szczególności oceniliśmy wpływ CAF na komórki nowotworowe w odpowiedzi na erlotynib, małą cząsteczkę ukierunkowaną na receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), który jest często stosowany w leczeniu klinicznym NSCLC. Do oceny wykorzystaliśmy platformę przesiewową o wysokiej zawartości i towarzyszące jej oprogramowanie do analizy obrazu; Próbując udostępnić tę metodologię innym badaczom, opracowaliśmy również porównywalny protokół downstream przy użyciu oprogramowania open source: CellProfiler10 i CellProfiler Analyst11. Większość opartych na obrazach testów przesiewowych o wysokiej zawartości jest analizowana za pomocą skomercjalizowanego oprogramowania specyficznego dla danego modelu urządzenia. Wyniki są trudne do powtórzenia w innych laboratoriach z innym oprogramowaniem, ponieważ podstawowe algorytmy są często zastrzeżone. Korzystając z tego potoku opartego na obrazie, zmierzono proliferację, śmierć i morfologię komórek każdej subpopulacji kultury heterokomórkowej w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne przy użyciu klasyfikacji opartej zarówno na fluorescencji, jak i morfologii. Poniższy protokół zapewnia solidną metodologię sondowania złożonych procesów komórkowych.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>średni suplement</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>średni suplement</td></tr><tr><td>TC20</td><td>Licznik komórek</td><td>1450102 Biorad</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka z błękitem trypanowym</td><td>Komórka 1450003 Biorad</td><td></td><td> szkiełka licznikowe</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>przezroczyste dolne czarne płytki</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>317275-100ML</td><td>roztwór do ponownego zawieszenia leku</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H21491</td><td>barwnik jądrowy</td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td>barwienie martwych komórek</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td>barwienie całych komórek</td></tr><tr><td>System obrazowania o wysokiej zawartości Operetka</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institue</td><td>wersja 2.2.0 (rev 9969f42)</td><td>http://cellprofiler.org/releases/</td></tr> <tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> <td>do hodowli komórkowychOdpowiedni będzie każdy inkubator do hodowli komórkowych - komórki hodowano pod 37 & ordm; C przy 5% CO2,</td></tr><tr><td>15 mL Probówki stożkowe Falcon</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 płytki do hodowli komórkowych</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr></tbody></table>

dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Procesy komórkowe są złożone i wynikają z wzajemnego oddziaływania między wieloma typami komórek i ich środowiskiem. Istniejące techniki biologii komórki często nie pozwalają na dokładną interpretację tej wzajemnej zależności. Stosując podejście oparte na obrazowaniu ilościowym, przedstawiamy protokół o wysokiej zawartości do charakteryzowania dynamicznych odpowiedzi fenotypowych (tj. zmian morfologii, proliferacji, apoptozy) heterogenicznych populacji komórek na zmiany bodźców środowiskowych. Podkreślamy naszą zdolność do rozróżniania typów komórek na podstawie intensywności fluorescencji lub nieodłącznych cech morfologii w zależności od zastosowania. Platforma ta pozwala na bardziej kompleksową charakterystykę reakcji subpopulacji na perturbacje przy jednoczesnym wykorzystaniu krótszego czasu, mniejszych ilości odczynników i mniejszego prawdopodobieństwa błędu niż tradycyjne testy biologii komórki. Jednak w niektórych przypadkach populacje komórek mogą być trudne do zidentyfikowania i ilościowego określenia na podstawie złożonych cech komórkowych i będą wymagały dodatkowego rozwiązywania problemów; Zwracamy uwagę na niektóre z tych okoliczności w protokole. Demonstrujemy tę aplikację za pomocą odpowiedzi na lek w modelu raka; Można go jednak z łatwością zastosować szerzej do innych procesów fizjologicznych. Protokół ten pozwala zidentyfikować subpopulacje w systemie kokultur i scharakteryzować szczególną reakcję każdej z nich na bodźce zewnętrzne.

Wygenerowano zestaw obrazów składający się z 25 pól/studzienkę, 54 studzienek/płytkę (3 populacje komórek x 6 stężeń leku x 3 powtórzenia), na trzech płytkach, co dało łącznie 4 050 pojedynczych obrazów. Zestawy obrazów wygenerowane w trakcie eksperymentu przeanalizowano za pomocą autorskiego oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby wyodrębnić różne właściwości ilościowe komórek (t.j. morfologię, fluorescencję), które następnie posłużyły do klasyfikacji subpopulacji komórek. Jednakże ze względu na ograniczony dostęp do stosowanego oprogramowania komercyjnego, stworzono porównywalne potoki analizy w programach CellProfiler i CellProfiler Analyst.
Klasyfikacja heterokomórkowa na subpopulacje
Jądra komórkowe zidentyfikowano i poddano segmentacji na podstawie barwienia DNA (w tym przypadku Hoechst), a populacje komórek sklasyfikowano albo na podstawie fluorescencji, albo morfologii (Rycina 1). W przypadku klasyfikacji opartej na fluorescencji, fibroblasty (CCD-19Lu) zostały wcześniej transdukowane lentiwirusem GFP. Dla każdego jądra zmierzono poziomy intensywności GFP; te, których wartości obliczono powyżej przyjętego progu (opartego na sygnale tła), zaklasyfikowano jako CCD-19Lu, natomiast wartości poniżej progu zidentyfikowano jako komórki nowotworowe (H325). W klasyfikacji opartej na morfologii komórki zostały wcześniej zabarwione nietoksycznym barwnikiem komórkowym (patrz tabela materiałów), co posłużyło do identyfikacji i segmentacji cytoplazmy. Algorytm uczenia maszynowego wytrenowano na ~50-10 komórkach z każdej populacji. Zidentyfikowano cechy morfologiczne, które istotnie różniły się między populacjami, a następnie wykorzystano je do zaprojektowania liniowego klasyfikatora pozwalającego odróżnić komórki CCD-19Lu od H325. Protokoły klasyfikacji fluorescencyjnej i morfologicznej były zgodne w 97,4% (n = 1403) przy rozróżnianiu dwóch populacji komórek w warunkach nieleczonych oraz w 92,5% (n = 916) w warunkach leczenia lekiem (1 µM erlotynibu) (Rycina 2).
Analizy fenotypowe subpopulacji
Oprócz rozróżniania typów komórek, dążyliśmy do scharakteryzowania właściwości fenotypowych każdej subpopulacji. Multipleksowanie analiz pozwala zaoszczędzić czas i odczynniki, zwiększa spójność oraz dostarcza dodatkowych informacji na temat badanego układu. Istnieje wiele potencjalnych parametrów fenotypowych, które należy wybierać w zależności od stawianych pytań badawczych. W niniejszej pracy badano zmiany w morfologii komórek i ich żywotności w odpowiedzi na leczenie erlotinibem. Po trzech dniach podawania leku zaobserwowano zmniejszenie powierzchni jądra oraz zwiększenie powierzchni komórek H3255 (Ryc. 3A). Stwierdzono, że średnia różnica w powierzchni jądra między populacjami „bez leku” a „leczonymi” jest statystycznie istotna w dwustronnym teście t typu 2 (równe wariancje) (p = 7,92 x 10-16). Hipotezą jest, że obserwacja ta stanowi odpowiedź komórkową na stres wywołany leczeniem farmakologicznym.
Interesujące jest również zbadanie, czy lek wywołuje efekt cytotoksyczny (t.j. wzrost liczby martwych komórek w czasie) czy cytostatyczny (t.j. spadek liczby nowych komórek w czasie), ponieważ ma to istotny wpływ kliniczny. Na przykład efekt cytostatyczny leku indukuje zatrzymanie wzrostu, ale nie eliminuje komórek z guza, w związku z czym istnieje możliwość ponownego zainicjowania proliferacji komórek nowotworowych po odstawieniu leku. Działanie leków często zależy od kontekstu, stężenia i typu komórek. Wcześniej zaobserwowaliśmy, że erlotynib wywołuje odpowiedź cytotoksyczną w jednym typie komórek, podczas gdy w innym wykazuje odpowiedź cytostatyczną13.
Tradycyjne testy żywotności podają względną liczbę komórek, a zatem nie rozróżniają między zatrzymaniem wzrostu a śmiercią komórkową. W niniejszej pracy martwe komórki zidentyfikowano na podstawie barwienia jodkiem propidylożym (Rycina 3B). Zaobserwowano zarówno efekty cytotoksyczne, jak i cytostatyczne erlotynibu w komórkach H3255, objawiające się zwiększeniem liczby zgonów oraz zmniejszeniem liczby podziałów po zastosowaniu leku (Rycina 3C). Warto zauważyć, że liczba martwych komórek spada po pierwszym dniu, co prawdopodobnie wynika z usuwania szczątków komórkowych. Komórki CCD-19Lu nie były pod wpływem leku. Dodatkową zaletą tej platformy jest generowanie danych ilościowych. Na przykład w naszym eksperymencie z ko-kulturą, początkowa subpopulacja 1 18 (75,8%) komórek H325 wzrosła do 2 817 (87,9%) lub spadła do 396 (57,2%) po trzech dniach odpowiednio bez lub z zastosowaniem erlotynibu (Rycina 4). Ponieważ jesteśmy w stanie uzyskać rzeczywistą liczbę komórek zamiast względnego procentu (jak w metodach cytometrii przepływowej), wyciągamy wniosek, że zmiana składu podczas leczenia lekiem wynika ze spadku liczby komórek H325, a nie ze wzrostu liczby komórek CCD-19Lu. Należy zauważyć, że wskaźniki śmiertelności mogą być niedoszacowane ze względu na usuwanie szczątków komórkowych, co jest trudne do oceny eksperymentalnej i prawdopodobnie różni się w zależności od typu komórek.
<img alt="Schemat blokowy klasyfikacji komórek; mikroskopia, segmentacja, morfologia, analiza fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu analizy obrazu. Dwa potencjalne potoki analizy obrazu w dalszych etapach procesu, służące do klasyfikacji populacji heterokomórkowych przy użyciu klasyfikacji opartej na morfologii lub klasyfikacji opartej na fluorescencji. Skala = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza działania leku; schemat przedstawiający morfologię, klasyfikacje fluorescencji: wyniki zgodności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zgodność między klasyfikacją opartą na morfologii a klasyfikacją opartą na fluorescencji. (A) Wykres zgodności obrazujący nakładanie się dwóch protokołów klasyfikacji. Te same komórki zostały sklasyfikowane jako H325 przy użyciu klasyfikacji opartej zarówno na morfologii, jak i na fluorescencji. Oba protokoły były zgodne w przypadku 97,4% (n = 1403) komórek nieleczonych oraz 92,5% (n = 916) komórek leczonych erlotinibem (Uwaga: biały obszar jest zbyt mały, aby był widoczny). (BObrazy 10X przedstawiające przykłady dobrej i słabej zgodności między klasyfikacją opartą na fluorescencji a klasyfikacją opartą na morfologii. Białe strzałki wskazują komórki, które zostały niespójnie sklasyfikowane pomiędzy platformami. Obraz wejściowy: niebieski – jądra komórkowe (Hoechst); zielony – CCD19Lu (GFP). Obrazy klasyfikacji: czerwony – H325; zielony – CCD-19Lu. Pasek skali = 100 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza komórek pod wpływem leku: Wykresy pudełkowe jąder komórkowych i powierzchni komórek (A); mikroskopia fluorescencyjna przeżywalności komórek z zastosowaniem barwnika do komórek martwych (B); wykresy liniowe obrazujące wzrost/śmierć komórek (C)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Multiple pomiary fenotypowe z pojedynczego układu eksperymentalnego. (ACechy morfologiczne, takie jak jądra i powierzchnia komórki, obliczono na poziomie pojedynczych komórek w obecności i pod nieobecność leku. Uwaga: powierzchnie komórek mniejsze niż 100 µm2 uznano za zanieczyszczenia i wykluczono z analiz. Wykres pudełkowy przedstawia medianę wraz z zakresami pierwszego i trzeciego kwartyla oraz słupkami błędów dla 95% przedziału ufności. (B) Komórki H3255 (niebieskie) i CCD-19Lu (zielone) poddano ko-kulturze, a martwe komórki zidentyfikowano na podstawie intensywności barwienia jodkiem propidium (czerwone) i obrazowano przy użyciu obiektywu 10X. Pasek skali = 1 mm (panel górny); 100 µm (dolne zdjęcia). (CObliczono całkowitą liczbę żywych i martwych komórek w ciągu trzech dni, z zastosowaniem leku lub bez niego, wykazując wyraźny spadek liczby żywych komórek oraz wzrost liczby martwych komórek po dodaniu erlotynibu. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej obliczony na podstawie trzech powtórzeń. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Mikroskopia, hodowla komórkowa, odpowiedź na lek, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy kołowe, H325, CCD-19Lu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Dynamika subpopulacji w czasie. Reprezentatywne obrazy 10X studni zawierających komórki H325 (niebieskie) i CCD-19Lu (zielone) w dniu 0. lub dniu 3., z lekiem i bez leku. Policzono komórki należące do każdej subpopulacji, a proporcjonalne wykresy kołowe przedstawiają rzeczywistą zmianę składu populacji w poszczególnych próbkach. Paski skali = 1 mm (panele środkowe, pokazane w panelu skrajnie lewym), 1 mm (obraz górny), 100 µm  (dolne obrazy). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest ilościowa ocena dynamicznych odpowiedzi fenotypowych populacji heterokomórkowych na zaburzenia, przy jednoczesnym rozróżnianiu poszczególnych subpopulacji. Większość oddziaływań fizjologicznych zachodzi w obecności wielu typów komórek. Metoda ta może pomóc biologom komórkowym ocenić, w jaki sposób heterogeniczne komórki reagują na identyczne presje środowiskowe oraz jak różne typy komórek wpływają na siebie nawzajem.Technika ta posiada kilka zalet: pozwala na rozróżnienie wielu typów komórek oraz umożliwia jednoczesną analizę subpopulacji, w tym tempa narodzin i śmierci komórek oraz dynamiki morfologicznej. Chociaż protokół ten może być wykorzystywany do badania wielu procesów biologicznych, zaprezentujemy przebieg pracy na przykładzie komórek nowotworowych H3255 oraz komórek fibroblastów CCD19LU traktowanych Erlotinibem, lekiem chemoterapeutycznym. Na początek, po przygotowaniu zawiesin komórkowych w probówkach zgodnie z protokołem tekstowym, należy odwrócić probówki, aby wymieszać komórki w roztworze i ustandaryzować wysiew.Następnie pipetujemy 10 µL każdej zawiesiny komórkowej do probówki do mikrowirówki i dodajemy 10 µL błękitu trypanu. 10 µL roztworu pipetujemy na szkiełko do liczenia komórek, a następnie wkładamy szkiełko do automatycznego licznika komórek. Liczenie komórek powtarzamy co najmniej trzy razy lub do momentu uzyskania spójnych wyników.Używając pipety wielokanałowej, wysiej łącznie 1 500 komórek w 100 µL pożywki RPMI do dołków płytki 96-dołkowej. Każdą zawiesinę komórkową wysiej w trzech powtórzeniach, stosując identyczny układ płytek dla każdego punktu czasowego. Inkubuj komórki przez noc.Do proszku Erlotinib dodać DMSO, aby przygotować roztwór zapasowy Erlotinib o stężeniu 10 mM. Następnie, użyć pożywki do hodowli komórkowej, aby rozcieńczyć lek do stężenia dwukrotnie wyższego niż najwyższe stężenie końcowe wynoszące 10 µM. Lek rozcieńczać seryjnie czterokrotnie w stosunku 1:10, aby otrzymać łącznie pięć stężeń leku oraz kontrolę bez leku.Do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej z komórkami pipetuj 100 µL roztworu leku, aby uzyskać końcowe stężenie leku 1x w pożywce. Następnie, w celu zabarwienia komórek do klasyfikacji opartej na fluorescencji, przygotuj w PBS barwnik jądrowy w stężeniu 5 µg/mL oraz barwnik do martwych komórek w stężeniu 5 µM. Do klasyfikacji opartej na morfologii przygotuj w PBS barwnik jądrowy w stężeniu 5 µg/mL, barwnik do martwych komórek w stężeniu 5 µM oraz barwnik do komórek w stężeniu 5 µM.Do każdego dołka dodaj 20 µL roztworu barwnika. Następnie inkubuj próbki w temperaturze 37 °C w ciemności przez 30 minut. Aby uzyskać obrazy, przetrzyj spód płytki 70% etanolem i umieść płytkę w komorze obrazowania.W karcie ustawień (set up), w sekcji wyboru kanałów (channel selection), kliknij przycisk plus, aby dodać do obrazu odpowiednie kanały. W sekcji wyboru układu (layout selection) ustaw stos z (z stack) obrazów testowych co 2 µm, zaczynając od 0 µm i kończąc na 20 µm, aby zidentyfikować płaszczyznę ostrości. Kliknij snapshot pod każdym kanałem, aby ocenić intensywność sygnału i zoptymalizować czasy ekspozycji.Wprowadź wyższe lub niższe wartości w polu czasu, zgodnie z potrzebami. Jądra komórkowe muszą znajdować się w ogniskowej, aby zapewnić dokładność dalszej analizy. Na schemacie płytki zaznacz odpowiednie studzienki.Następnie w schemacie dołków zaznacz w podobny sposób 25 pól do obrazowania. W sekcji uruchamiania eksperymentu określ płytkę w polu nazwy płytki, a następnie kliknij przycisk start, aby uruchomić protokół akwizycji obrazów z użyciem obiektywu 10x w celu wygenerowania obrazów TIFF w skali szarości w wybranych kanałach. Po zainstalowaniu otwartoźródłowego oprogramowania CellProfiler oraz CellProfiler analysis, otwórz program CellProfiler, kliknij Plik, Importuj, Potok z pliku i wybierz odpowiedni plik.Wybierz potok klasyfikacji oparty na fluorescencji, aby zaklasyfikować komórki jako H3255 lub CCD19LU na podstawie intensywności EGFP oraz obliczyć cechy morfologiczne. Kliknij View output settings, a następnie wybierz lokalizację plików obrazów do analizy oraz miejsce docelowe dla wyekstrahowanych danych. Przed uruchomieniem analizy protokół należy przetestować w trybie testowym, aby sprawdzić wartości parametrów.Kluczowe jest, aby segmentacja jądrowa i komórkowa była dokładna. Niniejszy protokół został opracowany w celu identyfikacji komórek o zróżnicowanym barwieniu jąder oraz zapewnienia, że wartość piksela, o którą jądra są rozszerzane, jest wystarczająco duża, aby zamaskować jądra o najsilniejszym barwieniu DNA, ale jednocześnie wystarczająco mała, aby nie zamaskować sąsiednich jąder. Aby sklasyfikować populacje na podstawie fluorescencji, należy najpierw przeskalować zakres intensywności GFP, następnie zmierzyć intensywność GFP każdego zidentyfikowanego jądra i sklasyfikować obiekty na podstawie zdefiniowanego przez użytkownika progu.Następnie kliknij analyze images, aby rozpocząć analizę. Po zakończeniu analizy przejdź do domyślnego folderu wyjściowego, aby przejrzeć obliczone dane. W przypadku klasyfikacji opartej na morfologii uruchom odpowiedni protokół w programie CellProfiler, aby wygenerować cechy morfologiczne całych komórek.Otwórz oprogramowanie do analizy Cell Profiler, wybierz plik właściwości bazy danych wygenerowany w Cell Profiler i kliknij otwórz. Kliknij kartę Classifier w górnym lewym rogu ekranu. Aby pobrać losowe obrazy komórek z eksperymentu, kliknij fetch; obrazy pojawią się w oknie unclassified.Ręcznie zaklasyfikuj komórki jako pozytywne lub negatywne, co w tym przypadku reprezentuje H3255 lub CCD19LU, wybierając i przeciągając komórki do odpowiedniego koszyka. Po zaklasyfikowaniu co najmniej 50 komórek na subpopulację kliknij Train Classifier, a następnie Check Progress. Na koniec kliknij Score All, aby wygenerować tabelę z liczbą komórek dla każdej subpopulacji.W heterokomórkowej hodowli w niskiej temperaturze komórek guza H3255 oraz fibroblastów CCD19LU zidentyfikowano i wysegmentowano jądra komórkowe na podstawie barwienia DNA. Populacje komórek sklasyfikowano za pomocą sztucznie wywołanej fluorescencji lub poprzez trenowanie algorytmu uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów komórek na podstawie różnic morfologicznych. Stwierdzono wysoką zgodność między metodologiami opartymi na fluorescencji i morfologii.Dwie metody klasyfikacji zastosowano niezależnie do tych samych obrazów, a zgodność wyników wyniosła odpowiednio 97,4% dla populacji nieleczonej i 92,5% dla populacji leczonej. W niniejszej pracy badano zmiany w morfologii komórek oraz odpowiedź na leczenie Erlotinibem. Po trzech dniach podawania leku w komórkach H3255 zaobserwowano zmniejszenie powierzchni jąder oraz zwiększenie powierzchni komórek.Mogło to być spowodowane śmiercią komórek. Aby sprawdzić, czy Erlotinib wykazuje działanie cytotoksyczne czy cytostatyczne wobec komórek, martwe komórki zidentyfikowano na podstawie barwienia jodkiem propidyny. Zaobserwowano zarówno działanie cytotoksyczne, jak i cytostatyczne Erlotinibu na komórki H3255, objawiające się zwiększeniem liczby zgonów oraz zmniejszeniem liczby podziałów po zastosowaniu leku.Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch nieprzylegających do siebie godzin, jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po zastosowaniu tej metody można przeprowadzić inne analizy, takie jak interferencja RNA lub CRISPR, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania z zakresu genomiki funkcjonalnej. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii nowotworów do zbadania wpływu komórek zrębu na progresję guza w wielu typach nowotworów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób badania odpowiedzi heterokomórkowych na bodźce środowiskowe, a w szczególności metodę wysokoprzepustowej analizy danych obrazowych uzyskanych za pomocą mikroskopii.

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Opisujemy użycie standardowego mikroskopu optycznego do wykonywania ilościowych pomiarów masy, objętości i gęstości komórek poprzez kombinację jasnego pola i różnicowego kontrastu interferencyjnego.

Ilościowa mikroskopia optyczna: pomiar cech biofizycznych komórek za pomocą standardowego mikroskopu optycznego

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Uśpione i aktywne fenotypy komórek nowotworowych zostały scharakteryzowane za pomocą ilościowego obrazowania fazowego. Testy proliferacji, migracji i morfologii komórek zostały zintegrowane i przeanalizowane w jednej prostej metodzie.

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Prezentujemy metodę, która wykorzystuje uogólnioną analizę obrazu opartą na obszarze do identyfikacji liczby komórek. Analiza różnych populacji komórek pozwoliła na wykorzystanie znacznych różnic w wysokości i strukturze komórek między różnymi typami komórek w ramach algorytmu adaptacyjnego.

Algorytm analizy obrazu oparty na obszarze do ilościowego oznaczania kokultur makrofagów i fibroblastów

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Poznaj metodę dyskryminacji i charakterystyki populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego. Protokół umożliwia jednoczesną analizę podpopulacji komórek H3255 i CCD19LU oraz ocenę ich dynamiki fenotypowej.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Przeglądaj więcej filmów