Protokół wielokrotnego nokautu genów w organoidach jelita cienkiego myszy przy użyciu konkategomera CRISPR

Ten protokół opisuje kroki klonowania wielu pojedynczych przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego RNA przewodnika, co jest szczególnie przydatne w tworzeniu wielogenowych nokautów przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. Wytwarzanie podwójnych nokautów w organoidach jelitowych przedstawiono jako możliwe zastosowanie tej metody.

Ogólnym celem tego protokołu jest sklonowanie wielu przewodnikowych RNA do jednego wektora konkategorującego CRISPR i osiągnięcie wysoce wydajnej elektroporacji w organoidach jelitowych myszy, w celu uzyskania jednoczesnego nokautu wielu genów. Metoda ta może znacznie poprawić efektywność badań nad utratą funkcji, umożliwiając przezwyciężenie potencjalnego efektu kompensacji równoległej. Główną zaletą naszej strategii CRISPR-concatemer jest wygoda pojedynczego etapu klonowania oraz możliwość jednoczesnego znokautowania do czterech różnych genów.

Demonstracją procedury zajmie się Alessandra Merenda, doktorantka z mojego laboratorium. Klonowanie przewodnikowych RNA lub gRNA do wektora konkategorowego CRISPR rozpoczyna się od pojedynczej reakcji mającej na celu wyżarzanie górnych i dolnych nici dla każdego oligonukleotydu gRNA i fosforylację ich końców. Przygotuj mieszaninę reakcyjną na lodzie, dla trzech konkamerów użyj trzech mikrolitrów górnych nici gRNA, trzech mikrolitrów dolnych nici gRNA, dwóch mikrolitrów buforu ligazy DNA T4, jednego mikrolitra kinazy polinukleotydowej T4 i wody do całkowitej objętości 20 mikrolitrów.

Dobrze wymieszaj, pipetując i uruchamiając termocykler przy następujących ustawieniach: 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, zmniejsz do 25 stopni Celsjusza przy 0,3 stopnia Celsjusza na minutę i przytrzymaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Kolejnym etapem jest reakcja tasowania Bbs1, w której wstępnie wyżarzone oligonukleotydy gRNA są wprowadzane w odpowiednie położenie wektora konkategorowego. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną od 1 do 100 w DNA, wodzie wolnej od RNA, aby wytworzyć trzy i cztery wektory konkategorów gRNA.

Zmontuj reakcje tasowania Bbs1 na lodzie. Użyj 100 nanogramów wektora konkategorowego CRISPR, 10 mikrolitrów mieszaniny oligo, jeden mikrolitr buforu enzymu restrykcyjnego, jeden mikrolitr DTT, jeden mikrolitr ATP, jeden mikrolitr enzymu Bbs1, jeden mikrolitr ligazy T7 i wodę do całkowitej objętości 20 mikrolitrów. Dobrze wymieszać przez pipetowanie, dołączyć kontrolę ujemną, która zawiera wektor.

Uruchom reakcje w termocyklerze, stosując następujące ustawienia, aby sklonować trzy i cztery konkamery gRNA, uruchom 50 cykli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut i 21 stopni Celsjusza przez pięć minut, przytrzymaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie utrzymuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w nieskończoność. W przypadku dwóch konkategomerów gRNA uruchom te same ustawienia z 25 cyklami kroku pierwszego. Po zakończeniu reakcji tasowania Bbs1 weź 11 mikrolitrów każdej mieszanki ligacyjnej i dodaj 1,5 mikrolitra buforu egzonukleazy, 1,5 mikrolitra ATP, jeden mikrolitr egzonukleazy DNA i wodę do całkowitej objętości 15 mikrolitrów.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie mieszanina reakcyjna jest wykorzystywana do przekształcania chemicznie kompetentnych bakterii E.Coli zgodnie ze standardowym protokołem. Aby potwierdzić obecność insercji gRNA w wektorze konkategorowym CRISPR, wybierz kolonie bakterii za pomocą pętli inokulacyjnej i zaszczepij każdą z nich w czterech mililitrach pożywki LB.

Hoduj klony przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wytrząsarce orbitalnej. Następnego dnia DNA jest ekstrahowane za pomocą zestawu do miniprepu plazmidu, zgodnie z instrukcjami producenta. Wymieszaj około 200 nanogramów każdej próbki DNA z 10 jednostkami EcoR1 i pięcioma jednostkami BglII w reakcji 10 mikrolitrów.

Dołączyć oddzielną mieszaninę reakcyjną z odpowiednim pierwotnym wektorem jako kontrolę pozytywną do porównania wielkości. Inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Uruchom reakcje trawienia na 1% żelu agarozowym o napięciu 90 woltów przez około 20 minut.

Wizualizuj żel za pomocą transiluminatora UV, aby zidentyfikować klony o odpowiednim rozmiarze wkładki. Aby potwierdzić, że gRNA zostały sklonowane we właściwej pozycji i w konsekwencji wszystkie miejsca rozpoznawania Bbs1 zostały utracone, należy przetrawić wybrane klony za pomocą pięciu jednostek Bbs1. Dołącz oddzielną mieszaninę reakcyjną, z odpowiadającym jej oryginalnym wektorem jako kontrolą.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, uruchamiać reakcje trawienia na 1% żelu agarozowym o napięciu 90 woltów przez około 20 minut. Wizualizuj żel za pomocą transiluminatora UV, aby zidentyfikować wektory, które nie są cięte przez Bbs1. Podczas rozdzielania organoidów do elektroporacji należy wysiać co najmniej sześć dołków z 48-dołkową płytką na transwekcję.

Wysiewaj organoidy w 20-mikrolitrowych kroplach macierzy podstawowej i hoduj je w 250 mikrolitrach WENR plus pożywka nikotynamidowa na dołek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnym inkubatorze. Drugiego dnia zastąp pożywkę WENR plus nikotynamidu 250 mikrolitrami EGF plus noggin, inhibitor GSK3 i inhibitor skały bez antybiotyków. Trzeciego dnia zmień podłoże organoidowe na EGF plus noggin, inhibitor GSK3, inhibitor skał i 1,25% dimetylosulfotlenku bez antybiotyków.

Czwartego dnia rozbij kopuły matrycy w piwnicy za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety i przenieś organoidy do 1,5-mililitrowej probówki. Wyciągnąć zawartość czterech studzienek z płytki 48-dołkowej do jednej probówki. Mechanicznie rozbić organoidy na małe fragmenty, pipetując pipetą P200 w górę iw dół pipetą P200 razy.

Wirować w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu usunąć pożywkę ze wszystkich probówek i ponownie zawiesić palety w jednym mililitrze rekombinowanej proteazy klasy hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez maksymalnie pięć minut.

Ważne jest, aby uważnie monitorować leczenie proteazą, ponieważ powodzenie elektroporacji zależy od uzyskania zawiesiny komórkowej, która zawiera klastry komórek, a nie pojedyncze komórki. Sprawdź kroplę próbki o pojemności 50 mikrolitrów pod mikroskopem światła odwróconego z czterokrotnym obiektywem. Pożądane są klastry od 10 do 15 komórek, ponieważ zwiększa to przeżywalność komórek po elektroporacji.

Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania i zakończ dysocjację, dodając dziewięć mililitrów podłoża podstawowego bez antybiotyków. Odwirować go w temperaturze 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić paletę w jednym mililitrze zredukowanej pożywki surowicy.

Policz liczbę ogniw z komorą Burkesa, potrzeba co najmniej 1 razy 10 do piątych ogniw na reakcję elektroporacji. Rozpocznij tę procedurę od dodania dziewięciu mililitrów zredukowanej pożywki surowicy do 15-mililitrowej probówki zawierającej zawiesinę komórek i odwiruj pod ciśnieniem 400 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Usuń cały supernatant i ponownie zawieś paletę w roztworze do elektroporacji.

Dodaj łączną ilość 10 mikrogramów DNA do dwóch nowych probówek. Następnie dodaj roztwór do elektroporacji do końcowej objętości 100 mikrolitrów i trzymaj mieszaninę DNA komórki na lodzie. Przenieś mieszaninę DNA komórki do kuwety elektroporacyjnej, umieść kuwetę w komorze elektroporatora.

Zmierz impedancję, naciskając odpowiedni przycisk na elektroporatorze i upewnij się, że wynosi od 0,030 do 0,055 oma. Wykonaj elektroporację zgodnie z ustawieniami wskazanymi w protokole tekstowym. Dodaj 400 mikrolitrów buforu do elektroporacji i inhibitora skał do kuwety, a następnie przenieś całą jej zawartość do 1,5 mililitrowej probówki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby komórki mogły się zregenerować. Po 30 minutach wirować z prędkością 400 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant i ponownie zawieś paletę w 20 mikrolitrach na studzienkę matrycy podstawowej.

Wysiewaj około 10 razy do czwartej do jednej razy 10 do piątej komórki na studzienkę w 48-dołkowej płytce i dodaj EGF plus noggin, inhibitor GSK3, inhibitor skały i 1,25% pożywki z dimetylosulfotlenku. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zmień pożywkę na EGF plus noggin, inhibitor GSK3 i inhibitor skały i sprawdź wydajność transwekcji, obserwując ekspresję GFP.

Utrzymuj organoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dwa dni później zastąp podłoże świeżym. Cztery dni po elektroporacji zmień pożywkę na WENR plus pożywkę z nikotynamidu i inhibitorem skał i kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Obecność prawidłowej liczby insercji gRNA w wektorze konkategorowym potwierdza trawienie z podwójnym ograniczeniem z EcoR1 i BglII. Oczekiwany rozmiar dolnego pasma wynosi około 1,6 kilozasady dla wektora konkatenera z czterema gRNA i 1,2 kilozasady dla wektora konkatenera z trzema gRNA. Ponadto trawienie za pomocą Bbs1 potwierdza, że gRNA zostały sklonowane we właściwej pozycji, w wyniku czego wszystkie miejsca rozpoznawania Bbs1 zostają utracone.

Potwierdzone konstrukty są dostarczane do organoidów jelitowych myszy za pomocą elektroporacji, aby osiągnąć skuteczność transwekcji do 70%, jak wykazano za pomocą ekspresji GFP. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wektory konkategorów gRNA i jak skutecznie dostarczać je do kultur organoidów 3D za pomocą elektroporacji, aby osiągnąć nokaut wielu genów w tym samym czasie.