Uniwersalny i skuteczny protokół elektroporacji w inżynierii genetycznej organoidów przewodu pokarmowego

Metoda ta umożliwia wydajną transfekcję kultur komórkowych 3D, takich jak organoidy. Można ułatwić różne zastosowania inżynierii genetycznej. Protokół jest uniwersalny i może być wykonany w ciągu jednego dnia.

Nie wymaga intensywnego przygotowania ani specjalnych, kosztownych do elektroporacji. Ta metoda transfekcji została zademonstrowana w guzach i zdrowych organoidach, ale można ją również dostosować do sferoid i hodowli komórek 2D. Jeśli wykonujesz ten protokół po raz pierwszy, ważne jest, aby obchodzić się z organoidami ostrożnie ze względu na ich indywidualną proliferację i reakcję na dysocjację.

Monitoruj je pod mikroskopem podczas całego zabiegu. Zacznij od wstępnego podgrzania 48-dołkowych płytek w temperaturze 37 stopni Celsjusza do wysiewu po elektroporacji, a następnie przygotuj podłoża specyficzne dla kultur podstawowych i organoidowych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Hodować pięć dołków organoidów na próbkę do elektroporacji na 48-dołkowej płytce, przygotować 230 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego z 10-mikromolowym Y-27632 na studzienkę.

Monitorować organoidy pod mikroskopem. Usunąć pożywkę hodowlaną ze studzienek i mechanicznie zdysocjować organoidy w przygotowanej mieszaninie dysocjacyjnej. Połącz pięć studzienek na próbkę do elektroporacji w jednej 15-mililitrowej probówce.

Wymieszaj zawartość probówki przez wirowanie i inkubuj ją przez pięć do 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż pojawią się skupiska od 10 do 15 komórek, sprawdzając dysocjację pod mikroskopem. Zatrzymaj trawienie, dodając do 10 mililitrów podłoża podstawowego bez antybiotyków. Odwirować probówkę o stężeniu 450 razy g przez pięć minut, odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki czterema mililitrami buforu do elektroporacji.

Odwirować i wyrzucić supernatant po każdym przemyciu. Po przepłukaniu ponownie zawiesić osad organoidowy w 100 mikrolitrach buforu do elektroporacji z 30 mikrogramami plazmidowego DNA. Dozuj kompletną mieszaninę DNA-organoid do kuwety do elektroporacji.

Upewnij się, że unikasz pęcherzyków powietrza. Ustaw parametry elektroporacji zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym i postukaj palcem w kuwetę, aby delikatnie wymieszać ogniwa. Umieść kuwetę w komorze kuwety i naciśnij przycisk impedancji na elektroporatorze, aby zanotować wartość impedancji.

Naciśnij przycisk Start, aby zainicjować program elektroporacji i kontrolować wyświetlane wartości prądów, voltage i energie. Po elektroporacji natychmiast dodać do komórek 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez antybiotyków i wymieszać, pipetując w górę iw dół. Przenieś próbkę do nowej 15-mililitrowej probówki i przepłucz kuwetę podłożem podstawowym, aby zebrać pozostałe komórki, a następnie inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 40 minut.

Odwirować komórki w temperaturze 450 razy g przez pięć minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach matrycy podstawowej i wysiać krople o pojemności 20 mikrolitrów na podgrzanej 48-dołkowej płytce. Inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji i dodać 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej Y-27632 i CHIR99021 do dołka.

Aby określić skuteczność transfekcji, sprawdź fluorescencję w kontroli transfekcji pod mikroskopem po 24 do 48 godzinach. W przypadku analizy FACS należy zebrać komórki zgodnie z wcześniejszym opisem i trawić przez 10 do 20 minut, aż pojawią się pojedyncze komórki. Dodać do 10 mililitrów PBS i odwirować komórki w temperaturze 450 razy g przez pięć minut, a następnie odessać i wyrzucić supernatant.

Aby odróżnić żywe komórki, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze PBS i dodaj odpowiednie przeciwciało lub jodek propidyny. Delikatnie wymieszaj komórki, stukając i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji przemyć komórki 10 mililitrami PBS, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS i przefiltrować zawiesinę przez 100-mikrometrowe sitko do probówki FACS. Przeanalizuj komórki za pomocą maszyny FACS przy użyciu odpowiedniej strategii bramkowania i określ wydajność transfekcji. Organoidy czterech różnych jednostek nowotworowych poddano elektroporacji co najmniej trzykrotnie przy użyciu 30 mikrogramów małego plazmidu lub dużego plazmidu.

Analizowano je za pomocą cytometrii przepływowej 48 godzin po elektroporacji i bramkowano pod kątem kształtu komórek, pojedynczych komórek, żywych komórek i ekspresji eGFP. We wszystkich czterech jednostkach organoidowych mały plazmid był transfekowany z większą wydajnością niż większy. Najbardziej efektywną transfekcję małego plazmidu osiągnięto w organoidach PDAC z 92,1% komórkami GFP-dodatnimi, podczas gdy duży plazmid był transfekowany ze skutecznością 46,7%, większy plazmid był skuteczniej transfekowany do organoidów CRC ze średnią wydajnością 53,4%, podczas gdy mały plazmid był transfekowany ze średnią wydajnością 84,3%Najtrudniejszą jednostką do transfekcji były organoidy raka żołądka, który wykazał najniższą skuteczność transfekcji dla obu plazmidów.

Jako dowód słuszności koncepcji, ludzkie normalne organoidy żołądka zostały elektroporowane plazmidem kodującym Cas9, GFP i 2sgRNA ukierunkowane na TP53. Klony zostały wybrane przez podanie Nutlin3, a nokaut TP53 został potwierdzony przez sekwencjonowanie alleli. Jak wykazaliśmy na organoidach ludzkiego żołądka, wydajna elektroporacja umożliwia różne manipulacje bazami CRISPR Cas9 w kulturach organoidów, takie jak nokaut lub knockin, dzięki czemu można modelować różne choroby.