Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego
11 sierpnia 2019
Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.
Długoterminowa plastyczność synaptyczna, w szczególności długotrwałe wzmocnienie i długotrwała depresja były szeroko badane wzdłuż poprzecznej orientacji hipokampa. Przyjrzano się mu również wzdłuż orientacji podłużnej. Jednak jeśli chodzi o orientację podłużną, bardzo mało uwagi poświęcono podłużnej osi CA1 hipokampa w odniesieniu do plastyczności synaptycznej.
Poprzednia publikacja z naszego laboratorium wykazała, że neurony piramidowe CA1 w hipokampie tworzą połączenia asocjacyjne, które mogą wspierać plastyczność synaptyczną. W celu lepszego zrozumienia tego protokołu zaleca się zapoznanie się z poprzednią publikacją z podanym poniżej odniesieniem. Wstrzyknij uretan, aby znieczulić mysz.
Umieść w pełni znieczuloną mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Nałóż żel pod oczy, aby zwilżyć oczy. Mocno przymocuj czaszkę myszy za pomocą zacisku ocznego.
Klamra oczna daje eksperymentatorowi swobodę ruchomości podczas zabiegów chirurgicznych. Może to być szczególnie przydatne w eksperymentach z udziałem kory słuchowej. Należy jednak dołożyć wszelkich starań, aby uzyskać dokładne współrzędne stereotaktyczne.
Oddziel tkankę podskórną i mięśnie na końcu kości międzyciemieniowej i potylicznej myszy za pomocą skalpela. Osusz oponę twardą bawełnianym wacikiem. Następnie nakłuwa się cisterna magna, aby odprowadzić płyn mózgowo-rdzeniowy.
Załóż bawełniany wacik, aby kontynuować odprowadzanie płynu mózgowo-rdzeniowego. Wytnij i usuń skórę na skórze głowy i utrzymuj odsłonięty obszar w suchości. Zaznacz punkty odpowiadające obszarowi hipokampa za pomocą suwmiarki do veniyar.
Wykonaj nacięcie w czaszce powyżej grzbietowej części hipokampa wzdłuż zaznaczonych punktów za pomocą skalpela lub wiertła o dużej prędkości, obserwując pod mikroskopem. Utrzymuj odsłoniętą tkankę mózgową wilgotną, stosując sól fizjologiczną lub obojętny olej. Zamocuj i umieść elektrody stymulacyjne i rejestrujące mocno w uchwycie stereotaktycznym.
Wyreguluj elektrody stymulacyjne i rejestrujące nad grzbietowym hipokampem CA1. Użyj mózgu myszy we współrzędnej stereotaktycznej jako przewodnika w zlokalizowaniu współrzędnej dla grzbietowego podłużnego regionu hipokampa CA1. W przypadku nagrań przy użyciu elektrod wielokanałowych najpierw zlokalizuj współrzędne stereotaktyczne dla regionu hipokampa CA1 za pomocą pierwszego kanału.
Pozostałe elektrody ustawić tak, aby kąt elektrody stymulacji i elektrody rejestrującej mieściły się w zakresie od 30 stopni do 60 stopni w stosunku do linii środkowej od punktu bregma. Kąt ten odpowiada orientacji podłużnej obszaru hipokampa CA1. Włącz system nagrywania.
Otwórz oprogramowanie neuronowe do nagrywania i pozyskiwania danych. Powoli obniżaj elektrody rejestrujące i stymulujące za pomocą mikromanipulatora, aż dotknie powierzchni mózgu. Obserwuj wzrost impedancji w momencie, gdy elektroda dotyka powierzchni mózgu.
Można to zaobserwować w czerwonym kanale pokazanym na ekranie. Powoli opuść elektrody na przybliżoną głębokość odpowiadającą wybranym współrzędnym stereotaktycznym dla hipokampa CA1. Dawaj stymulację, dopóki nie zostanie zaobserwowany stabilny, wypełniony ewokacją, pobudzający potencjał postsynaptyczny.
Wykonaj krzywą wejścia-wyjścia, aby wykryć maksymalną intensywność bodźca. Użyj krzywej wejścia-wyjścia, aby ustawić intensywność linii bazowej i ustawić intensywność bodźca w celu wywołania stymulacji o wysokiej częstotliwości lub stymulacji o niskiej częstotliwości. Rejestruj lokalny pełny potencjał przez godzinę po stymulacji wysokiej częstotliwości lub stymulacji o niskiej częstotliwości.
Eksportuj dane i analizuj je za pomocą wybranego oprogramowania. Ubij 400 ml już przygotowanego roztworu do krojenia do osobnej kolby i natleniaj przez około 20 minut. Słabe 200 ml natlenionego roztworu do krojenia.
Przykryj folią i przenieś do zamrażarki o temperaturze 80 stopni na około 20 minut, aby uzyskać błoto pośniegowe. Pozostałe 200 ml roztworu do krojenia w komorze na plasterki mózgu należy umieścić w wodzie o temperaturze 32 stopni Celsjusza z ciągłym bulgotaniem. Wydobyć schłodzony roztwór do krojenia i ubić około 50 ml do zlewki.
Odetnij głowę znieczulonej myszy. Przetnij skórę pokrywającą czaszkę myszy i odetnij kawałek czaszki wzdłuż linii środkowej do kości potylicznej. Otwórz czaszkę kleszczami.
Delikatnie wydłub mózg szpatułką i umieść w schłodzonym roztworze do krojenia w zlewce. Oddziel dwie półkule mózgu wzdłuż linii środkowej za pomocą ostrza skalpela. Odizoluj hipokamp, delikatnie odłączając go od kory za pomocą szpatułki.
Wytnij przegrodowy i skroniowy koniec izolowanego hipokampa. Nałóż niewielką ilość kleju na płytkę do krojenia. W przypadku podłużnego wycinka hipokampa CA1 przymocuj obszar CA3 hipokampa do płytki do krojenia za pomocą kleju.
W przypadku przekroju poprzecznego, który będzie służył jako kontrola, przymocuj brzuszny koniec hipokampa do płytki tnącej wibratomu. Umieść go w komorze krojenia. Ustaw parametry wibratomu.
Pokrój przyczepiony hipokamp za pomocą wibratomu. Dobry podłużny wycinek mózgu hipokampa CA1 będzie miał jedną warstwę CA1 i dwie warstwy zakrętu zębatego. Obecna będzie również warstwa oriens i warstwa promieniowa regionu CA1.
Alternatywnie, poprzeczny wycinek mózgu hipokampa będzie miał obszary zakrętu zębatego CA3 i CA1 w takcie. Przenieś wycinki mózgu do komory na wycinki mózgu w bocie wodnym. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza i doprowadzić do temperatury pokojowej w celu odzyskania.
Ciągłe przelanie serfa ACS do komory zapisu z prędkością 2 ml na minutę. Przenieś wycinek mózgu do komory nagraniowej, wyreguluj pozycję wycinka mózgu kleszczami i przytrzymaj go na miejscu z trzaskiem. Włącz oprogramowanie do zbierania danych.
Podłużny wycinek mózgu. W przypadku plastrów podłużnych należy umieścić elektrodę stymulacyjną i rejestrującą w warstwie oriens. Umieść elektrodę stymulacyjnej po przegrodzie lub skroniowej wycinka mózgu z zapisem z tej samej warstwy.
Alternatywnie, umieść elektrodę stymulacyjną i rejestrującą w warstwie promieniowej, umieść elektrodę stymulacyjną w przegrodzie lub skroniowej stronie wycinka mózgu. W przypadku warstw poprzecznych jako kontroli, umieść elektrodę stymulacyjną w regionie szlaku pobocznego CA3 Schaffera, a elektrodę rejestrującą w regionie CA1. Włącz generator bodźców izolatora i podaj stymulację.
Dostosuj głębokość elektrody rejestrującej, aż do momentu zaobserwowania stabilnego pobudzającego potencjału postsynaptycznego. Wykonaj krzywą wejścia-wyjścia, aby wykryć maksymalną intensywność bodźca. Użyj krzywej wejścia-wyjścia, aby ustawić intensywność bodźca dla zapisu linii bazowej wywołującego stymulację o wysokiej częstotliwości lub stymulację o niskiej częstotliwości.
Zapoznaj się z załączonym plikiem PDF, aby zapoznać się z parametrami indukowania samotnego wzmocnienia lub długotrwałej depresji. Wywołany pobudzający potencjał postsynaptyczny zwiększył się w odpowiedzi na stymulację o wysokiej częstotliwości in vivo. To pokazuje, że podłużny hipokamp CA1 wspiera długotrwałe wzmocnienie.
W przypadku podłużnych wycinków mózgu CA1 w hipokampie zaobserwowano wzrost odpowiedzi na stymulację o wysokiej częstotliwości zarówno po stronie przegrody, jak i skroniowej warstwy oriens i warstwy promieniowej. Pokazuje to, że plastyczność synaptyczna indukowana wzdłuż podłużnego regionu CA1 hipokampa nie jest liniowa ani specyficzna dla kierunku. Stosując już ustalone protokoły leczenia długotrwałej depresji, nie wywołano długotrwałej depresji zarówno in vivo, jak i in vitro.
Podsumowując, pokazaliśmy, jak badać długoterminową plastyczność synaptyczną w podłużnym regionie CA1 hipokampa zarówno in vivo, jak i in vitro. Więcej szczegółów na temat protokołu można znaleźć w pliku PDF dołączonym do tego filmu, aby pomóc w badaniu długoterminowej plastyczności synaptycznej wzdłuż podłużnego regionu CA1 hipokampa we własnych laboratoriach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje długotrwałą plastyczność synaptyczną wzdłuż osi podłużnej obszaru CA1 hipokampa z wykorzystaniem podłużnych przekrojów mózgu oraz rejestracji in vivo. Badanie koncentruje się na wyjaśnieniu potencjałów postsynaptycznych zewnątrzkomórkowych w celu zrozumienia zmian synaptycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Plastyczność synaptyczna
Wprowadzenie
- Długotrwała plastyczność synaptyczna jest kluczowa dla uczenia się i pamięci.
- Poprzednie badania koncentrowały się głównie na orientacji poprzecznej hipokampa.
- Ograniczona liczba badań skupiała się na podłużnej plastyczności synaptycznej obszaru CA1.
- Połączenia asocjacyjne neuronów piramidowych CA1 mogą wspierać plastyczność.
Cel badania
- Badanie plastyczności synaptycznej wzdłuż osi podłużnej obszaru CA1.
- Analiza wywoływania pozakomórkowych potencjałów postsynaptycznych in vivo.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zmian synaptycznych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano podłużne skrawki mózgu z obszaru hipokampa oraz rejestracje in vivo.
- Myszom podano uretan w celu znieczulenia podczas procedur eksperymentalnych.
- W celu gromadzenia danych elektrody rozmieszczono precyzyjnie zgodnie z współrzędnymi stereotaktycznymi.
- Do rejestracji zastosowano protokoły stymulacji wysoką i niską częstotliwością.
- Dane analizowano przy użyciu oprogramowania neurologicznego w celu oceny kształtu fali i potencjału.
Główne wyniki
- Zarejestrowano stabilne wywołane pobudzające potencjały postsynaptyczne.
- Badanie potwierdziło mechanizmy długotrwałych zmian synaptycznych wzdłuż osi podłużnej obszaru CA1.
- Rejestracje elektrofizjologiczne wskazują na znaczną aktywność synaptyczną podczas stymulacji.
- Krzywe wejście-wyjście wykazały, że zastosowanie różnych intensywności bodźców prowadzi do wzmocnienia odpowiedzi synaptycznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie rzuca światło na słabo zbadaną długoterminową plastyczność synaptyczną neuronów pola CA1.
- Wnioski z badań mają znaczenie dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych w procesach uczenia się i pamięci.
- Wyniki mogą stanowić podstawę dla przyszłych badań nad dynamiką i plastycznością synaptyczną.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie podłużnej plastyczności synaptycznej w sieciach obszaru CA1 hipokampa dostarcza mechanistycznego wglądu w działanie obwodów neuronalnych istotnych dla walidacji celów w ośrodkowym układzie nerwowym. Niniejsza praca wypełnia lukę w modelach skoncentrowanych na warstwie poprzecznej poprzez charakterystykę połączeń asocjacyjnych CA1-CA1, co wspiera ograniczanie ryzyka w przypadku hipotez dotyczących procesów poznawczych zależnych od hipokampa. Dwukierunkowe podejście elektrofizjologiczne umożliwia ocenę zaangażowania celu oraz modulację szlaków w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących podłużnych obwodów hipokampa oraz mechanizmów plastyczności zależnej od receptora NMDA.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez elektrofizjologiczne odczyty specyficzne dla warstw i kierunków w nienaruszonych sieciach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez odróżnianie stanów sieci zdolnych do LTP od stanów z deficytem LTD w modelach przedklinicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych podłużnych skrawków hipokampa do powtarzalnych pomiarów zewnątrzkomórkowych potencjałów polowych.
- Wyniki ilościowe: Generowanie stabilnych wywołanych pobudzeniowych potencjałów postsynaptycznych, odpowiednich do profilowania zależności dawka-odpowiedź oraz częstotliwości stymulacji.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Standaryzacja przygotowania skrawków i rozmieszczenia elektrod umożliwia porównywalność między badaniami oraz podłużne śledzenie danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Jest zgodne z domenami poznawczymi zależnymi od hipokampa w modelach chorób neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
- Ciągłość mechanistyczna: Łączy testy plastyczności w fazie odkrywania z przedkliniczną walidacją efektów synaptycznych zapośredniczonych przez cel.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Brak LTD w obszarze CA1 międzylamellarnym determinuje wybór biomarkerów oraz kryteria go/no-go dla przesiewu modulatorów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, dostarczając dowodów elektrofizjologicznych na modulację synaptyczną w istotnym dla choroby podsystemie hipokampa.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących zaangażowania wzdłużnego szlaku CA1 oraz zależności od receptorów NMDA z wykorzystaniem krzywych wejście-wyjście i indukcji LTP.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane odczyty potencjału polowego, umożliwiając porównanie efektów związków wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej.
- Analityka: Wyniki obejmują amplitudę LTP, progi stymulacji oraz brak LTD — ilościowe parametry do oceny modulacji celu.
- Badania translacyjne: Łączy z pracami przedklinicznymi poprzez konserwatywną budowę mikroobwodów CA1 i zależność od receptorów NMDA u różnych gatunków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do wzdłużnego badania hipokampa, wykraczającą poza zastosowanie w ramach pojedynczego badania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez rozstrzygnięcie niejednoznaczności mechanistycznej w obrębie sygnalizacji podłużnej w hipokampie.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zstandaryzowane, powtarzalne protokoły rejestracji potencjałów polowych in vivo i in vitro z określonymi kryteriami rozmieszczenia elektrod.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez identyfikację sieci zdolnych do LTP i redukcję wyników fałszywie ujemnych w badaniach przesiewowych skoncentrowanych na plastyczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile plastyczności dwukierunkowej w systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu chirurgii stereotaktycznej, anatomii hipokampa oraz interpretacji sygnałów elektrofizjologicznych.
- Zależne od stabilnych systemów rejestracji, mikromanipulatorów oraz oprogramowania umożliwiającego generowanie krzywych wejście-wyjście oraz indukcję LTP/LTD.
- Wymaga standaryzacji orientacji skrawków, parametrów stymulacji oraz czasu trwania rejestracji bazowej pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych modeli wymaga walidacji homologii podłużnej CA1 oraz zachowania połączeń asocjacyjnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują techniczną wrażliwość na kąt wprowadzenia elektrody (30–60 stopni od linii środkowej) oraz drenaż płynu mózgowo-rdzeniowego podczas preparacji in vivo.
