Name: Demonstracja mikroskopu zintegrowanego z hipersoczewkami i obrazowania superrozdzielczego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-08T11:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj proces wytwarzania sferycznego hiper soczewki do obrazowania superrozdzielczego w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia powiększanie informacji dwuwymiarowych poniżej granicy dyfrakcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana finansowo przez program Young Investigator (NRF-2015R1C1A1A02036464), program Engineering Research Center (NRF-2015R1A5A1037668) i program Global Frontier (CAMM-2014M3A6B3063708), M.K., S.S., I.K. potwierdza Globalne Stypendia Doktoranckie (NRF-2017H1A2A1043204, NRF-2017H1A2A1043322, NRF-2016H1A2A1906519) poprzez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (MSIP) Korei) poprzez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (MSIP) Korei) rząd.

1. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Otrzymaj wysoko rafinowany wafel kwarcowy. Do opisanej tutaj produkcji należy użyć płytki o grubości 500 μm.</li>
	<li>Wirować wafel kwarcowy dodatnim fotorezystem przy 2 000 obr./min i piec przez 60 s w temperaturze 90 °C. 
	UWAGA: Dodatnia warstwa fotorezystu jest powlekana, aby zapobiec uszkodzeniom podczas kolejnego etapu cięcia.</li>
	<li>Za pomocą kostki pokrój wafel z fotorezystem na małe kawałki o wymiarach 20 x 20mm2.</li>
	<li>Przedmuchać za pomocą pistoletu do sprężonego azotu, aby usunąć cząstki stałe powstałe na etapie cięcia.</li>
	<li>Umieścić go w łaźni ultradźwiękowej w wodzie dejonizowanej (DI) na 5 minut w temperaturze 45 °C. Usunąć warstwę fotorezystu za pomocą kąpieli ultradźwiękowej w acetonie przez 5 minut w temperaturze 45 °C. Oczyścić podłoże za pomocą dwóch kąpieli ultradźwiękowych, acetonu i alkoholu izopropylowego, każda przez 5 minut w temperaturze 45 °C.</li>
	<li>Osuszyć podłoże pistoletem do sprężonego azotu.</li>
</ol>
2. Wytrawianie wzoru maski
<ol>
	<li>Załaduj czyste podłoża kwarcowe do wysokopróżniowego systemu odparowywania wiązką elektronów. Upewnij się, że rotacja podłoża jest włączona</li>.
	<li>Osadzać warstwę chromu z szybkością stapiania 2 Κ/s. 
	UWAGA: Na maskę trawiącą należy nałożyć warstwę o grubości co najmniej 100 nm, aby zapobiec dziurkom powstałym w wyniku osadzania.</li>
	<li>Naciśnij przycisk odpowietrzania, aby odpowietrzyć komorę i zamontuj próbkę na uchwycie skupionej wiązki jonów (FIB) za pomocą przewodzącej taśmy miedzianej.</li>
	<li>Załaduj uchwyt FIB do komory FIB.</li>
	<li>Zamknij drzwiczki komory i naciśnij przycisk pompy, aby opróżnić komorę.</li>
	<li>Wybierz "wiązka włączona" w zakładce sterowania wiązką i ustaw prąd wiązki jonów (7,7 pA) i napięcie przyspieszenia (30 kV) dla trybu FIG.</li>
	<li>Włącz system wiązki jonów.</li>
	<li>Wybierz "wiązka włączona" pod zakładką sterowania wiązką, aby włączyć wiązkę elektronów i ustawić ostrość obrazu przy małym powiększeniu za pomocą oprogramowania.</li>
	<li>Ustaw odległość roboczą (WD) na 4 mm pod zakładką nawigacyjną w trybie skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).</li>
	<li>Ustaw kąt nachylenia uchwytu na 52° i wykonaj obrazy SEM w różnych powiększeniach przed wykonaniem wzoru maski z matrycą otworów.</li>
	<li>Na karcie wzoru wybierz region wzoru i utwórz układ otworów 50 nm na warstwie chromu. 
	UWAGA: W zakładce tworzenia wzorów dostępne są proste narzędzia do tworzenia wzorów. Bardziej złożoną geometrię i kontrolę ekspozycji można uzyskać, importując mapy bitowe lub generując skrypty.</li>
	<li>Po zakończeniu wyłącz systemy wiązki elektronów i wiązki jonów i schładzaj system.</li>
	<li>Naciśnij przycisk odpowietrzania i odpowietrz komorę gazowym azotem. Wyjmij uchwyt z komory.</li>
	<li>Zamknij drzwiczki komory i opróżnij komorę, naciskając przycisk pompy.</li>
</ol>
3. Proces trawienia na mokro i usuwanie warstwy maski
<ol>
	<li>Wzorzyste podłoże umieścić w buforowym wytrawiaczu tlenkowym w skali 1:10 na 5 min. 
	UWAGA: Kwarc jest selektywnie i izotropowo trawiony na mokro przez wytrawiacz i tworzy kulisty kształt. Kształt soczewki można uzyskać za pomocą maski trawiącej, a średnica jest precyzyjnie kontrolowana przez czas trawienia. Lepszy kulisty kształt można uzyskać przy mniejszej średnicy wzoru. Półkulę o średnicy 1,5 μm można uzyskać w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Umieść wzorzyste podłoże w wodzie DI, aby oczyścić buforowany wytrawiacz tlenkowy (5 min, dwa razy). 
	UWAGA: Buforowany wytrawiacz tlenkowy może być niebezpieczny, dlatego należy zachować ostrożność podczas korzystania z tego wytrawiacza.</li>
	<li>Osuszyć próbkę sprężonym azotem gazowym.</li>
	<li>Umieść wzorzyste podłoże w wytrawiaczu chromowym CR-7, aby usunąć warstwę maski chromowej. 
	UWAGA: Po usunięciu warstwy chromu można uzyskać podłoże o kulistym wzorze o średnicy 1,5 μm.</li>
	<li>Włóż wzorzyste podłoże do wody DI w celu jego oczyszczenia (5 min).</li>
</ol>
4. Wielowarstwowe osadzanie i nano-wymiarowa inskrypcja obiektu
UWAGA: Para warstw jest osadzona na sferycznym podłożu kwarcowym. W tym przypadku jako materiały do osadzania stosuje się Ag i TiO2. Ag i TiO2 osadza się naprzemiennie o grubości 15 nm.
<ol>
	<li>Naciśnij przycisk odpowietrzania systemu odparowywania wiązką elektronów i poczekaj, aż odpowietrznik się skończy.</li>
	<li>Załaduj wzorzyste podłoże do wysokopróżniowego systemu parowania wiązką elektronów za odpowietrznikiem.</li>
	<li>Zamknij drzwiczki komory i opróżnij komorę do stopnia podciśnienia 10-7 Torr, naciskając przycisk pompy. 
	UWAGA: Stan próżni powinien być utrzymywany na poziomie 10-7 Torr, aby zmniejszyć rozpraszanie spowodowane chropowatością powierzchni.</li>
	<li>Osadzać warstwę Ag z szybkością wzrostu 1 A/s i osadzać warstwę Ag o grubości 15 nm.</li>
	<li>Po osadzeniu warstwy Ag podłoże schładzać przez 5 min.</li>
	<li>Zmienić kieszeń w systemie parowania wiązką elektronów, wybierając inny tygiel i osadzając warstwę TiO2 o szybkości wzrostu 1 Α/s. Umieść warstwę TiO2 o grubości 15 nm. 
	UWAGA: Podczas procesu osadzania szybkość wzrostu filmu jest utrzymywana na niskim poziomie, aby utrzymać jednorodność chropowatości powierzchni.</li>
	<li>Po osadzeniu warstwy TiO2 należy schłodzić podłoże przez 5 min.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.4 - 4.7 przez dziesiątki cykli, aby nałożyć wielowarstwową Ag i TiO2. 
	UWAGA: W tym momencie produkcja hipersoczewek dobiegła końca. Następnym krokiem jest stworzenie dowolnej funkcji ograniczonej subdyfrakcją do testowania możliwości obrazowania hipersoczewkowego. Nanometrowe otwory i szczeliny są wpisane w frezowanie FIB.</li>
	<li>Zmienić kieszeń systemu parowania wiązką elektronów i osadzać warstwę chromu o grubości 50 nm.</li>
	<li>Po osadzeniu warstwy Cr wyłącz system parowania wiązką elektronów. Naciśnij przycisk odpowietrzania i odpowietrz komorę, wprowadzając gazowy azot.</li>
	<li>Po odpowietrzniku otwórz drzwiczki komory i wyjmij uchwyt montażowy z komory. Zdejmij spreparowane urządzenie hyperlens.</li>
	<li>Zamknij drzwiczki komory i opróżnij komorę, naciskając przycisk pompy.</li>
	<li>Zamontuj hipersoczewkę osadzoną chromem w systemie mielenia FIB i uformuj strukturę o rozmiarach nano, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Konfiguracja systemu obrazowania i procedura obrazowania
<ol>
	<li>Umieść konwencjonalny transmisyjny mikroskop optyczny na stole optycznym. 
	UWAGA: W tym przypadku jako główny korpus użyto odwróconego mikroskopu optycznego.</li>
	<li>Podłącz źródło światła białego do ścieżki oświetlenia mikroskopu za pomocą adaptera.</li>
	<li>Umieść optyczny filtr pasmowoprzepustowy wyśrodkowany na 410 nm. 
	UWAGA: Filtr pasmowoprzepustowy selektywnie penetruje określoną długość fali światła; W tym przypadku na próbce świeci światło o długości fali 410 nm. Hipersoczewka składająca się z Ag i TiO2 ma wysoką wydajność przy długości fali 410 nm. Wynik symulacji (Rysunek 2c) pokazuje wydajność hipersoczewki, która spełnia zależność dyspersji hiperbolicznej przy świetle 410 nm.</li>
	<li>Wybierz soczewkę obiektywową z olejkiem o dużym powiększeniu. Użyj wysokiej jakości kamery CCD, aby uzyskać obrazy. 
	UWAGA: To ustawienie optyczne po prostu umieszcza filtr pasmowoprzepustowy w ścieżce oświetlenia światła, aby uporządkować światło o długości fali 410 nm. Określona długość fali światła może być oświetlana na próbce bez użycia światła białego, ale w normalnym laboratorium mikroskopy optyczne mogą mieć źródło światła białego do obserwacji próbek za pomocą obrazowania w jasnym polu lub fluorescencji.</li>
	<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na soczewce obiektywu. Umieść hipersoczewkę na stoliku próbki i zarejestruj obrazy. 
	UWAGA: Nanoobiekty wpisane w nano na wewnętrznej powierzchni hipersoczewki mogą być oświetlone światłem o długości fali 410 nm. Dzięki hiperobiektywowi obiekty o rozmiarach nano zostaną powiększone i uchwycone przez obiektyw obiektywu oraz zobrazowane przez kamerę CCD.</li>
</ol>

<ol><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF02956173?LI=true">Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).</li>
<li>Dürig, U., Pohl, D. W., Rohner, F. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Dieter_Pohl/publication/224419975_Near-Field_Optical_Scanning_Microscopy_in_Reflection/links/00b7d5270d75651937000000.pdf">Near-field optical-scanning microscopy.</a> J Appl Phys. 59 (10), 3318-3327 (1986).</li>
<li>Pendry, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Refraction+Makes+a+Perfect+Lens%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Negative Refraction Makes a Perfect Lens.</a> Phys Rev Lett. 85 (18), 3966-3969 (2000).</li>
<li>Fang, N., Liu, Z., Yen, T. -J., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+evanescent+waves+from+a+silver+superlens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Regenerating evanescent waves from a silver superlens.</a> Opt Express. 11 (7), 682-687 (2003).</li>
<li>Fang, N., Lee, H., Sun, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-Diffraction-Limited+Optical+Imaging+with+a+Silver+Superlens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sub-Diffraction-Limited Optical Imaging with a Silver Superlens.</a> Science. 308 (5721), 534-537 (2005).</li>
<li>Melville, D. O. S., Blaikie, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+through+a+planar+silver+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging through a planar silver layer.</a> Opt Express. 13 (6), 2127-2134 (2005).</li>
<li>Taubner, T., Korobkin, D., Urzhumov, Y., Shvets, G., Hillenbrand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Field+Microscopy+Through+a+SiC+Superlens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Near-Field Microscopy Through a SiC Superlens.</a> Science. 313 (5793), 1595-1595 (2006).</li>
<li>Jacob, Z., Alekseyev, L. V., Narimanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Hyperlens%3A+Far-field+imaging+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Optical Hyperlens: Far-field imaging beyond the diffraction limit.</a> Opt Express. 14 (18), 8247-8256 (2006).</li>
<li>Lee, H., Liu, Z., Xiong, Y., Sun, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+optical+hyperlens+for+imaging+below+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Development of optical hyperlens for imaging below the diffraction limit.</a> Opt Express. 15 (24), 15886-15891 (2007).</li>
<li>Liu, Z., Lee, H., Xiong, Y., Sun, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-Field+Optical+Hyperlens+Magnifying+Sub-Diffraction-Limited+Objects%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-Field Optical Hyperlens Magnifying Sub-Diffraction-Limited Objects.</a> Science. 315 (5819), 1686-1686 (2007).</li>
<li>Kim, M., Rho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metamaterials+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Metamaterials and imaging.</a> Nano Converg. 2 (1), 22(2015).</li>
<li>Byun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+nanoimprinted+hyperlens+array+for+high-throughput+sub-diffraction+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Demonstration of nanoimprinted hyperlens array for high-throughput sub-diffraction imaging.</a> Sci Rep. 7, 46314(2017).</li>
<li>Shekhar, P., Atkinson, J., Jacob, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbolic+metamaterials%3A+fundamentals+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Converg%22%5BJournal%5D)">Hyperbolic metamaterials: fundamentals and applications.</a> Nano Converg. 1 (1), 14(2014).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/ra/c6ra17098f">Sub-diffraction demagnification imaging lithography by hyperlens with plasmonic reflector layer.</a> RSC Advances. 6 (98), 95973-95978 (2016).</li>
<li>Sun, J., Xu, T., Litchinitser, N. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.6b04175">Experimental demonstration of demagnifying hyperlens.</a> Nano Lett. 16 (12), 7905-7909 (2016).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sub-wavelength+nanofocusing+of+UV-visible+light+by+hyperbolic+metamaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Deep sub-wavelength nanofocusing of UV-visible light by hyperbolic metamaterials.</a> Sci Rep. 6, 38645(2016).</li>
<li>Rho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+hyperlens+for+two-dimensional+sub-diffractional+imaging+at+visible+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spherical hyperlens for two-dimensional sub-diffractional imaging at visible frequencies.</a> Nat Commun. 1, 143(2010).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-thin+ultra-smooth+and+low-loss+silver+films+on+a+germanium+wetting+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Ultra-thin ultra-smooth and low-loss silver films on a germanium wetting layer.</a> Opt Express. 18 (5), 5124-5134 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Produkcja hipersoczewki obejmuje trzy główne etapy: zdefiniowanie geometrii półkulistej w podłożu kwarcowym poprzez proces trawienia na mokro, ułożenie wielowarstwy metalu i dielektryka za pomocą systemu parowania wiązką elektronów oraz wpisanie obiektu w warstwę Cr. Najważniejszym krokiem jest drugi, ponieważ może on znacząco wpłynąć na jakość hipersoczewki. W procesie osadzania cienkowarstwowego występują dwa warunki, które wymagają szczególnej dbałości o wyraźny obraz o wysokiej rozdzielczości. Układanie wielowarstwy ...

Chęć obserwowania biomolekuł w żywych komórkach doprowadziła do wynalezienia mikroskopii, a pojawienie się mikroskopii przyczyniło się do rewolucji w różnych dziedzinach, takich jak biologia, patologia i materiałoznawstwo, w ciągu ostatnich kilku stuleci. Jednak dalszy postęp badań został ograniczony przez dyfrakcję, która ogranicza rozdzielczość konwencjonalnych mikroskopów do około połowy długości fali1. Dlatego obrazowanie superrozdzielcze w celu pokonania granicy dyfrakcji było interesującym obszarem badawczym w ostatnich dziesięcioleciach.
Ponieważ limit dyfrakcji jest przypisywany utracie fal ulotnych, które zawierają informacje o sub-długości fal na obiektach, przeprowadzono wczesne badania, aby zapobiec zanikaniu fal ulotnych lub je odzyskać2,3. Wysiłek zmierzający do pokonania limitu dyfrakcji został po raz pierwszy opisany za pomocą skaningowej mikroskopii optycznej bliskiego pola, która zbiera ulotne pole w bliskiej odległości od obiektu, zanim zostanie ono rozproszone2. Ponieważ jednak skanowanie całego obszaru obrazu i jego rekonstrukcja zajmuje dużo czasu, nie można go zastosować do obrazowania w czasie rzeczywistym. Chociaż inne podejście oparte na "supersoczewce", która wzmacnia fale ulotne, zapewnia możliwość obrazowania w czasie rzeczywistym, obrazowanie poniżej długości fali jest możliwe tylko w obszarze bliskiego pola i nie może sięgać daleko poza obiekty4,5,6,7.
Ostatnio hipersoczewka pojawiła się jako nowatorskie podejście do obrazowania optycznego dalekiego pola w czasie rzeczywistym8,9,10,11,12. Hipersoczewka, która jest wykonana z wysoce anizotropowych metamateriałów hiperbolicznych13, wykazuje płaską dyspersję hiperboliczną, dzięki czemu obsługuje wysokie informacje przestrzenne przy tej samej prędkości fazowej. Ponadto, ze względu na prawo zachowania pędu, wektor fali poprzecznej o wysokiej długości poprzecznej jest stopniowo ściskany, gdy fala przechodzi przez geometrię cylindryczną. Ta powiększona informacja może być zatem wykryta przez konwencjonalny mikroskop w obszarze dalekiego pola. Ma to szczególne znaczenie w przypadku obrazowania dalekiego pola w czasie rzeczywistym, ponieważ nie wymaga skanowania punkt po punkcie ani rekonstrukcji obrazu. Co więcej, hipersoczewka może być wykorzystywana do zastosowań innych niż obrazowanie, w tym do nanolitografii. Światło, które przechodzi przez hipersoczewkę w odwrotnym kierunku, zostanie skupione na obszarze subdyfrakcyjnym ze względu na symetrię odwrócenia czasu14,15,16.
Tutaj informujemy o sferycznym hipersoczewce, która powiększa dwuwymiarowe informacje z częstotliwością widzialną. W przeciwieństwie do konwencjonalnej geometrii cylindrycznej, sferyczna soczewka hipersoczewkowa powiększa obiekty w dwóch wymiarach bocznych, ułatwiając praktyczne zastosowania obrazowania. Szczegółowo przedstawiono metodę produkcji i konfigurację obrazowania za pomocą hipersoczewki w celu odtworzenia wysokiej jakości hipersoczewki. Obiekt o poddługości fali jest wpisywany w hipersoczewkę w celu udowodnienia jej superrozdzielczej mocy. Potwierdzono, że drobne cechy wpisanych obiektów są powiększane przez hipersoczewkę. W ten sposób uzyskuje się wyraźnie rozdzielcze obrazy w obszarze pola dalekiego w czasie rzeczywistym. Ten nowy typ sferycznej soczewki hiperobiektywnej, dzięki łatwości integracji z konwencjonalną mikroskopią, zapewnia możliwość praktycznych zastosowań obrazowania, prowadząc do świtu nowej ery w biologii, patologii i ogólnej nanonauce.

<table><tbody><tr><td>Frezarka z skupioną wiązką jonów</td><td>FEI</td><td>Helios Nanolab G3 CX</td><td></td></tr><tr><td>System odparowywania wiązki elektronów</td><td>Korea Vacuum Tech</td><td>KVE-E4000</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi</td><td>SU6600</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia odwrócona</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>EXCELITAS Technologies</td><td>X-Cite 110 LED</td><td></td></tr><tr><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma</td><td>ET405/30M</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>Plan-Apochromat</td><td>NA=1.3, 100X</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Kamera Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Wafel kwarcowy</td><td>CORNING</td><td>Topiona krzemionka Corning 7980</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany wytrawiacz tlenkowy</td><td>J.T Baker TM</td><td>J.T.Baker 5175</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>AZ electronic materiały</td><td>GXR-601 PR</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiacz chromowy</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>J.T Baker TM</td><td>UN1090</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>J.T Baker TM</td><td>UN1219</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie symulacyjne MES</td><td>COMSOL 5.1 Multiphysics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demonstracja mikroskopu zintegrowanego z hipersoczewkami i obrazowania superrozdzielczego

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

Wykorzystanie obrazowania super-rozdzielczego do pokonania limitu dyfrakcji konwencjonalnej mikroskopii wzbudziło zainteresowanie badaczy biologii i nanotechnologii. Chociaż mikroskopia skaningowa bliskiego pola i supersoczewki poprawiły rozdzielczość w obszarze bliskiego pola, obrazowanie dalekiego pola w czasie rzeczywistym pozostaje poważnym wyzwaniem. Ostatnio hipersoczewka, która powiększa i przekształca fale ulotne w fale rozchodzące się, pojawiła się jako nowatorskie podejście do obrazowania w polu dalekim. Tutaj donosimy o wytworzeniu sferycznej soczewki składającej się z naprzemiennie cienkich warstw srebra (Ag) i tlenku tytanu (TiO2). W przeciwieństwie do konwencjonalnej cylindrycznej soczewki hipersoczewkowej, sferyczna soczewka hipersoczewkowa pozwala na dwuwymiarowe powiększenie. Dzięki temu włączenie do konwencjonalnej mikroskopii jest proste. Zaproponowano nowy układ optyczny zintegrowany z hipersoczewką, który pozwala na uzyskanie obrazu o długości poniżej długości fali w obszarze pola dalekiego w czasie rzeczywistym. W tym badaniu szczegółowo wyjaśniono metody wytwarzania i konfiguracji obrazowania. W pracy opisano również dostępność i możliwości hipersoczewki, a także praktyczne zastosowania obrazowania w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, które mogą doprowadzić do rewolucji w biologii i nanotechnologii.

Zdolność urządzenia hyperlens do rozdzielania struktur subdyfrakcyjnych zależy od jego jednorodności oraz wysokiej jakości wykonania. W tym przypadku hyperlens składa się z naprzemiennie osadzonych warstw Ag i TiO2. Rysunek 2a przedstawia obraz SEM prawidłowo wykonanego hyperlens17. Obraz przekroju poprzecznego wykazuje, że wielowarstwa z cienkich filmów Ag i Ti3O5 została osadzona z jednorodną grubości...

Użycie hipersoczewki zostało uznane za nowatorską technikę obrazowania w superrozdzielczości ze względu na jej zalety w obrazowaniu w czasie rzeczywistym i jej prostą implementację za pomocą konwencjonalnej optyki. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący wytwarzanie i obrazowanie zastosowań hipersoczewki sferycznej.

Demonstracja mikroskopu zintegrowanego z hipersoczewkami i obrazowania superrozdzielczego

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zademonstrowanie procesu wytwarzania oraz obrazowania subdyfrakcyjnego za pomocą dwuwymiarowego urządzenia typu hyperlens. Ta nowatorska technika obrazowania w superrozdzielczości charakteryzuje się zaletami takimi jak obrazowanie w czasie rzeczywistym oraz łatwość implementacji w konwencjonalnej optyce. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny obrazowania w superrozdzielczości, takie jak obrazowanie żywych komórek i dynamicznych nanocząsteczek poniżej limitu dyfrakcyjnego.Hipersoczewka (hyperlens) to specjalna soczewka sferyczna o strukturze wielowarstwowej, charakteryzująca się płaską dyspersją hiperboliczną, która umożliwia powiększanie informacji o wysokiej częstotliwości oraz uzyskanie rozdzielczości typowej dla podobnych układów optycznych w polu dalekim w czasie rzeczywistym. Główną zaletą sferycznej hipersoczewki jest możliwość powiększania informacji dwuwymiarowej przy częstotliwościach widzialnych. Sferyczną hipersoczewkę można również łatwo zintegrować z konwencjonalną mikroskopią bez konieczności stosowania dodatkowych, złożonych systemów.Procedurę zademonstrują Dasol Lee i Inki Kim, doktoranci z mojego laboratorium. Na początek na waferze kwarcowym należy rozprowadzić metodą spin-coatingu pozytywny fotorezyst przy 2 000 rpm, a następnie wypiekać przez 60 sekund w temperaturze 90 °C. Następnie, przy użyciu maszyny do dicingu, należy pociąć wafer z fotorezystem na małe kawałki o wymiarach 20 na 20 mm².Przedmuchaj elementy pistoletem z sprężonym azotem, aby usunąć wszelkie cząsteczki powstałe w wyniku etapu cięcia. Następnie umieść pocięty wafer w kąpieli ultradźwiękowej z wodą dejonizowaną na pięć minut w temperaturze 45 °C. Usuń warstwę fotorezystu, stosując kąpiel ultradźwiękową z acetonem przez pięć minut w temperaturze 45 °C.Następnie oczyść podłoże, umieszczając je w kąpieli ultradźwiękowej z alkoholem izopropylowym na pięć minut w temperaturze 45 °C. Osusz podłoże za pomocą pistoletu z azotem sprężonym. Aby wytrawić wzór maski, najpierw umieść oczyszczone podłoża kwarcowe w systemie naparowania wiązką elektronów w wysokiej próżni.Nanieś warstwę chromu z szybkością osadzania wynoszącą dwie angstromy na sekundę. Naciśnij przycisk odpowietrzania, aby odpowietrzyć komorę. Zamocuj próbkę w uchwycie do skupionej wiązki jonów (FIB), używając przewodzącej taśmy miedzianej.Następnie umieść uchwyt FIB w komorze FIB. Zamknij drzwi komory i naciśnij przycisk pompy, aby odessać powietrze z komory. W zakładce sterowania wiązką wybierz opcję Beam On, a następnie ustaw natężenie prądu wiązki jonowej i napięcie przyspieszające dla trybu FIB.Włącz system wiązki jonowej. W zakładce sterowania wiązką wybierz opcję Beam On, aby uruchomić wiązkę elektronów, a następnie za pomocą oprogramowania ustaw ostrość obrazu przy niskim powiększeniu. Następnie, w trybie skaningowego mikroskopu elektronowego, ustaw odległość roboczą na 4 mm w zakładce nawigacji.Ustaw kąt nachylenia uchwytu na 52 stopnie i wykonaj obrazy SEM przy różnych powiększeniach przed wytworzeniem wzoru maski z macierzy otworów. W zakładce wzorowania (patterning) wybierz obszar wzorowania i wykonaj macierz otworów o rozmiarze 50 nanometrów na warstwie chromu. Po zakończeniu wyłącz systemy wiązki elektronowej i wiązki jonowej, a następnie je schłodź.Naciśnij przycisk odpowietrzania, aby przedmuchać komorę azotem. Następnie wyjmij uchwyt z komory. W kolejnym kroku umieść wzorowany podłoże w roztworze trawiącym tlenek buforowanym w stosunku 1:10 na pięć minut.Umieść podłoże z naniesionym wzorem w wodzie dejonizowanej, aby wypłukać buforowany trawiciel tlenków. Następnie osusz próbkę sprężonym azotem. Umieść podłoże z naniesionym wzorem w trawicielu chromu, aby usunąć chromową warstwę maskującą.Na koniec umieść wyprawiony podłoże w wodzie dejonizowanej na pięć minut w celu jego oczyszczenia. Naciśnij przycisk odpowietrzania w systemie naparowania wiązką elektronową i poczekaj do zakończenia procesu odpowietrzania. Następnie, po odpowietrzeniu, wprowadź wyprawione podłoże do wysokopróżniowego systemu naparowania wiązką elektronową.Zamknij drzwi komory i odessaj powietrze z komory, naciskając przycisk pompy. Nanieś warstwę srebra z szybkością wzrostu 1 Å/s, aż do uzyskania grubości warstwy srebra wynoszącej 15 nm. Po nałożeniu warstwy srebra chłodź podłoże przez pięć minut.Zmień kieszeń w systemie naparowania wiązką elektronową, wybierając inny tygiel, a następnie nanieś warstwę tlenku tytanu z szybkością wzrostu 1 Å/s. Następnie nanieś warstwę tlenku tytanu o grubości 15 nm. Po naniesieniu warstwy tlenku tytanu chłodź podłoże przez pięć minut.Powtórz etapy osadzania przez kilkadziesiąt cykli, aby wytworzyć wielowarstwę srebra i tlenku tytanu. Zmień tygiel w systemie naparowania wiązką elektronową i osadź warstwę chromu o grubości 50 nanometrów. Po osadzeniu warstwy chromu wyłącz system naparowania wiązką elektronową.Naciśnij przycisk odpowietrzania i odpowietrz komorę, wprowadzając azot. Po odpowietrzeniu otwórz drzwi komory i wyjmij uchwyt montażowy z komory. Zdejmij wykonany element hyperlens.Następnie zamknij drzwi komory i odessaj z niej powietrze, naciskając przycisk pompy. Zamocuj hipersoczewkę z naniesionym chromem w systemie frezowania FIB i wytwórz strukturę nanometryczną zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie ustaw konwencjonalny mikroskop optyczny w transmisji na stole optycznym.Za pomocą adaptera podłącz źródło białego światła do toru oświetlenia mikroskopu. Umieść filtr pasmowo-przepustowy z centrum przy 410 nanometers. Wybierz obiektyw imersyjny o dużym powiększeniu i użyj wysokiej jakości kamery CCD w celu uzyskania obrazów.Nanieś kroplę olejku imersyjnego na soczewkę obiektywu. Na koniec umieść hyperlens na stole przedmiotowym i wykonaj zdjęcia. Przedstawiony tutaj hyperlens składa się z naprzemiennie naniesionych warstw srebra i tlenku tytanu.Obraz przekroju poprzecznego pokazuje, że wielowarstwowa cienka powłoka z srebra i tlenku tytanu została osadzona z jednorodną grubością na półsferycznym podłożu kwarcowym. Hyperlens składający się ze srebra i tlenku tytanu wykazuje wysoką wydajność przy długości fali 410 nanometrów, ponieważ relacja dyspersyjna ułożonych warstw ma hiperboliczną krzywą dyspersyjną, jak pokazano tutaj. Komponenty o wysokim przestrzennym wektorze falowym mogą propagować wzdłuż kierunku radialnego hyperlensu.Małe elementy posiadające wysokoczęstotliwościowe składowe, których nie można zarejestrować za pomocą konwencjonalnej optyki, mogą propagować do pola dalekiego poprzez hyperlens, co wykazano w symulacji metodą elementów skończonych. Po wykonaniu hyperlens może zostać zintegrowany z konwencjonalnym systemem mikroskopowym, co przedstawiono na tym prostym schemacie układu obrazowania z wykorzystaniem hyperlens. Hyperlens jest umieszczany na obiektywie.W celu zademonstrowania działania hipersoczewki, na jej wewnętrznej powierzchni wyryto sztuczny wzór. Wyniki przedstawiają obrazy zarejestrowane za pomocą hipersoczewki. W każdym przypadku wielkość przerwy wynosi od 160 nanometrów do 180 nanometrów.Cechy o rozmiarach poniżej limitu dyfrakcji zostały rozdzielone, co potwierdza nadrozdzielczą moc hyperlensu. Opracowanie hyperlensu utorowało drogę do wykorzystania technik obrazowania nadrozdzielczego w badaniu nanometrowych maszynerii biomolekularnych oraz nieorganicznych nanocząsteczek. Po obejrzeniu tego filmu uzyskają Państwo praktyczną wiedzę na temat tego, jak wytworzyć wysokiej jakości hyperlens oraz jak skonfigurować własny system obrazowania nadrozdzielczego.Przewidujemy, że praktyczność techniki hyperlens zostanie zwiększona dzięki zastosowaniu skalowalnej i powtarzalnej metody wytwarzania. Hyperlens pozwoli naukowcom na obserwację dynamiki biofizycznej zachodzącej w nanoskali w czasie rzeczywistym i będzie służyć jako obrazowanie superrozdzielcze nowej generacji w różnych zastosowaniach, takich jak biologia, nauki medyczne, inżynieria materiałowa i nanotechnologia.

demonstration-hyperlens-integrated-microscope-super-resolution

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Przedstawiono metodę pokonywania limitu dyfrakcji optycznej. Metoda obejmuje dwuetapowy proces: optyczne odzyskiwanie fazy za pomocą iteracyjnego algorytmu Gerchberga-Saxtona oraz przesunięcie systemu obrazowania, po którym następuje powtórzenie pierwszego kroku. Syntetycznie zwiększona apertura obiektywu jest generowana wzdłuż kierunku ruchu, co zapewnia wyższą rozdzielczość obrazowania.

Multipleksowanie czasowe Technika super rozdzielczości do obrazowania z ruchomej platformy

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj proces wytwarzania sferycznego hiper soczewki do obrazowania superrozdzielczego w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia powiększanie informacji dwuwymiarowych poniżej granicy dyfrakcji.

Demonstracja mikroskopu zintegrowanego z hipersoczewkami i obrazowania superrozdzielczego

Przeglądaj więcej filmów